專利名稱：高產(chǎn)dha的裂壺藻藻株及其發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)DHA的裂壺藻藻株及其發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
二十二碳六烯酸(DHA)主要存在于人體大腦灰質(zhì)及視網(wǎng)膜中，是維持人體正常生理代謝的必需脂肪酸成分，在嬰幼兒大腦和視力發(fā)育中具有非常重要的生理作用，并可治療心血管疾病，提高人體免疫力等。DHA因其特有的生理調(diào)節(jié)機(jī)能而引起人們極大的興趣并得到廣泛的應(yīng)用。DHA的傳統(tǒng)來源為深海魚油，但從魚油中提取的多不飽和脂肪酸(PUFAs)存在著產(chǎn)量不穩(wěn)、得率低、成本高及含有其它的《-6PUFAS等問題，且隨著漁業(yè)資源的日益緊張， 傳統(tǒng)的DHA資源己無法滿足日益增長的市場需求。因此，開發(fā)DHA的新生資源己成為新的研究熱點(diǎn)。微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA以其獨(dú)特的優(yōu)勢而成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一，其中利用微藻培養(yǎng)生產(chǎn)DHA具有更大的優(yōu)勢和生產(chǎn)潛能。微藻具有生長周期短、繁殖速度快、可塑性強(qiáng)、對營養(yǎng)要素要求簡單等特點(diǎn)，而且部分可以通過生物工程方法和培養(yǎng)條件的控制達(dá)到高密度發(fā)酵培養(yǎng)。目前已發(fā)現(xiàn)多種微藻中富含多不飽和脂肪酸(PUFAs)，如裂壺藻、隱甲藻等。微藻是海洋食物鏈中多不飽和脂肪酸的最初生產(chǎn)者，有些藻細(xì)胞中多飽和脂肪酸DHA、EPA含量較高，其相對含量高達(dá)細(xì)胞干重的5% _6%，而且所含的多不飽和脂肪酸種類比較單純，進(jìn)行單一成分的分離提純相對容易一些，因而利用海洋微藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸是一個(gè)非常有前景的商業(yè)領(lǐng)域。微藻油因多富含多不飽和脂肪酸，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品、飼料等領(lǐng)域。裂壺藻細(xì)胞中DHA含量豐富，而其它的不飽和脂肪酸含量卻很低。該藻使用安全，Hammond等人用其對白鼠、兔子進(jìn)行了一系列的安全性檢測，沒有發(fā)現(xiàn)任何毒副作用。 裂壺藻的安全性已經(jīng)得到美國食品和藥品部(Food and Drug Administration)的認(rèn)可。 目前國內(nèi)外已有較多利用裂壺藻發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)DHA的研究，但大多存在產(chǎn)量不高的問題。 T. Yokocki等在搖瓶中采用多種碳源和氮源對裂壺藻khizochytriumlimacinum SR21進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，得到的DHA最高產(chǎn)量為4g/L。Kw Fan等人以葡萄糖和酵母提取物為碳、氮源培養(yǎng)裂壺藻Gchizochytrium mangroves)，DHA的產(chǎn)量僅為2. 79g/L。以上培養(yǎng)中DHA的產(chǎn)量都不是很高，這除了與所選用的藻株有關(guān)外，與培養(yǎng)工藝也有直接的關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)DHA的裂壺藻藻株及其發(fā)酵方法。本發(fā)明提供了裂壺藻khizochytrium sp. TIOl 101，它的保藏編號(hào)為 CGMCCNo. 4603。用于所述裂壺藻TI01101的發(fā)酵培養(yǎng)基，制備方法如下將葡萄糖100_130g、酵母浸膏15-30g、蛋白胨10-20g、磷酸二氫鉀2-4g、硫酸鎂l-3g、微量元素復(fù)合液8-llml和維生素復(fù)合液4-8ml用0. 5 X海水定容至IL ；所述0. 5 X海水是將1體積份海水與1體積份水混合得到的。所述發(fā)酵培養(yǎng)基中所述葡萄糖為120g、所述酵母浸膏為20g、所述蛋白胨為15g、 所述磷酸二氫鉀為3g、所述硫酸鎂為2g、所述微量元素復(fù)合液為10ml、所述維生素復(fù)合液為 5ml。所述微量元素復(fù)合液的制備方法具體如下=Na2 · EDTA 6. 0g, FeCl3 · 6H20 0. 29g, H3BO36. 84g, MnCl2 · 4H20 0. 86g, ZnCl2O. 06g, CoCl2 · 6H20 0. 026g, NiSO4 · 6H20 0. 052g, CuSO4 · 5H20 0. 002g, NaMoO4 · 2H20 0. 005g，用水定容至 1L。所述維生素復(fù)合液的制備方法具體如下維生素Bl (thiamin) IOOmg,維生素 H(biotin)0. 5mg，維生素 B12 (cyanoccAalamin)0. 5mg，用水定容至 1L。本發(fā)明還保護(hù)一種培養(yǎng)所述裂壺藻TI01101的方法，是在25-30°C，pH 5. 5-7. 