專利名稱：一種提高酵母菌甲醇耐受性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域中一種提高酵母菌甲醇耐受性的方法。
背景技術：
聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate或PHA)是許多種類的細菌都能合成的一種細胞內(nèi)聚酯，在生物體內(nèi)主要是作為細胞內(nèi)碳源和能源的貯藏物而存在(Lemoigne M.Products of dehydration and of polymerization of β-hydroxybutyric acid.Bull.Soc.Chem.Biol.，1926，8770-782)。近年來研究發(fā)現(xiàn)PHB(聚羥基丁酸酯)也存在于原核生物和真核生物的膜中。在原核生物中，它存在于其原生質膜中；而在真核生物中，則以在線粒體和微體膜中的比例為最多。相比于胞內(nèi)的高分子量的聚合物，存在于膜上的PHB分子較小，只有100-200個單體。對這種小分子量PHB的研究表明，它可能起著膜上的離子通道的作用。最近，在人的血細胞中也發(fā)現(xiàn)較多量的這種低分子量PHB。PHA作為新型的生物可降解塑料不但可應用于低值易耗日用品行業(yè)，而且由于它的一些特殊性質，如生物相容性、光學活性、壓電性、氣體相隔性等，有可能在某些高附加值領域(如組織工程)得以應用，對PHA的研究已經(jīng)成為一個基礎理論與實踐應用結合得非常緊密的分支領域。
根據(jù)PHA單體組分的碳鏈長短，可將PHA分為三種類型(1)短鏈PHA(short-chain-length PHA，SCL-PHA)，單體含3-5個碳原子，如聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutyrate，PHB)、羥基丁酸與羥基戊酸共聚的聚羥基丁酸羥基戊酸酯PHBV，[poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate)]。
(2)中長鏈PHA(medium-chain-length PHA，MCL-PHA)，單體含6個以上碳原子，如聚羥基己酸酯(PHHx)、聚羥基辛酸酯(PHO)。
(3)含短鏈與中長鏈單體的PHA，多是兩種或兩種以上單體的隨機共聚物(Lageveen RG，Huisman GW，Preusting H，Ketelaar H，Eggink G and WitholtB.Formation of Polyesters by Pseudomonas oleovoransEffect of Substrateson formation and composition of poly-(R)-3-hydroxyalkanoates andpoly-(R)-3-hydroxyalkenoates.Appl.Environ.Microbiol，1988，542924-2932)。
PHA的積累對于產(chǎn)生菌本身適應外界環(huán)境的變化及逆境生存具有重要的意義。以PHB為例，有些細菌胞內(nèi)的PHB可以減緩細胞內(nèi)重要成分-RNA和蛋白質在饑餓條件下的降解，從而可以增加細菌對生存逆境的抵抗能力。在某些芽孢桿菌屬中，盡管孢子的形成并不必需PHB，但PHB可以作為孢子形成時的能源和碳源從而增加這些菌的生存機會。此外，PHB還可以為某些固氮菌屬的包囊形成提供必要的碳源和能源。對Rhizobium sp.ORS 571的固氮與PHB的形成及降解的研究表明，當節(jié)結中的氧濃度增加時，可以通過PHB降解保護固氮酶不受損傷(Anderson AJ andDawes EA.Occurense，Metabolism，Metabolic Role，and Industrial Use ofBacterial Polyhydroxyalkanoates.Microb.Rev.，1990，54450-472)。不同類型PHA在細菌內(nèi)的合成途逕是不同的(Lee SY.BacterialPolyhydroxyalkanoates.Biotech.Bioeng.1996，491-14)，目前已知的合成途徑主要有1.由乙酰輔酶A直接合成PHB途徑以羅氏真氧菌(Wautersia eutropha H16，又名Ralstonia eutropha，Alcaligenes eutrophus)為代表的PHB生物合成系統(tǒng)包含三種酶由一個合成操縱子基因phbCAB編碼β-酮基硫解酶(β-ketothiolase)、NADPH依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶(acetoacyl-CoA reductase)和PHB合成酶(PHB synthase)；三種酶分別由phbA、phbB和phbC基因編碼，由同一個啟動子調(diào)控表達。細胞內(nèi)的代謝中間體乙酰輔酶A在β-酮基硫解酶(β-ketothiolase，PhaA)的催化作用下形成乙酰乙酰輔酶A，然后在NADPH依賴的還原酶(PhaB)的作用下還原為(R)-羥基丁酰輔酶A，(R)-羥基丁酰輔酶A在PHB合成酶的作用下聚合成PHB，合成過程需要消耗還原力NADPH，產(chǎn)生NADP(Schubert P，SteinbüchelA，Schlegel HG.Cloning of Alcaligenes eutrophuspoly-β-hydroxybutyrate synthetic pathway and synthesis of PHB inEscherichia coli.J.Bacteriol.1988，1705837-5847；Peoples O P，Sinskey A J.Poly-β-hydroxybutyrate biosynthesis in Alcaligeneseutrophus H16.Identification and characterization of the PHBpolymerase gene(phbC).J.Biol.Chem.1989，26415298-15303)。
