專利名稱：用于等溫核酸擴增的材料和方法
用于等溫核酸擴增的材料和方法對相關申請的引用本申請要求2010年I月8日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/293，372的優(yōu)先權，通過提及而將其完整收入本文。
背景技術：
核酸擴增廣泛用于研究、法醫(yī)學、醫(yī)學和農(nóng)業(yè)。聚合酶鏈式反應(PCR)是用于體外DNA擴增的最廣泛使用的方法。PCR反應通常利用與靶序列的5’和3’邊界雜交的兩種寡核苷酸引物和通過聚合脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)延伸退火引物以生成雙鏈產(chǎn)物的DNA依賴性DNA聚合酶。通過提高和降低反應混合物的溫度(稱為熱循環(huán))，DNA產(chǎn)物的兩條鏈被分開，并且可以充當下一輪退火和延伸的模板，并且重復該過程。在過去幾年中，已經(jīng)開發(fā)出不依賴于熱循環(huán)的其它核酸擴增方法。這些方法由于 它們不依賴于運行溫度變化的重復循環(huán)的實情而寬泛地分類為“等溫靶物擴增”。一個此類例子是解旋酶依賴性擴增(HDA)。在體內(nèi)，聚合酶借助于多種輔助蛋白質擴增核酸。一種此類輔助蛋白質稱作“解旋酶”，其共享將核酸的雙重鏈分成單鏈，然后，其可接近聚合酶進行擴增的共同特征。HAD通過利用解旋酶生成單鏈模板以進行引物雜交及隨后聚合酶的引物延伸在體外模擬此通用方案。通過對反應混合物添加解旋酶，可以在不需要重復熔解和將引物再退火至模板的情況下繼續(xù)擴增的重復輪次。因而，可以避免昂貴的熱循環(huán)裝置或乏味的手動熱循環(huán)。另外，HAD通過具有單一反應方案并且是整個過程可以于一個溫度實施的真正等溫反應提供與其它等溫DNA擴增相比的幾個優(yōu)點。一種PCR變型(稱作逆轉錄酶PCR(RT-PCR))通常用于測量基因表達、分析樣品中的RNA、和合成經(jīng)修飾的互補cDNA探針、等等。在典型的方案中，具有逆轉錄酶活性的酶使用RNA模板生成互補的DNA鏈(cDNA)，然后經(jīng)由PCR將其擴增。HAD也可以用于擴增cDNA，在該情況中該過程稱作逆轉錄酶HDA(RT-HDA)。在任一種情況中，每種活性通常使用不同酶逆轉錄酶用于生成cDNA ；DNA依賴性DNA聚合酶用于擴增cDNA ;而在HAD的情況中，解旋酶用于生成單鏈模板。不幸地，酶逆轉錄酶可以是高度易錯的，因為它們通常不擁有校對能力。此外，對反應混合物添加的每種酶增加不同最佳溫度、反應條件、試劑等的潛在必要性。如此，尋找生成大量高保真性DNA的一組酶和一組條件經(jīng)常是困難的任務。一種簡化此任務的方式是減少牽涉的酶的數(shù)目。發(fā)明概述本文中公開了使用具有逆轉錄酶活性和DNA依賴性DNA聚合酶活性兩者的酶實施靶核酸等溫擴增的材料和方法。一方面涉及使用具有解旋酶活性的第一酶和具有逆轉錄酶和DNA依賴性DNA聚合酶活性兩者的第二酶等溫擴增靶核酸的方法。另一方面涉及使用具有解旋酶活性的第一酶和具有逆轉錄酶和DNA依賴性DNA聚合酶活性兩者的第二酶等溫擴增靶RNA的的方法。另一方面涉及使用具有切口誘導活性的第一酶和具有逆轉錄酶和DNA依賴性DNA聚合酶活性兩者的第二酶等溫擴增靶RNA的方法。另一方面涉及使用具有解旋酶活性的第一酶和具有逆轉錄酶活性和DNA依賴性DNA聚合酶活性兩者的第二酶的RT-HAD的方法。另一方面涉及鑒定樣品中人乳頭瘤病毒(HPV)的存在的方法，包括通過使用具有解旋酶活性的第一酶和具有逆轉錄酶和DNA依賴性DNA聚合酶活性兩者的第二酶檢測HPV的核酸序列。又一方面涉及用于等溫擴增靶核酸的試劑盒，其包含具有解旋酶活性的第一酶和具有逆轉錄酶和DNA依賴性DNA聚合酶活性兩者的第二酶。在另一方面，提供了用于等溫擴增靶RNA的試劑盒，其包含具有解旋酶活性的酶和具有逆轉錄酶和DNA依賴性DNA聚合酶活性兩者的酶，并且不包含具有DNA依賴性DNA
聚合酶活性的任何其它酶。另一方面涉及用于RT-HAD的試劑盒，其中用具有逆轉錄酶活性和DNA依賴性DNA聚合酶活性的酶替換具有逆轉錄酶活性的酶或具有聚合酶活性的酶，或這兩者。另一方面涉及用于測定樣品中至少一種人乳頭瘤病毒(HPV)的存在和/或豐度的試劑盒，其包含具有解旋酶活性的第一酶和具有逆轉錄酶和DNA依賴性DNA聚合酶活性兩者的第二酶。附圖
