專利名稱：一種用農(nóng)桿菌介導(dǎo)對裂壺藻進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種用農(nóng)桿菌介導(dǎo)對裂壺藻進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的方法。
背景技術(shù)：
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，簡稱DHA)是重要的ω-3高度不飽和脂肪酸，具有促進(jìn)腦細(xì)胞生長發(fā)育，降血脂，降血糖，保護(hù)視力，抗癌及提高免疫能力等多種重要的生理功能，受到醫(yī)療界及食品界的廣泛關(guān)注。商業(yè)化DHA的主要來源是深海魚油，但深海魚類資源有限，且魚油中DHA含量受魚的品種、季節(jié)及地理位置的影響而不穩(wěn)定，不能滿足日益增長的市場需求。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)DHA具有周期短，脂肪酸構(gòu)成簡單，不受原料的限制，易于提純等優(yōu)點，有望成為高純度DHA的有效來源。裂壺藻是一種海洋微藻，與硅藻、褐藻等微藻同屬Stramenopiles綱。裂壺藻可利用葡萄糖為碳源進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)，其營養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)二均分裂，脂肪酸組成簡單，DHA含量高，分離純化簡單，是獲取天然高濃度DHA的很好資源?；蚬こ碳夹g(shù)是近年來興起的一種現(xiàn)代生物技術(shù)，該技術(shù)在育種領(lǐng)域里已取得了一些重大成果并獲得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益，獲得了許多性狀優(yōu)良的品種。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來改善裂壺藻的品質(zhì)，獲得生長速度快、油脂含量高、組分簡單的裂壺藻新品種將具有巨大的商業(yè)優(yōu)勢和廣闊的市場前景，所以利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)提高裂壺藻的品質(zhì)顯得異常重要。但是，目前裂壺藻的基因工程領(lǐng)域尚處于空白。雖然裂壺藻的基因槍轉(zhuǎn)化和電擊轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)建立，但是這些方法介導(dǎo)的重組方式為同源重組，因此需要從裂壺藻體內(nèi)克隆獲得同源片段，由于缺乏裂壺藻的基因組序列信息，極大的限制了上述兩種轉(zhuǎn)化方法的應(yīng)用。因此，發(fā)展新的裂壺藻非同源重組基因轉(zhuǎn)化方法將極大的推進(jìn)裂壺藻基因工程領(lǐng)域的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用農(nóng)桿菌介導(dǎo)對裂壺藻進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的方法。本發(fā)明提供了一種制備轉(zhuǎn)基因裂壺藻的方法，包括如下步驟用重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化裂壺藻原生質(zhì)體，得到轉(zhuǎn)基因裂壺藻；所述重組農(nóng)桿菌是將含有外源基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化出發(fā)農(nóng)桿菌得到的。所述出發(fā)農(nóng)桿菌可為農(nóng)桿菌菌株LBA4404。所述裂壺藻具體可為裂壺藻Schizochytrium sp. TI01101 CGMCC No. 4603。所述裂壺藻原生質(zhì)體的制備方法可包括如下步驟(1)將所述裂壺藻培養(yǎng)至對數(shù)生長期；(2)收集所述裂壺藻的細(xì)胞，用纖維素酶和蝸牛酶消化，獲得裂壺藻原生質(zhì)體。在進(jìn)行所述步驟(1)前，可將所述裂壺藻進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。所述預(yù)培養(yǎng)具體可為將所述裂壺藻接種于YPD培養(yǎng)基中，28°C搖床中培養(yǎng)過夜。所述步驟(1)中，所述培養(yǎng)溫度可為28°C。所述步驟(1)中，具體可 采用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)所述裂壺藻。所述步驟(2)中，可通過離心收集所述裂壺藻的細(xì)胞。所述離心的參數(shù)具體可為 4000rpm、4°C離心5min。所述步驟(2)中，收集所述裂壺藻后進(jìn)行所述消化前，可先用預(yù)冷的無菌水洗滌所述細(xì)胞。所述步驟(2)中，所述消化的條件具體可為28°C消化5-6小時。 所述步驟(2)中，所述纖維素酶和所述蝸牛酶具體可通過酶處理液的方式加入；所述酶處理液由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶劑為20mM磷酸鹽緩沖液(pH5.8)；所述溶質(zhì)及其濃度如下 2% (質(zhì)量百分比)纖維素酶，2% (質(zhì)量百分比)蝸牛酶和0.7MKC1。所述用重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化裂壺藻原生質(zhì)體可包括如下步驟①用乙酰丁香酮對重組農(nóng)桿菌進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)；②將所述裂壺藻原生質(zhì)體與完成步驟①的重組農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因裂壺藻。