專利名稱：含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品及其制造方法，還涉及一種用于該制造方法的培養(yǎng)基用添加劑、培養(yǎng)基及試劑盒、以及使用它們的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell, MSC)不僅可以從骨髓、脂肪、滑膜、齒槽骨、齒根膜等成人的組織中分離，而且可以從胎盤、臍帶血、臍帶的各種細(xì)胞等中分離，并且可以在生物體外進(jìn)行培養(yǎng)、增殖。而且，間充質(zhì)干細(xì)胞具有多分化能力，不僅可以分化為多種間充質(zhì)(成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞)的譜系細(xì)胞，而且可以分化為非間充質(zhì)(神經(jīng)前體細(xì)胞、肝細(xì)胞)的譜系細(xì)胞，因此，期待作為再生醫(yī)療或細(xì)胞治療的細(xì)胞源的利用。目前，在間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)中，通常使用含有胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基。存在如下問題在牛的血清中不僅存在批次差別，而且不同種動物源性血清蛋白質(zhì)混入間充質(zhì)干 細(xì)胞中，在移植時(shí)引起免疫應(yīng)答。即使使用人血清進(jìn)行培養(yǎng)，也因個(gè)體差異而難以進(jìn)行穩(wěn)定的培養(yǎng)，另外，供體的身體負(fù)擔(dān)大，而且費(fèi)用高。因此，為了供給更安全且穩(wěn)定的品質(zhì)的間充質(zhì)干細(xì)胞，已知在其培養(yǎng)過程中使用不同種類的動物源性蛋白質(zhì)混入少的無血清培養(yǎng)基為宜。即，優(yōu)選將間充質(zhì)干細(xì)胞在無血清下進(jìn)行培養(yǎng)并使其增殖。在專利文獻(xiàn)I及非專利文獻(xiàn)I中記載有間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)。如專利文獻(xiàn)I及非專利文獻(xiàn)I中記載的那樣，通過將間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行無血清培養(yǎng)，與含5 15% FBS培養(yǎng)基中間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)相比，可得到更優(yōu)異的增殖促進(jìn)效果，而且，通過該培養(yǎng)，可得到具有維持的(提高的)多分化能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。另外，已公開間充質(zhì)干細(xì)胞不僅自身的免疫原性低，而且對各種免疫效應(yīng)細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突細(xì)胞)的功能產(chǎn)生影響(非專利文獻(xiàn)2 5)。因此，期待著將間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于涉及免疫反應(yīng)的各種疾病的治療(非專利文獻(xiàn)6)。在非專利文獻(xiàn)7中記載有間充質(zhì)干細(xì)胞抑制小鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)引起的T細(xì)胞增殖?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :國際公開W02007/080919號小冊子(2007年7月19日公開)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :加藤幸夫，第五回醫(yī)療機(jī)器7才一 9 A予稿集，33-35，2007非專利文獻(xiàn)2 :Keating，A.，Cell Stem Cell, 2,106-108, 2008非專利文獻(xiàn)3 :Corcione，A.等，Blood 107，367-372，2006非專利文獻(xiàn)4 :Ramasamy, R.等，Transplantation 83,71-76,2007非專利文獻(xiàn)5 :Aggarwal，S.等，Blood 105，1815-1822，2005非專利文獻(xiàn)6 Le Blanc K.等，J Intern Med.，262，509-525，2007非專利文獻(xiàn)7 :Djouad，F(xiàn).等，Blood 102，3837-3844，200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題在再生醫(yī)療方面，移植時(shí)的免疫學(xué)的排斥反應(yīng)為重要的問題，為了抑制排斥反應(yīng)，可使用免疫抑制劑。但是，免疫抑制劑的副作用等成為問題。另一方面，由于間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫抑制能力，因此，如果利用間充質(zhì)干細(xì)胞，則不需要使用免疫抑制劑。因此，如果通過異種蛋白質(zhì)、合成培養(yǎng)基混入的危險(xiǎn)性低的無血清或低血清培養(yǎng)可以得到具有免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞，則是有利的。就含F(xiàn)BS培養(yǎng)基而言，尤其是從不僅牛血清白蛋白的量、而且具有變應(yīng)性的其它可溶性物質(zhì)混合存在方面考慮，都存在問題，不含有FBS的培養(yǎng)基的使用是不可缺少的。 本發(fā)明是鑒于上述問題點(diǎn)而完成的發(fā)明，其目的在于，提供一種用于通過無血清或低血清培養(yǎng)來制造維持有免疫抑制能力的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法。用于解決課題的方法本發(fā)明人等為了解決上述課題，對無血清培養(yǎng)給間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制能力帶來的影響進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在含有特定的添加劑的無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞維持免疫抑制能力，而且提高其免疫抑制效果，直至完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明所述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法的特征在于，包含以下工序增殖工序，在含有FGF、H)GF、TGF-i3、HGF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸的無血清培養(yǎng)基A中使間充質(zhì)干細(xì)胞增殖；篩選工序，從上述增殖工序后的間充質(zhì)干細(xì)胞中篩選具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明所述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的特征在于，是利用上述的制造方法制造的。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑為用于制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的無血清的培養(yǎng)基用添加劑，特征在于含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基為用于制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的無血清培養(yǎng)基，特征在于含有上述培養(yǎng)基用添加劑。本發(fā)明用于制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的培養(yǎng)方法，特征在于包含在上述培養(yǎng)基中將間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的工序。本發(fā)明用于制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的試劑盒，特征在于至少包含上述培養(yǎng)基用添加劑。發(fā)明的效果本發(fā)明所述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法包含以下工序增殖工序，在含有FGF、H)GF、TGF-i3、HGF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸的無血清培養(yǎng)基A中使間充質(zhì)干細(xì)胞增殖；篩選工序，從上述增殖工序后的間充質(zhì)干細(xì)胞中篩選具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞，因此，可以通過無血清或低血清培養(yǎng)來制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品。本發(fā)明的其它目的、特征及優(yōu)異的方面通過以下所示的記載充分地得知。另外，參照附圖，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)通過以下的說明而清楚。附圖簡述
