專(zhuān)利名稱(chēng)：菊酸乙酯酯酶及其編碼基因與其表達(dá)專(zhuān)用工程菌和該酶的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶及其編碼基因與其表達(dá)專(zhuān)用工程菌和該酶的應(yīng)用，特別是涉及一種菊酸乙酯酯酶及其編碼基因與其表達(dá)專(zhuān)用工程菌和該酶在生產(chǎn)(+)-反式菊酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
菊酸(Chrysanthemic acid，[2，2-二甲基-3-(2-甲基-1-丙烯基)環(huán)丙烷羧酸]，分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)式1)是一種新型、高效、低毒的擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的重要中間體，因其作為人工合成的擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的酸性部分而被廣泛地應(yīng)用于此類(lèi)殺蟲(chóng)劑的合成。此外，菊酸也是國(guó)際上最流行的美白成分之一，能夠有效抑制酪氨酸酶的活性。
式1擬除蟲(chóng)菊酯是一種模擬天然除蟲(chóng)菊酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)合成的殺蟲(chóng)劑。它的分子結(jié)構(gòu)由菊酸和醇兩部分組成。迄今為止，人工合成的擬除蟲(chóng)菊酯已近萬(wàn)種。目前廣泛使用的有20多種，以氯菊酯、溴菊酯、氯氰菊酯、甲醚菊酪，氰戊菊酯、節(jié)菊酯(敵殺死)和殺滅菊酪(速滅殺丁)等為代表。
我國(guó)于70年代開(kāi)始在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中推廣使用擬除蟲(chóng)菊酯。這類(lèi)農(nóng)藥的特點(diǎn)為對(duì)哺乳動(dòng)物毒性較低，除蟲(chóng)毒性大于胃毒，且沒(méi)有內(nèi)吸毒性；低溫效果高于高溫，在環(huán)境中持留時(shí)間短，對(duì)害蟲(chóng)的擊倒力強(qiáng)；它們除作殺蟲(chóng)劑外，尚可用于殺螨、防霉等用途?；谏鲜鎏攸c(diǎn)，該類(lèi)農(nóng)藥具有廣闊的應(yīng)用前景。
采用人工化學(xué)反應(yīng)合成擬除蟲(chóng)菊酯，一直無(wú)法解決合成產(chǎn)物中混雜幾乎無(wú)任何作用的光學(xué)異構(gòu)體的難題。合成擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的關(guān)鍵性中間體是菊酸(Campbell，I.G.M.，and S.H.Harper.The chrysanthemumcarboxylic acids.IV.Opticalresolution of the chrysanthemic acids.J.Sci.Food Agric.1952，3189-192.；Yoshioka，H.，and J.Miyamoto.Synthetic Pyrethroids(1).Chem.Biol.1976，14427-434.(In Japanese.))，它有四種同分異構(gòu)體。
研究表明，菊酸的四種立體異構(gòu)體分別與一定結(jié)構(gòu)的菊醇形成的除蟲(chóng)菊酯的殺蟲(chóng)活性相差很大，通常以(+)-反式-菊酸形成的菊酯的殺蟲(chóng)活性最高(Schneider，M.，N.Engel，and H.Boensmann.Enzymatic synthesis of chiral building blocks fromracematespreparation of(1R，3R)-chrysanthemic，-permethrinic and-caronicacids from racemic，diastereomeric mixtures.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1984，2364-66.)，因此分離菊酸的四種立體異構(gòu)體是擬除蟲(chóng)菊酯研究及生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)之一。
現(xiàn)今，國(guó)內(nèi)常利用化學(xué)拆分劑和立體異構(gòu)體光學(xué)拆分的方法進(jìn)行菊酸的化學(xué)合成，但利用生物合成的方法進(jìn)行菊酸的工業(yè)化生產(chǎn)還未見(jiàn)報(bào)道(鐘民，陳良.順式(+-)菊酸動(dòng)力學(xué)拆分研究.華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).1995，355-60.)。