進(jìn)行所述步驟①前，可將所述重組農(nóng)桿菌在YEB培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后離心收集重組農(nóng)桿菌菌體。所述步驟①中，所述預(yù)誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件可為28°C培養(yǎng)4-5小時。所述步驟①可在誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM中進(jìn)行。所述重組農(nóng)桿菌在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM 中的濃度為0D600 = 0. 6-0. 8，所述乙酰丁香酮在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM中的濃度為250umol/ L0所述步驟②中，所述共培養(yǎng)的條件可為28°C震蕩培養(yǎng)10-18小時，具體可為28°C 震蕩培養(yǎng)14小時。所述步驟②可在誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM中進(jìn)行。所述用重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化裂壺藻原生質(zhì)體的方法還可包括將共培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行抗生素篩選的步驟。所述抗性篩選可采用如下條件28°C培養(yǎng)2-3天。所述抗生素篩選中的抗生素具體可由G418、氨芐青霉素和氯霉素組成。所述抗生素篩選優(yōu)選采用YPD篩選培養(yǎng)基進(jìn)行。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM由水和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM中的濃度如下=NaCl 0. 15g/L、MgSO4 · 7H20 0. 25g/L、K2HPO4 2. 28g/L、KH2PO4 1. 36g/L、CaCl2 · H2O 0. 078g/L、FeSO4 0. 0025g/L、(NH4)2SO4 0. 53g/L、葡萄糖 1. 98g/L、甘油 0. 54g/L、MES 7. 808g/L ；pH5. 3。所述YPD篩選培養(yǎng)基由YPD培養(yǎng)基、G418、氨芐青霉素和氯霉素組成，G418的濃度為300mg/L，氨芐青霉素的濃度為300mg/L，氯霉素的濃度為300mg/L。所述YEB培養(yǎng)基由水和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在所述YEB培養(yǎng)基中的濃度如下 5g/L 牛肉浸膏、lg/L 酵母提取物、5g/L 蛋白胨、5g/L 蔗糖、0. 5g/L MgSO4 · 7H20 ；pH7. 4。所述YPD培養(yǎng)基由水和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在所述YPD培養(yǎng)基中的濃度如下 10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖，50% (體積百分比)海水；pH6. 2-6. 8。所述外源基因具體可為序列表的序列1所示的GUS基因、序列表的序列2所示的 NPTII基因和序列表的序列3所示的EGFP基因中的至少一種。所述外源基因為所述GUS基因和所述NPT II基因時，所述含有外源基因的質(zhì)粒為雙元載體PCAMBIA2301。所述外源基因為EGFP基因時，所述含有外源基因的質(zhì)粒為重組質(zhì)粒 PCAMBIA2301-EGFP ；所述重組質(zhì)粒pCAMBIA2301_EGFP可為在雙元載體pCAMBIA2301的多克隆位點插入TEFl-EGFP-CYC1片段得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-EGFP具體可為在雙元載體PCAMBIA2301的HindIII和BamHI酶切位點插入所述TEFl-EGFP-CYC1片段得到的重組質(zhì)粒。所述TEF1-EGFP-CYC1片段自上游至下游依次包括序列表的序列4所示的組成型啟動子TEF1、序列表的序列3所示的EGFP基因和序列表的序列5所示的轉(zhuǎn)錄終止子CYCl。所述TEFl-EGFP-CYC1片段具體可為用用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒pBS-TEFl-EGFP-CYC1得到的小片段；所述重組質(zhì)粒pBS_TEFl-EGFP-CYC1具體可為以克隆載體pBluescript II SK+為骨架質(zhì)粒，在EcoRI和PstI位點之間插入序列表的序列3所示的EGFP基因，在HindIII和EcoRI位點之間插入序列表的序列4所示的組成型啟動子TEF1，在PstI和BamHI位點之間插入序列表的序列5所示的轉(zhuǎn)錄終止子CYC1。以上任一所述方法得到的轉(zhuǎn)基因裂壺藻也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明提供了一種高效、穩(wěn)定、簡便的裂壺藻基因轉(zhuǎn)化的方法。本發(fā)明以裂壺藻原生質(zhì)體為受體材料，通過農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化裂壺藻，巧妙的利用了裂壺藻與農(nóng)桿菌LBA4404對抗生素的敏感性不同的特點完成了轉(zhuǎn)基因裂壺藻的篩選。本發(fā)明不需要涉及昂貴的儀器，易于操作，重復(fù)性好，且轉(zhuǎn)化效率高，每IO7個藻體細(xì)胞可獲得100個以上的轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的建立為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改善裂壺藻的品質(zhì)，獲得生長速度快、油脂含量高、組分簡單的裂壺藻新品種奠定了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明方法對裂壺藻的遺傳改良具有十分重要的意義。