圖I是表示在MSCGM培養(yǎng)基中將小鼠源性活化T細(xì)胞和hMSC進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，hMSC對于抗CD3及抗CD28刺激T細(xì)胞增殖反應(yīng)的免疫抑制效果的圖。圖2是表示在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中所述的無血清培養(yǎng)基A中將小鼠源性活化T細(xì)胞和hMSC進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，hMSC對于抗CD3及抗CD28刺激T細(xì)胞增殖反應(yīng)的免疫抑制效果的圖。圖3是表示在MSCGM培養(yǎng)基中將小鼠源性活化T細(xì)胞和hMSC進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，hMSC對于有絲分裂原刺激T細(xì)胞增殖反應(yīng)的免疫抑制效果的圖。圖4是表示在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中所述的無血清培養(yǎng)基A中將小鼠源性活化T細(xì)胞和hMSC進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，hMSC對于有絲分裂原刺激T細(xì)胞增殖反應(yīng)的免疫抑制效果的圖。 圖5是表示hMSC對于小鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)刺激T細(xì)胞增殖反應(yīng)的免疫抑制效果的圖(培養(yǎng)第3天的結(jié)果)。圖6是表示hMSC對于小鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)刺激T細(xì)胞增殖反應(yīng)的免疫抑制效果的圖(培養(yǎng)第4天的結(jié)果)。圖7是表示從培養(yǎng)開始第8天的脂肪組織源性hMSC的增殖狀態(tài)的圖。圖8是表示培養(yǎng)基I及培養(yǎng)基2對于初期的滑膜源性hMSC的增殖促進(jìn)效果的圖，(a)是表示從培養(yǎng)開始第12天的滑膜源性hMSC的細(xì)胞數(shù)的圖，(b)是表示從培養(yǎng)開始第12天的滑膜源性hMSC的增殖狀態(tài)的圖。圖9是表示從培養(yǎng)開始第O天至第68天的滑膜源性hMSC的細(xì)胞數(shù)的經(jīng)時(shí)變化的圖。

圖10是表示從培養(yǎng)開始第5天的骨髓源性hMSC (細(xì)胞I)的增殖狀態(tài)的圖。圖11是表示從培養(yǎng)開始第5天的骨髓源性hMSC (細(xì)胞2)的增殖狀態(tài)的圖。圖12是表示從培養(yǎng)開始第5天的骨髓源性hMSC (細(xì)胞3)的增殖狀態(tài)的圖。圖13是表示培養(yǎng)基I對于正常人皮膚成纖維細(xì)胞及人軟骨肉瘤細(xì)胞株的增殖的效果的圖，(a)是表示從培養(yǎng)開始第14天的正常人皮膚成纖維細(xì)胞的集落數(shù)的圖，(b)是表示從培養(yǎng)開始第14天的人軟骨肉瘤細(xì)胞株的集落數(shù)的圖。
具體實(shí)施例方式下面，對本發(fā)明的實(shí)施方式詳細(xì)地進(jìn)行說明。但是，本發(fā)明并不限定于此，可以以在記述的范圍內(nèi)加入有各種變形的方式實(shí)施。需要說明的是，在本說明書中，只要沒有特殊說明，表示數(shù)值范圍的“A B”是指“A以上，B以下”。如上所述，在專利文獻(xiàn)I及非專利文獻(xiàn)I中，記載有在不含有血清的培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基)中不喪失增殖性而用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基是將特定的生長因子群、磷脂及脂肪酸的復(fù)合物添加于基礎(chǔ)培養(yǎng)基而形成的，通過使用該培養(yǎng)基，即使在無血清條件下，也帶來與10%血清的情況相同或更大的細(xì)胞增殖促進(jìn)效果。另外，可以在該培養(yǎng)基中將間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行無血清培養(yǎng)，而仍舊維持分化能力和提高其維持能力。而且，在該培養(yǎng)基中，可以進(jìn)行骨髓源性MSC、脂肪源性MSC、滑膜源性MSC的無血清培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明，作為這種可以在無血清條件下使間充質(zhì)干細(xì)胞大量增殖的培養(yǎng)基的進(jìn)一步效果，實(shí)現(xiàn)免疫抑制能力的維持或提高的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，可以制造特別對再生醫(yī)療用途有用的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品。(I)含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法本發(fā)明提供一種在無血清條件下制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的方法。本發(fā)明所述細(xì)胞制品的制造方法包含以下工序增殖工序，在含有FGF、PDGF, TGF- β、HGF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸的無血清培養(yǎng)基A中使間充質(zhì)干細(xì)胞增殖；篩選工序，從上述增殖工序后的間充質(zhì)干細(xì)胞中篩選具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。(增殖工序)在本發(fā)明所述的制造方法的增殖工序中，將間充質(zhì)干細(xì)胞在含有FGF、PDGF,TGF-β、HGF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸的無血清培養(yǎng)基A中進(jìn)行培養(yǎng)并使間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。 本說明書中所使用的情況，“無血清培養(yǎng)基”是指不含有血清的培養(yǎng)基，“無血清培養(yǎng)”是指不使用血清的培養(yǎng)。另外，“低血清培養(yǎng)”是指使用與一般的含血清培養(yǎng)基(例如含10% FBS培養(yǎng)基)相比含有的血清量少的培養(yǎng)基的培養(yǎng)，及與使用一般的含血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)相比使用含血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)期間短的培養(yǎng)。在本說明書中，“細(xì)胞制品”為用于作為再生醫(yī)療用材料的再生醫(yī)療等的、將細(xì)胞進(jìn)行了制劑化的治療藥，不僅包含使細(xì)胞仍舊為原來的狀態(tài)且不使功能變化并進(jìn)行了制劑化的物質(zhì)，而且包含在特定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)及增殖，由此將使分化能力、免疫抑制能力等功能提聞的細(xì)胞進(jìn)行制劑化的物質(zhì)。另外，在本說明書中，“間充質(zhì)干細(xì)胞”不僅包含從骨髓、脂肪細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、齒槽骨、齒根膜等成人的組織中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，而且包含從胎盤、臍帶血、胎兒的各種細(xì)胞等中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，優(yōu)選為人間充質(zhì)干細(xì)胞，但可以為大鼠、小鼠等非人動物源性間充質(zhì)干細(xì)胞。就用于構(gòu)成在增殖工序中使用的無血清培養(yǎng)基A的基礎(chǔ)培養(yǎng)基而言，只要在該領(lǐng)域中為眾所周知的動物細(xì)胞用培養(yǎng)基，就沒有特別限定，作為優(yōu)選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可列舉例如Ham’ s Fl2培養(yǎng)基、DMHM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、MCDB培養(yǎng)基等。這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以單獨(dú)使用，也可以混合使用多種。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于構(gòu)成無血清培養(yǎng)基A的基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選將MCDB和DMEM以I : I的比率混合成的培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方式中，將在上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加有FGF、PDGF, TGF-β、HGF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸的無血清培養(yǎng)基A用于增殖工序即可。對于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的FGF的含量，以終濃度計(jì)，優(yōu)選為O. I 100ng/ml，進(jìn)一步優(yōu)選為3ng/ml。