國(guó)外亦主要用化學(xué)方法合成菊酸(Synthetic pyrethroids chemical WATCHfactsheet 2003，Beyond Pesticides.；Aratani，T.，Y.Yoneyoshi，and T.Nagase.Asymmetric synthesis of chrysanthemic acid.An application of copper carbenoidreaction.Tetrahedron Lett.1975，211707-1710.)。菊酸合成過(guò)程中重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)環(huán)丙烷部分的合成，依據(jù)該部分的合成方法，可把菊酸的化學(xué)合成方法歸為兩類(lèi)(a)ylide，carbenoid化學(xué)，和其它相關(guān)的[2+1]補(bǔ)充；(b)1，3-消旋和相關(guān)的2，2-dimethyldimedone同分異構(gòu)體(Stephane Jeanmart.Trends in chrysanthemic acidchemistryA survey of recent pyrethrum syntheses.Aust.J.Chem.2003，56，559-566.)。上述化學(xué)合成方法亦未能解決合成產(chǎn)物中混雜幾乎無(wú)任何作用的光學(xué)異構(gòu)體的難題。關(guān)于菊酸生物合成方法的研究，Masako nishizawa等人的研究最富有成果，但還存在一些不完善的地方，如在可溶性及分泌表達(dá)等方面仍需完善。他們用環(huán)形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)的菊酸乙酯酯酶在大腸桿菌中發(fā)酵表達(dá)，利用產(chǎn)生的菊酸乙酯酯酶生物合成(+)-反式菊酸，但獲得的菊酸乙酯酯酶的酶活力較低(Masako nishizawa，Masatoshi shimizu，Hideo ohkawa，and Masaharu kanaoka.Steroselective production of(+)-trans-chrysanthemic acid by a microbialesterasecloning，nucleotide sequence，and overexpression of the esterasegene of Arthrobacter globiformis in Escherichia coli.Applied AndEnvironmental Microbiology.1995，613208-3215.)。
環(huán)形節(jié)桿菌菊酸乙酯酯酶(ethyl chrysanthemate esterase，ECE)基因(GenBank號(hào)為L(zhǎng)22516)是從一種環(huán)形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis SC-6-98-28)中克隆得到的，此基因編碼由375個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，蛋白分子量約為40KD。它是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)能很好辨別(+/-)-cis，trans-菊酸乙酯的酯酶(Masakonishizawa，Masatoshi shimizu，Hideo ohkawa，and Masaharu kanaoka.Steroselective production of(+)-trans-chrysanthemic acid by a microbialesterasecloning，nucleotide sequence，and overexpression of the esterasegene of Arthrobacter globiformis in Escherichia coli.Applied AndEnvironmental Microbiology.1995，613208-3215.)。此酯酶能立體選擇性地水解(+)-反式-菊酸乙酯為(+)-反式-菊酸和乙醇，而對(duì)其它菊酸乙酯立體異構(gòu)體不起作用，從而為(+)-反式-菊酸的合成提供了一個(gè)良好的途徑(Nishizawa，M.，H.Gomi，and F.Kishimoto.Purification and some properties of carboxylesterase fromArthrobacter globiformisstereoselective hydrolysis of ethyl chrysanthemate.Biosci.Biotechnol.Biochem.1993，57594-598.)。與常規(guī)的擬除蟲(chóng)菊酯的化學(xué)合成方法相比，利用該酶不僅能簡(jiǎn)化流程，且能提供高度專(zhuān)一活性的擬除蟲(chóng)菊酯。研究表明，此酶穩(wěn)定性好，可利用固定化酶技術(shù)，在酶反應(yīng)器中選擇最佳條件不間斷地生產(chǎn)(+)-反式-菊酸。若能使此合成途徑高效地運(yùn)作起來(lái)，必將帶來(lái)美好的應(yīng)用前景并取得良好的經(jīng)濟(jì)效益(K.H.E.Lam，K.C.Chow，W.K.R.Wong.Construction ofan efficient Bacillus subtillis system for extracellar production ofheterologous proteins.Journal of Biotechnology 1998，63167-177.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種菊酸乙酯酯酶及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的菊酸乙酯酯酶，命名為ECE1，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有菊酸乙酯酯酶活性的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №1由375個(gè)氨基酸殘基組成。
