專利名稱：酵母培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠提高菌體中的谷胱甘肽含量的酵母培養(yǎng)方法，以及從所述培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的酵母制造酵母提取物的方法。本申請要求2010年3月26日于日本申請的特愿2010-073818號的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容在此并入。
背景技術(shù)：
以啤酒酵母、面包酵母為代表的屬于酵母屬(Saccharomyces)菌的酵母平衡良好地含有天然的B族維生素、氨基酸、以及礦物質(zhì)等，除了用于啤酒、面包的制造以外，也有有 效應(yīng)用。例如，干燥酵母在日本長期作為醫(yī)藥品、食品原料以及調(diào)味料等使用，其被認(rèn)為是營養(yǎng)價(jià)值和安全性高的原材料。此外，近年來作為酵母提取物的原料酵母也有廣泛應(yīng)用。酵母提取物是從酵母的培養(yǎng)物制備的，其含有豐富的氨基酸等，傳統(tǒng)上作為諸如用于賦予美味、厚味的調(diào)味料等食品添加劑而使用。特別是目前崇尚天然的情趣高漲，對作為調(diào)味料的酵母提取物的需求有增加的傾向。從富含呈味成分的酵母制備的酵母提取物可以期待作為更優(yōu)良的調(diào)味料使用，因而更多含有呈味成分的酵母的開發(fā)盛行。作為酵母菌體內(nèi)的代表性含硫化合物，可以列舉出谷胱甘肽和S-腺苷甲硫氨酸。谷胱甘肽是具有肝機(jī)能恢復(fù)、以及抗氧化活性等的極其有用的物質(zhì)，近年來期待其作為調(diào)味料、健康食品等飲食品的添加劑、化妝品基材等，有著廣泛的用途。另一方面，已知S-腺苷甲硫氨酸在各種生物體反應(yīng)中作為甲基的供體發(fā)揮作用。此外，還報(bào)告有抗抑郁作用、關(guān)節(jié)病的緩和、以及肝機(jī)能恢復(fù)等效果，已知這些含硫化合物對生物體起到重要的作用。含硫化合物通常是使用甲硫氨酸、半胱氨酸等含硫氨基酸，通過以MET基因(甲硫氨酸合成基因)群為代表的許多基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯產(chǎn)物來合成。因而，為了得到更高生產(chǎn)含硫化合物的酵母，廣泛地對酵母具有的與這些含硫化合物的合成相關(guān)的基因?qū)嵤┩蛔?，制造含硫化合物富含酵母突變株。例如、作為制造富含谷胱甘肽的酵母的方法，已?jīng)公開了(I)通過對因突變處理而能夠在同時(shí)含乙硫氨酸和亞硫酸鹽的培養(yǎng)基中生長的假絲酵母屬(Candida)酵母的突變株進(jìn)行需氧性培養(yǎng)，提高菌體中的谷胱甘肽含量的方法(參照例如專利文獻(xiàn)I)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :特開昭59-151894號公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題為了能夠更低成本且高效率地工業(yè)上量產(chǎn)谷胱甘肽本身、富含谷胱甘肽的酵母提取物等，利用谷胱甘肽含量高的酵母是重要的。如專利文獻(xiàn)I所述的方法，通過從進(jìn)行突變處理等而實(shí)施了遺傳修飾的酵母中篩選谷胱甘肽含量更高的酵母的方法，雖然能夠獲得富含谷胱甘肽的酵母，但是突變處理以及篩選需要時(shí)間和勞力，此外，很多情況下未必能夠得到富含谷胱甘肽的酵母。此外，有些情況下，與重組體相比，更需要天然酵母(野生株)，因而希望開發(fā)不進(jìn)行突變處理、而提高酵母中的谷胱甘肽含量的方法。例如，在將酵母本身、酵母提取物用于食用的情況下，有些情況下野生株比重組體更為理想。本發(fā)明的目的是提供能夠不實(shí)施遺傳修飾而提高菌體中的谷胱甘肽含量的酵母的培養(yǎng)方法。解決問題的方法本發(fā)明人對上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)酵母屬菌等的酵母時(shí)，通過在液體培養(yǎng)基中添加一定量以上的檸檬酸，能夠提高該酵母的谷胱甘肽含量，從而完成了本發(fā)明。