圖1為雙元載體pCAMBIA2301的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為轉(zhuǎn)基因裂壺藻的表型鑒定結(jié)果。圖3為PCR驗證轉(zhuǎn)基因裂壺藻中NPT II基因的插入情況。圖4為PCR驗證轉(zhuǎn)基因裂壺藻中⑶S基因的插入情況。圖5為重組質(zhì)粒pBS-EGFP的構(gòu)建過程示意圖。圖6為重組質(zhì)粒pBS-TEFl-EGFP-CYC1的構(gòu)建過程示意圖。圖7為重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-EGFP的構(gòu)建過程示意圖。圖8為PCR驗證轉(zhuǎn)基因裂壺藻中外源基因EGFP的插入情況。圖9為轉(zhuǎn)基因裂壺藻的southern雜交結(jié)果。圖10為Western blot檢測轉(zhuǎn)基因裂壺藻中外源基因EGFP的表達(dá)情況。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。MES中文名稱為2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸一水。質(zhì)粒pEGFP-Nl =Clontech, Catalog Number #6085-1?？寺≥d體 pBluescript II SK+Stratagene，Catalog Number #212205·。質(zhì)粒 pGAPZ α A Jnvitrogen, Catalog Number V205-20。雙元載體 pCAMBIA2301 =CAMBIA, Canberra, Australia.。農(nóng)桿菌菌株 LBA4404 Jnvitrogen, Catalog Number 18313-015.。
酶處理液由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶劑為20mM磷酸鹽緩沖液(pH5. 8)；所述溶質(zhì)及其濃度如下2% (質(zhì)量百分比)纖維素酶，2% (質(zhì)量百分比)蝸牛酶和0.7M KC1。YPD培 養(yǎng)基10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖，50% (體積百分比) 海水，其余為水；PH6. 2-6.8。YEB培養(yǎng)基5g/L牛肉浸膏、lg/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、5g/L蔗糖、0. 5g/L MgSO4 · 7H20，其余為水；pH7. 4。誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM:由水和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其濃度如下NaCl 0. 15g/L、 MgSO4 · 7H20 0. 25g/L、K2HPO4 2. 28g/L、KH2PO4 1. 36g/L、CaCl2 · H2O 0. 078g/L、FeSO4 0. 0025g/L、(NH4)2SO4 0. 53g/L、葡萄糖 1. 98g/L、甘油 0. 54g/L、MES 7. 808g/L ；pH5. 3。YPD篩選培養(yǎng)基由YPD培養(yǎng)基、G418、氨芐青霉素和氯霉素組成；G418的濃度為 300mg/L，氨芐青霉素的濃度為300mg/L，氯霉素的濃度為300mg/L。實施例1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)裂壺藻的基因轉(zhuǎn)化(⑶S基因和NPT II基因)一、裂壺藻原生質(zhì)體的制備裂壺藻Schizochytrium sp. TIOl 101已于2011年02月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 4603。裂壺藻Schizochytrium sp. TI01101 CGMCC No. 4603 簡稱裂壺藻 TI01101。制備原生質(zhì)體的步驟如下(1)將裂壺藻TIOl 101接種于YPD培養(yǎng)基中，28°C搖床中培養(yǎng)過夜。(2)次日按照(體積比)的接種量轉(zhuǎn)接入50ml新鮮的液體YPD培養(yǎng)基中28°C 培養(yǎng)至對數(shù)生長期。(3)以4000rpm的轉(zhuǎn)速4°C離心5min收集藻細(xì)胞，利用預(yù)冷的無菌水洗滌藻細(xì)胞一次后加入IOml酶處理液，28°C搖床中消化5-6小時，顯微鏡觀察裂壺藻形成原生質(zhì)體的狀態(tài)，當(dāng)90%以上裂壺藻細(xì)胞轉(zhuǎn)化為原生質(zhì)體時即可停止消化。二、農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)裂壺藻的基因轉(zhuǎn)化雙元載體pCAMBIA2301的結(jié)構(gòu)圖譜見圖1。