編碼上述菊酸乙酯酯酶的基因(ECE1)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，它是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由1128個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1到第1128位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增上述菊酸乙酯酯酶編碼基因中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種菊酸乙酯酯酶的專(zhuān)用表達(dá)工程菌，是將含有上述菊酸乙酯酯酶基因ECE1的表達(dá)載體導(dǎo)入枯草芽孢桿菌中得到的。
用于構(gòu)建所述含有菊酸乙酯酯酶基因ECE1的表達(dá)載體的出發(fā)載體可為pMA5、pBE2、pSBPTQ、pC194或pM2Veg等，優(yōu)選為pMA5。
以pMA5為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有菊酸乙酯酯酶基因ECE1的表達(dá)載體為pMA5-ECE1。
所述枯草芽孢桿菌可為枯草芽孢桿菌DB1342、WB700、DB104或WB600等，優(yōu)選為枯草芽孢桿菌DB1342。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種(+)-反式菊酸的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明所提供的(+)-反式菊酸的生產(chǎn)方法，是發(fā)酵上述菊酸乙酯酯酶的專(zhuān)用表達(dá)工程菌，獲得菊酸乙酯酯酶，再加入底物(+)-反式菊酸乙酯，得到(+)-反式菊酸。
上述生產(chǎn)方法中，所述發(fā)酵用培養(yǎng)基可為普通枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基或2×MSR培養(yǎng)基。普通枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基配方為每1000mL水中含2-3％酵母浸出物，1-2％蛋白胨，0.1-0.2％K2HPO4.3H2O，0.1％KH2PO4和1％NaCl，其余為水；2×MSR培養(yǎng)基配方為每1000mL水中含5％酵母浸出物，3％蛋白胨，0.6％K2HPO4，1.0％葡萄糖，其余為水。所述百分比濃度均為質(zhì)量百分濃度。
發(fā)酵溫度為27-42℃，優(yōu)選為35-37℃；發(fā)酵時(shí)間為24-148小時(shí)，優(yōu)選為72-120小時(shí)。
本發(fā)明在原有的環(huán)形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis SC-6-98-28)的菊酸乙酯酯酶基因序列的基礎(chǔ)上，根據(jù)枯草桿菌的密碼子偏好性對(duì)編碼菊酸乙酯酯酶的前10個(gè)氨基酸殘基的密碼子用PCR的方法進(jìn)行改造，改造后的基因可在枯草桿菌中高水平表達(dá)菊酸乙酯酯酶，并利用枯草桿菌表達(dá)載體將改造的基因轉(zhuǎn)化到枯草桿菌中，獲得了菊酸乙酯酯酶的表達(dá)工程菌。該工程菌在普通枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基或2×MSR培養(yǎng)基中經(jīng)24-148小時(shí)發(fā)酵后，即可產(chǎn)生酶活較高的菊酸乙酯酯酶，酶活力可達(dá)到5.7×105U/L，顯著高于用已有方法生產(chǎn)的菊酸乙酯酯酶的酶活力，并且該工程菌具有表達(dá)量高，生產(chǎn)成本低，易于產(chǎn)業(yè)化的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的菊酸乙酯酯酶可轉(zhuǎn)一性的作用于(+)-反式菊酸乙酯，并生成(+)-反式菊酸。本發(fā)明具有較高的實(shí)用性和可推廣性，在(+)-反式菊酸的工業(yè)化生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
說(shuō)明書(shū)附1為PCR擴(kuò)增的菊酸乙酯酯酶基因的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖2為ECE1專(zhuān)用表達(dá)載體pMA5-ECE1的構(gòu)建示意3為ECE1的枯草芽孢桿菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)結(jié)果圖4為pMA5-ECE1在普通枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中發(fā)酵不同時(shí)間的培養(yǎng)液的酶活力測(cè)定結(jié)果具體實(shí)施方式
下屬實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所有百分比濃度均為質(zhì)量百分比濃度，所有引物合成及測(cè)序工作均由上海生工完成。
實(shí)施例1、菊酸乙酯酯酶基因ECE1的克隆1、PCR擴(kuò)增菊酸乙酯酯酶基因根據(jù)已公開(kāi)的菊酸乙酯酯酶基因的核苷酸序列(GenBank號(hào)為L(zhǎng)22516)設(shè)計(jì)引物，引物序列如下ECE-UP(上游引物)5’-GAGCTCCATGGATGCACAGACGATTGCC-3’；ECE-Down(下游引物)5’-GAAGACTCCTACTGAGCCAGTTCGG-3’其中，上游引物引入了限制性?xún)?nèi)切酶NcoI識(shí)別序列(帶下劃線堿基)，并將菊酸乙酯酯酶基因的起始密碼子“GTG”改為“ATG”。以環(huán)形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis)的基因組DNA為模板，在引物ECE-UP和引物ECE-Down的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增菊酸乙酯酯酶基因。PCR反應(yīng)體系為1μl經(jīng)5分鐘超聲波處理過(guò)的環(huán)形節(jié)桿菌菌液，上、下游引物各1μl，1μl 10mM dNTP，5μl 10倍PCR緩沖液，0.5μl pfuTaq酶(Stratagene公司)，補(bǔ)水至50μl；PCR反應(yīng)條件為首先94℃ 5min；然后94℃ 1min，55℃ 30sec，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如