2.脂肪酸從頭合成途徑以惡臭假單胞菌(Pseudomonas putita)為代表，該條途徑合成PHA需要兩種酶的催化phaG編碼的3-羥?；??；D移蛋白-輔酶A轉移酶(3-Hydroxyacyl-ACP-CoA transferase)和phaC編碼的PHA合酶。脂肪酸從頭合成途徑的中間體3-羥?；??；D移蛋白由3-羥酰基-?；D移蛋白-輔酶A轉移酶(PhaG)催化形成PHA的前體3-羥基酯酰輔酶A，再由PHA合酶聚合成PHA。惡臭假單胞菌(Pseudomonas putita)的3-羥?；??；D移蛋白-輔酶A轉移酶PhaG的編碼基因phaG的Genbank登錄號是AF052507(Rehm BH，KrugerN and SteinbuchelA.A new metabolic link between fatty acid de novosynthesis and polyhydroxyalkanoic acid synthesis.The phaG gene fromPseudomonas putida KT2440 encodes a 3-hydroxyacyl-acyl carrierprotein-coenzyme A transferase.1998.J.Biol.Chem.273(37)，24044-24051)。
3.β-氧化途徑以嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)為代表，從這條途徑合成PHA需要一種結構蛋白和另外兩種酶的催化作用phaP編碼一種結合PHA顆粒表面的結構蛋白，phaJ編碼(R)-烯?；?水合酶((R)-enoyl-CoA hydratase)和phaC編碼PHA合酶。脂肪酸β-氧化的中間體烯?；??；D移蛋白由(R)-烯酰基-水合酶(PhaJ)催化形成PHA的前體3-羥基酯酰輔酶A，再由PHA聚合酶聚合成PHA。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的三個PHA合成相關基因組成一個操縱子(PHA synthase operon)，操縱子編碼基因的Genbank檢索號是AY093685，包括PhaP，PhaJ和PhaC的編碼基因(Lu XY，Wu Q，Chen JY，ZhangWJ，Zhang G and Chen GQ.Molecular cloning of polyhydroxyalkanoatessynthesis operon from Aeromonas hydrophila and its expression in E.coli.Biotech Prog 20(2004)1332-1336)。
在PHA的代謝途徑中，既有能量的代謝(NAD/NADH，NADP/NADPH等)，也有物質的代謝(乙酰輔酶A，脂肪酸等)，因此PHA的代謝過程，實際上是一個細胞內(nèi)能量和物質的改變過程。由于PHA代謝有益于宿主細胞，能夠廣泛存在于各種原核或真核細胞中，因此可以將各種PHA合成機制作為調(diào)節(jié)手段應用于不同的微生物，從而調(diào)節(jié)其物質和能量的代謝流和代謝水平，進一步影響細胞生長代謝(張晉宇。(2005)表達phbCAB基因對獸疫鏈球菌中乳酸和透明質酸產(chǎn)量的影響。清華大學碩士學位論文。)。
酵母是基因工程最常用的外源基因真核表達系統(tǒng)，但常規(guī)酵母質粒表達系統(tǒng)，即釀酒酵母(S accharomyces cerevisiae)質粒不穩(wěn)定導致表達效率低。80年代末，國外一些科研工作者開始對非常規(guī)酵母(non-conventional yeast)表達體系進行了探索，其中包括巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)以及多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)等(Wegner，G.Emerging applications of the methylotrophic yeasts.FEMS Microbiol.Rev.1990，7，279-283)。其中，以甲醇作為唯一碳源的巴斯德畢赤氏酵母外源基因表達體系最引人注目。這是由于巴斯德畢赤氏酵母體系的獨特優(yōu)點(1)高表達，它能利用很強的啟動子，具有極快的細胞生長速度，所以表達量相對很高。(2)高穩(wěn)定，該系統(tǒng)的載體能和細胞基因組進行整合，所以構建的重組菌株遺傳性狀穩(wěn)定，一般不會出現(xiàn)外源基因隨生長繁殖而丟失的現(xiàn)象。(3)嚴緊調(diào)控，外源基因在醇氧化酶啟動子的嚴緊調(diào)節(jié)控制下，可通過加入甲醇而誘導外源基因表達(Cregg JM，Ceregino JL，Shi J，et al.Recombinant protein expressioninPichia Pastoris.Molecular Biotechnology 2000，1623-52)。
乙醇氧化酶(alcohol oxygenase，AOX)催化甲醇代謝的第一步，甲醇被氧化成為甲醛和H2O2，部分甲醛進一步被胞漿脫氧酶氧化成甲酸和CO2，同時這一過程為細胞生長提供能量。乙醇氧化酶只有在細胞在甲醇培養(yǎng)基中生長才高水平表達(占總可溶性蛋白的30％)，在其他碳源如葡萄糖、甘油或乙醇中幾乎無法檢測到(Couderc，R.and Baratti，J.Oxidation of methanol by the yeast Pichiapastorispurification and properties of alcohol oxidase.Agric.Biol.Chem.1980，44，2279-2289)。畢赤酵母表達載體含有乙醇氧化酶基因5′AOX1啟動子、3′AOX1終止子，這兩段序列之間是供外源基因插入的多克隆位點。通常以組氨醇脫氫酶(Histidinol dehydrogenase，HIS)基因HIS4作為營養(yǎng)互補型篩選標志或Zeocin及卡那霉素基因(kanamycin，Kana)賦予酵母的遺傳霉素(G418)抗性作為篩選標志。作為一個能在大腸桿菌中繁殖、擴增的穿梭質粒，它還含有pBR322質粒的部分序列和氨芐青霉素(Amp，Ampicillin)抗性基因的篩選標志，表達載體通過同源重組整合到酵母細胞染色體DNA中。重組時用DNA內(nèi)切酶Bg1 II、Dra I和Sal I等線性化表達載體，通過電轉化等方法使之整合于酵母基因組內(nèi)的AOX1基因的位置，整合后的外源基因可隨酵母的生長穩(wěn)定地傳代(Cregg JM，Ceregino JL，Shi J，et al.Recombinant protein expressionin PichiaPastoris.Molecular Biotechnology 2000，1623-52)。