5， 的條件下培養(yǎng)所述裂壺藻TI01101。所述培養(yǎng)方法中，溫度可為25°C，pH可為6.0。所述培養(yǎng)優(yōu)選在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行。所述裂壺藻TI01101在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種濃度可為 1.0X106f/mL。所述裂壺藻TI01101可用于制備油脂和/或二十二碳六烯酸。本發(fā)明還保護(hù)一種制備油脂和/或二十二碳六烯酸的方法，是發(fā)酵所述裂壺藻 TI01101，得到油脂和/或二十二碳六烯酸。所述發(fā)酵的參數(shù)可為25-30°C，PH 5.5-7.5。 所述發(fā)酵的參數(shù)優(yōu)選為25°C，pH 6. 0，溶氧10%。所述發(fā)酵中可采用200-400rpm的轉(zhuǎn)速， 優(yōu)選采用300rpm的轉(zhuǎn)速。所述發(fā)酵的時(shí)間具體可為96小時(shí)。所述發(fā)酵優(yōu)選在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行。所述裂壺藻TI01101在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種濃度可為1.0X IO6個(gè)/mL。 所述發(fā)酵的過程中，可進(jìn)行分批補(bǔ)料。對于每6L發(fā)酵培養(yǎng)基，所述分批補(bǔ)料具體可為從發(fā)酵1 的時(shí)刻開始流加葡萄糖溶液(由葡萄糖和水組成，葡萄糖的濃度為50g/L)和酵母膏溶液(由酵母膏和水組成，酵母膏的濃度為10g/L)直至發(fā)酵50h的時(shí)刻，葡萄糖溶液的流速為50mL/h、酵母膏溶液的流速為20mL/h。發(fā)酵7 后，裂壺藻TI01101的生物量、油脂含量及DHA占總脂含量分別為120g/ L.54. 3%和51. 4%，每IOOg干藻體可以得到54. 3g油脂、27. 9gDHA，極具開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的有益效果(1)分離獲得了裂壺藻TI01101 ;(2)實(shí)現(xiàn)了裂壺藻TI01101 的高密度異養(yǎng)發(fā)酵；(3)此發(fā)酵條件下獲得的裂壺藻TI01101細(xì)胞所提油脂中DHA含量高且成分較為單純。


圖1為裂壺藻TI01101 18S rRNA基因PCR電泳圖。圖2為裂壺藻TIOl 101 18S rRNA基因進(jìn)化樹。圖3為裂壺藻TIOl 101細(xì)胞干重隨發(fā)酵時(shí)間的變化圖。圖4為裂壺藻TI01101油脂樣品甲酯化后的色譜圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。海水取自廈門海域。微量元素復(fù)合液的制備方法=Na2 · EDTA 6. 0g, FeCl3 · 6H20 0. 29g, H3BO36. 84g, MnCl2 · 4H20 0. 86g, ZnCl2O. 06g, CoCl2 · 6H20 0. 026g, NiSO4 · 6H20 0. 052g, CuSO4 · 5H200. 002g, NaMoO4 · 2H20 0. 005g，蒸餾水補(bǔ)足 1L。維生素復(fù)合液的制備方法維生素Bl (thiamin) lOOmg，維生素H(biotin)0. 5mg， 維生素 B12 (cyanocobalamin) 0. 5mg,蒸餾水補(bǔ)足 1L。發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法葡萄糖120g、酵母浸膏20g、蛋白胨15g、磷酸二氫鉀3g、 硫酸鎂2g、微量元素復(fù)合液10ml、維生素復(fù)合液5ml，用0. 5X海水(用淡水稀釋1倍的海水)定容至1L。實(shí)施例1、裂壺藻TIOl 101的分離和鑒定一、裂壺藻TIOl 101的分離(松花粉垂釣法)取廈門賞笪湖紅樹林中的腐敗落葉，剪成直徑約為1. 5cm的小圓片，用含有鏈霉素和青霉素各lg/L的無菌海水洗凈，接種于固體分離平板上，每個(gè)平皿3-5片，加約3mL無菌海水和少量無菌松花粉于平板上，在下培養(yǎng)4-5d，挑取松花粉，觀察在松花粉上粘附生長的培養(yǎng)物，將粘附培養(yǎng)物的松花粉再轉(zhuǎn)接到新的平板上進(jìn)行劃線分離，直到獲得純培養(yǎng)物為止。將得到的一株藻命名為TI01101。二、裂壺藻TI01101的鑒定1、藻落及細(xì)胞形態(tài)觀察培養(yǎng)物在分離純化平板上培養(yǎng)5d后觀察長出的藻落形態(tài)、并通過制片在高倍顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)。裂壺藻藻落呈淡黃色、不透明、邊緣不整齊，其營養(yǎng)細(xì)胞為橢球形， 直徑約7-13 μ m,行二分裂生長。2、分子鑒定(1)基因組DNA提取采用改良的裂解法提取總DNA。取發(fā)酵液5mL于離心管中，8000r/min離心5min，無菌蒸餾水洗滌一遍后同樣條件下離心收集藻體。將新鮮藻體置于無菌研缽中加適量液氮研磨。研磨后的藻體轉(zhuǎn)移到離心管中，加入 2. 4ml 裂解液(0. 25mol/L Tris-Cl pH 8. 2,0. lmol/L EDTA pH 8. 