對于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的I3DGF的含量，以終濃度計(jì)，優(yōu)選為O. 5 100ng/ml，進(jìn)一步優(yōu)選為10ng/ml。對于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的TGF-β的含量，以終濃度計(jì)，優(yōu)選為O. 5 100ng/ml，進(jìn)一步優(yōu)選為10ng/ml。對于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的HGF的含量，以終濃度計(jì)，優(yōu)選為O. I 50ng/ml，進(jìn)一步優(yōu)選為5ng/ml。對于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的EGF的含量，以終濃度計(jì)，優(yōu)選為0. 5 200ng/ml，進(jìn)一步優(yōu)選為20ng/ml。對于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的磷脂的總含量，以終濃度計(jì)，優(yōu)選為0. I 30μ g/ml，進(jìn)一步優(yōu)選為10μ g/ml。對于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的脂肪酸的總含量優(yōu)選為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的1/1000 1/10，進(jìn)一步優(yōu)選為1/100。通過使用這種無血清培養(yǎng)基A，防止異種蛋白質(zhì)的混入，同時(shí)可得到與含血清培養(yǎng)基相同或更大的增殖促進(jìn)效果，可以使間充質(zhì)干細(xì)胞如所希望那樣增殖。在本發(fā)明所述的制造方法的增殖工序中，作為無血清培養(yǎng)基A含有的磷脂，可列舉例如磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰環(huán)己六醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿及磷脂酰甘油等，可以單獨(dú)含有這些磷脂，也可以組合含有。在一個(gè)實(shí)施方式中，無血清培養(yǎng)基A可以組合含有磷脂酸和磷脂酰膽堿，這些磷脂可以為動物源性，也可以為植物源性。作為無血清培養(yǎng)基A含有的脂肪酸，可列舉例如亞油酸、油酸、亞麻酸、花生四烯酸、十四烷酸、棕櫚酰酸、棕櫚酸及硬脂酸等，就本實(shí)施方式所述的培養(yǎng)基用添加劑而言，可以單獨(dú)含有這些脂肪酸，也可以組合含有。另外，本實(shí)施方式所述的無血清培養(yǎng)基A除含有上述脂肪酸之外，還可以含有膽固醇。本說明書中所使用的情況，F(xiàn)GF是指從成纖維細(xì)胞生長因子(FGF fibroblastgrowth factor)家族中選擇的生長因子，優(yōu)選為FGF-2 (bFGF)，也可以從FGF-I等其它FGF家族中選擇。另外，本說明書中所使用的情況，TOGF是指從血小板衍生生長因子(PDGF:platelet derived growth factor)家族中選擇的生長因子，優(yōu)選為 F1DGF-BB 或 FOGF-AB。而且，本說明書中所使用的情況，TGF-β是指從轉(zhuǎn)化生長因子_β (TGF-β transforminggrowth factor-β )家族中選擇的生長因子,優(yōu)選為TGF-β 3,也可以從其它TGF-β家族中選擇。本說明書中所使用的情況，HGF是指從肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growthfactor)家族中選擇的生長因子，EGF是指從上皮生長因子(EGF :epidermal growthfactor)家族中選擇的生長因子。另外，在一個(gè)實(shí)施方式中，無血清培養(yǎng)基A還可以含有選自結(jié)締組織生長因子(CTGF !connective tissue growth factor)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF :vascularendothelial growth factor)及抗壞血酸化合物構(gòu)成的組中的至少2種因子。本說明書中所使用的情況，抗壞血酸化合物是指抗壞血酸(維生素C)或抗壞血酸2磷酸或與它們類似的化合物。需要說明的是，無血清培養(yǎng)基A中所含的上述的生長因子可以為天然的，也可以為通過基因重組而制造的。在一個(gè)方面，優(yōu)選無血清培養(yǎng)基A含有脂質(zhì)抗氧化劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，無血清培養(yǎng)基A中所含的脂質(zhì)抗氧化劑可以為DL- α -生育酚醋酸酯(維生素Ε)。無血清培養(yǎng)基A還可以含有表面活性劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，無血清培養(yǎng)基A中所含的表面活性劑可以為普盧蘭尼克F-68或吐溫80。無血清培養(yǎng)基A還可以含有胰島素、運(yùn)鐵蛋白及硒酸鹽。本說明書中所使用的情況，胰島素可以為胰島素樣生長因子，可以來自天然的細(xì)胞，也可以為通過基因重組而制造的。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑還可以含有地塞米松或其它糖皮質(zhì)激素。在增殖工序中，在上述的無血清培養(yǎng)基A中播種從人等動物組織或細(xì)胞中利用目前公知的方法分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)至增殖為所希望的數(shù)量。作為培養(yǎng)條件，對于Iml培養(yǎng)基，優(yōu)選播種I 2X IO4個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為37°C ±1°C，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為48 96小時(shí)，且5% CO2下。通過這樣培養(yǎng)，可以有效且大量地得到具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。在增殖工序中，就用于培養(yǎng)的培養(yǎng)容器而言，只要可以增殖間充質(zhì)干細(xì)胞，就沒有、特別限定?？梢詢?yōu)選使用例如Falcon制75cm2燒瓶、住友膠木制75cm2燒瓶等。但是,有時(shí)細(xì)胞的增殖因細(xì)胞、因使用的培養(yǎng)容器的種類而受到影響。因此，為了使間充質(zhì)干細(xì)胞更有效地增殖，作為在增殖工序中使其增殖的對象的每種間充質(zhì)干細(xì)胞(以下，也稱為“增殖對象細(xì)胞”)，優(yōu)選使用適于增殖的培養(yǎng)容器進(jìn)行增殖工序。作為適于增殖對象細(xì)胞的增殖的培養(yǎng)容器的選擇方法，可以列舉例如在增殖對象細(xì)胞中選擇最適的培養(yǎng)容器的方法。具體地進(jìn)行說明時(shí)，準(zhǔn)備多種培養(yǎng)容器，除培養(yǎng)容器的種類不同之外，在相同的培養(yǎng)條件下使增殖對象細(xì)胞增殖，利用公知的方法測量從培養(yǎng)開始2周后的細(xì)胞數(shù)，可以從細(xì)胞數(shù)多的容器按順序判斷為適于增殖對象細(xì)胞的增殖的培養(yǎng)容器。另外，增殖對象細(xì)胞的增殖速度快的情況，即使在從培養(yǎng)開始經(jīng)過2周之前，也可以從達(dá)到匯合狀態(tài)的80 90%的細(xì)胞數(shù)的期間短的容器按順序判斷為適于增殖對象細(xì)胞的增殖的培養(yǎng)容器。在本發(fā)明所述的制造方法的增殖工序中，在適于增殖對象細(xì)胞的增殖的培養(yǎng)容器已經(jīng)清楚的情況，使用該培養(yǎng)容器即可。與此相對，在適于增殖對象細(xì)胞的增殖的培養(yǎng)容器 不清楚等情況下，本發(fā)明所述的制造方法可以在增殖工序之前還包含用于選擇適于增殖對象細(xì)胞的增殖的培養(yǎng)容器的“培養(yǎng)容器選擇工序”(后面進(jìn)行描述)。需要說明的是，就間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖而言，細(xì)胞粘附于培養(yǎng)容器為必需條件，因此，增殖對象細(xì)胞對于培養(yǎng)容器的粘附弱時(shí)，優(yōu)選在增殖工序中，在上述無血清培養(yǎng)基A中還含有細(xì)胞粘附分子。作為上述“細(xì)胞粘附分子”，可以列舉例如纖連蛋白、骨膠原、明膠等。這些細(xì)胞粘附分子可以單獨(dú)使用一種，也可以組合使用多種。對于無血清培養(yǎng)基A的細(xì)胞粘附分子的含量，以終濃度計(jì)，優(yōu)選為I 50μ g/ml，進(jìn)一步優(yōu)選為5μ g/ml。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用纖連蛋白作為細(xì)胞粘附分子的情況，通過以對于無血清培養(yǎng)基A的纖連蛋白的終濃度為5 μ g/ml的方式進(jìn)行添加，可以使增殖對象細(xì)胞對于培養(yǎng)容器的粘附效率提高。另外，在增殖工序中，可以將間充質(zhì)干細(xì)胞繼代至少I次。由于間充質(zhì)干細(xì)胞錨定依賴性地增殖，因此，在間充質(zhì)干細(xì)胞局部地不均勻地增殖等的情況下，在增殖工序的中途將間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行繼代，由此可以改善培養(yǎng)條件。作為間充質(zhì)干細(xì)胞的繼代方法，沒有特別限定，可以使用目前公知的間充質(zhì)干細(xì)胞的繼代方法進(jìn)行繼代。由于繼代后的間充質(zhì)干細(xì)胞的狀態(tài)良好，因此，優(yōu)選在上述增殖工序中、在進(jìn)行繼代的情況下使用不含有來自哺乳類及微生物的成分的細(xì)胞剝離劑將上述間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行剝離。作為上述“不含有來自哺乳類及微生物的成分的細(xì)胞剝離劑”，可以列舉例如 ACCUTASE (Innovative Cell Technologies, Inc.)。在此，對使用ACXUTASE作為上述“不含有來自哺乳類及微生物的成分的細(xì)胞剝離齊IJ”的一個(gè)例子時(shí)的繼代方法進(jìn)行說明。按照(i) (Vi)的順序?qū)㈤g充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行剝離、繼代。需要說明的是，在以下說明的繼代方法中，假定使用T-25燒瓶(Falcon制)作為