目前應用最廣泛的甲醇快速利用型宿主是Cregg等1985年構建的GS115菌株，它含有AOX1和AOX2基因，在含有甲醇的培養(yǎng)基中生長迅速(Mut+)(Cregg JM，Vedvick TS，Raschke WC，Recent advances in the expression of foreign genesin Pichia pastoris.Bio/Technology.11(1993)905-910)。載體轉化入酵母后主要以插入或置換兩種方式與酵母基因組發(fā)生重組。含有AOX1基因序列的表達載體既可以在酵母基因組AOX1或HIS4位點發(fā)生單交換(Single crossover)，插入到酵母基因組中；也可以發(fā)生雙交換(Double crossover)而取代AOX1基因，以何種方式發(fā)生重組都可以同時有多個拷貝整合到基因組中，而且整合的基因拷貝數(shù)不同，表達量也有很大差異，通常情況下，拷貝數(shù)越多表達量越高。AOX1啟動子(PAOX1)受甲醇的嚴格調(diào)控，在碳源為非甲醇的條件下，AOX1基因轉錄的mRNA檢測不到，但在甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中，AOX1基因編碼的mRNA可達到總RNA的5％，AOX1則占可溶性蛋白的30％，由此可見甲醇的添加可以誘導AOX1基因轉錄水平的提高。在PAOX1調(diào)控下表達外源基因時，可通過調(diào)節(jié)甲醇而適時地控制表達過程，這樣可以有效地減輕宿主選擇壓力，保證外源基因的穩(wěn)定存在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高酵母菌甲醇耐受性的方法。
本發(fā)明所提供的提高酵母菌甲醇耐受性的方法，是將聚羥基脂肪酸酯合成途徑相關基因導入酵母菌。
所述聚羥基脂肪酸酯合成途徑相關基因選自下述1)，2)和3)中的任意一種1)由phbC，phbB和phbA組成的phbCAB基因；2)phaG和phaC基因；3)phaPCJ。
所述聚羥基脂肪酸酯合成途徑相關基因優(yōu)選為phaPCJ。
所述phbC具有Genbank登錄號為J05003的自5′端第842位至2611位脫氧核苷酸組成的核苷酸序列；所述phbA具有Genbank登錄號為J04987的自5′端第40位至1221位脫氧核苷酸組成的核苷酸序列；所述phbB具有Genbank登錄號為J04987的自5′端第1296位至2036位脫氧核苷酸組成的核苷酸序列。
所述phaPCJ基因優(yōu)選為嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila 4AK4)的phaPCJ(序列1)，Genbank登錄號為AY093685。
序列1由2920個脫氧核苷酸組成，其編碼序列為自序列1的5′端第292位至2920位脫氧核苷酸。
所述phaG基因具有序列表中序列2的核苷酸序列(Genbank登錄號為AF052507)，其編碼序列為自序列2的5′端第912位至1799位脫氧核苷酸；所述phaC基因具有序列1的自5′端第735位至2519位脫氧核苷酸組成的序列。
上述PHA合成途徑相關基因可以通過多種途徑導入酵母菌中，例如，利用表達載體如質粒、粘粒、噬菌體等，通過轉化、轉導、接合等手段導入酵母菌中；也可以利用原生質體融合等手段來實現(xiàn)。具體可將PHA合成途徑相關基因克隆到針對于目的菌的質粒載體上，將構建的質粒導入到目的菌中獲得重組菌。PHA合成途徑相關基因可以在質粒上或整合到染色體上。
所述phaPCJ可通過pPIC3.5K-phaPCJ導入酵母菌；所述pPIC3.5K-phaPCJ是將phaPCJ插入pPIC3.5K的BamHI和EcoRI識別位點間得到的重組表達載體。
本發(fā)明優(yōu)選電擊轉化的方法將構建在酵母胞內(nèi)高效表達載體pPIC3.5K上的重組質粒pPIC3.5K-phaPCJ導入優(yōu)選的宿主細胞巴斯德畢赤酵母(Pichia pastorisGS115)。為提高轉化效率，將重組質粒表達載體導入目的菌中的方法優(yōu)選為電轉化法，但也可以采用其它生物工程領域中常用的方法，包括熱激法、原生質體轉化法和接合轉化法。
上述酵母菌為嗜甲醇酵母。
所述嗜甲醇酵母可為巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)或多形漢遜酵母(Hansenula polymopha)。
所述巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)優(yōu)選為巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris)GS115。
雖然甲醇對于畢赤酵母誘導表達蛋白是必需和有益的，但是由于酵母對于甲醇的耐受性有限，因此當甲醇濃度高時將抑制菌體生長(抑制菌體生物量，細胞干重)，從而進一步限制了目的蛋白的表達(趙菁菁，茹炳根.山蛭素(haemadin)在畢赤甲醇酵母中的表達及其性質鑒定.北京大學學報(自然科學版)，Vol.41，No.4，2005.p506-512)。本發(fā)明通過向巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)GS115中導入聚羥基脂肪酸酯合成途徑相關基因，獲得了能夠快速生長和更高甲醇耐受性的酵母表型突變株。本發(fā)明運用基因工程及微生物發(fā)酵相結合的方法，創(chuàng)造性地優(yōu)化改造了酵母菌的生理代謝途徑，從而促進酵母菌快速生長，為實現(xiàn)更低成本更高蛋白質產(chǎn)量提供了優(yōu)良的宿主菌株。本發(fā)明進一步表明PHA的產(chǎn)生對宿主代謝過程及生理功能的維持有重要的意義，而且外源導入PHA生物合成途徑對宿主是有益的。
本發(fā)明所提供的提高酵母菌甲醇耐受性的方法，是通過基因工程的手段在甲醇酵母中導入異源PHA合成途徑的相關基因，實現(xiàn)在甲醇酵母中建立PHA合成途徑，營造PHA代謝途徑與宿主固有途徑的交互作用(cross-talking)，從而影響細胞的整個代謝網(wǎng)絡。將本發(fā)明的方法應用到各種酵母菌中，可以有效的影響酵母菌的代謝途徑，增加宿主酵母菌的抗逆性，提高目標產(chǎn)物的生物合成產(chǎn)量。
在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領域的普通技術人員可以在形式和細節(jié)上對其做出各種改變和改進，這些均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)，如利用密碼子簡并原則或堿基互補原則所獲得的與本發(fā)明的聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關基因功能基本相同的核酸分子，對于聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關酶，在其不起主要作用的位點進行氨基酸插入和/或缺失和/或替換所得到的功能基本相同的蛋白質或多肽的編碼基因，來實現(xiàn)本發(fā)明的目的，均被認為落入了本發(fā)明的保護范圍。