0,2% SDS, 0. lmol/L NaCl)，混勻后裂解40min。加入等體積的酚氯仿異戊醇05 M 1)萃取，異丙醇沉淀，乙醇洗滌。所提DNA加入50 μ 110mmol/L的TE溶液溶解，_20°C冰箱保存。(2) 18S rRNA 擴(kuò)增、測序擴(kuò)增引物為正向Pf 5，-CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3，；反向ft· :5，-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT-3。50 μ L PCR反應(yīng)體系組成10XPCR buffer (5 μ L)、dNTP G μ L)、正向引物(1 μ L)、 反向引物(1 μ L)、TaKaRa Taq (0· 2 μ L，1. 25U)、模板 DNA (2 μ L，0· 6 1· 5 μ g)，蒸餾水補(bǔ)足至 50μ L。PCR 擴(kuò)增條件95°C預(yù)變性 5min，95°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin，30 個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。采用1 %的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物電泳檢測，見圖1，產(chǎn)生大小約為1700bp的18S rRNA基因。，
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體進(jìn)行連接，在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。序列全長1707bp (見序列表的序列表1)。(3)系統(tǒng)發(fā)育分析將測序獲得的18S rRNA基因序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析，利用ClustalX 1.8和Mega2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明該藻株18S rRNA基因與khizochytrium mangrovei具有99%以上的同源性，利用ClustalX 1. 8和Mega2軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖2，系統(tǒng)進(jìn)化樹表明該藻株與khizochytrium mangrovei聚為一支，親緣關(guān)系最近。根據(jù)藻落及細(xì)胞形態(tài)和分子鑒定的結(jié)果，TI01101屬于裂壺藻 Gchizochytriumsp.)。裂壺藻 khizochytrium sp. TI01101 已于 2011 年 02 月 23 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 4603。裂壺 M Schizochytrium sp. TI01101CGMCC No. 4603 簡稱裂壺藻 TI01101。實(shí)施例2、裂壺藻TIOl 101的高密度異養(yǎng)發(fā)酵一、發(fā)酵在10L發(fā)酵罐中加入6L發(fā)酵培養(yǎng)基，然后加入0. 6L裂壺藻TI01101菌液，使裂壺藻TI01101在培養(yǎng)基中的濃度約為1. OX IO6個(gè)/mL;發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度25°C，pH值 6.0，轉(zhuǎn)速300rpm(200-400rpm均可)，溶氧10%，培養(yǎng)96h ；進(jìn)行10L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料培養(yǎng) 從發(fā)酵1 的時(shí)刻開始流加葡萄糖溶液(由葡萄糖和水組成，葡萄糖的濃度為50g/L)和酵母膏溶液(由酵母膏和水組成，酵母膏的濃度為10g/L)直至發(fā)酵50h的時(shí)刻，葡萄糖溶液的流速為50mL/h、酵母膏溶液的流速為20mL/h。二、生物量、油脂及DHA含量檢測1、生物量取步驟一中不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液檢測生物量(以收集的藻體細(xì)胞干重計(jì))，方法如下取IOOmL發(fā)酵液裝入預(yù)先稱重的離心管中，8000r/min離心IOmin收集沉淀，用無菌蒸餾水清洗3次后，真空干燥至恒重后稱重，即為干藻體。裂壺藻干重(即干藻體的重量)隨發(fā)酵時(shí)間的變化如圖3。發(fā)酵培養(yǎng)7 后，裂壺藻獲得最高生物量為140g/L。2、油脂將步驟1得到的干藻體研磨成粉后采用索氏抽提法(GB5009. 6-85)抽提油脂并稱重。干藻體中的油脂含量較高，達(dá)到M.3%。3、DHA取0. Ig抽提所得油脂樣品置于IOml帶蓋離心管中，加入ImL乙醚正己烷混合液(乙醚正己烷為2 1 ；體積比)，搖勻15min后加入0. 8mol/L的K0H/CH30H溶液2mL, 搖勻后50°C反應(yīng)15min，沿壁加水到IOmL刻度處，靜置分層，取上清液進(jìn)行毛細(xì)管氣相色譜法分析。毛細(xì)管氣相色譜法分析的參數(shù)=Varian GC3800氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測器， CP-sil5CB毛細(xì)管柱(0. 32mmX0. 25 μ mX 30m)；載氣為氮?dú)猓魉贋?0. OmL/min ；進(jìn)樣口溫度為250°C，檢測器溫度為280°C;柱溫采用程序生溫初始溫度160°C (保留3min)，以6°C / min速率升到230°C，保留8min。采用十七烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法定量分析。