S卩，本發(fā)明提供(I) 一種酵母培養(yǎng)方法,其包括將酵母在朽1檬酸濃度為20mM以上的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。(2)上述(I)所述的酵母培養(yǎng)方法，其中，所述液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度為200mM以下。(3)上述⑴或⑵所述的酵母培養(yǎng)方法,其中，培養(yǎng)開始時(shí)的液體培養(yǎng)基的朽1檬酸濃度為20mM以上。(4)上述(I)所述的酵母培養(yǎng)方法，其中，培養(yǎng)開始時(shí)的液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度為小于20mM，且包括在酵母的生長狀態(tài)為延滯期或?qū)?shù)生長期時(shí)，將液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度調(diào)整至2(T200mM。(5)上述(I)所述的酵母培養(yǎng)方法,其中，培養(yǎng)開始時(shí)的液體培養(yǎng)基的朽1檬酸濃度為小于20mM，且包括在培養(yǎng)開始后9小時(shí)以內(nèi)將液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度調(diào)整至20 200mM。(6)上述(1) (5)中任一項(xiàng)所述的酵母培養(yǎng)方法，其中，所述酵母為酵母屬(Saccharomyces)菌或假絲酵母屬(Candida)菌。(7)上述(1Γ(5)中任一項(xiàng)所述的酵母培養(yǎng)方法，其中，所述酵母為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或產(chǎn)I元假絲酵母(Candida utilis)。(8)提高酵母的谷胱甘肽含量的方法，其包括將酵母在檸檬酸濃度為20mM以上的
液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。(9)酵母的制造方法，其包括回收采用上述(1Γ(7)中任一項(xiàng)所述的酵母培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)而得到的酵母。(10)酵母提取物的制造方法，其包括從采用上述(1Γ(7)中任一項(xiàng)所述的酵母培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)而得到的酵母抽提酵母提取物。(11)飲食品的制造方法，其包括使用選自下組中的I種以上的制造物作為原料采用上述(I廣(7)中任一項(xiàng)所述的酵母的培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的酵母、以及從所述酵母制備得到的酵母提取物。(12)酵母提取物，其是從采用上述(1Γ(7)中任一項(xiàng)所述的酵母培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)而得到的酵母制備的。
(13)調(diào)味料組合物，其含有采用上述(1Γ(7)中任一項(xiàng)所述的酵母培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)而得到的酵母或上述(12)所述的酵母提取物。(14)飲食品，其含有采用上述(1Γ(7)中任一項(xiàng)所述的酵母培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)而得到的酵母或上述(12)所述的酵母提取物。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法，通過在含充分量的檸檬酸的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)這樣的簡單步驟，能夠增大酵母屬菌等酵母的谷胱甘肽含量。此外，采用該培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的酵母的谷胱甘肽含量充分高，因而通過使用該酵母，能夠簡便地得到高谷胱甘肽含量的酵母提取物或飲食品。


[圖I]顯示實(shí)施例I中液體培養(yǎng)基中每個(gè)檸檬酸濃度下的GSH含有率(%)的曲線圖。[圖2Α]顯示實(shí)施例2中在糖蜜培養(yǎng)基(I)中添加的每個(gè)檸檬酸濃度下各培養(yǎng)物的GSH含有率(%)的曲線圖。[圖2Β]顯示實(shí)施例2中在糖蜜培養(yǎng)基(I)中添加的每個(gè)檸檬酸濃度下培養(yǎng)結(jié)束時(shí)間點(diǎn)的液體培養(yǎng)基的ρΗ(終pH)的曲線圖。[圖3A]顯示實(shí)施例5中釀酒酵母KK122株的GSH含有率以及0D_的測定結(jié)果的圖。[圖3B]顯示實(shí)施例5中釀酒酵母KK124株的GSH含有率以及0D_的測定結(jié)果的圖。[圖4]顯示實(shí)施例11中各樣品中的酵母的GSH含有率(%)的測定結(jié)果的圖。[圖5]顯示參考例I中培養(yǎng)前后的各上清中的檸檬酸含量的測定結(jié)果的圖。發(fā)明的