簡述圖I顯示了 PYROPHAGE 3173在一步RT-HAD中與在存在Bst聚合酶的情況下的其它逆轉錄酶一樣有效。利用Bst聚合酶(2U)和uvrD解旋酶(IU)在25 μ I中實施擴增75分鐘。使用CtRNA作為靶物。對10和100個RNA拷貝給出Thermoscript、Thermo-X,Transcriptor 和 PYROPHAGE 的測定信號(Luminex MFI)。圖2顯示了 PYROPHAGE 3173酶在一步等溫RT-HAD中可以作為逆轉錄酶和DNA依賴性DNA聚合酶運行。在25 μ L中實施擴增75分鐘。反應混合物含有具有Bst (標記為Bst+的柱形)或沒有添加的Bst聚合酶(標記為Bst-的柱形)的PYROPHAGE 3173 (2. 5U)。使用Ct RNA(25或100個拷貝)作為靶物。在Luminex上實施檢測，并且結果以信號/噪
音呈現(xiàn)。圖3顯示了在沒有Bst聚合酶的情況下使用THERM0-X、THERM0SCRIPT、TRANSCRIPT0R、和PYROPHAGE 3173的RT-HAD反應。反應條件與圖2中所描述相同。圖4顯示了 PYROPHAGE 3173酶可以在沒有Bst的情況下擴增DNA。在50 μ L中實施擴增90分鐘。反應含有PYROPHAGE 3173 (5U)或Bst聚合酶(20U)。使用HPV16DNA作為具有堿變性的標準tHDA測定法的靶物。在Luminex上實施檢測，并且結果以信號/噪音呈現(xiàn)。圖5顯示了擴增兩種HPV 16RNA靶物的RT-HAD反應的信噪比(signal overnoise, S / N)。每個柱形代表用多個引物濃度擴增后兩種靶物中每種的S / N(y-軸)。在X軸上標示引物濃度和擴增的靶物。發(fā)明詳述在一方面,通過具有逆轉錄酶活性和DNA依賴性DNA聚合酶活性兩者的酶實現(xiàn)靶核酸的擴增。作為使用DNA依賴性DNA聚合酶和/或逆轉錄酶的替代或者在使用DNA依賴性DNA聚合酶和/或逆轉錄酶外,使用具有雙重活性的這種酶。
如本文中所使用的，“核酸”指雙鏈(ds)或單鏈(ss) DNA、RNA分子或DNA-RNA雜合物。雙鏈核酸分子可以是有切口的或完整的。雙鏈或單鏈核酸分子可以是線性或環(huán)形的。雙鏈體可以是平端的或者具有單鏈尾部。單鏈分子可以具有發(fā)夾或環(huán)和莖形式的二級結構。核酸可以從多種來源，包括環(huán)境、食物、農(nóng)業(yè)、發(fā)酵、生物流體諸如血液、奶、腦脊液、痰、唾液、糞、肺吸出物、粘膜組織的拭子或組織樣品或細胞分離。核酸樣品可以自細胞、細菌或病毒獲得，并且可以包括下列任一種染色體DNA、染色體外DNA，包括質粒DNA、重組DNA、DNA片段、信使RNA、轉移RNA、核糖體RNA、雙鏈RNA或存在于細胞、細菌或病毒中的其它RNA。核酸可以分離、克隆或依靠化學合成在體外合成。任何上文所描述的核酸可以進行修飾，其中將核酸內(nèi)的各個核苷酸化學改變(例如，通過甲基化進行)。修飾可以天然出現(xiàn)或者通過體外合成進行。術語“雙鏈體”指整個或部分雙鏈的核酸分子。如本文中所使用的，術語“靶核酸”指意圖進行擴增的任何核酸序列。要擴增的靶核酸的大小可以例如，在約50bp至約IOOkb的范圍中，包括高于100至5000bp的范圍。靶核酸可以包含在較長的雙鏈或單鏈核酸內(nèi)。或者，靶核酸可以是整條雙鏈或單鏈核酸。在一個實施方案中，具有逆轉錄酶和DNA依賴性DNA聚合酶活性兩者的酶是 PYROPHAGE 3173。PYROPHAGE 3173記載于美國專利申請No. 12/089，221 (以美國專利申請公開文本No. 2008/0268498公布)，將其內(nèi)容完整收錄。PYROPHAGE 3173可獲自LUCIGENCorporation,并且是一種具有導致高保真性擴增的固有3’ 一 5’外切核酸酶(校對)活性的熱穩(wěn)定性噬菌體酶。由于此活性，可以是優(yōu)選的是，使用硫代磷酸酯引物和在擴增前對靶核酸模板和引物的最小暴露?；蛘?，可以使用突變體型式，其中已經(jīng)將3’ 一 5’外切核酸酶活性滅活(PYROPHAGE 3173Exo_突變體)。PYROPHAGE 3173還具有鏈置換活性，其容許貫穿整條雙鏈DNA的DNA合成。