圖1所示(泳道M為MarkerIII(北京奇華盛公司)，泳道1為PCR產(chǎn)物)，PCR擴(kuò)增出了大小約1200bp的單一條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。再將PCR產(chǎn)物克隆入載體pMD18T(TaKaRa公司)中，得到含有菊酸乙酯酯酶基因的重組載體，命名為pMD18T-ECE。用測(cè)序的方法做進(jìn)一步的鑒定，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增的菊酸乙酯酯酶基因與已公開(kāi)的菊酸乙酯酯酶基因一致。
2、菊酸乙酯酯酶基因核苷酸序列的改造為在枯草桿菌中高水平表達(dá)菊酸乙酯酯酶，在原有菊酸乙酯酯酶基因核苷酸序列的基礎(chǔ)上，根據(jù)枯草桿菌的密碼子偏好性對(duì)編碼菊酸乙酯酯酶的前10個(gè)氨基酸殘基的密碼子用PCR的方法進(jìn)行改造，首先根據(jù)枯草桿菌的密碼子偏好性設(shè)計(jì)引物，引物序列如下引物1(上游引物)5’-GGAATTCCATATGGACGCTCAAACTATCGCTCCTGGATTCGAATCAGTCGCC-3’；引物2(下游引物)5’-GAAGATCTCTACTGAGCCAGTTCGGTGAC-3’再以步驟1構(gòu)建的含有菊酸乙酯酯酶基因的重組載體pMD18T-ECE為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增經(jīng)改造的菊酸乙酯酯酶基因。PCR反應(yīng)體系為1μlpMD18T-ECE質(zhì)粒，上、下游引物各1μl，1μl 10mM dNTP，5μl 10倍PCR緩沖液，0.5μl pfu Taq酶，補(bǔ)水至50μl；；PCR反應(yīng)條件為首先94℃ 5min；然后94℃1min，55℃ 30sec，72℃延伸1min 30sec，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR擴(kuò)增出了大小約1200bp的單一條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。再將PCR產(chǎn)物克隆入載體pMD18T中，用測(cè)序的方法做進(jìn)一步的鑒定，測(cè)序結(jié)果表明獲得的經(jīng)改造的菊酸乙酯酯酶基因具有序列表中SEQ ID№2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №2由1128個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1到第1128位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，序列表中的SEQ ID №1由375個(gè)氨基酸殘基組成，將獲得的經(jīng)改造的菊酸乙酯酯酶基因命名為ECE1。
實(shí)施例2、ECE1專(zhuān)用表達(dá)工程菌的構(gòu)建1、ECE1專(zhuān)用表達(dá)載體pMA5-ECE1的構(gòu)建如圖2所示，ECE1專(zhuān)用表達(dá)載體pMA5-ECE1的構(gòu)建方法為用無(wú)水乙醇沉淀并回收實(shí)施例1 PCR擴(kuò)增的ECE1，將其用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和BglII雙酶切后，與經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和BamHI雙酶切的載體pMA5用T4DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)篩選挑取轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和XbaI進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)酶切獲得1100bp片段的為陽(yáng)性克隆，再對(duì)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒用PCR的方法做進(jìn)一步鑒定，所用引物為實(shí)施例1中的引物1和引物2，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明構(gòu)建的含ECE1的重組表達(dá)載體正確，將其命名為pMA5-ECE1。
2、ECE1專(zhuān)用表達(dá)工程菌BSMA5-ECE1的構(gòu)建將pMA5-ECE1用熱擊的方法轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌DB1342(基因型his nprR2 nprE18aprAS epr)，將經(jīng)鑒定正確的整合有pMA5-ECE1的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子命名為BSMA5-ECE1。