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明以及本申請說明書中，如無特別說明，谷胱甘肽是指氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽這兩者，總谷胱甘肽含量是指氧化型谷胱甘肽以及還原型谷胱甘肽的合計(jì)含量。在本發(fā)明以及申請說明書中，單位酵母干燥菌體重量的谷胱甘肽含量可以采用在對微生物中的谷胱甘肽含量進(jìn)行定量時(shí)常規(guī)進(jìn)行的方法求出。例如，單位酵母干燥菌體重量的總谷胱甘肽含量可以采用Titze等的方法(Analytical Biochemistry, Vol. 27、p502、1969)來測定。該方法是利用在5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)被煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸還原型(NADPH)還原的反應(yīng)中，該反應(yīng)的反應(yīng)速度與谷胱甘肽存在量成比例，來測定谷胱甘肽量的方法。本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法以將酵母在檸檬酸濃度為20mM以上的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)為特征。通過使用該培養(yǎng)方法培養(yǎng)酵母，能夠提高酵母的谷胱甘肽含量，能夠得到富含谷胱甘肽的酵母(谷胱甘肽含量高的酵母)。能夠得到這樣的谷胱甘肽富含效果(提高酵母的谷胱甘肽含量的效果)的理由不明。但如后面的實(shí)施例3所示，將其他酸添加至液體培養(yǎng)基時(shí)觀察不到該效果，且即使在PH控制環(huán)境下通過檸檬酸的添加也能夠得到該效果，可以推斷這不是簡單的液體培養(yǎng)基的PH調(diào)整效應(yīng)，而是由于檸檬酸特有的某種作用，促進(jìn)了谷胱甘肽的產(chǎn)生、或者抑制了谷胱甘肽向菌體外的排出，從而谷胱甘肽在酵母菌體內(nèi)蓄積。本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法的I個(gè)方面是富含谷胱甘肽的酵母的制造方法，該富含谷胱甘肽的酵母的制造方法包括通過將酵母在檸檬酸濃度為20mM以上的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到含所述酵母的培養(yǎng)物，以及從所述培養(yǎng)物中回收所述酵母。本發(fā)明的富含谷胱甘肽的酵母，是指與親本株相比較，菌體內(nèi)的谷胱甘肽含量顯著增加的酵母。此外，培養(yǎng)物是指包含酵母菌體以及用于培養(yǎng)酵母的培養(yǎng)基的培養(yǎng)物?？捎糜诒景l(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法的酵母沒有特殊限制，優(yōu)選酵母屬菌或假絲酵母屬菌?？梢允褂美玑劸平湍?Saccharomyces cerevisiae)、奇異酵母(Saccharomycesparadoxus)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces mikatae)、貝酵母(Saccharomyces bayanus)、庫德里阿茲威酵母(Saccharomyces kudriavzevii)、產(chǎn)I元假絲酵母(Candida utilis)、熱 帶假絲酵母(Candida tropicalis)、解脂假絲酵母(Candida lypolitica)、以及清酒假絲酵母(Candida sake)等。在本發(fā)明中，優(yōu)選用于釀酒酵母或產(chǎn)朊假絲酵母的培養(yǎng)，因?yàn)槟軌蛉〉锰貏e良好的谷胱甘肽富含效果。本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法不僅在培養(yǎng)野生株(天然的酵母)的情況下，在培養(yǎng)通過突變處理得到的突變株的情況下，也能夠得到谷胱甘肽富含效果。而且，在本發(fā)明以及申請說明書中，“野生株”是指自然界本來存在的酵母、即未對基因?qū)嵤┤斯ね蛔兲幚淼慕湍?。與此相對，“突變株”是指對基因?qū)嵤┤斯ね蛔兲幚矶玫降慕湍?。而且，在本發(fā)明中，對突變處理沒有特殊限制，是能夠使酵母等生物所具有的基因的一部分發(fā)生突變的處理即可，可以使用在制作酵母等微生物的突變株時(shí)通常采用的任何方法。例如，通過使用紫外線、電離放射線、亞硝酸、亞硝基胍、甲基磺酸乙酯(Ethylmethanesulufonate,以下簡稱EMS)等作為突變原對酵母進(jìn)行處理，可以對酵母進(jìn)行突變處理。