培養(yǎng)容器。(i)使用PBS (-) 5mL清洗細(xì)胞層。(ii)添加 ACCUTASE 2mL。(iii)在室溫下靜置2分鐘左右，在確認(rèn)細(xì)胞剝離的基礎(chǔ)上，使細(xì)胞懸浮液移至離心管。
(iv)在培養(yǎng)容器中添加PBS (_)7mL，沖洗燒瓶底面。(V)使上述(iv)溶液移至上述(iii)的離心管，以1500rpm(200Xg)離心5分鐘。(vi)除去上清液，以5，000個(gè)/cm2的播種濃度使用無血清培養(yǎng)基A進(jìn)行播種。需要說明的是，在增殖工序中，優(yōu)選供給從人等動物組織中采取后繼代至少I次(PD的間充質(zhì)干細(xì)胞。(篩選工序)在本發(fā)明所述的制造方法的篩選工序(也稱為“第I篩選工序”。)中，從上述增殖工序后的間充質(zhì)干細(xì)胞中篩選具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。在上述的無血清培養(yǎng)基A中進(jìn)行了增殖的增殖工序后的間充質(zhì)干細(xì)胞至少維持有免疫抑制能力，甚至免疫抑制能力提高。因此，通過將這種間充質(zhì)干細(xì)胞以免疫抑制能力為基準(zhǔn)進(jìn)行篩選， 可以挑選具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。而且，通過將挑選的間充質(zhì)干細(xì)胞用作細(xì)胞制品，實(shí)現(xiàn)抑制免疫學(xué)的排斥反應(yīng)的間充質(zhì)干細(xì)胞的移植治療而不用免疫抑制劑。上述的無血清培養(yǎng)基A不含有異種蛋白質(zhì)，而且，在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞維持作為干細(xì)胞的功能。另外，在上述的無血清培養(yǎng)基A中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞與在含胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，增殖能力高，且顯示免疫抑制效果的活性也高。因此，將在上述的無血清培養(yǎng)基A中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞用于移植治療時(shí)，保持其特性的細(xì)胞增加，同時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的活性也高，因此，可以期待協(xié)同效果。另一方面，本發(fā)明人等擔(dān)心由于上述的無血清培養(yǎng)基A的增殖能力的效果的致瘤性，利用體外的軟瓊脂培養(yǎng)法和體內(nèi)的高靈敏度免疫缺陷小鼠(N0G小鼠)的致瘤性試驗(yàn)法分別進(jìn)行了研究。具體而言，將3批滑膜源性人間充質(zhì)干細(xì)胞和I批骨髓源性人間充質(zhì)干細(xì)胞在上述的無血清培養(yǎng)基A中進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)細(xì)胞1，000，000個(gè)移植在軟瓊脂培養(yǎng)用的培養(yǎng)基及NOG小鼠的皮下10處。其結(jié)果，就軟瓊脂培養(yǎng)而言，在Hela細(xì)胞1，000個(gè)的移植中看到腫瘤集落，與此相對，3批間充質(zhì)干細(xì)胞均為陰性。另一方面，就NOG小鼠而言，即使僅I個(gè)H印G2細(xì)胞混合存在，即使在檢測出腫瘤結(jié)節(jié)的實(shí)驗(yàn)條件下，在任一移植組織中都沒有看到腫瘤結(jié)節(jié)(數(shù)據(jù)未顯示)。由此也明確，利用本發(fā)明制造的細(xì)胞制品在移植治療中的有用性。在本說明書中，“免疫抑制能力”為抑制將異種或同種細(xì)胞等進(jìn)行異體移植時(shí)產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)的能力，是指通過抑制T細(xì)胞的增殖等，對各種免疫效應(yīng)細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響而抑制其引起的免疫反應(yīng)的能力。其為抗炎癥能力的一部分。在本說明書中，“維持免疫抑制能力”是指間充質(zhì)干細(xì)胞本來具有的免疫抑制能力沒有通過上述增殖工序而喪失，“提高了免疫抑制能力”是指在上述增殖工序的前后間充質(zhì)干細(xì)胞具有的免疫抑制能力提聞。在篩選工序中，在上述增殖工序后的無血清培養(yǎng)基A中將進(jìn)行了增殖的間充質(zhì)干細(xì)胞和免疫細(xì)胞共培養(yǎng)，通過對共培養(yǎng)后的培養(yǎng)基中的免疫細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評價(jià)，可以篩選具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞，但并不限定于此。例如，在使用T細(xì)胞作為免疫細(xì)胞的情況下，如后述的實(shí)施例所示，對T細(xì)胞的增加量或細(xì)胞因子的產(chǎn)生量進(jìn)行評價(jià)，在使用B細(xì)胞或活化NK細(xì)胞作為免疫細(xì)胞的情況下,通過對這些細(xì)胞的增加量進(jìn)行評價(jià)，可以篩選具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。另外，在使用樹突細(xì)胞作為免疫細(xì)胞的情況下，通過對其分化、成熟、活化等進(jìn)行評價(jià)，可以篩選具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。用于這種篩選的免疫細(xì)胞優(yōu)選為T細(xì)胞、B細(xì)胞或活化NK細(xì)胞，更優(yōu)選為T細(xì)胞或B細(xì)胞，最優(yōu)選為T細(xì)胞。(第2篩選工序)本發(fā)明所述的制造方法還可以包含第2篩選工序，其從上述增殖工序后的間充質(zhì)干細(xì)胞中篩選不具有致瘤性的間充質(zhì)干細(xì)胞。就在上述的無血清培養(yǎng)基A中進(jìn)行了增殖的增殖工序后的間充質(zhì)干細(xì)胞而言，不具有致瘤性的間充質(zhì)干細(xì)胞選擇性地增加。因此，通過將這種間充質(zhì)干細(xì)胞以致瘤性為基準(zhǔn)進(jìn)行篩選，可以挑選不具有致瘤性的間充質(zhì)干細(xì)胞。而且，通過將挑選的間充質(zhì)干細(xì)胞用作細(xì)胞制品，實(shí)現(xiàn)不具有致瘤性的間充質(zhì)干細(xì)胞的移植治療。因此，本發(fā)明也可以提供一種在無血清條件下含有不具有致瘤性的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法。關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞是否具有致瘤性，如在上述“篩選工序”中說明的那樣，可以利 用目前公知的體外的軟瓊脂培養(yǎng)法、體內(nèi)的高靈敏度免疫缺陷小鼠(N0G小鼠)的致瘤性試驗(yàn)法等進(jìn)行確認(rèn)，但并不限定于這些。即，在本說明書中，“不具有致瘤性的間充質(zhì)干細(xì)胞”是指利用確認(rèn)上述致瘤性的有無的方法確認(rèn)有不具有致瘤性的間充質(zhì)干細(xì)胞。需要說明的是，在本發(fā)明所述的制造方法中，還包含第2篩選工序的情況，進(jìn)行上述第I篩選工序和該第2篩選工序的順序沒有特別限制。即，可以在第2篩選工序之前進(jìn)行第I篩選工序，也可以在第2篩選工序之后進(jìn)行第I篩選工序。(血清培養(yǎng)工序)本發(fā)明所述的制造方法還包含血清培養(yǎng)工序，其將增殖工序后的間充質(zhì)干細(xì)胞在篩選工序之前、在含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在血清培養(yǎng)工序中，將在增殖工序中進(jìn)行了無血清培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在進(jìn)行血清培養(yǎng)工序的情況，將血清培養(yǎng)工序后的間充質(zhì)干細(xì)胞供于篩選工序。作為在血清培養(yǎng)工序中使用的含血清培養(yǎng)基，可以使用目前公知的含血清培養(yǎng)基，也可以將在上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加有10% FBS的含10% FBS培養(yǎng)基用作含血清培養(yǎng)基。