它還在切口處有效地啟動，并且因此，可以用引物或在通過位點特異性切口酶引入的切口處啟動DNA合成。PYROPHAGE 3173還具有逆轉錄活性，并且如此可以在RNA模板上運行單管、單酶逆轉錄PCR。由于此雙重活性，PYROPHAGE 3173可以在RT-HAD中作為逆轉錄酶和DNA依賴性DNA聚合酶的替代使用。另外，PYROPHAGE 3173酶的較高熱穩(wěn)定性可以容許較高的RNA擴增率。在一個實施方案中，使用等溫擴增來擴增靶核酸。“等溫擴增”指于單一溫度發(fā)生擴增。這不包括擴增起始時單一的短暫時間段(小于15分鐘)，其可以與擴增規(guī)程于相同溫度或于更高的溫度進行。在一個實施方案中，等溫擴增方法是RT-HAD。傳統(tǒng)上，在RT-HAD中使用三種酶逆轉錄酶、解旋酶、和DNA依賴性DNA聚合酶。逆轉錄酶(又稱為RNA依賴性DNA聚合酶)是一種具有通過聚合脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)將單鏈RNA(ssRNA)轉錄成互補單鏈DNA(cDNA)的DNA聚合酶活性的酶。相同的Pyrophage酶也可以聚合cDNA的“第二條鏈”，生成ds-DNA。這消除在自ss-RNA的ds_DNA合成的傳統(tǒng)過程中使用兩種酶(逆轉錄酶和DNA依賴性DNA聚合酶)。解旋酶具有解開ds-DNA以重復(擴增)ds-DNA的上鏈和下鏈的引物依賴性DNA聚合的酶促活性。然后，DNA依賴性DNA聚合酶通過聚合dNTP將cDNA轉錄成互補的單鏈DNA。此過程自身重復，使得可以在不需要熱循環(huán)的情況中于單一溫度實現(xiàn)指數(shù)擴增。在一個實施方案中，使用提供逆轉錄酶和DNA依賴性DNA聚合酶活性兩者的單一酶實施RT-HDA。如本文中所使用的，“HAD”指解旋酶依賴性擴增，其是一種通過使用解旋酶制備物解開雙鏈核酸以生成擴增模板來擴增核酸的體外方法。如本文中所使用的，“解旋酶”或“有或具有解旋酶活性的酶”指能夠解開雙鏈核酸的任何酶。例如，解旋酶是存在于所有生物體及牽涉核酸的所有過程諸如復制、重組、修復、轉錄、翻譯和RNA剪接中的酶?？梢允褂萌魏谓庑福溲刂鳧NA或RNA以5 ’ 一 3 ’方向或以相反的3’一 5’方向移位。這包括自原核生物、病毒、古細菌(archaea)、和真核生物獲得的解旋酶或天然存在的酶的重組形式及具有規(guī)定活性的類似物或衍生物。天然存在的DNA解旋酶的例子包括大腸桿菌(E. coli)解旋酶I、II、III和IV、Itep、DnaB、PriA、PcrA、T4Gp41解旋酶、T4Dda解旋酶、T7Gp4解旋酶、SV40大T抗原、酵母RAD?？梢允怯杏玫钠渌庑赴≧ecQ解旋酶、來自騰沖嗜熱菌(T. tengcongensis)和極端嗜熱菌(T. thermophilus)的熱穩(wěn)定性UvrD解旋酶、來自水生棲熱菌(T. aquaticus)的熱穩(wěn)定性DnaB解旋酶、和來自古細菌和真核生物體的MCM解旋酶。在另一個實施方案中，解旋酶是一種熱穩(wěn)定性解旋酶?？梢酝ㄟ^在包括例如范圍為45。C至75° C的較高溫度的溫育條件下使用熱穩(wěn)定性解旋酶制備物加速核酸雙鏈體的變性。于較高溫度使用熱穩(wěn)定性解旋酶制備物和熱穩(wěn)定性聚合酶實施HAD可以提高引物 結合的特異性，這可以改善擴增的特異性。在又一個實施方案中，在擴增反應中使用多種不同酶解旋酶。多種解旋酶的使用可以在不同解旋酶協(xié)調(diào)各種功能以提高雙鏈體核酸的解開效率的某些條件下提高HAD中靶物擴增的產(chǎn)率和長度。例如，可以組合具有低的持續(xù)合成能力，但是能夠熔解平端DNA的解旋酶與具有較大持續(xù)合成能力，但是識別在啟動解開的雙鏈體區(qū)邊界的單鏈尾部的第二解旋酶。在此例子中，第一解旋酶最初分開長的核酸雙鏈體的平端，生成5’和3’單鏈尾部，然后由于其有限的持續(xù)合成能力而自所述底物分開。隨后，此部分解開的底物被第二解旋酶識別，然后，所述第二解旋酶以卓越的持續(xù)合成能力繼續(xù)解開過程。這樣，可以通過使用含有多種解旋酶的解旋酶制備物解開核酸雙鏈體中的長的靶物，隨后在HAD反應中擴增。在又一個實施方案中，輔助蛋白包含在反應混合物內(nèi)?！拜o助蛋白”指能夠刺激解旋酶活性的任何蛋白質。