本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法中使用的液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度可以是20mM以上。通過檸檬酸濃度為20mM以上，能夠使得對實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽富含效果而言充分量的檸檬酸與酵母作用。在本發(fā)明中，液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度優(yōu)選2(T200mM，更優(yōu)選2(Tl20mM，更優(yōu)選2(Tl00mM，特別優(yōu)選5(Tl00mM。在液體培養(yǎng)基中添加過量的檸檬酸的情況下，不但不能期待谷胱甘肽富含效果，還會存在抑制酵母的生長性等隱患，通過使液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度為200mM以下，能夠在抑制對酵母的生長性的影響的同時(shí)，得到充分的谷胱甘肽富含效果。而且，在不對液體培養(yǎng)基的pH進(jìn)行控制的條件進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，即使在添加檸檬酸以外的酸的情況下，與未添加的液體培養(yǎng)基相比，谷胱甘肽含量也稍稍升高?？梢酝茰y這是因?yàn)橥ㄟ^酸的添加引起的緩沖作用，液體培養(yǎng)基的PH得到調(diào)整所致。即，在不控制pH的情況下，液體培養(yǎng)基中添加的檸檬酸的一部分被用于液體培養(yǎng)基的PH控制。因此，存在這樣的傾向，即獲得同等程度的谷胱甘肽富含效果所必需的液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度，在不控制PH的培養(yǎng)條件下比控制pH的培養(yǎng)條件下更高。因此，在不控制液體培養(yǎng)基的pH的情況下，本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法中，優(yōu)選以液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度6(TlIOmM培養(yǎng)酵母。更優(yōu)選以75、0mM培養(yǎng)酵母。另一方面，在將液體培養(yǎng)基的pH控制在4. (Γ6. O的情況下，本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法中，優(yōu)選以液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度2(Tl00mM培養(yǎng)酵母，更優(yōu)選以2(T75mM培養(yǎng)酵母。
在本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法中，可以使用預(yù)先進(jìn)行調(diào)整使得檸檬酸濃度為20mM以上的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母，也可以在培養(yǎng)開始后向液體培養(yǎng)基中添加檸檬酸。即，可以在培養(yǎng)開始時(shí)以20mM以上的液體培養(yǎng)基的朽1檬酸濃度來培養(yǎng)酵母,也可以在培養(yǎng)開始時(shí)以小于20mM的液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度(也包括完全不含檸檬酸的液體培養(yǎng)基)來培養(yǎng)酵母，并在培養(yǎng)開始后將液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度調(diào)整為2(T200mM。在調(diào)整液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度的方法中，可以向液體培養(yǎng)基中添加固體的檸檬酸來進(jìn)行調(diào)整，也可以添加檸檬酸水溶液來進(jìn)行調(diào)整。在酵母屬、假絲酵母屬的酵母、特別是酵母屬的許多菌株中，存在向液體培養(yǎng)基中添加檸檬酸的時(shí)期越早就能夠獲得越高的富含谷胱甘肽效果的傾向。通過對出芽繁盛狀態(tài)的酵母作用充分濃度的檸檬酸，可以充分發(fā)揮谷胱甘肽富含效果。因此，在培養(yǎng)開始后調(diào)整液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度的情況下，優(yōu)選在進(jìn)入平臺期之前、即酵母的生長狀態(tài)為延滯期或?qū)?shù)生長期，優(yōu)選培養(yǎng)開始后至對數(shù)生長期的中期之間，更優(yōu)選培養(yǎng)開始后至對數(shù)生長期的前期之間進(jìn)行調(diào)整。