在血清培養(yǎng)工序中，在這種含血清培養(yǎng)基上將增殖工序中得到的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行播種并培養(yǎng)。作為培養(yǎng)條件，對于Iml培養(yǎng)基，間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量優(yōu)選為I 2X IO4個(gè)，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為37°C ±1°C，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為48 96小時(shí)，且為5% CO2下。通過這樣培養(yǎng)，可以有效且大量地得到在更早期發(fā)揮免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。而且，將在含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞供于篩選工序，挑選具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。這樣，通過將間充質(zhì)干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基A中進(jìn)行前培養(yǎng)之后，在含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行主培養(yǎng)，可得到與前培養(yǎng)及主培養(yǎng)同時(shí)在含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的情況相同或更大的免疫抑制效果，而且，可以更早期地發(fā)揮間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制效果。另外，由于僅在主培養(yǎng)時(shí)使用血清，因此,血清的含量少,可以實(shí)現(xiàn)低血清培養(yǎng)。(前增殖工序)本發(fā)明所述的制造方法還可以包含前增殖工序，其在上述增殖工序之前，在含有FGF、H)GF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸的無血清培養(yǎng)基B中使間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。在此，上述“無血清培養(yǎng)基B”不含有HGF及TGF-β，在這一方面與上述“增殖工序”項(xiàng)中說明的無血清培養(yǎng)基A不同。關(guān)于HGF及TGF-β以外的成分$6 、^)6 36 、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸)及基礎(chǔ)培養(yǎng)基，如上述“增殖工序”項(xiàng)中關(guān)于無血清培養(yǎng)基A說明的那樣，因此，在此省略說明。另外，在一個(gè)方面，優(yōu)選無血清培養(yǎng)基B與無血清培養(yǎng)基A同樣含有脂質(zhì)抗氧化齊U。另外，無血清培養(yǎng)基B還可以含有表面活性劑。另外，無血清培養(yǎng)基B還可以含有胰島素、運(yùn)鐵蛋白及硒酸鹽。另外，無血清培養(yǎng)基B還可以含有地塞米松或其它糖皮質(zhì)激素。關(guān)于這些成分，也與上述“增殖工序”項(xiàng)中關(guān)于無血清培養(yǎng)基A說明的那樣，在此省略說明。需要說明的是，就無血清培養(yǎng)基B中所含的上述成分的含量而言，只要為上述“增殖工序”項(xiàng)中關(guān)于無血清培養(yǎng)基A說明的含量的范圍內(nèi)，可以與無血清培養(yǎng)基A中所含的各成分的含量相同，也可以不同。在前增殖工序中，在上述的無血清培養(yǎng)基B中將從人等動物組織中利用目前公知 的方法分離的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行播種，培養(yǎng)至增殖為所希望的數(shù)量。作為培養(yǎng)條件，優(yōu)選對于Iml培養(yǎng)基將I 500mg的組織片(含有MSC)進(jìn)行分離，將間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行播種，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為37°C ±1°C，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為3 14天，且為5% CO2下。對供于前增殖工序的間充質(zhì)干細(xì)胞沒有特別限制，優(yōu)選為初期的間充質(zhì)干細(xì)胞，即從人等動物組織中采取后根本未經(jīng)過繼代培養(yǎng)的細(xì)胞。如后述的實(shí)施例所示，通過在供于增殖工序之前、在無血清培養(yǎng)基B中使初期的間充質(zhì)干細(xì)胞預(yù)先增殖，可以使在增殖工序中得到的間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量非常顯著地增加。在一個(gè)實(shí)施方式中，作為前增殖工序中的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，例如，以2X105個(gè)/cm2的播種濃度在無血清培養(yǎng)基B中將間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行播種，其后I周左右，每2天追加并添加播種時(shí)培養(yǎng)液量的10%的無血清培養(yǎng)基B，使細(xì)胞增殖至細(xì)胞數(shù)為匯合狀態(tài)的70 80%。通過這樣將在無血清培養(yǎng)基B中預(yù)先培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞供于增殖工序，可以有效且大量地得到具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。另外，為了在前增殖工序中使間充質(zhì)干細(xì)胞更有效地增殖，優(yōu)選對作為在前增殖工序中進(jìn)行增殖的對象的每種間充質(zhì)干細(xì)胞(以下，也稱為“前增殖對象細(xì)胞”)使用適于增殖的培養(yǎng)容器進(jìn)行前增殖工序。作為適于前增殖對象細(xì)胞的增殖的培養(yǎng)容器的選擇方法，如上述“增殖工序”項(xiàng)中說明的那樣，因此，在此省略說明。另外，與增殖工序同樣地，在前增殖工序中，在前增殖對象細(xì)胞對于培養(yǎng)容器的粘附弱的情況下，在上述無血清培養(yǎng)基B中還可以含有細(xì)胞粘附分子。關(guān)于上述細(xì)胞粘附分子，如上述“增殖工序”項(xiàng)中說明的那樣，因此，在此省略說明。另外，與增殖工序同樣地，在前增殖工序中，可以將間充質(zhì)干細(xì)胞繼代至少I次。通過在前增殖工序的中途將間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行繼代，可以改善培養(yǎng)條件。需要說明的是，前增殖工序優(yōu)選在原代培養(yǎng)(PO) 繼代第3次(P3)的期間進(jìn)行。關(guān)于在前增殖工序中途繼代間充質(zhì)干細(xì)胞的方法及將前增殖工序后的細(xì)胞供于增殖工序時(shí)的繼代方法，如上述“增殖工序”項(xiàng)中說明的那樣，因此，在此省略說明。(培養(yǎng)容器選擇工序)本發(fā)明所述的制造方法還可以包含培養(yǎng)容器選擇工序，其在上述增殖工序之前(或上述前增殖工序之前)選擇適于間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖的培養(yǎng)容器。作為適于間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖的培養(yǎng)容器的選擇方法，如上述“增殖工序”項(xiàng)中說明的那樣，因此，在此省略說明。(2)用于制造細(xì)胞制品的無血清的培養(yǎng)基用添加劑本發(fā)明提供一種用于制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的無血清的培養(yǎng)基用添加劑。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑含有FGF、PDGF,TGF-β、HGF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑可以添加于目前公知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、作為用于制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的無血清培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基A)使用。作為本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑含有的磷脂，可列舉例如磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰環(huán)己六醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿及磷脂酰甘油等，本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑可以單獨(dú)含有這些磷脂，也可以組合含有。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑組合含有磷脂酸和磷脂酰膽堿。