實(shí)施例3、ECE1在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)及酶活力的測(cè)定一、ECE1在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)普通枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基配方每1000mL水中含2-3％酵母浸出物，1-2％蛋白胨，0.1-0.2％ K2HPO4.3H2O，0.1％KH2PO4，1％NaCl。
將實(shí)施例2構(gòu)建的ECE1專(zhuān)用表達(dá)工程菌BsMA5-ECE1接種于普通枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中，在37℃下連續(xù)培養(yǎng)120h，以轉(zhuǎn)化有pMA5空載體的枯草芽孢桿菌DB1342和轉(zhuǎn)化有ECE1的大腸桿菌BL21(DE3)plys(將ECE1克隆入載體pET26(Navagen公司)中，得到含有ECE1的大腸桿菌表達(dá)載體，命名為pET26-ECE1，再將pET26-ECE1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plys，經(jīng)篩選獲得陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子，發(fā)酵培養(yǎng)條件為37℃下培養(yǎng)12h。)為對(duì)照。于第三天取樣(每份樣品1.5mL)，提取總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示(泳道M為Marker，泳道1為轉(zhuǎn)化有pMA5空載體的枯草芽孢桿菌DB1342的培養(yǎng)液上清，泳道2為轉(zhuǎn)化有pMA5空載體的枯草芽孢桿菌DB1342經(jīng)超聲破碎后的培養(yǎng)液上清，泳道3為轉(zhuǎn)化有pMA5空載體的枯草芽孢桿菌DB1342經(jīng)超聲破碎后濃縮的培養(yǎng)液上清，泳道4 BsMA5-ECE1的培養(yǎng)液上清，泳道5為BsMA5-ECE1經(jīng)超聲破碎后的培養(yǎng)液上清，泳道6為BsMA5-ECE1經(jīng)超聲破碎后濃縮的的培養(yǎng)液上清，泳道7為BsMA5-ECE1經(jīng)濃縮的上清，泳道8為轉(zhuǎn)化有pET26-ECE1的大腸桿菌BL21(DE3)plys轉(zhuǎn)化子經(jīng)發(fā)酵后的培養(yǎng)液上清，泳道9為轉(zhuǎn)化有pET26-ECE1的大腸桿菌BL21(DE3)plys轉(zhuǎn)化子經(jīng)發(fā)酵后重懸的沉淀)，結(jié)果表明ECE1在普通枯草芽孢桿菌中獲得了表達(dá)(圖中箭頭所指)，表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為40KD，與預(yù)期結(jié)果相符。
二、ECE1的枯草芽孢桿菌表達(dá)產(chǎn)物的酶活力測(cè)定1、在普通枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中ECE1的枯草芽孢桿菌表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)酶活力測(cè)定按步驟一所述的方法在枯草芽孢桿菌中發(fā)酵表達(dá)ECE1，每隔24h取培養(yǎng)液15μl測(cè)酶活，為測(cè)定質(zhì)粒穩(wěn)定性，將連續(xù)培養(yǎng)120h后轉(zhuǎn)接在普通枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中，再連續(xù)培養(yǎng)120h，每隔24h取培養(yǎng)液15μl測(cè)酶活。蛋白相對(duì)酶活是以721分光光度計(jì)測(cè)定254nm處的吸光值。菊酸乙酯的快速酶活性檢測(cè)用酚酞二丁酸酯(Phenolphthalein Dibutyrate，Sigma-Aldrich R289086)。反應(yīng)混合液含1.5mL 200mM甘氨酸-氫氧化鈉(pH 10.0)5μl 10mM的酚酞二丁酸酯。40℃溫育3min后，加入適量的酶ECE1或培養(yǎng)液(25μl)，40℃下反應(yīng)。用分光光度計(jì)測(cè)定550nm光吸收的增長(zhǎng)速率。以轉(zhuǎn)化有pMA5空載體的枯草芽孢桿菌DB1342的培養(yǎng)液為對(duì)照，測(cè)定5min內(nèi)不同處理在254nm的吸光值。結(jié)果如表1所示，發(fā)酵BsMA5-ECE1獲得的酯酶ECE1的活性很高，550nm處的光吸收值最高為0.5，對(duì)照設(shè)為0。
表1 通枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基上發(fā)酵不同時(shí)間BsMA5Z2-ECE1獲得的ECE1的相對(duì)酶活測(cè)定結(jié)果 2、在2×MSR培養(yǎng)基中ECE1的枯草芽孢桿菌表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)酶活力測(cè)定2×MSR培養(yǎng)基配方5％酵母浸出物，3％蛋白胨，0.6％K2HPO4，1.0％葡萄糖。
將培養(yǎng)基換成2×MSR培養(yǎng)基，其余發(fā)酵條件與步驟1相同，以環(huán)形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)為對(duì)照，發(fā)酵結(jié)束后，分別取1、2、6、15μl菌液測(cè)定相對(duì)酶活，結(jié)果如表2所示，發(fā)酵BsMA5-ECE1獲得的酯酶ECE1的活性很高，550nm處的光吸收值最高為0.52。