圖1為pPIC3.5K-phaPCJ的物理圖譜圖2為轉pPIC3.5K-phaPCJ的宿主菌與轉pPIC3.5K的宿主菌用2％甲醇誘導48小時的細胞干重柱狀3為轉pPIC3.5K-phaPCJ的宿主菌與轉pPIC3.5K的宿主菌用2％甲醇誘導不同時間的細胞干重柱狀4為轉pPIC3.5K-phaPCJ的宿主菌與轉pPIC3.5K的宿主菌的蛋白質印跡分析圖譜具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
實施例1、提高巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)GS115的甲醇耐受性1、酵母胞內(nèi)表達重組質粒pPIC3.5K-phaPCJ的構建構建重組質粒pPIC3.5K-phaPCJ包括以下步驟1)目的基因的獲得用細菌基因組DNA提取試劑從嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)(購自中國科學院微生物研究所“中國普通微生物純培養(yǎng)物保藏中心”)中提取基因組DNA作為模板，以phaPCJ基因特異性上、下游引物(phaPCJ-upper-BamHI5’＞TTG GAT CCT GGA GAC CGA TGA TGA ATA TG＜3’；phaPCJ-lower-Eco RI5’＞ATG AAT TCT TAA GGC AGC TTG ACC ACG G＜3’)進行目的基因片段(2641bp)的PCR擴增、純化，結果得到2641bp的PCR片段。其中，50μl PCR反應體系包括1μl基因組DNA模板，1μl上游引物，1μl下游引物，5μl PCR反應緩沖液(10×)，6μl dNTP混合物，35.5μl滅菌去離子水，0.5μl高保真聚合酶(pyrobest polymerase)；PCR條件如下先95℃預變性8min；然后94℃變性1min，65℃退火1min，72℃延伸2min，30個循環(huán)后，72℃后延伸10min。
2)目的基因與載體的雙酶切和連接
從美國Invitrogen公司購買到酵母胞內(nèi)表達載體pPIC3.5K。用TaKaRa公司的限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI在37℃8小時酶切載體與步驟1)得到的2641bp的PCR片段后，用T4DNA連接酶連接已酶切純化的載體和目的基因DNA，載體與插入片段的摩爾比為1∶3，10ul連接體系，16℃保溫24h。
3)重組質粒的轉化和驗證將步驟2)的10μl連接混合物與50μl大腸桿菌感受態(tài)細胞E.coli JM109混合，預冷，加入1mm電擊杯中，1.25Kv電擊轉化，迅速加入1ml LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，取200μl涂布含有50μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素雙抗LB平板，37℃培養(yǎng)12～16h挑取陽性克隆，接入4ml含雙抗(50μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素)LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8小時，取3ml提取質粒，進行PCR驗證，以陽性克隆質粒為模板，使用目的基因phaPCJ基因特異性引物phaPCJ-upper-BamHI和phaPCJ-lower-EcoRI進行PCR擴增。將PCR擴增能得到2.6kb DNA片段的陽性克隆質粒進行DNA測序分析，確保翻譯讀碼框正確。將具有自序列1的5′端第292位至2920位脫氧核苷酸的phaPCJ基因片段的質粒命名為pPIC3.5K-phaPCJ(圖1)。
2、重組酵母陽性轉化子的獲得1)重組質粒線性化采用Sal I酶切線性化重組質粒pPIC3.5K-phaPCJ。
2)畢赤酵母感受態(tài)細胞的制備和轉化實驗操作程序a)從美國Invitrogen公司購買到甘油管保存的酵母宿主菌株(Pichiapastori5)GS115，劃線于YPD瓊脂平板上，于30℃活化培養(yǎng)2天。挑取單菌落接種于裝有1ml YPD液體培養(yǎng)基的試管中，于30℃震蕩培養(yǎng)1天。
b)把新鮮培養(yǎng)的酵母按10％(體積比)的接種量轉移到裝有10ml YPD液體培養(yǎng)基的150ml三角瓶中，于30℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至OD600值為1.4-1.5。
c)移取1ml培養(yǎng)液于EP離心管中，于4℃低溫離心5分鐘(5000rpm)，棄去上清液。以1ml含有20mM HEPES和37.5μl的1M DTT的YPD溶液懸浮酵母細胞沉淀，于30℃培養(yǎng)15分鐘。于4℃低溫離心5分鐘(5000rpm)，棄去上清液。
d)取1.5ml1M山梨醇懸浮酵母細胞沉淀，于4℃低溫離心5分鐘(5000rpm)，棄去上清液，共進行3次；也就是用1M山梨醇洗酵母細胞三次。
e)用20μl 1M山梨醇懸浮酵母細胞，合并2管，得到40μl的電感受態(tài)酵母GS115，取5μl經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sac I線性化的表達載體pPIC3.5K-phaPCJ和40μl的電感受態(tài)酵母GS115混合。
f)電擊杯(0.2cm)放置冰上預冷，將轉化混合物轉移到電擊杯中，吸干杯的外表面，放入電轉化儀的樣品槽中，進行電轉化；g)取出電擊杯，迅速加入1毫升含有180.2mg山梨醇的YPD培養(yǎng)基，并用滅菌槍頭轉移到滅菌的Eppendorf管中，30℃培養(yǎng)1.5小時。
h)取培養(yǎng)液涂布于含有1mg/mL抗生素G418(遺傳霉素，Geneticin)的YPD平板上，于30℃培養(yǎng)2-5天后出現(xiàn)抗性菌落，挑取抗性菌落，用phaPCJ基因特異性上、下游引物(phaPCJ-upper-BamH I5’＞TTG GAT CCT GGA GAC CGA TGA TGAATA TG＜3’；和phaPCJ-lower-EcoR I5’＞ATG AAT TCT TAA GGC AGC TTG ACCACG G＜3’)進行菌落PCR，結果獲得四個可擴增到2.6kb的PCR片段的陽性酵母菌落，說明pPIC3.5K-phaPCJ整合到基因組DNA上了。將陽性酵母菌分別命名為P7-I GS115/pPIC3.5K-phaPCJ，P12-H GS115/pPIC3.5K-phaPCJ，P13-1 GS115/pPIC3.5K-phaPCJ，P18-2 GS115/pPIC3.5K-phaPCJ。