例如，大腸桿菌MutL蛋白是一種用于增強UvrD解旋酶活性的輔助蛋白。輔助蛋白與選定的解旋酶一起是有用的。然而，可以在沒有輔助蛋白的情況中通過解旋酶實現(xiàn)核酸的解開。在另一個實施方案中，至少一種單鏈結合蛋白(SSB)包含在反應混合物內(nèi)。中溫解旋酶在存在SSB的情況下顯示改善的活性。在這些情況中，SSB的選擇一般不限于特定的蛋白質。單鏈結合蛋白的例子是T4基因32蛋白、大腸桿菌SSB、T7gp2. 5SSB、噬菌體phi29SSB及這些蛋白質的截短形式。如此，在某些實施方案中，可以對擴增反應添加一種或多種SSB。在又一個實施方案中，提供了至少一種輔因子。“輔因子”指解旋酶解開活性需要的小分子劑。解旋酶輔因子包括核苷三磷酸(NTP)和脫氧核苷三磷酸(dNTP)和鎂(或其它二價陽離子)。例如，ATP (三磷酸腺苷)可以以范圍為O. I至IOOmM,且優(yōu)選地范圍為I至IOmM(例如3mM)的濃度作為UvrD解旋酶輔因子使用。類似地，dTTP (脫氧胸苷三磷酸)可以在范圍I至IOmM (例如3mM)中作為T7Gp4B解旋酶的輔因子使用。在又一個實施方案中，DNA依賴性DNA聚合酶以序列依賴性擴增轉錄cDNA?！靶蛄幸蕾囆院铣伞被颉靶蛄幸蕾囆詳U增”指借助于靶物特異性引物相對于存在于樣品中的非靶序列擴增靶序列。如本文中所使用的，“靶物特異性引物”指能夠結合靶核酸上預先確定的單鏈區(qū)以便于要選擇性擴增的靶核酸的聚合酶依賴性復制的單鏈核酸。在一個實施方案中，使用靶物特異性引物對(一條與靶序列的5’側翼雜交，而另一條與靶物的3’側翼雜交)來實現(xiàn)靶序列的指數(shù)擴增。在另一個實施方案中，可以在單一反應中利用多對靶物特異性引物以在多重反應中使用不同檢測標簽同時擴增多種靶物。通常在單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析及檢測病原體中使用多重化(multiplexing)。一般地，合適的靶物特異性引物對是短的合成的寡核苷酸，例如，其具有10個或更多個核苷酸且小于50個核苷酸的長度。靶物特異性、寡核苷酸引物設計牽涉多種參數(shù)諸如基于串的比對得分、熔解溫度、引物長度和GC含量。在設計靶物特異性引物時，重要的因素之一是選擇靶片段內(nèi)對要擴增的核酸分子特異性的序列。另一個重要的因素是計算反應的靶物特異性引物的熔解溫度。通過所述寡核苷酸的長度和GC含量測定靶物特異性引物的熔解溫度。優(yōu)選地，引物的熔解溫度比會發(fā)生引物雜交和靶物擴增的溫度高約10至
30。Co“弓丨物雜交”指寡核苷酸引物在引物僅特異性結合一條模板鏈上的其互補序列的條件下結合單鏈核酸模板的某個區(qū)域(不是模板中的其它區(qū)域)。可以通過寡核苷酸引物的長度、實施雜交反應的溫度、離子強度、和反應混合物的PH影響雜交的特異性。每條靶物特異性引物與靶核酸的每個末端雜交，并且可以使用靶核苷酸序列作為模板通過聚合酶以3’ 一 5’方向延伸。為了實現(xiàn)特異性擴增，同源的或完全匹配的靶物特異性引物是優(yōu)選的。然而，靶物特異性引物可以包含與靶核苷酸序列不互補的5’端引物。或者，靶物特異性引物在任何部分可以含有與靶核酸不完全互補的核苷酸或序列。靶物特異性引物可以包含任何脫氧核糖核苷酸堿基A、T、G或C和/或一種或多種核糖核苷酸堿基A、C、U、G和/或一種或多種經(jīng)修飾的核苷酸(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，其中該修飾不阻止引物與核酸雜交或靶物特異性引物延長或雙鏈分子變性?？梢杂没瘜W基團諸如硫代磷酸酯或膦酸甲酯或者用非核苷酸接頭修飾靶物特異性引物以增強其性能或者便于表征擴增產(chǎn)物。一般地，適合于容許靶物特異性引物-模板識別的特異性及隨后退火的變性溫度可以存在于某個溫度范圍里，例如0° C至75° C。可以依照為熔解過程選擇的解旋酶選擇優(yōu)選的變性溫度?？梢酝ㄟ^常規(guī)實驗通過改變反應混合物的溫度并使用凝膠電泳比較擴增產(chǎn)物確定用于測定在存在選定的解旋酶的情況中擴增核酸的最佳溫度的測試。靶物特異性引物可以進行修飾，諸如熒光或化學發(fā)光標記、和生物素化(例如，熒光標簽諸如羧基熒光素的胺反應性熒光素酯)。其它標記方法包括放射性同位素、生色團和配體諸如生物素或半抗原，其雖然不直接可檢測，但是可以通過與其特異性結合配偶體，例如分別為親合素和抗體的標記形式反應容易地檢測?？梢允褂么祟愋揎棛z測擴增產(chǎn)物。“熔解”、“解開”、或“變性”指分開核酸雙鏈體的兩條互補鏈的整個或部分。在又一個實施方案中，DNA依賴性DNA聚合酶以不依賴于序列的擴增轉錄cDNA。如本文中所使用的，“不依賴于序列的擴增”指通過不擴增特定序列的DNA依賴性DNA聚、合酶實施的任何擴增。作為例子而非限制，可以使用隨機引物混合物或切口誘導劑來啟動不依賴于序列的擴增。