表2 用2×MSR培養(yǎng)BsMA5Z2-ECE1后取不同量菌液的的相對(duì)酶活測(cè)定結(jié)果 3、在普通枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中ECE1的枯草芽孢桿菌表達(dá)產(chǎn)物和環(huán)形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)發(fā)酵產(chǎn)物的相對(duì)酶活力比較分別取37℃搖床培養(yǎng)2天的3mL原始菌種環(huán)形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis)LB液體培養(yǎng)液和37℃搖床培養(yǎng)5天的3mL BsMA5-ECE1的普通枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液作相對(duì)酶活性比較，具體方法為接種環(huán)形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis)于3mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)2天，把3ml菌液離心到一個(gè)1.5ml離心管中，棄上清(上清幾乎沒(méi)有測(cè)到酶活性)，把菌體同離心管中殘余的培養(yǎng)液混勻，成為濃縮的菌體混懸物，約60μl。同時(shí)以BsMA5-ECE1在3mL普通枯草培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)發(fā)酵5天。分別取前者60μl中的15μl，后者發(fā)酵5天的培養(yǎng)液1μl，2μl，6μl，15μl加入到1.5mL反應(yīng)液40℃反應(yīng)5min(以BsMA5-ECE1 37℃搖床培養(yǎng)發(fā)酵4天為對(duì)照，設(shè)為0)，然后用721分光光度計(jì)測(cè)550nm的光吸收值，結(jié)果如表3所示。由表1和表2可以粗略計(jì)算出在枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)中經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的ECE1相對(duì)酶活性為發(fā)酵環(huán)形節(jié)桿菌所產(chǎn)生的菊酸乙酯酯酶的500-750倍。
表3 BsMA5Z2-ECE1與環(huán)形節(jié)桿菌相對(duì)酶活的對(duì)比
4、在普通枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中ECE1的枯草芽孢桿菌表達(dá)產(chǎn)物的絕對(duì)酶活力測(cè)定相對(duì)酶活力沒(méi)有嚴(yán)格依據(jù)一般酶效率的計(jì)算方法，因此只能作初步估計(jì)。絕對(duì)酶活力酶活力則根據(jù)一個(gè)酶活單位的定義40℃反應(yīng)每分鐘產(chǎn)生1μmol酚酞的酶量。分別在0，5，10，15，20min時(shí)間段取樣，計(jì)算回歸方程。根據(jù)比爾定律A＝εbc(1)其中，A為吸光度；ε為消光系數(shù)；b為光程；c為吸光物質(zhì)濃度。在波長(zhǎng)、溶液和溫度確定的情況下，物質(zhì)的摩爾消光系數(shù)是由給定物質(zhì)的特性決定的。Nishizawa等人(Nishizawa，M.，H.Gomi，and F.Kishimoto.Purification and some propertiesof carboxylesterase from Arthrobacter globiformisstereoselectivehydrolysis of ethyl chrysanthemate.Biosci.Biotechnol.Biochem.1993，57594-598.)測(cè)得的酚酞二丁酸酯消光系數(shù)為23200/M.cm。酶活力單位可以依據(jù)其定義和上述公式計(jì)算得出。分析不同時(shí)間段254nm處BsMA5-ECE1在普通枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中發(fā)酵的培養(yǎng)液吸收值的變化，如圖4所示(發(fā)酵液離心后上清(a)，沉淀用PBS懸浮后上清(b)，以及超聲波破碎細(xì)胞壁后離心上清(c))。由于上清最易得到，且量大，因此最具有實(shí)際意義。上清的回歸方程為y＝0.0164x+0.141，按公式(1)計(jì)算出上清酶活力為1.41U/25ul酶液，約合5.7萬(wàn)單位/升發(fā)酵液。
實(shí)施例4、用本發(fā)明的菊酸乙酯酯酶ECE1制備(+)-反式菊酸的特異性分析取500ul菊酸乙酯混合物((+)-反式(-)-反式(+)-順式(-)-順式＝45∶45∶5∶5(重量分?jǐn)?shù)比))加入到24.5mL的200mM甘氨酸溶液(pH10.0)，再加入50ul實(shí)施例3表達(dá)的菊酸乙酯酯酶ECE1酶液(1.41U/25ul)，在500rpm、45℃下反應(yīng)24h后用2mL 35％HCl終止反應(yīng)。然后用甲基異丁酮(MIBK)萃取，在5mL萃取液中加入100ul二氯苯胺和100ul二環(huán)己基碳二胺，室溫反應(yīng)3h，反應(yīng)液用1.0N HCl和水洗，MgSO4脫水后用高壓液相色譜(HPLC)進(jìn)行產(chǎn)物分析。HPLC反應(yīng)中用Bio-Rad Hipore C18反向色譜柱分析，流動(dòng)相為己烷∶二氯甲烷＝17∶3，流速1mL/min，在254nm處檢測(cè)。結(jié)果表明，加入酶液的處理在18.5min有產(chǎn)物(+)-反式菊酸胺洗脫峰出現(xiàn)。測(cè)定反應(yīng)生成的(+)-反式菊酸和未水解的(+)-反式菊酸乙酯，沒(méi)有生成其它類(lèi)型的菊酸異構(gòu)體，表明本發(fā)明的菊酸乙酯酯酶ECE1的底物僅為(+)-反式菊酸乙酯。用該酶可以替代化學(xué)法，直接用(+)-反式菊酸乙酯耒生產(chǎn)(+)-反式菊酸。