按照上述步驟2的方法，用pPIC3.5K轉化酵母宿主菌株(Pichia pastoris)GS115，得到含有pPIC3.5K的重組酵母WT GS115，作為對照宿主菌。
3、陽性重組畢赤酵母的誘導培養(yǎng)貯備液、培養(yǎng)基配制如下磷酸緩沖液(200ml)45.6g K2HPO4，7ml H3PO4。
13.4％酵母氮素堿基(10×YNB)0.45μm濾器過濾除菌。
500×生物素(0.02％Biotin)0.45μm濾器過濾除菌。
甲醇0.45μm濾器過濾除菌。
A)生長培養(yǎng)基(改良BMGY)配制酵母浸出物 1g胰蛋白胨 2g甘油 2ml蒸餾水定容至78ml，121℃滅菌20min再加入磷酸緩沖液 10ml，10×YNB10ml，500×生物素2ml。
總體積 100ml
B)誘導表達培養(yǎng)基(改良BMYY)配制酵母浸出物 1g胰蛋白胨2g蒸餾水定容至76ml，121℃滅菌20min再加入磷酸緩沖液 10ml10×YNB 10ml甲醇2ml500×生物素 2ml總體積 100ml將含phaPCJ基因的重組酵母P7-I GS115/pPIC3.5K-phaPCJ，P12-HGS115/pPIC3.5K-phaPCJ，P13-1 GS115/pPIC3.5K-phaPCJ，P18-2GS115/pPIC3.5K-phaPCJ，只含pPIC3.5K的重組酵母WT GS115，分別在生長培養(yǎng)基中生長2天(48h)后，在無菌條件下離心，更換甲醇誘導培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2天(48h)后，收獲細胞，低溫冷凍干燥細胞，稱量細胞干重，結果如圖2所示，表明重組酵母P7-I GS115/pPIC3.5K-phaPCJ，P12-H GS115/pPIC3.5K-phaPCJ，P13-1 GS115/pPIC3.5K-phaPCJ和P18-2 GS115/pPIC3.5K-phaPCJ的細胞干重均明顯高于只含pPIC3.5K的重組酵母WT GS115，與WT GS115相比有更加優(yōu)越的生長特性。
將重組酵母菌P7-I GS115/pPIC3.5K-phaPCJ，P12-H GS115/pPIC3.5K-phaPCJ，P13-1 GS115/pPIC3.5K-phaPCJ，P18-2 GS115/pPIC3.5K-phaPCJ和WT GS115分別在生長培養(yǎng)基中生長2天(48h)后，在無菌條件下離心，更換甲醇誘導培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h、96h、144h后，收獲細胞，低溫冷凍干燥細胞，稱量細胞干重，結果如圖3所示，不同甲醇誘導時間(48h，96h，144h，甲醇濃度v/v 2％)的細胞干重，進一步證實重組酵母菌P7-I GS115/pPIC3.5K-phaPCJ，P12-HGS115/pPIC3.5K-phaPCJ，P13-1 GS115/pPIC3.5K-phaPCJ和P18-2 GS115/pPIC3.5K-phaPCJ比對照宿主菌WT GS115擁有更加優(yōu)越的細胞生長特性和更高的甲醇耐受性。一般在重組畢赤酵母中誘導表達外源蛋白質，為了提高蛋白質表達量，在誘導培養(yǎng)二天后通過補加0.5％(V/V)的甲醇以達到目的。在本發(fā)明的實驗中，補加的甲醇量可以達到2％(V/V)而不影響細胞生長。圖3中，P7-I GS115，P12-H GS115，P13-I GS115，P13-I GS115，P18-II分別表示P7-I GS115/pPIC3.5K-phaPCJ，P12-H GS115/pPIC3.5K-phaPCJ，P13-1 GS115/pPIC3.5K-phaPCJ和P18-2 GS115/pPIC3.5K-phaPCJ。
實施例2、Western blott ing檢測含有phaPCJ的重組酵母表達phaP和phaJ異源基因的情況1、PhaP和PhaJ抗血清的制備(1)制備純化的可溶蛋白質PhaP和PhaJ設計PhaP基因特異性引物phaP-upper-BamH I5’＞TTG GAT CCT GGA GAC CGATGA TGA ATA TG＜3’、phaP-lower-HindIII5’＞AATAAG CTTGGC CTT GCC CGTGCT CTT C＜3’；和PhaJ基因特異性引物phaJ-upper-BamH I5’＞TAT TGG ATC CATGAG CGC ACA ACC CCT TG＜3’、phaJ-lower-Hind III5’＞AATAAG CTTAGG CAGCTT GAC CAC GGC＜3’，分別以酵母重組質粒pPIC3.5K-phaPCJ為模板，PCR擴增獲得特異的DNA片段phaP和phaJ。從德國NOVAGEN公司購得原核表達載體pET28a(+)，將載體pET28a(+)用BamH I和HindIII酶切后與特異的DNA片段phaP和phaJ分別進行連接和轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞E.coJi BL21(DE3)。在卡那霉素抗性平板上篩選陽性克隆，小量表達實驗篩選過量表達帶有組氨酸融合標簽蛋白質的重組菌。純化帶組氨酸標簽的蛋白質的親和層析方法參照鎳柱(Ni-NTAResin，Qiagen公司)使用說明書進行，得到純化的帶有組氨酸融合標簽的PhaP和PhaJ蛋白質。
(2)小鼠的免疫及PhaP和PhaJ多克隆抗血清的制備實驗動物BALB/C小白鼠，注射途徑為腹腔注射。
初次免疫，5-10μg步驟(1)制備的PhaP和PhaJ分別溶解于磷酸(PBS)緩沖液中，加入等體積弗氏完全佐劑混合乳化，乳化好后立即使用。為了獲取高質量(高滴度和高親和力)的抗血清，有必要對實驗動物作加強注射。初次免疫后第15天進行第一次加強免疫，加強免疫注射的劑量為初次免疫劑量的1/2(一半)，隔兩周加強免疫一次，共進行3次。第三次加強注射后第三天，分別從免疫的BALB/C小白鼠尾部取血50μL，室溫放置2小時后離心，取血清即獲得抗PhaP的多克隆抗血清和抗PhaJ的多克隆抗血清。對每一動物作免疫接種前先采集血樣，得到的正常血清作免疫印跡時的陰性對照。
2、Western blotting檢測含有phaPCJ的重組酵母表達phaP和phaJ的情況根據(jù)抗原-抗體分子間特異性識別、結合的原理設計重組酵母菌表達PHA合成相關蛋白質的免疫檢測實驗。