如本文中所使用的，“隨機引物混合物”指短的隨機生成的寡核苷酸序列的混合物。如本文中所使用的，“切口啟動的聚合酶活性”指由模板中的單鏈斷裂啟動的在沒有外源引物的情況中的聚合酶活性。合成在DNA中的單鏈斷裂處，而不是在外源合成引物的末端啟動。憑借切口啟動的合成，引物的除去是不必要的，這降低成本、加工時間和損失或降解產(chǎn)物的潛力。另外，切口啟動的合成降低由引物的自身延伸引起的假擴增信號。切口可以通過使用在識別序列處產(chǎn)生切口的酶在限定位置處引入，或者可以在靶多核苷酸中隨機引入。如本文中所使用的，“切口誘導劑”指在雙鏈核酸的一條鏈中的兩個相鄰核苷酸間的磷酸二酯鍵中引入斷裂的任何酶促或化學劑或物理處理。切口誘導酶的例子包括BpulOI>BstNB I,Alw I.BbvC I.BbvC I,Bsm I、BsrD、和大腸桿菌內(nèi)切核酸酶I。在一個實施方案中，至少一種切口誘導酶作為解旋酶的替換包含在反應混合物中。在另一個實施方案中，在至少一種解旋酶外，將至少一種切口誘導酶添加至反應混合物。在合適的情況中，其它擴增反應組分可以包括緩沖液、生物分子、鹽、尿素、二甲基亞砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)、鎂、拓撲異構酶、輔助蛋白、變性劑、輔因子、或其混合物。在引物啟動的擴增是期望的時，將引物添加至擴增反應組分。 添加脫氧核糖核苷酸三磷酸dNTP (即，dATP、dGTP、dCTP和dTTP)，其用于建造DNA的新鏈。添加ATP或TTP作為能源。ATP或TTP是高度持續(xù)解旋酶的一種通常優(yōu)選的能源。DNA解旋酶解開I至4個堿基對消耗平均I個ATP分子。為了擴增較長的靶物，與較短的靶物相比，可以消耗更多ATP。在這些情況中，可以期望包括與解旋酶一起使用的基于丙酮酸激酶的ATP再生系統(tǒng)。如此，在某些實施方案中，可以對擴增反應組分添加ATP或TTP或組合或基于丙酮酸激酶的ATP再生系統(tǒng)?？梢栽陂L的HAD反應中使用拓撲異構酶以提高HAD擴增長靶物擴增子的能力。在通過解旋酶分開非常長的線性DNA雙鏈體時，拓撲異構酶的旋轉(松弛)功能消除扭曲并阻止過卷(over-winding)。例如,可以使用大腸桿菌拓撲異構酶I通過將切口引入一條DNA鏈中松弛負超螺旋的DNA。DNA促旋酶(拓撲異構酶II)將瞬時雙鏈斷裂引入DNA中，容許DNA鏈彼此穿過。如此，在某些實施方案中，可以對擴增反應添加拓撲異構酶或促旋酶，或這兩者。在又一個實施方案中，可以通過多種方法，包括溴化乙啶染色和依靠標記物，諸如但不限于放射性標記物、突光標記物、和酶檢測擴增序列來檢測擴增的核酸產(chǎn)物。例如，可以使用突光標記的LUX引物(Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.)(其是設計為具有接近發(fā)夾結構中3’端的熒光團的寡核苷酸)實時檢測HDA擴增的產(chǎn)物。此構型在沒有分開的淬滅模塊的情況中固有地給予熒光淬滅能力。在引物被摻入雙鏈擴增產(chǎn)物中時，將熒光團去淬滅，導致熒光信號的顯著升高。本公開內(nèi)容還涵蓋包含具有解旋酶活性的酶和具有逆轉錄酶活性和DNA依賴性DNA聚合酶活性兩者的酶的試劑盒。試劑盒可以進一步包含擴增反應組分，其選自但不限于下列一種或多種dNTP、ATP、TTP、引物、鎂、拓撲異構酶、SSB蛋白、輔助蛋白、變性劑、聚乙二醇、輔因子、或其混合物。又一個實施方案涉及包含作為等溫擴增靶物的核酸的混合物。核酸靶物可以是ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、RNA-DNA雜合物、或任何上述物質的混合物。