另外，這些磷脂可以為動物源性，也可以為植物源性。 作為本實(shí)施方式所述的培養(yǎng)基用添加劑含有的脂肪酸，可列舉例如亞油酸、油酸、亞麻酸、花生四烯酸、十四烷酸、棕櫚酰酸、棕櫚酸及硬脂酸等，本實(shí)施方式所述的培養(yǎng)基用添加劑可以單獨(dú)含有這些脂肪酸，也可以組合含有。另外，本實(shí)施方式所述的培養(yǎng)基用添加劑除含有上述脂肪酸之外，還可以含有膽固醇。本說明書中所使用的情況，F(xiàn)GF是指從成纖維細(xì)胞生長因子(FGF fibroblastgrowth factor)家族中選擇的生長因子，優(yōu)選為FGF-2 (bFGF)，也可以從FGF-I等其它FGF家族中選擇。另外，本說明書中所使用的情況，TOGF是指從血小板衍生生長因子(PDGF:platelet derived growth factor)家族中選擇的生長因子，優(yōu)選為 F1DGF-BB 或 FOGF-AB。而且，本說明書中所使用的情況，TGF-β是指從轉(zhuǎn)化生長因子_β (TGF-β transforminggrowth factor-β )家族中選擇的生長因子,優(yōu)選為TGF-β 3,也可以從其它TGF-β家族中選擇。本說明書中所使用的情況，HGF是指從肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growthfactor)家族中選擇的生長因子，EGF是指從細(xì)胞表皮生長因子(EGF epidermal growthfactor)家族中選擇的生長因子。另外，在一個(gè)實(shí)施方式中，無血清培養(yǎng)基A還可以含有選自結(jié)締組織生長因子(CTGF !connective tissue growth factor)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF :vascularendothelial growth factor)及抗壞血酸化合物構(gòu)成的組中的至少2種因子。本說明書中所使用的情況，抗壞血酸化合物是指抗壞血酸(維生素C)或抗壞血酸2磷酸或與它們類似的化合物。需要說明的是，本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑中所含的生長因子可以為天然的，也可以為通過基因重組而制造的。在一個(gè)方面，本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑優(yōu)選含有脂質(zhì)抗氧化劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，本實(shí)施方式所述的培養(yǎng)基用添加劑中所含的脂質(zhì)抗氧化劑可以為DL-α-生育酚醋酸酯(維生素E)。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑還可以含有表面活性劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，本實(shí)施方式所述的培養(yǎng)基用添加劑中所含的表面活性劑可以為普盧蘭尼克F-68或吐溫80。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑還可以含有胰島素、運(yùn)鐵蛋白及硒酸鹽。本說明書中所使用的情況，胰島素可以為胰島素樣生長因子，可以來自天然的細(xì)胞，也可以為通過基因重組而制造的。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑還可以含有地塞米松、或其它糖皮質(zhì)激素。(3)用于將動物細(xì)胞進(jìn)行無血清培養(yǎng)的試劑盒本發(fā)明提供一種用于制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的無血清的培養(yǎng)基用添加劑。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑(培養(yǎng)基用添加劑A)含有FGF、PDGF, TGF-β、HGF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸。另外，本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑還可以含有細(xì)胞粘附分子。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑試劑盒可以在同一容器內(nèi)包含F(xiàn)GF、PDGF, TGF-β、HGF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸，也可以分別包含這些成分。另外，本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑試劑盒還可以含有細(xì)胞粘附分子。關(guān)于上述細(xì)胞粘附分子，如本說明書中的上述“(I)含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制 品的制造方法”項(xiàng)的“增殖工序”中說明的那樣，因此，在此省略說明。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑試劑盒可以添加于目前公知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，作為用于制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的無血清培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基A)使用。本說明書中所使用的情況，“組合物”是指在一種物質(zhì)中含有各主要成分的方式，“試劑盒”是指在其它物質(zhì)中含有各主要成分的至少I種的方式。因此，容易理解，本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑試劑盒中所包含的生長因子、磷脂及脂肪酸與關(guān)于培養(yǎng)基用添加劑的 上述物質(zhì)相同。另外，本發(fā)明所述的試劑盒為用于制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的試劑盒，至少包含本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑(培養(yǎng)基用添加劑A)。另外，本發(fā)明所述的試劑盒還可以包含含有FGF、PDGF, EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸的培養(yǎng)基用添加劑B。需要說明的是，可以將關(guān)于“無血清培養(yǎng)基B”的說明換用另一詞句讀作關(guān)于“培養(yǎng)基用添加劑B”的說明。(4)用于制造細(xì)胞制品的無血清培養(yǎng)基本發(fā)明提供一種用于制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的無血清培養(yǎng)基。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基含有FGF、PDGF, TGF- β、HGF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基可以作為用于制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的無血清培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基A)使用。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基含有FGF、PDGF, TGF- β、HGF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸即可，這些成分可以同時(shí)添加于基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，也可以分別添加。即，可以說，本發(fā)明所述的培養(yǎng)基含有上述的培養(yǎng)基用添加劑中所含的成分或培養(yǎng)基用添加劑試劑盒中所包含的成分即可。就用于構(gòu)成本發(fā)明所述的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基而言，只要是在該領(lǐng)域中眾所周知的動物細(xì)胞用培養(yǎng)基，就沒有特別限定，作為優(yōu)選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可列舉例如Ham’ s F12培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、MCDB培養(yǎng)基等。這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以單獨(dú)使用，也可以混合使用多種。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于構(gòu)成本發(fā)明所述的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選將MCDB和DMEM以I : I的比率混合成的培養(yǎng)基。(5)用于制造細(xì)胞制品的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種用于制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的培養(yǎng)方法。