分別取實施例1中甲醇誘導48小時的1ml誘導表達的酵母轉化子P7-IGS115/pPIC3.5K-phaPCJ和WT GS115菌液離心，收集菌體，加入100μl 0.5MTris(pH6.8)緩沖液懸浮細胞后，加入25μl 4×SDS-PAGE上樣緩沖液(4×SDS-PAGE上樣緩沖液的配方為50mg SDS，4mg溴酚藍，1mlβ-巰基乙醇，3ml甘油，2ml 0.5M Tris(pH6.8)緩沖液，4ml去離子水，總體積10ml)，煮沸裂解。取25μl細胞裂解液制備成的胞內(nèi)蛋白樣品進行SDS-PAGE和Western blotting。SDS-PAGE后，電轉移膠上的表達蛋白質到NC膜上(電轉條件Tris-glycine緩沖液(Tris-glycine緩沖液的配方為5.8g Tris，2.9g glycine，0.37g SDS溶于800ml去離子水，加入200ml甲醇)，20伏，4℃，2小時)，對固定于電轉膜上的蛋白質進行麗春紅S染色[(具體方法見分子克隆實驗指南第二版P893)Ponceau S，Sigma P3504；0.1％麗春紅溶解于5％(v/v)的冰乙酸，麗春紅S染色法可與后續(xù)免疫學檢測方法兼容]，該染料只會短暫顯色而且在進行印跡分析時可被洗去。染色后，用蒸餾水洗去染液。加入1％無鈣的脫脂奶粉封閉液(1克無鈣的脫脂奶粉溶于磷酸緩沖液，pH7.4)，在轉速為60rpm的搖床上室溫處理2-4小時，封閉膜上剩余的疏水結合位點；棄去封閉液，分別以步驟1制備的PhaP多克隆抗血清和phaJ多克隆抗血清作為一抗血清，用磷酸緩沖液以1∶400的體積比稀釋，在緩慢搖床上室溫處理45分鐘后，用磷酸緩沖液洗三次，每次10分鐘；加入二抗(兔抗鼠IgG，偶聯(lián)HRP)，以1∶2000體積比稀釋(5微升二抗加入10毫升的磷酸緩沖液中)，在緩慢搖床上室溫處理45分鐘后，用磷酸緩沖液洗三次，每次10分鐘；加入0.6mg/mL DAB的底物溶液和15uL的過氧化氫(6mg DAB溶于10mL的磷酸緩沖液)顯色。結果如圖4所示，含有pPIC3.5K-phaPCJ的酵母轉化子P7-IGS115/pPIC3.5K-phaPCJ表達了14kDa的PhaP，19kDa的PhaJ。而轉化了空載體的對照宿主菌WT GS115中沒有PhaP和PhaJ的表達。圖4中，1為含有pPIC3.5K-phaPCJ的酵母轉化子P7-I GS115/pPIC3.5K-phaPCJ的總細胞蛋白質與phaJ多克隆抗血清的雜交結果，2為轉空載體的對照宿主菌WT GS115與phaJ多克隆抗血清的雜交結果，3為轉空載體的對照宿主菌WT GS115與phaP多克隆抗血清的雜交結果，4為含有pPIC3.5K-phaPCJ的酵母轉化子P7-IGS115/pPIC3.5K-phaPCJ的總細胞蛋白質與phaP多克隆抗血清的雜交結果。
該結果表明PHA生物合成相關基因在含有pPIC3.5K-phaPCJ的重組酵母中獲得了準確轉錄和正確翻譯，同時說明PHA生物合成代謝賦予了含有pPIC3.5K-phaPCJ的重組酵母更快的生長優(yōu)越性和更高的甲醇耐受性(如前所述，補加甲醇從0.5％提高到2％)。對甲醇的耐受性提高的機理可能是含phaPCJ基因的重組畢赤酵母由于更加快速的生長和芽殖，需要更多的甲醇作為碳源；反之，更高的甲醇濃度提供了更多的碳源供重組畢赤酵母更加快速的生長和芽殖以產(chǎn)生更大量的外源蛋白質，從而形成良性循環(huán)。
序列表<160>2<210>1<211>2920<212>DNA<213>嗜水氣單胞菌(Aeromonnas hydrophila)<400>1gcagtctgaa taagcttcca gcctatcagc gcggcgccag cacggcgagg gagcatcggg 60tcccgtgcgt cacctctcgt ctgacccacg cccccgacgg aggtcgctga caaaaaaatt 120caaacagaaa ttaacattta tgtcatttac accaaaccgc atttggttgc agaatgctca 180aacgtgtgtt tgaacagagc aagcaacacg taaacaggga tgacatgcag tacccgtaaa 240aagggccgat tggcccacaa caacactgtt ctgccgaact ggagaccgat gatgaatatg 300gacgtgatca agagctttac cgagcagatg caaggcttcg ccgcccccct cacccgctac 360aaccaactgc tggccagcaa catcgagcag ctgacccggt tgcagctggc ctccgccaac 420gcctacgccg aactgggcct caaccagttg caggccgtga gcaaggtgca ggacacccag 480agtctggctg ccctcggcac agtgcagctg gagaccgcca gccagctctc ccgccagatg 540ctggacgaca tccagaagct gagcgccctc ggccagcagt tcaaggaaga gctggatgtc 600ctgaccgcgg acggcatcaa gaagagcacg ggcaaggcct gataacccct ggctgcccgt 660tcgggcagcc acatctcccc acgactcgac gctacgggct agctcccgcc tcgggtgtgg 720gtgaaggaga gcacatgagc caaccatctt atggcccgct gttcgaggcc ctggcccact 780acaatgacaa gctgctggcc atggccaagg cccagacaga gcgcaccgcc caggcgctgc 840tgcagaccaa tctggacgat ctgggccagg tgctggagca gggcagccag cagccctggc 900agctgatcca ggcccagatg aactggtggc aggatcagct caagctgatg cagcacaccc 960tgctgaaaag cgcaggccag cagagcgagc cggtgatcac cccggagcgc agcgatcgcc1020gcttcaaggc cgaggcctgg agcgaacaac ccatctatga ctacctcaag cagtcctacc1080tgctcaccgc caggcacctg ctggcctcgg tggatgccct ggacggcgtc ccccagaaga1140gccgggagcg gctgcgtttc ttcacccgtc agtacgtcaa cgccatggca cccagcaact1200tcctggccac caacccggag ctgctcaagc tcaccctgga gtccgacggc cagaacctgg1260tgcgcgggct ggccctcttg gccgaggatc tggagcgcag cgccgatcag ctcaacatcc1320gcctgaccga cgaatccgcc ttcgagctcg gccgggatct ggcgaccacc ccgggccggg1380