雙元載體pCAMBIA2301含有葡萄糖苷酶基因(GUS基因，如序列表的序列1所示)和G418抗性基因(NPT II基因，如序列表的序列2所示)；其中GUS基因作為報告基因，在裂壺藻中可表達(dá)葡萄糖苷酸酶，在底物存在的情況下使轉(zhuǎn)基因裂壺藻產(chǎn)生顯色反應(yīng)；NPT II基因作為選擇標(biāo)記基因，賦予轉(zhuǎn)基因裂壺藻對G418的抗性。具體操作步驟如下1、將雙元載體pCAMBIA2301轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株LBA4404，得到重組農(nóng)桿菌。2、挑取重組農(nóng)桿菌至液體YEB培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體，利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM重懸稀釋調(diào)整農(nóng)桿菌的濃度為0D600 = 0. 6-0. 8，并加入終濃度為 250umol/L的乙酰丁香酮，28°C預(yù)誘導(dǎo)4_5小時。3、離心收集步驟一制備的原生質(zhì)體，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM重懸后，加入步驟2得到的菌液中，28°C震蕩侵染14小時(采用10-18小時均可)。4、將步驟3得到的藻細(xì)胞與菌體混合培養(yǎng)物離心收集，涂布于固體YPD篩選培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)2-3天。
5、挑取固體YPD篩選培 養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化子克隆。6、二次篩選和表型鑒定將獲得的轉(zhuǎn)化子克隆培養(yǎng)后在固體YPD篩選培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，同時以野生型裂壺藻藻株(裂壺藻TI01101)作為陰性對照，照片見圖2 (Al至A7為轉(zhuǎn)基因裂壺藻藻株；WT 為裂壺藻TI01101)。轉(zhuǎn)基因裂壺藻藻株A1-A7均能夠在YPD篩選固體培養(yǎng)中生長，而野生型裂壺藻藻株則不能夠生長。結(jié)果表明，獲得了轉(zhuǎn)基因裂壺藻藻株。三、轉(zhuǎn)化效果鑒定(PCR驗證外源基因在轉(zhuǎn)基因裂壺藻基因組中的整合情況)分別以轉(zhuǎn)基因裂壺藻A1_A6(以裂壺藻TI01101作為陰性對照，WT)的基因組DNA 為模板，使用NPT II-F和NPT II-R組成的引物對PCR檢測NPT II基因，使用⑶S-F和 ⑶S-R組成的引物對PCR檢測⑶S基因。NPT II-F :5，-TCACTGAAGCGGGAAGGGACT-3，；NPT II-R 5，-GCGGCGATACCGTAAAGCAC-3，。GUS-F :5，-GACTCGTCCGTCCTGTAGAAACC-3，；GUS-R 5’ -AAAGTCCCGCTAGTGCCTTGTC-3 ’。PCR反應(yīng)條件95 °C預(yù)變性5min，然后經(jīng)30個循環(huán)(94 °C 30s,56 °C 30s、 72°C lmin)，72°C IOmin。取5 μ 1 PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，EB染色觀察。結(jié)果見圖3和圖4。結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因裂壺藻Α1-Α6的基因組中均可以PCR擴(kuò)增獲得NPTII基因的目的片段(約500bp)和⑶S基因的目的片段(約750bp)；在裂壺藻 TI01101的基因組中沒有目的條帶。說明外源基因已經(jīng)成功插入轉(zhuǎn)基因裂壺藻的基因組中。 每IO7個藻體細(xì)胞可獲得100個以上轉(zhuǎn)基因裂壺藻藻株。實施例2、農(nóng)桿菌介導(dǎo)裂壺藻的基因轉(zhuǎn)化(EGFP基因)一、重組質(zhì)粒 pCAMBIA2301-EGFP 的構(gòu)建1、綠色熒光蛋白基因(EGFP)的克隆(1)以質(zhì)粒pEGFP-Nl為模板，用EGFP-F和EGFP-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(綠色熒光蛋白基因，又稱EGFP基因，如序列表的序列3所示)。EGFP-F :5，-GGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGA-3，；EGFP-R 5’ -AACTGCAGTTACTTGTACAGCTCGTC-3 ’。PCR反應(yīng)條件95 °C預(yù)變性5min，然后經(jīng)30個循環(huán)(94 °C 30s,58 °C 30s、 72°C lmin) ,72°C IOmin。(2)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI雙酶切克隆載體pBluescript II SK+，回收載體骨架(約3000bp)。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pBS-EGFP。重組質(zhì)粒pBS-EGFP的結(jié)構(gòu)示意圖見圖5。2、綠色熒光蛋白表達(dá)模塊的構(gòu)建(1)以質(zhì)粒pGAPZ α A為模板，用TEF-F和TEF-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(組成型啟動子TEF1，如序列表的序列4所示)。TEF-F :5，-CCCAAGCTTCCCACACACCATAGCTTC-3，；