序列表<160>2<210>1<211>375<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Met Asp Ala Gln Thr Ile Ala Pro Gly Phe Glu Ser Val Ala Glu Leu1 5 10 15Phe Gly Arg Phe Leu Ser Glu Asp Arg Glu Tyr Ser Ala Gln Leu Ala20 25 30Ala Tyr His Arg Gly Val Lys Val Leu Asp Ile Ser Gly Gly Pro His35 40 45Arg Arg Pro Asp Ser Val Thr Gly Val Phe Ser Cys Ser Lys Gly Val50 55 60Ser Gly Leu Val Ile Ala Leu Leu Val Gln Asp Gly Phe Leu Asp Leu65 70 75 80Asp Ala Glu Val Val Lys Tyr Trp Pro Glu Phe Gly Ala Glu Gly Lys85 90 95Ala Thr Ile Thr Val Ala Gln Leu Leu Ser His Gln Ala Gly Leu Leu100 105 110Gly Val Glu Gly Gly Leu Thr Leu Ala Glu Tyr Asn Asn Ser Glu Leu115 120 125Ala Ala Ala Lys Leu Ala Gln Met Arg Pro Leu Trp Lys Pro Gly Thr130 135 140Ala Phe Gly Tyr His Ala Leu Thr Ile Gly Val Phe Met Glu Glu Leu
145 150 155 160Cys Arg Arg Ile Thr Gly Ser Thr Leu Gln Glu Ile Tyr Glu Gln Arg165 170 175Ile Arg Ser Val Thr Gly Ala His Phe Phe Leu Gly Leu Pro Glu Ser180 185 190Glu Glu Pro Arg Tyr Ala Thr Leu Arg Trp Ala Ala Asp Pro Ser Gln195 200 205Pro Trp Ile Asp Pro Ala Ser His Phe Gly Leu Ser Ala Asn Ser Ala210 215 220Val Gly Asp Ile Leu Asp Leu Pro Asn Leu Arg Glu Val Arg Ala Ala225 230 235 240Gly Leu Ser Ser Ala Ala Gly Val Ala Ser Ala Glu Gly Met Ala Arg245 250 255Val Tyr Ala Ala Ala Leu Thr Gly Leu Ala Ala Asn Gly Asp Arg Ala260 265 270Ala Val Ala Pro Leu Leu Ser Glu Glu Thr Ile Gln Thr Val Thr Ala275 280 285Glu Gln Val Phe Gly Ile Asp Arg Val Phe Gly Glu Thr Ser Cys Phe290 295 300Gly Thr Val Phe Met Lys Ser His Ala Arg Ser Pro Tyr Gly Ser Tyr305 310 315 320Arg Ala Phe Gly His Asp Gly Ala Ser Ala Ser Leu Gly Phe Ala Asp325 330 335Pro Val Tyr Glu Leu Ala Phe Gly Tyr Val Pro Gln Gln Ala Glu Pro340 345 350Gly Gly Ala Gly Cys Arg Asn Leu Glu Leu Ser Ala Ala Val Arg Lys355 360 365Ala Val Thr Glu Leu Ala Gln370 375<210>2
<211>1128<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2atggacgctc aaactatcgc tcctggattc gaatcagtcg ccgaactctt tggccgtttc 60ctgagcgaag accgggaata ttcagcccag ctcgcggcct accaccgcgg agtcaaggta 120ttggacatca gcggtgggcc gcaccgccgc ccggattccg tgaccggtgt tttctcctgc 180tccaagggag tatccgggct ggtcatcgca cttttggtcc aggacggctt cctcgacctc 240gacgccgaag tggtcaagta ctggccggaa ttcggcgccg aaggaaaggc cacgattacc 300gtggcccagc tgctctccca ccaggccggg cttctgggag tcgaaggcgg actcaccctc 360gcggaataca acaactccga actggccgcc gccaagctcg cgcagatgcg gccgctgtgg 420aagcccggga ccgccttcgg gtaccacgcc ctgaccatcg gcgtcttcat ggaggagctt 480tgccgccgga tcaccgggtc cacgctccag gaaatctacg aacagcggat ccgctcggtc 540acgggcgccc acttcttcct gggactgcct