包含靶核酸的混合物還包含至少一種具有解旋酶活性的酶和至少一種具有逆轉錄酶活性和DNA依賴性DNA聚合酶活性兩者的酶。包含靶核酸和酶的混合物還可以包含先前所描述的一種或多種擴增反應組分。另一方面是通過所描述的擴增方法獲得的擴增核酸。擴增核酸可以是DNA或RNA。在另一方面，提供了使用等溫逆轉錄酶/擴增反應檢測HPV RNA的試劑盒，其中該試劑盒包含至少一種具有逆轉錄酶和DNA依賴性DNA聚合酶活性兩者的酶。在一個實施方案中，試劑盒進一步包含至少一種具有選自下組的活性的酶解 旋酶活性和切口誘導活性。在另一個實施方案中，試劑盒進一步包含至少一種具有解旋酶活性的酶和至少一種具有切口誘導活性的酶。試劑盒可以進一步包含進行期望的擴增必需的其它試劑，包括但不限于緩沖液；生物分子；鹽；尿素；二甲基亞砜(DMSO);聚乙二醇(PEG);鎂；拓撲異構酶；促旋酶；輔助蛋白；變性劑；輔因子；dNTP ；ATP ；TTP ;序列特異性引物組，包括但不限于未標記的引物和經(jīng)標記的引物，諸如生物素化的引物和LUX引物；和隨機引物。如使用的，術語“包括”包括“基本上由…組成”和“由…組成”。
實施例實施例I :使用PYROPHAGE 3173作為RT-HAD中RT酶的替換PYROPHAGE 3173DNA 聚合酶與 Transcriptor 和 Thermoscript 逆轉錄酶相比具有幾個優(yōu)點。例如，已知Thermoscript和Transcriptor于65° C在HAD緩沖液中具有有限的活性。測試PYROPHAGE 3173DNA聚合酶以測定它是否可以在一步等溫RT-HAD擴增中替換這些逆轉錄酶。簡言之，創(chuàng)建25 μ L反應混合物，其包含(1)0、10、或100個拷貝的在體外轉錄、合成的RNA,其包含沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)隱蔽性質粒RNA (ct-RNA) (GenBank登錄號 X06707) (SEQ ID NO: I) ； (2)正向引物 5’-ATC GCA TGC AAG ATA TCG AGT ATGCGT-3，(SEQ ID NO:2)和反向引物5’-CTC ATA ATT AGC MG CTG CCT CAG AAT-3，(“ct-orf引物”)(SEQ ID NO: 3) ； (3) 2. 5 個 U 的 Thermoscript、Thermo-X、Transcriptor、或Pyrophage 3173 ; (4) 2個U的Bst聚合酶；和(5) I個U的uvrD解旋酶。于65。C實施擴增75分鐘。反應混合物含有表I中所列的終濃度的試劑。如可以在圖I看出的，PYROPHAGE3173與其它RT酶一樣好地實施擴增。
試劑__終濃度_
Tris-HCl 20 mM
_5]KCl__IOmM_
MgSOq4 mM
NaC丨40 mM_
............dNTP I 0.4 mM
dMP I 3mM_

表 I
實施例2 :使用PYROPHAGE 3173作為RT和DNA依賴性DNA聚合酶兩者的替換測試PYROPHAGE 3173DNA聚合酶以測定它是否可以替換在一步等溫RT-HAD擴增中的逆轉錄酶和DNA依賴性DNA聚合酶兩者。簡言之，創(chuàng)建25 μ L反應混合物，其包含(I) 0、25、或 100 個拷貝的 ct-RNA ;(2)ct_orf 引物；(3) 2. 5 個U 的 Pyrophage 3173 ;(4)0 個U或2個U Bst聚合酶；和(5) I個UuvrD解旋酶。反應混合物含有表I中所列的終濃度的試劑。于62° C或65° C實施擴增75分鐘。在圖2顯示結果。如可以看到的，PYROPHAGE3173能夠替換在一步等溫RT-HAD中的逆轉錄酶和DNA依賴性DNA聚合酶兩者。還在沒有不同DNA依賴性DNA聚合酶的情況下實施RT-HAD的能力方面比較PYROPHAGE 3173DNA聚合酶與具有逆轉錄酶活性的其它酶。簡言之，創(chuàng)建25yL反應混合物，其包含(I) O、25、或100個拷貝的ct-RNA ； (2) ct-orf引物；(3) 2. 5個U的Thermoscript、Thermo-X> Transcriptor、或 Pyrophage3173 ;和(4) I 個 U 的 uvrD 解旋酶。