本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法包含在含有FGF、PDGF, TGF- β、HGF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸的無血清培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基A)中將間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的工序(培養(yǎng)工序A)?？梢哉f，本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法在將間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，使用上述的無血清培養(yǎng)基即可。另外，本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法還可以包含在上述培養(yǎng)工序A之前，在含有FGF、H)GF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸的無血清培養(yǎng)基B中，將間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的工序(培養(yǎng)工序B)。需要說明的是，上述“培養(yǎng)工序A”及上述“培養(yǎng)工序B”分別與本發(fā)明所 述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法中的“增殖工序”及“前增殖工序”相對應(yīng)。因此，將關(guān)于本說明書中的上述“(I)含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法”項(xiàng)的“增殖工序”及“前增殖工序”的說明分別換用另一詞句讀作關(guān)于“培養(yǎng)工序A”及“培養(yǎng)工序B”的說明。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法可以包含將FGF、PDGF, TGF-β、HGF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸同時(shí)添加于基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的工序。另外，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法可以包含將FGF、PDGF, EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸同時(shí)添加于基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的工序。就上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基而言，如上所述，只要是在該領(lǐng)域中眾所周知的動物細(xì)胞用培養(yǎng)基，就沒有特別限定。(6)進(jìn)一步用途如上所述，根據(jù)本發(fā)明，即使為無血清或低血清培養(yǎng)基，也可以以與在含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的情況同等或以上的速度使間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，而且，維持或提高進(jìn)行了增殖的間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制能力。而且，就在本發(fā)明中進(jìn)行了增殖的間充質(zhì)干細(xì)胞而言，不具有致瘤性的間充質(zhì)干細(xì)胞選擇性地增加。而且，在本發(fā)明中進(jìn)行了增殖的間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力維持或提高(參照專利文獻(xiàn)I)。因此，在將這種含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品施用于患者的情況，不僅可以實(shí)現(xiàn)利用間充質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)異的移植治療，而且有效地抑制作為移植治療的大問題之一的免疫排斥反應(yīng)，減輕患者的負(fù)擔(dān)，同時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的治療。另外，與使用血清制造的現(xiàn)有細(xì)胞制品相比，不需要考慮血清的批量差別，可以在移植治療中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的治愈率。還可以說，利用本發(fā)明制造的細(xì)胞制品中所含的間充質(zhì)干細(xì)胞維持了間充質(zhì)干細(xì)胞本來具有的對免疫效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生影響的功能，因此，還可以期待該間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用及免疫耐受作用，將利用本發(fā)明制造的細(xì)胞制品也應(yīng)用于期待有這些作用的治療。而且，根據(jù)利用本發(fā)明制造的細(xì)胞制品，通過間充質(zhì)干細(xì)胞的抗炎癥作用，也可以期待作為移植治療中的抗炎癥劑的功能。另外，就本細(xì)胞制品而言，也期待抗炎癥作用引起抗衰老效果。而且，就利用本發(fā)明制造的細(xì)胞制品而言，期待更有效地進(jìn)行不僅在需要間充質(zhì)干細(xì)胞的移植的地方進(jìn)行施用(局部施用)的局部疾病的治療，而且利用在靜脈內(nèi)等進(jìn)行施用并輸送至全身的全身施用，對通過骨髓移植等引起的急性GVHD等的強(qiáng)免疫排斥反應(yīng)的治療，使人的存活率顯著地提高。另外，由于利用本發(fā)明制造的細(xì)胞制品是通過無血清培養(yǎng)而制造的，因此，有用的生長因子或分化因子不會與血清蛋白質(zhì)一起非特異性地吸附在陶瓷等移植材料上。因此，利用本發(fā)明制造的細(xì)胞制品移植形成的組織再生能力更高，其結(jié)果，治療效果也高。而且，不用說，也可以進(jìn)行合并有局部施用和全身施用的治療。另外，利用本發(fā)明制造的細(xì)胞制品中所含的間充質(zhì)干細(xì)胞具有維持或提高的免疫抑制能力，抑制移植時(shí)的免疫排斥反應(yīng)，因此，可以應(yīng)用于將自身以外的組織及細(xì)胞移植給他人的(供體和受體不同)異體移植的治療。而且，可以說，也可以優(yōu)選不僅用于使用人組織或人細(xì)胞的同種異體移植(同種移植)，而且用于使用人以外的動物組織或動物細(xì)胞的異種移植(異種移植)。而且，利用本發(fā)明制造的細(xì)胞制品與僅使用現(xiàn)有的含血清培養(yǎng)基而得到的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，早期發(fā)揮免疫抑制效果，因此，期待在移植時(shí)早期發(fā)現(xiàn)治療效果，可預(yù)料治愈率的增加。另外，本發(fā)明所述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法還可以包含血清培養(yǎng)工序，其將上述增殖工序后的間充質(zhì)干細(xì)胞在上述篩選工序之前，在含有血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。另外，本發(fā)明所述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法優(yōu)選還包含前增殖 工序，其在上述增殖工序之前，在含有FGF、H)GF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸的無血清培養(yǎng)基B中使間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。還可以包含第2篩選工序，其從上述增殖工序后的間充質(zhì)干細(xì)胞中篩選不具有致瘤性的間充質(zhì)干細(xì)胞。另外，本發(fā)明所述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法優(yōu)選在上述增殖工序中，使用適于上述間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖的培養(yǎng)容器使該間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。另外，本發(fā)明所述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法優(yōu)選在上述增殖工序中，上述無血清培養(yǎng)基A中還含有細(xì)胞粘附分子。另外，本發(fā)明所述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法在上述增殖工序中，可以將上述間充質(zhì)干細(xì)胞繼代至少I次。另外，本發(fā)明所述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法優(yōu)選在上述增殖工序中、在進(jìn)行繼代的情況下，使用不含來自哺乳類及微生物的成分的細(xì)胞剝離劑將上述間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行剝離。