標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)為Y=L 4648X-0. 0087，相關(guān)系數(shù)r為0. 9999。其中Y軸代表分析物峰大小與內(nèi)標(biāo)峰大小之比。X軸代表所進(jìn)分析物的量與所進(jìn)內(nèi)標(biāo)量的比。內(nèi)標(biāo)十七烷酸甲酯及裂壺藻油脂樣品色譜圖見圖4。結(jié)果顯示裂壺藻DHA占總脂的含量為51.4%。每IOOg干藻體可以得到54. 3g油脂，得到27. 9gDHA。
權(quán)利要求
1.裂壺藻khizochytrium sp. TI01101，它的保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4603。
2.用于權(quán)利要求1所述裂壺藻TI01101的發(fā)酵培養(yǎng)基，制備方法如下將葡萄糖 100-130g、酵母浸膏15-30g、蛋白胨10-20g、磷酸二氫鉀2_4g、硫酸鎂l_3g、微量元素復(fù)合液8-1 Iml和維生素復(fù)合液4-8ml用0. 5 X海水定容至IL ；所述0. 5 X海水是將1體積份海水與1體積份水混合得到的。
3.如權(quán)利要求2所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述葡萄糖為120g、所述酵母浸膏為20g、所述蛋白胨為15g、所述磷酸二氫鉀為3g、所述硫酸鎂為2g、所述微量元素復(fù)合液為 10ml、所述維生素復(fù)合液為5ml。
4.如權(quán)利要求2或3所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述微量元素復(fù)合液的制備方法如下=Na2 · EDTA 6. 0g, FeCl3 · 6H20 0. 29g, H3BO36. 84g, MnCl2 · 4H20 0. 86g, ZnCl2O. 06g, CoCl2 · 6H20 0. 026g, NiSO4 · 6H20 0. 052g, CuSO4 · 5H20 0. 002g, NaMoO4 · 2H20 0. 005g，用水定容至 IL ；所述維生素復(fù)合液的制備方法如下維生素Bl lOOmg，維生素H 0.5mg，維生素B12 0. 5mg，用水定容至1L。
5.一種培養(yǎng)權(quán)利要求1所述裂壺藻TIOl 101的方法，是在25-30pH 5. 5-7. 5，的條件下培養(yǎng)所述裂壺藻TIOl 101。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述溫度為25°C，所述pH為6.0 ；所述培養(yǎng)優(yōu)選在權(quán)利要求2或3或4所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行。
7.權(quán)利要求1所述裂壺藻TIOl101在制備油脂和/或二十二碳六烯酸中的應(yīng)用。
8.一種制備油脂和/或二十二碳六烯酸的方法，是發(fā)酵權(quán)利要求1所述裂壺藻 TI01101，得到油脂和/或二十二碳六烯酸。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的參數(shù)為25-30°C，pH5.5-7.5； 所述發(fā)酵的參數(shù)優(yōu)選為25°C，pH 6.0，溶氧10%。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵在權(quán)利要求3或4或5所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)DHA的裂壺藻藻株及其發(fā)酵方法。本發(fā)明提供的藻株為裂壺藻Schizochytrium sp.TIO1101，它的保藏編號(hào)為CGMCC No.4603。對裂壺藻TIO1101進(jìn)行高密度異養(yǎng)發(fā)酵72h后，其生物量、油脂含量及DHA占總脂含量分別為120g/L、54.3％和51.4％，極具開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的有益效果(1)分離獲得了裂壺藻TIO1101；(2)實(shí)現(xiàn)裂壺藻裂壺藻TIO1101的高密度異養(yǎng)發(fā)酵；(3)此發(fā)酵條件下獲得的裂壺藻TIO1101細(xì)胞所提油脂中DHA含量高且成分較為單純。
文檔編號(hào)C12P7/64GK102199541SQ20111011124
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者吳欣, 張 林, 李科, 楊善軍, 林汝榕, 林祥志, 林秋云, 王昭凱, 榮輝, 馬涌 申請人:中海源(福建)生物科技有限公司, 國家海洋局第三海洋研究所