于65° C實施擴增75分鐘。通過Luminex檢測，如在實施例I中的。結果在圖3顯示。與 PYROPHAGE 3173形成對比，其它逆轉錄酶對于RT-HAD不是Bst聚合酶的有效替代物。在省略Bst聚合酶時，對利用Thermo-X、Thermoscript或Transcriptor的RT-HAD反應觀察到很少的測定信號或無測定信號。僅PYROPHAGE 3173能夠在沒有Bst聚合酶的反應中產(chǎn)生信號。實施例3 :使用PYROPHAGE 3173進行DNA擴增靶物擴增.使用HPV16DNA作為HAD測定法中的靶DNA。將雙鏈DNA靶物在5 μ I
O.IM NaOH中于65° C變性10分鐘。然后，添加等體積的O. 2Μ Hepes以中和變性的靶物。將15 μ I預混合物和25 μ I擴增混合物添加至靶物，并于65° C溫育I. 5小時。表2中列出了預混合物和擴增混合物組分。
擴增子檢測.將HAD產(chǎn)物(5 μ L)轉移至U底雜交板，然后在5 μ I IX變性試劑(Digene HC2DNR, Qiagen Gaithersburg, Inc. , Gaithersburg, MD)中稀釋。然后，將板密封，并以IlOOrpm在Digene搖動器中搖動30秒,并于室溫溫育15分鐘。添加雜交稀釋劑(5 μ IIX hc2 探針稀釋劑，Qiagen Gaithersburg, Inc. , Gaithersburg, MD),并將板再密封，并以IlOOrpm在Digene搖動器中搖動30秒。將與擴增子具有互補寡核苷酸的Luminex珠混合物(IX TE中的10 μ I)添加至每孔(3000個珠/孔)，將板再次密封，并于50° C溫育30分鐘，期間在黑暗中搖動。添加鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白(Moss Corp.)(在PBS中稀釋至12. 5ng/ μ I的10 μ I),并將板再次密封,并在防光的Digene搖動器中以IIOOrpm搖動5分鐘。然后，添加磷酸鹽緩沖鹽水(150 μ I)，將板再密封，并以800rpm搖動I分鐘。使用Luminex 100和Luminex I. 7軟件測定中值熒光強度(MFI)。在圖4顯示結果。高于背景水平的MFI與DNA靶物的存在相關聯(lián)。實施例4 :使用一步RT-HAD檢測兩種HPV 16mRNA序列使用與HPV 16E6-7基因和HPV 16L1基因對應的合成的、體外轉錄的RNA作為靶物。每個反應中包含25或250個拷貝的每種靶核酸。如實施例2中那樣運行一步等溫RT-HAD反應，其使用表3中所列的引物替換Ct-orf引物進行。以終濃度75mM使用反向引物，而正向引物濃度是35禮、401111、451111、501111、或551111。在圖5顯示結果。各25個拷貝的兩種HPV 16RNA的檢測對于RT-HAD反應是穩(wěn)健的。此實驗中的最佳引物濃度是75mM每種反向、生物素化的引物和40或45mM每種正向引物。S/N的變異系數(shù)(n=3)對于這些反應是
權利要求
1.一種用于等溫擴增靶核酸的方法，該方法包括所述靶核酸與反應混合物起反應，所述反應混合物包含 a)具有解旋酶活性的第一酶；和 b)第二酶，其具有 1.逆轉錄酶活性；和 ii.DNA依賴性DNA聚合酶活性。
2.權利要求I的方法，其中所述靶核酸選自下組dsDNA、dsRNA、ssDNA、或ssRNA。
3.權利要求I或權利要求2的方法，其中所述具有逆轉錄酶活性的第二酶是PYROPHAGE 3173。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述靶核酸是HPV核酸。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述反應混合物進一步包含靶特異性核酸引物。
6.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述反應混合物包含隨機引物。
7.權利要求1-6中任一項的方法，其中所述反應混合物進一步包含拓撲異構酶或促旋酶。
8.權利要求1-7中任一項的方法，其中所述靶核酸是靶RNA，且所述第二酶通過包括逆轉錄反應的方法將所述靶RNA轉化成靶DNA。