gagtccgagg aaccccgcta tgccaccctc 600cgttgggctg cagacccctc ccagccgtgg attgatcccg ccagccattt cggcctttcc 660gcaaactcgg ccgtggggga catccttgac ctgcccaacc tccgcgaggt ccgcgcagcc 720ggcctgagtt cagccgccgg agtcgccagc gcggaaggca tggcccgcgt ctacgctgcg 780gcactcaccg gacttgccgc caacggcgac cgagccgccg tcgcgcccct cctcagcgaa 840gagaccatcc aaaccgtcac ggccgagcag gtcttcggca tcgaccgggt gttcggcgag 900acgagctgct ttgggacagt gttcatgaaa tcgcatgcac gctcgcctta tggcagctac 960cgggcgttcg ggcacgacgg cgccagcgca tctttggggt tcgctgaccc tgtgtatgaa1020ctcgccttcg ggtacgtgcc gcaacaggcc gagccgggcg gagcgggatg ccgcaacctt1080gagctgagcg ccgccgtgcg gaaggcagtc accgaactgg ctcagtag 1128
權(quán)利要求
1.一種菊酸乙酯酯酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有菊酸乙酯酯酶活性的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菊酸乙酯酯酶，其特征在于所述菊酸乙酯酯酶具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
3.編碼權(quán)利要求1所述的菊酸乙酯酯酶的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
5.含有權(quán)利要求3所述基因的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6.一種菊酸乙酯酯酶的專(zhuān)用表達(dá)工程菌，是將含有權(quán)利要求3所述的菊酸乙酯酯酶基因的表達(dá)載體導(dǎo)入枯草芽孢桿菌中得到的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的工程菌，其特征在于用于構(gòu)建所述含有權(quán)利要求3所述菊酸乙酯酯酶基因的表達(dá)載體的出發(fā)載體為pMA5、pBE2、pSBPTQ、pC194或pM2Veg。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的工程菌，其特征在于所述表達(dá)載體為pMA5-ECE1。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的工程菌，其特征在于所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌DB1342、WB700、DB104或WB600。
10.一種(+)-反式菊酸的生產(chǎn)方法，是發(fā)酵權(quán)利要求6所述的菊酸乙酯酯酶的專(zhuān)用表達(dá)工程菌，獲得菊酸乙酯酯酶，再加入底物(+)-反式菊酸乙酯，得到(+)-反式菊酸；所述發(fā)酵用培養(yǎng)基為普通枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基或2×MSR培養(yǎng)基，普通枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基配方為每1000mL水中含2-3％酵母浸出物，1-2％蛋白胨，0.1-0.2％K2HPO4.3H2O，0.1％KH2PO4和1％NaCl，其余為水；2×MSR培養(yǎng)基配方為每1000mL水中含5％酵母浸出物，3％蛋白胨，0.6％K2HPO4，1.0％葡萄糖，其余為水；發(fā)酵溫度為27-42℃，發(fā)酵時(shí)間為24-148小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種菊酸乙酯酯酶及其編碼基因與其表達(dá)專(zhuān)用工程菌和該酶的應(yīng)用。該酶是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有菊酸乙酯酯酶活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明在原有的環(huán)形節(jié)桿菌的菊酸乙酯酯酶基因序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，改造后的基因可在枯草桿菌中高水平表達(dá)菊酸乙酯酯酶，并構(gòu)建了菊酸乙酯酯酶的枯草桿菌表達(dá)工程菌。實(shí)驗(yàn)證明，分泌表達(dá)的菊酸乙酯酯酶可轉(zhuǎn)一性的作用于(+)－反式菊酸乙酯，并生成(+)－反式菊酸。本發(fā)明具有較高的實(shí)用性和可推廣性，在(+)－反式菊酸的工業(yè)化生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P7/40GK1766097SQ20051009799
公開(kāi)日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2005年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月2日
發(fā)明者夏國(guó)興, 邱并生, 胡學(xué)博 申請(qǐng)人:夏瀚生物工程(上海)有限公司