而且，對數(shù)生長期是指在分批以及流加培養(yǎng)中，在以吸光度等作為指標(biāo)隨時(shí)間測定培養(yǎng)容器中的酵母的量的情況下，觀察到對數(shù)增大的時(shí)期。另一方面，在連續(xù)培養(yǎng)中，是指可以觀察到培養(yǎng)容器中的酵母的量基本上一定的時(shí)期。在分批以及流加培養(yǎng)中，延滯期是指培養(yǎng)開始后至對數(shù)生長期前的時(shí)期。另一方面，在連續(xù)培養(yǎng)中，是指直至將作為目標(biāo)的參數(shù)控制在一定值時(shí)為止的時(shí)期。例如，通過在培養(yǎng)開始后9小時(shí)以內(nèi)、優(yōu)選3小時(shí)以內(nèi)調(diào)整液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度，能夠使出芽繁盛狀態(tài)的酵母與充分濃度的檸檬酸進(jìn)行作用。作為可用于本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法的液體培養(yǎng)基，可以使用在酵母能夠增殖的液體培養(yǎng)基中、適宜添加朽1檬酸使得朽1檬酸濃度為20mM以上而得到的培養(yǎng)基。作為被添加檸檬酸的液體培養(yǎng)基，還可以使用任何包含碳源、氮源、以及無機(jī)鹽等的、通?？捎糜卺劸平湍傅冉湍傅呐囵B(yǎng)的培養(yǎng)基。作為液體培養(yǎng)基中含有的碳源，可以使用例如選自通常的微生物培養(yǎng)中利用的葡萄糖、蔗糖、醋酸、乙醇、糖蜜、以及亞硫酸鹽紙漿廢液等中的I或2種以上的物質(zhì)。此外，作為氮源，可以是含氮無機(jī)鹽，也可以是含氮有機(jī)物?？梢允褂美邕x自尿素、氨、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、玉米漿(CSL)、酪蛋白、酵母提取物、以及蛋白胨等中的I或2種以上的物質(zhì)。此外，作為無機(jī)鹽，可以使用過磷酸石灰、磷酸銨等磷酸成分、氯化鉀、氫氧化鉀等鉀成分、以及硫酸鎂、氯化鎂等鎂成分等。此外，還可以使用鋅、銅、錳、以及鐵離子等的無機(jī)鹽。而且，本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法中使用的液體培養(yǎng)基中可以適宜添加維生素、以及核酸相關(guān)物質(zhì)等。作為本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法中使用的液體培養(yǎng)基，可以是SD培養(yǎng)基等合成培養(yǎng)基，也可以是YPD培養(yǎng)基、糖蜜培養(yǎng)基等半合成培養(yǎng)基。此外，也可以是諸如糖蜜培養(yǎng)基這樣的本來就含有少量檸檬酸的培養(yǎng)基。而且，也可以是對這些培養(yǎng)基進(jìn)行改變而得到的培養(yǎng)基。而且，糖蜜培養(yǎng)基(糖濃度3%)因批次等而含量存在差異，但一般而言，總有機(jī)酸濃度為廣3. 5g/L左右，檸檬酸濃度為5(T400mg/L。即，根據(jù)檸檬酸的分子量是192，可以計(jì)算出酵母的培養(yǎng)中使用的糖蜜培養(yǎng)基通常含有O. 2^2mM的檸檬酸。而且，已知在培養(yǎng)酵母時(shí)，可以使用檸檬酸作為碳源。但是，由于檸檬酸會影響培養(yǎng)基的pH,所以一般而言不會向培養(yǎng)基中積極地添加朽1檬酸(例如添加IOmM以上的朽1檬酸)。而且，如后面的參考例I所不，培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)基中的朽1檬酸量比培養(yǎng)前的大，這表明在本發(fā)明中，液體培養(yǎng)基中添加的檸檬酸未被用作碳源。而且，通過在液體培養(yǎng)基中添加檸檬酸，酵母中的谷胱甘肽含量增大，這是本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)的。對培養(yǎng)形式無特殊限制，只要使用液體培養(yǎng)基即可，可以在考慮培養(yǎng)規(guī)模、以及所得培養(yǎng)物的使用用途等的基礎(chǔ)上，適宜確定。作為液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)形式，可以列舉出例如分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)以及連續(xù)培養(yǎng)等。對本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法的培養(yǎng)條件無特殊限制，只要使用含指定濃度的檸檬酸的液體培養(yǎng)基即可，可以采用培養(yǎng)酵母時(shí)一般采用的條件進(jìn)行培養(yǎng)。