9.權利要求8的方法，其進一步包括擴增反應，其中所述第二酶擴增所述靶DNA。
10.權利要求1-9中任一項的方法，其中所述反應混合物包含 a.KCl ；b.TrisHCl ； c.MgSO4 ； d.NaCl ； e.dNTP ；f.dATP ;和 g.引物組。
11.權利要求10的方法，其中所述引物組選自下組靶特異性核酸引物組和隨機引物組。
12.權利要求1-11中任一項的方法，其中所述引物組包含選自下組的引物SEQIDNO:2 到 SEQ ID NO:7。
13.權利要求1-12中任一項的方法，其進一步包括自樣品分離所述靶核酸。
14.權利要求13的方法，其中通過如下方法自所述樣品分離所述靶核酸，所述方法包括 a.生成包含所述靶核酸的DNA= RNA雜合物； b.將所述DNA= RNA雜合物結合至固相；并 c.自所述樣品分離結合至所述固相的所述DNA:RNA雜合物。
15.權利要求14的方法，其中所述DNA= RNA雜合物結合至抗DNA = RNA抗體。
16.權利要求15的方法，其中所述抗DNA= RNA抗體結合或適合于結合至所述固相。
17.權利要求13的方法，其中在擴增所述靶核酸前自所述樣品純化所述靶核酸。
18.權利要求13的方法，其中在擴增所述靶核酸后自所述樣品純化所述靶核酸。
19.一種試劑盒，其包含 a)具有解旋酶活性的第一酶；和 b)第二酶，其具有 i.逆轉錄酶活性；和 ii.DNA依賴性DNA聚合酶活性。
20.權利要求19的試劑盒，其進一步包含至少一種選自下組的組分 a.KCl ；b.TrisHCl ； c.MgSO4 ； d.NaCl ； e.dNTP ； f.dATP ； g.促旋酶； h.拓撲異構酶； i.引物組； j.核酸探針； k.抗DNA = RNA雜合物抗體；和 I.固相， 其中任選地，每種組分是儲備溶液的組分。
21.權利要求19或權利要求20的試劑盒，其包含核酸探針、抗DNA:RNA雜合物抗體、和固相，其中 a.所述抗DNA:RNA抗體適合于結合至所述固相或結合至所述固相；或 b.所述核酸探針適合于結合至所述固相或結合至所述固相。
22.權利要求19-21中任一項的試劑盒，其包括包含KCl和TrisHCl的儲備退火緩沖液。
23.權利要求22的試劑盒，其中配制所述退火緩沖液，使得可稀釋至IOmMKCl和20mMTris-HCl的終濃度。
24.權利要求19-23中任一項的試劑盒，其中所述第二酶是PYR0PHAGE3173。
25.一種混合物，其包含 a.靶核酸； b.具有解旋酶活性的第一酶；和 c.第二酶，其具有 i.逆轉錄酶活性；和 ii.DNA依賴性DNA聚合酶活性。
26.權利要求25的混合物，其進一步包含至少一種選自下組的組分 a.KCl ；b.TrisHCl ； c.MgSO4 ；d.NaCl ； e.dNTP ； f.dATP ； g.促旋酶； h.拓撲異構酶； i.引物組； j.核酸探針； k.抗DNA = RNA雜合物抗體；和 I.固相。
27.權利要求25或26的混合物，其包含核酸探針、抗DNA= RNA雜合物抗體、和固相，其中 a.所述抗DNA:RNA抗體適合于結合至所述固相或結合至所述固相；或 b.所述核酸探針適合于結合至所述固相或結合至所述固相。
28.權利要求25-27中任一項的混合物，其包含水溶液中的下列組分a.IOmM KCl ；b.20mM Tris HCl ；c.4mM MgSO4 ；d.40mM NaCl ；e.0. 4mM dNTP ；f.3mM dATP。
29.權利要求25-28中任一項的混合物，其中所述第二酶是PYR0PHAGE3173。
30.通過權利要求1-18中任一項的方法獲得的擴增核酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于等溫擴增靶核酸序列的方法。通過具有解旋酶活性的酶和具有逆轉錄酶活性和DNA依賴性DNA聚合酶活性的酶擴增靶核酸。還公開了用于等溫擴增靶核酸序列，包括HPV核酸的試劑盒。該試劑盒包含具有解旋酶活性的第一酶和具有逆轉錄酶活性和DNA依賴性DNA聚合酶活性兩者的第二酶。
文檔編號C12Q1/68GK102791884SQ201180013177
公開日2012年11月21日 申請日期2011年1月7日 優(yōu)先權日2010年1月8日
發(fā)明者A.福爾布萊特, B.洛維 申請人:奇亞根蓋瑟斯堡股份有限公司