TEF-R 5’ -GGAATTCGGTTTAGTTCCTCACCTT-3’。PCR反 應(yīng)條件95 °C預(yù)變性5min，然后經(jīng)30個循環(huán)(94 °C 30s,56 °C 30s、 72°C lmin)，72°C IOmin。(2)用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切重組質(zhì)粒pBS_EGFP，回收載體骨架 (約 3800bp)。(4)將步驟⑵的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pBS-TEF1-EGFP。(5)以質(zhì)粒pGAPZ α A為模板，用CYCl-F和CYCl-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(轉(zhuǎn)錄終止子CYCl，如序列表的序列5所示)。CYCl-F :5，-AACTGCAGCACGTCCGACGGCGGCC-3，；CYCl-R 5，-CGGGATCCAGCTTGCAAATTAAAGCCT-3，。PCR反應(yīng)條件95 °C預(yù)變性5min，然后經(jīng)30個循環(huán)(94 °C 30s,56 °C 30s、 72°C lmin) ,72°C IOmin。(6)用限制性內(nèi)切酶PstI和BamHI雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(7)用限制性內(nèi)切酶PstI和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒pBS_TEFl-EGFP，回收載體骨架(約 4300bp)。(8)將步驟(6)的酶切產(chǎn)物和步驟(7)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pBS-TEF1-EGFP-CYC1。重組質(zhì)粒pBS-TEF 1-EGFP-CYC1的結(jié)構(gòu)示意圖見圖6。3、重組質(zhì)粒 pCAMBIA2301-EGFP 的構(gòu)建(1)用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒pBS_TEFl-EGFP_CYCl，回收酶切產(chǎn)物(EGFP基因的表達(dá)模塊TEFl-EGFP-CYC1)。(2)用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI雙酶切雙元載體pCAMBIA2301，回收載體骨
^K O(3)將步驟⑴的酶切產(chǎn)物和步驟(2)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 PCAMBIA230I-EGFP。重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-EGFP的結(jié)構(gòu)示意圖見圖7。二、農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)裂壺藻的基因轉(zhuǎn)化1、裂壺藻原生質(zhì)體的制備同實施例1的步驟一。2、農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)裂壺藻的基因轉(zhuǎn)化用重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-EGFP代替雙元載體pCAMBIA2301，其它同實施例1的步驟二，獲得轉(zhuǎn)基因裂壺藻藻株。3、轉(zhuǎn)化效果鑒定(I)PCR驗證外源基因在轉(zhuǎn)基因裂壺藻基因組中的整合情況分別以轉(zhuǎn)基因裂壺藻(藻株E1-E6 ；以裂壺藻TI01101作為陰性對照，WT)的基因組DNA為模板，使用EGFP-F和EGFP-R組成的引物對PCR檢測EGFP基因(egfp基因)。EGFP-F 5’ -GGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3 ’ ；
EGFP-R 5’ -AACTGCAGTTACTTGTACAGCTCGTC-3 ’。PCR反應(yīng)條件95 0C預(yù)變性5min，然后經(jīng)30個循環(huán)(94 °C 30s,56 °C 30s、 72°C lmin)，72°C IOmin。取5 μ 1 PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，EB染色觀察。結(jié)果見圖8。結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因裂壺藻Ε1-Ε6的基因組中均可以PCR擴(kuò)增獲得 EGFP基因的目的片段(約700bp)；在裂壺藻TI01101的基因組中沒有目的條帶。說明外源基因已經(jīng)成功插入轉(zhuǎn)基因裂壺藻的基因組中。(2) Southern雜交驗證轉(zhuǎn)基因裂壺藻中外源基因的拷貝數(shù)目分別將轉(zhuǎn)基因裂壺藻(藻株E1-E6 ；以裂壺藻TI01101作為陰性對照，WT)的基因組DNA進(jìn)行southern雜交(采用地高辛標(biāo)記的egfp基因片段作為探針，探針如序列表的序列3自5’末端第5至668位核苷酸所示)。結(jié)果見圖9。結(jié)果顯示，所得到的轉(zhuǎn)基因裂壺藻均為陽性，且外源基因均為單拷貝隨機(jī)插入。(3) Western blot檢測外源基因在轉(zhuǎn)基因裂壺藻中的表達(dá)情況分別將轉(zhuǎn)基因裂壺藻(藻株E1-E6 ；以裂壺藻TI01101作為陰性對照，WT)用蛋白裂解液裂解后得到蛋白液。將各種蛋白液進(jìn)行Western blot (—抗為EGFP的抗體)。結(jié)果見圖10。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因裂壺藻E1-E6中均能夠成功檢測到EGFP蛋白的表達(dá)，而野生型裂壺藻中則不能檢測到。說明外源基因EGFP已經(jīng)成功的在轉(zhuǎn)基因裂壺藻中得到了表達(dá)。每IO7個藻體細(xì)胞可獲得100個以上轉(zhuǎn)基因裂壺藻藻株。