tggtgcagcg caccgagctc tatgagctga tccagtacag ccccaccacg gaaaccgtgg1440gcaagacgcc tgtgctgatc gtgcccccct tcatcaacaa gtactacatc atggacatgc1500ggccccagaa ctccctggtc gcctggctgg tcgcccaggg ccagacggtg ttcatgatct1560cctggcgcaa cccgagcgta gcccaggccc aaatcgatct cgacgactac gtggtggatg1620gcgtcatcgc cgccctggac ggcgtggaag cggccaccgg cgagcgggag gtgcacggca1680tcggctactg catcgacggc accgccctgt cgctcgccat gggctggctg gcggcgcggc1740gccagaagca gcgggtgcgc actgccaccc tgttcaccac cctgctggac ttctcccagc1800cgggggagct tggcatcttc attcacgagc ccatcatagc ggcgctcgag gcgcaaaatg1860aggccaaggg catcatggac gggcgccagc tggctgtctc tttcagcctg ctgcgggaga1920acagcctcta ctggaactac tacatcgaca gctacctcaa gggtcagagc ccggtggcct1980tcgatctgct gcactggaac agcgacagca ccaatgtggc gggcaagacc cacaacagcc2040tgccgcgccg tctctatctg gagaaccagc tggtgaaggg ggagctcaag atccgcaaca2100cccgcatcga tcttggcaag gtgaagaccc ctgtgctgct ggtgtcggcg gtggacgatc2160acatcgccct ctggcagggc acctggcagg gcatgaagct gtttggcggg gagcagcgct2220tcctcctggc agagtccggc cacatcgccg gcatcatcaa cccgccggtc gccaacaagt2280acggcttctg gcacaacggg gccgaggccg atagcccgga gagctggctg gcaggggcga2340cgcatcagag cggctcctgg tggcccgaga tgatgggctt tatccagagc cgtgacgaag2400ggtcagagcc cgtccccgca cgggtgcccg aggaggggct ggcccccgcc cccggccact2460atgtcaaggt gcggctcaac cccgtgtttg ccagcgccac agaggaggac gccgcatgag2520cgcacaaccc cttgaagtgg gccagaaggc ccgtctcagc aagcggttcg gggcggcaga2580ggtggccgcc ttcgccgcgc tctcggagga tttcaaccct ctgcaccttg atccggcctt2640cgccgccacc acggcgttcg agcgacccat cgtccacggc atgctgctgg ccagcctctt2700ctccgggctg ctgggccagc agttgccggg caaggggagc atctatctgg gccagagcct2760cagcttcaag ctgccggtct ttgtcgggga tgaggtgacg gccgaggtgg aggtgaccgc2820ccttcgcagc gacaagccca tcgccaccct gaccacccgc atcttcactt caaacggcgc2880cctcgccgtg acgggggaag ccgtggtcaa gctgccttaa 2920<210>2<211>3061<212>DNA<213>惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)<400>2
gaattcagcc gcgtagagct ggacgagcaa ctgctgcagg ccggccgccc ggcccgctac 60ctgatgctgt acaagcccac tggctgcgta acggccaccc acgatccgca acaccgtacc 120gttctcgacc tgctgccagc ggcgttgcga gatgacctgc acatagccgg cgcgcctgga 180cttcaacacc accggcctga tgatcctgac caacgatggc caatggtcac ggcggcctga 240ccagcctgcc accaagctgc ccaagcatta tctggtggac accgaggacg agattggcga 300gcactatgtg gccaagtttc gcgagggttt ctattttgcc ttcgaagacc tcaccaccca 360acctgcccag ctggacatcc tcggccccca ccgagcccgg ctggcgatcg tcgaggggcg 420ttaccaccag gtcaagcgca tgttcgggca tttcaacaac aaggtgatcg ggctgcatcg 480ggagagcatg ggggcgatcc ggctggatcc ggggttggcg ccgggggagt atcgtgaact 540gacggccaat gagatagcca ctgtctaggc cgtgacagac agcccgtgtc gtcatacgac 600cgctcagcga caaaagtcac attacttacc gaacggcact tgcgcgatcc ccaacccact 660gcttgaatcc aaatcgtcag tctgcatgtg actaccaagt cacacctgca gccgatgaca 720ctttttgccg gccacccaaa gcctagatgc cttggggcac ggcaaattgc ccgccaaaaa 780caataccgtc gacgcaagtg ccaaggatcg acacagggcc cccggattat cttcaggcaa 840atgcctacct gtcataaaga