例如，培養(yǎng)溫度優(yōu)選2(T40°C，更優(yōu)選25 35°C。此外，培養(yǎng)基的pH優(yōu)選3. 5 8. O,更優(yōu)選4. 0 6. O。特別是在工業(yè)量產(chǎn)培養(yǎng)物的情況下，優(yōu)選對培養(yǎng)基中的PH進(jìn)行定期測定，并進(jìn)行調(diào)整使得維持 ρΗ4· 0 6· O。此外，優(yōu)選一邊進(jìn)行通氣以及攪拌，一邊進(jìn)行培養(yǎng)。通氣的量和攪拌的條件可以在考慮培養(yǎng)的容量和時(shí)間、以及菌的初始濃度的基礎(chǔ)上，適宜確定。例如，通氣可以以O(shè). 2 TLV. Μ.(體積每體積每分鐘)左右、攪拌可以以5(T800rpm左右來進(jìn)行。通過本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法，能夠培養(yǎng)谷胱甘肽含量高的酵母。例如，通過采用本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，與用檸檬酸濃度小于20mM的液體培養(yǎng)基(包括完全不含檸檬酸的液體培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)的情況相比，可以使干燥酵母菌體中所含的谷胱甘肽含量增大10%以上。而且，干燥菌體重量是指將菌體干燥后的重量。在求出干燥后的菌體重量的方法中，例如，首先通過對酵母的培養(yǎng)物進(jìn)行離心分離處理，將菌體作為沉淀回收。將回收的菌體通過離心分離操作水洗2次后，測定105°C干燥5小時(shí)后的重量，從而求出干燥菌體重量。S卩，通過本發(fā)明的包括將酵母在檸檬酸濃度為20mM以上的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的酵母的培養(yǎng)方法，能夠獲得含富含谷胱甘肽的酵母的培養(yǎng)物，并能夠采用公知方法從所述培養(yǎng)物回收所述酵母。對從所述培養(yǎng)物回收酵母的方法無特殊限制，可以采用從酵母的培養(yǎng)物回收酵母時(shí)通常使用的任何回收方法。作為從所述培養(yǎng)物回收酵母的方法，可以列舉出例如對酵母的培養(yǎng)物進(jìn)行離心分離處理的方法等。通過從采用本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法得到的培養(yǎng)物回收酵母，可以制造谷胱甘肽含量非常高的酵母。此外，本發(fā)明的酵母提取物可以通過從采用本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的酵母抽提酵母提取物來制備。因此，可以從采用本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法制造的酵母制備谷胱甘肽含量高的酵母提取物，從而進(jìn)行制造。如前述，谷胱甘肽是具有各種生理活性的物質(zhì)。即，僅僅通過應(yīng)用本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，就可以制造附加價(jià)值高于傳統(tǒng)的酵母、酵母提取物。對來自采用本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的酵母的酵母提取物的制備無特殊限制，可以采用在制備酵母提取物時(shí)通常使用的任何制備方法。作為所述制備方法，有例如利用酵母菌體內(nèi)本來具有的蛋白質(zhì)分解酶等對菌體進(jìn)行可溶化的自溶法，添加微生物、植物來源的酶制劑將菌體可溶化的酶分解法，通過在熱水中浸潰一定時(shí)間使菌體可溶化的熱水抽提法，添加各種酸或者堿使菌體可溶化的酸堿分解法，通過進(jìn)行I次以上的凍結(jié)以及融解來破碎菌體的凍融法，以及通過物理刺激來破碎菌體的物理破碎法等。作為物理破碎法中使用的物理刺激，有例如超聲波處理、高壓下的勻漿、以及通過與玻璃珠等固形物混合來進(jìn)行磨碎等。此外，通過將采用本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法得到的培養(yǎng)物進(jìn)行干燥處理，能夠得到谷胱甘肽含量高的干燥酵母菌體。對于對所述培養(yǎng)物進(jìn)行干燥處理的方法無特殊限制，可以采用在制備干燥酵母菌體時(shí)通常使用的任何制備方法。作為所述制備方法，有例如凍干法、噴霧干燥法、以及滾筒干燥法等。而且，通過將所得干燥酵母菌體加工成粉末狀，能夠得到可操作性良好的谷胱甘肽含量高的干燥酵母菌末。