另外，本發(fā)明所述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法還可以包含培養(yǎng)容器選擇工序，其在上述增殖工序之前選擇適于間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖的培養(yǎng)容器。而且，在本發(fā)明所述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法中，其特征在于，上述磷脂選自由磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰環(huán)己六醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿及磷脂酰甘油構(gòu)成的組。另外，在本發(fā)明所述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法中，其特征在于，上述脂肪酸選自由亞油酸、油酸、亞麻酸、花生四烯酸、十四烷酸、棕櫚酰酸、棕櫚酸及硬脂酸構(gòu)成的組。另外，本發(fā)明所述的培養(yǎng)基用添加劑還可以含有細(xì)胞粘附分子。另外，本發(fā)明所述的試劑盒還可以包含含有FGF、PDGF, EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸的培養(yǎng)基用添加劑B。需要說明的是，在用于實(shí)施發(fā)明的方式的項(xiàng)中進(jìn)行的具體的實(shí)施方式及以下的實(shí)施例歸根結(jié)底是闡明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容的，不應(yīng)該僅限定于這種具體實(shí)例而狹義地解釋，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明的精神及所附的專利權(quán)利要求內(nèi)進(jìn)行變更而實(shí)施。另外，本說明書中中所記載的全部學(xué)術(shù)文獻(xiàn)及專利文獻(xiàn)在本說明書中作為參考被引用。實(shí)施例以下，利用實(shí)施例對本發(fā)明具 體地進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不受實(shí)施例限定。[實(shí)施例I]進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)。(I.細(xì)胞培養(yǎng))人骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞(骨髓源性hMSC)從Lonza WalKersville, Inc.(以下，Lonza社)購入，在間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MSCBM) (Lonza社)中加入有間充質(zhì)細(xì)胞生長添加物(MCGS) (Lonza社)的含血清培養(yǎng)基(MSCGM培養(yǎng)基)或表I所示的無血清的培養(yǎng)基I中進(jìn)行培養(yǎng)。[表 I]
權(quán)利要求
1.一種含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法，特征在于包含以下工序 增殖工序，在含有FGF、roGF、TGF-i3、HGF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸的無血清培養(yǎng)基A中使間充質(zhì)干細(xì)胞增殖； 篩選工序，從所述增殖工序后的間充質(zhì)干細(xì)胞中篩選具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求I所述的制造方法，特征在于還包含血清培養(yǎng)工序?qū)⑺鲈鲋彻ば蚝蟮拈g充質(zhì)干細(xì)胞在所述篩選工序之前，在含有血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求I或2所述的制造方法，特征在于還包含前增殖工序在所述增殖工序之前，在含有FGF、PDGF, EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸的無血清培養(yǎng)基B中使間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。
4.如權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的制造方法，特征在于還包含第2篩選工序從所述增殖工序后的間充質(zhì)干細(xì)胞中篩選不具有致瘤性的間充質(zhì)干細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求I 4中任一項(xiàng)所述的制造方法，特征在于在所述增殖工序中，使用適于所述間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖的培養(yǎng)容器使該間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。
6.如權(quán)利要求I 5中任一項(xiàng)所述的制造方法，特征在于在所述增殖工序中，所述無血清培養(yǎng)基A中還含有細(xì)胞粘附分子。
7.如權(quán)利要求I 6中任一項(xiàng)所述的制造方法，特征在于在所述增殖工序中，將所述間充質(zhì)干細(xì)胞繼代至少I次。
8.如權(quán)利要求7所述的制造方法，特征在于在所述增殖工序中，在進(jìn)行繼代時(shí)，使用不含有來自哺乳類及微生物的成分的細(xì)胞剝離劑將所述間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行剝離。
9.如權(quán)利要求5所述的制造方法，特征在于還包含培養(yǎng)容器選擇工序在所述增殖工序之前，選擇適于間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖的培養(yǎng)容器。
10.如權(quán)利要求I 9中任一項(xiàng)所述的制造方法，特征在于所述磷脂選自由磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰環(huán)己六醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿及磷脂酰甘油構(gòu)成的組。
11.如權(quán)利要求I 10中任一項(xiàng)所述的制造方法，特征在于所述脂肪酸選自由亞油酸、油酸、亞麻酸、花生四烯酸、十四烷酸、棕櫚酰酸、棕櫚酸及硬脂酸構(gòu)成的組。
12.—種含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品，該細(xì)胞制品是利用權(quán)利要求I 11中任一項(xiàng)所述的制造方法制造的。
13.—種無血清的培養(yǎng)基用添加劑，該培養(yǎng)基用添加劑用于制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品，特征在于含有FGF、H)GF、TGF-i3、HGF、EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸。
14.如權(quán)利要求13所述的培養(yǎng)基用添加劑，特征在于還含有細(xì)胞粘附分子。
15.一種無血清培養(yǎng)基，該無血清培養(yǎng)基用于制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品，特征在于含有權(quán)利要求13或14所述的培養(yǎng)基用添加劑。
16.一種用于制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的培養(yǎng)方法，特征在于包含在權(quán)利要求15所述的培養(yǎng)基中將間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的工序。
17.一種用于制造含有具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的試劑盒，特征在于至少包含權(quán)利要求13或14所述的培養(yǎng)基用添加劑A。
18.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，特征在于還包含培養(yǎng)基用添加劑B，所述培養(yǎng)基用添加劑B含有FGF、PDGF, EGF、至少I種磷脂及至少I種脂肪酸。
全文摘要
通過無血清或低血清培養(yǎng)來制造含有維持有免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品。一種含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制品的制造方法，其特征在于，包含以下工序增殖工序，在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少1種磷脂及至少1種脂肪酸的培養(yǎng)基中使間充質(zhì)干細(xì)胞增殖；篩選工序，從上述增殖工序后的間充質(zhì)干細(xì)胞中篩選具有維持或提高的免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。
文檔編號C12N5/0775GK102791276SQ20118001294
公開日2012年11月21日 申請日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月10日
發(fā)明者加藤幸夫, 原真依子, 土屋利江, 辻纮一郎, 邵金昌 申請人:智再如股份有限公司