acgtgcaccc taggtgacgc gaataccctt tttgcgccag 900gagtcgatga catgaggcca gaaatcgctg tacttgatat ccaaggtcag tatcgggttt 960acacggagtt ctatcgcgcg gatgcggccg aaaacacgat catcctgatc aacggctcgc1020tggccaccac ggcctcgttc gcccagacgg tacgtaacct gcacccacag ttcaacgtgg1080ttctgttcga ccagccgtat tcaggcaagt ccaagccgca caaccgtcag gaacggctga1140tcagcaagga gaccgaggcg catatcctcc ttgagctgat cgagcacttc caggcagacc1200acgtgatgtc tttttcgtgg ggtggcgcaa gcacgctgct ggcgctggcg caccagccgc1260ggtacgtgaa gaaggcagtg gtgagttcgt tctcgccagt gatcaacgag ccgatgcgcg1320actatctgga ccgtggctgc cagtacctgg ccgcctgcga ccgttatcag gtcggcaacc1380tggtcaatga caccatcggc aagcacttgc cgtcgctgtt caaacgcttc aactaccgcc1440atgtgagcag cctggacagc cacgagtacg cacagatgca cttccacatc aaccaggtgc1500tggagcacga cctggaacgt gcgctgcaag gcgcgcgcaa tatcaacatc ccggtgctgt1560tcatcaacgg cgagcgcgac gagtacacca cagtcgagga tgcgcggcag ttcagcaagc1620atgtgggcag aagccagttc agcgtgatcc gcgatgcggg ccacttcctg gacatggaga1680acaagaccgc ctgcgagaac acccgcaatg tcatgctggg cttcctcaag ccaaccgtgc1740gtgaaccccg ccaacgttac caacccgtgc agcaggggca gcatgcattt gccatctgag1800cggctcggcg ccttgtagcc aatacccgca ggccacgggg cgccgacaag cttttttata1860
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1.一種提高酵母菌甲醇耐受性的方法，是將聚羥基脂肪酸酯合成途徑相關基因導入酵母菌。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述聚羥基脂肪酸酯合成途徑相關基因選自下述1)，2)和3)中的任意一種1)phbC，phbB和phbA；2)phaG和phaC；3)phaPCJ。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述聚羥基脂肪酸酯合成途徑相關基因為phaPCJ。
4.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述phbC具有Genbank登錄號為J05003的自5′端第842位至2611位脫氧核苷酸組成的核苷酸序列；所述phbA具有Genbank登錄號為J04987的自5′端第40位至1221位脫氧核苷酸組成的核苷酸序列；所述phbB具有Genbank登錄號為J04987的自5′端第1296位至2036位脫氧核苷酸組成的核苷酸序列。
5.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述phaG基因具有序列表中序列2的核苷酸序列；所述phaC基因具有序列1的自5′端第735位至2519位脫氧核苷酸組成的序列。
6.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述phaPCJ具有序列表中序列1的核苷酸序列。
7.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述phaPCJ通過pPIC3.5K-phaPCJ導入酵母菌；所述pPIC3.5K-phaPCJ是將phaPCJ插入pPIC3.5K的BamHI和EcoRI識別位點間得到的重組表達載體。
8.根據(jù)權利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于所述酵母菌為嗜甲醇酵母。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于所述甲醇酵母為巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)或多形漢遜酵母(Hansenula polymopha)。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于所述巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris)為巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)GS115。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高酵母菌甲醇耐受性的方法。該提高酵母菌甲醇耐受性的方法，是將聚羥基脂肪酸酯合成途徑相關基因導入酵母菌。本發(fā)明通過向巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris) GS115中導入聚羥基脂肪酸酯合成途徑相關基因，獲得了能夠快速生長和更高甲醇耐受性的酵母表型突變株。本發(fā)明運用基因工程及微生物發(fā)酵相結合的方法，創(chuàng)造性地優(yōu)化改造了酵母菌的生理代謝途徑，從而促進酵母菌快速生長，為實現(xiàn)更低成本更高蛋白質產(chǎn)量提供了優(yōu)良的宿主菌株。本發(fā)明進一步表明PHA的產(chǎn)生對宿主代謝過程及生理功能的維持有重要的意義，而且外源導入PHA生物合成途徑對宿主是有益的。
文檔編號C12N15/31GK1763176SQ200510098410
公開日2006年4月26日 申請日期2005年9月6日 優(yōu)先權日2005年9月6日
發(fā)明者陳國強, 趙明蓮, 吳瓊, 陳金春 申請人:清華大學