此外，可以從采用本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法得到的培養(yǎng)物獲得含有谷胱甘肽的分級物。作為從培養(yǎng)物對含有谷胱甘肽的分級物進(jìn)行分級的方法，可以采用通常使用的方法中的任何方法。例如，通過將采用熱水抽提或菌體破碎抽提等得到的抽提物，用加載有與含硫化合物之間的親和性高的物質(zhì)的親和柱進(jìn)行分級，能夠濃縮純化至高濃度含有谷胱甘肽 的級分。采用本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法得到的富含谷胱甘肽的酵母、所述酵母的干燥酵母菌體、從所述酵母制備的酵母提取物、以及所述酵母提取物粉末可以作為調(diào)味料組合物。而且，所述調(diào)味料組合物可以僅由本發(fā)明的酵母提取物等組成，也可以除了本發(fā)明的酵母提取物等之外，還含有穩(wěn)定劑、以及防腐劑等其他成分。所述調(diào)味料組合物可以像其他調(diào)味料組合物那樣，適宜用于各種飲食品。而且，采用本發(fā)明的酵母的培養(yǎng)方法得到的富含谷胱甘肽的酵母、所述酵母的干燥酵母菌體、從所述酵母制備的酵母提取物、以及所述酵母提取物粉末可以作為原料直接包含在飲食品中。由此，能夠有效率地制造高濃度含有谷胱甘肽的飲食品。作為這些飲食品，可以是通常能夠添加干燥酵母、酵母提取物、以及包含它們的調(diào)味料組合物的飲食品，可以列舉出例如酒精飲料、清涼飲料、發(fā)酵食品、調(diào)味料、湯類、面包類、以及點(diǎn)心類等。此夕卜，所述培養(yǎng)物等還可以通過加工成軟膠囊劑、硬膠囊劑以及片劑等，而作為滋補(bǔ)品等被攝取食用。具體地，在飲食品的制造步驟中，通過像其他原料那樣添加上述富含谷胱甘肽的酵母、所述酵母的干燥酵母菌體、從所述酵母制備的酵母提取物、以及所述酵母提取物粉末等，能夠制造聞濃度含有谷胱;甘妝的飲食品。
實(shí)施例下面給出實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但本發(fā)明不受以下實(shí)施例的限定。而且，以下實(shí)施例中，有些情況下也將“單位干燥菌體重量的總谷胱甘肽含量(％(w/w)) ”說成“ GSH含有率(%)”。此外，在以下實(shí)施例所使用的酵母中，釀酒酵母YNN27株、釀酒酵母BY4742株、釀酒酵母NCYC506株、以及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) JCM1846株為野生株。釀酒酵母AB9 株〈MATa/ a gpi 10/gpi 10ura3/URA31eu2/LEU2> 是編碼 α 1，2_ 甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的基因具有突變，向培養(yǎng)基中釋放甘露聚糖蛋白質(zhì)的突變株(參照例如國際公開2006/025295號小冊子)。釀酒酵母AB9株保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(茨城縣筑波市東1-1-1)(保藏號FERM BP-10390)(原保藏的保藏日2004年7月13日、國際保藏移交日2005年8月3日)。釀酒酵母AB13株是如下獲得的富含谷胱甘肽突變株。首先，對釀酒酵母的野生株進(jìn)行EMS處理，從所得突變株中選擇出谷胱甘肽含量高于親本株的突變株。然后，對該選擇出的突變株進(jìn)行EMS處理，從所得突變株中選擇出谷胱甘肽含量高于親本株的突變株。通過將該步驟重復(fù)2次以上，得到了釀酒酵母AB13、KKlOl株、KK122株、以及KK124株。此外，以下的實(shí)施例中用于酵母的培養(yǎng)的半合成培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、SD培養(yǎng)基、以及糖蜜培養(yǎng)基{(I)、(2)}的組成、向其中添加的痕量元素以及維生素溶液的組成分別如表Γ7所示。[表 I]
權(quán)利要求
1.一種酵母培養(yǎng)方法,其包括將酵母在朽1檬酸濃度為20mM以上的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
2.權(quán)利要求I所述的酵母培養(yǎng)方法，其中，所述液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度為200mM以下。
3.權(quán)利要求I或2所述的酵母培養(yǎng)方法，其中，培養(yǎng)開始時(shí)的液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度為20mM以上。