權(quán)利要求
1.一種制備轉(zhuǎn)基因裂壺藻的方法，包括如下步驟用重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化裂壺藻原生質(zhì)體，得到轉(zhuǎn)基因裂壺藻；所述重組農(nóng)桿菌是將含有外源基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌得到的。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述農(nóng)桿菌為農(nóng)桿菌菌株LBA4404。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述裂壺藻為裂壺藻Schizochytrium sp.TI01101 CGMCC No. 4603。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述裂壺藻原生質(zhì)體的制備方法包括如下步驟(1)將所述裂壺藻培養(yǎng)至對數(shù)生長期；(2)收集所述裂壺藻的細(xì)胞，用纖維素酶和蝸牛酶消化，獲得裂壺藻原生質(zhì)體。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述用重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化裂壺藻原生質(zhì)體包括如下步驟①用乙酰丁香酮對重組農(nóng)桿菌進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)；②將所述裂壺藻原生質(zhì)體與完成步驟①的重組農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因裂壺藻。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述方法還包括將共培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行抗生素篩選的步驟；所述抗生素篩選中的抗生素優(yōu)選由G418、氨芐青霉素和氯霉素組成。
7.如權(quán)利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述外源基因為序列表的序列1 所示的GUS基因、序列表的序列2所示的NPT II基因和序列表的序列3所示的EGFP基因中的至少一種。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述外源基因為所述GUS基因和所述NPTII 基因；所述含有外源基因的質(zhì)粒為雙元載體PCAMBIA2301。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述外源基因為EGFP基因；所述含有外源基因的質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-EGFP ；所述重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-EGFP是在雙元載體pCAMBIA2301的多克隆位點插入TEFl-EGFP-CYC1片段得到的；所述TEFl-EGFP-CYC1片段自上游至下游依次包括序列表的序列4所示的組成型啟動子TEF1、序列表的序列3所示的EGFP基因和序列表的序列5所示的轉(zhuǎn)錄終止子CYCl。
10.權(quán)利要求1至9中任一所述方法得到的轉(zhuǎn)基因裂壺藻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用農(nóng)桿菌介導(dǎo)對裂壺藻進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的方法。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟用重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化裂壺藻原生質(zhì)體，得到轉(zhuǎn)基因裂壺藻；所述重組農(nóng)桿菌是將含有外源基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌得到的。本發(fā)明不需要涉及昂貴的儀器，易于操作，重復(fù)性好，且轉(zhuǎn)化效率高，每107個藻體細(xì)胞可獲得100個以上的轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的建立為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改善裂壺藻的品質(zhì)，獲得生長速度快、油脂含量高、組分簡單的裂壺藻新品種奠定了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明方法對裂壺藻的遺傳改良具有十分重要的意義。
文檔編號C12N1/13GK102220359SQ20111011201
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者吳欣, 張 林, 李科, 楊善軍, 林汝榕, 林祥志, 王昭凱, 程汝濱, 榮輝, 馬涌, 馬瑞娟 申請人:國家海洋局第三海洋研究所