4.權(quán)利要求I所述的酵母培養(yǎng)方法，其中，培養(yǎng)開始時(shí)的液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度為小于20mM，且包括在酵母的生長狀態(tài)為延滯期或?qū)?shù)生長期時(shí)將液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度調(diào)整至2(T200mM。
5.權(quán)利要求I所述的酵母培養(yǎng)方法，其中，培養(yǎng)開始時(shí)的液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度為小于20mM，且包括在培養(yǎng)開始后9小時(shí)以內(nèi)將液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度調(diào)整至2(T200mM。
6.權(quán)利要求廣5中任一項(xiàng)所述的酵母培養(yǎng)方法，其中，所述酵母是酵母屬(Saccharomyces)菌或假絲酵母屬(Candida)菌。
7.權(quán)利要求廣5中任一項(xiàng)所述的酵母培養(yǎng)方法，其中，所述酵母是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或產(chǎn)I元假絲酵母(Candida utilis)。
8.提高酵母的谷胱甘肽含量的方法，其包括將酵母在檸檬酸濃度為20mM以上的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
9.酵母的制造方法，其包括回收采用權(quán)利要求廣7中任一項(xiàng)所述的酵母培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)而得到的酵母。
10.酵母提取物的制造方法，其包括從采用權(quán)利要求廣7中任一項(xiàng)所述的酵母培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)而得到的酵母抽提酵母提取物。
11.飲食品的制造方法，其包括使用選自下組中的I種以上的制備物作為原料采用權(quán)利要求Γ7中任一項(xiàng)所述的酵母培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)而得到的酵母，以及從所述酵母制備得到的酵母提取物。
12.酵母提取物，其是從采用權(quán)利要求Γ7中任一項(xiàng)所述的酵母培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)而得到的酵母制備的。
13.調(diào)味料組合物，其含有采用權(quán)利要求Γ7中任一項(xiàng)所述的酵母培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)而得到的酵母、或權(quán)利要求12所述的酵母提取物。
14.飲食品，其含有采用權(quán)利要求Γ7中任一項(xiàng)所述的酵母培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)而得到的酵母、或權(quán)利要求12所述的酵母提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及包括將酵母在檸檬酸濃度為20mM以上的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的酵母培養(yǎng)方法；培養(yǎng)開始時(shí)的液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度為小于20mM，且包括在酵母的生長狀態(tài)為延滯期或?qū)?shù)生長期時(shí)將液體培養(yǎng)基的檸檬酸濃度調(diào)整至20～200mM的前述酵母培養(yǎng)方法；以及包括前述任一項(xiàng)所述的酵母的培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的酵母抽提酵母提取物的酵母提取物的制造方法；包括使用選自前述中任一項(xiàng)所述的酵母的培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的酵母、以及從所述酵母制備得到的酵母提取物中的1種以上的制造物作為原料的飲食品的制造方法。根據(jù)本發(fā)明，提供能夠不實(shí)施遺傳修飾而提高菌體中的谷胱甘肽含量的酵母的培養(yǎng)方法。
文檔編號A23L1/28GK102812119SQ20118001351
公開日2012年12月5日 申請日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者田中美和, 川島健司 申請人:朝日集團(tuán)控股株式會社