一種酵母篩選培養(yǎng)基及其用途和篩選酵母菌株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酵母篩選培養(yǎng)基及其在篩選酵母菌株中的用途和利用該酵母篩 選培養(yǎng)基篩選酵母菌株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于傳統(tǒng)化石能源用量急增，能源緊缺已成為世界性問題，能源多元化發(fā)展和加 快可再生能源開發(fā)已成為世界各國的研發(fā)重點，其中，燃料乙醇的生產(chǎn)和應(yīng)用在經(jīng)濟發(fā)展 和戰(zhàn)略安全上顯示出重大意義。以燃料乙醇等替代能源為代表的能源供應(yīng)多元化戰(zhàn)略已成 為我國能源政策的重要方向。纖維素是十分豐富而廉價的生物質(zhì)原料，可以被降解為可發(fā) 酵性糖，用于燃料乙醇的生產(chǎn)。大力發(fā)展生物質(zhì)燃料乙醇作為可再生能源，有助于緩解石油 資源短缺，改善大氣環(huán)境等問題，在穩(wěn)定糧食生產(chǎn)、促進農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與消費的良性循環(huán)和可持 續(xù)發(fā)展等方面具有積極作用。
[0003] 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)作為單細胞真核生物，具有易培養(yǎng)、生長 周期短的特點，已廣泛應(yīng)用于異源基因的表達。雖然普通釀酒酵母能夠高效利用葡萄糖產(chǎn) 乙醇，但對發(fā)酵液中的抑制物和高濃乙醇耐受性（Almeida J R M et al.，2007)較差，特別 是對纖維素水解液中的抑制成分敏感，使釀酒酵母無法成為木質(zhì)纖維素乙醇生產(chǎn)的優(yōu)勢菌 株。其次，纖維素乙醇生產(chǎn)中，纖維素原料預(yù)處理過程產(chǎn)生和殘留的降解物會對后續(xù)菌株發(fā) 酵造成不同程度的抑制，其中乙酸、糠醛、酚類和SO廣等抑制因子對酵母有較強毒害作用， 會顯著抑制細胞的生長及其發(fā)酵性能。
[0004] 目前，在纖維素乙醇生產(chǎn)菌種一釀酒酵母的研究領(lǐng)域，大多集中于將各種實驗 室缺陷型菌種為研究對象進行改造，而缺乏能夠應(yīng)用于生產(chǎn)的野生型酵母模型，能夠耐受 多重抑制物、具有高抗逆性的釀酒酵母具有更強的實用性，顯然，研究新的能夠用于篩選酵 母菌株的培養(yǎng)基對篩選獲得具有上述特性的酵母模型極為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有方法篩選得到的釀酒酵母難不能耐受多重抑制物而抗 逆性低的缺陷，提供一種用于篩選且抗逆性高的酵母菌株的酵母篩選培養(yǎng)基及其在篩選酵 母菌株中的用途和利用該酵母篩選培養(yǎng)基篩選酵母菌株的方法。
[0006] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，雖然釀酒酵母能夠高產(chǎn)乙醇，但是對發(fā)酵液中的抑制物抗 性較差，這使得釀酒酵母無法成為木質(zhì)纖維素乙醇生產(chǎn)的優(yōu)勢菌株?；诖耍景l(fā)明的發(fā)明 人進一步對抑制因子和釀酒酵母的關(guān)系進行的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用含有葡萄糖和含乙酸 根離子源的培養(yǎng)基進行篩選，得到的酵母菌株能夠在多重抑制物存在下穩(wěn)定發(fā)酵產(chǎn)乙醇。 因此，為了實現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種酵母篩選培養(yǎng)基，其中，該酵母篩選 培養(yǎng)基含有葡萄糖和含乙酸根離子源。
[0007] 第二方面，本發(fā)明提供了上述第一方面的酵母篩選培養(yǎng)基在篩選酵母菌株中的用 途。
[0008] 第三方面，本發(fā)明提供了一種篩選酵母菌株的方法，其中，該方法包括：將待篩選 的酵母菌株在第一方面的酵母篩選培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
[0009] 通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明的酵母篩選培養(yǎng)基能夠耐受多重抑制物而具有高抗逆 性的酵母菌株。
[0010] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【具體實施方式】
[0011] 以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應(yīng)當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0012] 在本發(fā)明中，在未作相反說明的情況下，使用的術(shù)語"抗逆性"是指微生物在偏離 其最佳生長條件下的環(huán)境中的生長和發(fā)酵能力，比如較高或較低的溫度，較高或較低的PH， 較高或較低的滲透壓，較高的反饋抑制，有毒物質(zhì)的存在等環(huán)境。
[0013] 本發(fā)明提供的酵母篩選培養(yǎng)基含有葡萄糖和含乙酸根離子源。
[0014] 本發(fā)明中，只要含有葡萄糖和含乙酸根離子源即可實現(xiàn)本發(fā)明的目的，對其含量 沒有特別的要求。優(yōu)選地，葡萄糖的含量為5-100g/L，更優(yōu)選為10-80g/L。優(yōu)選地，以乙酸 根的含量計，含乙酸根尚子源的含量為0. 5_60g/L，更優(yōu)選為2_40g/L。
[0015] 本發(fā)明中，含乙酸根離子源可以為各種能夠提供乙酸根離子的化合物，如水溶性 的乙酸和/或乙酸鹽，優(yōu)選為乙酸、乙酸鈉、乙酸鉀和乙酸銨中的至少一種。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述酵母篩選培養(yǎng)基含有l(wèi)_5g/L的乙酸、 20-40g/L的NH 4Ac、20-40g/L的NaAc和5-40g/L的KAc中的至少一種。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選 的實施方式，所述酵母篩選培養(yǎng)基含有l(wèi)_3g/L的乙酸、20-40g/L的NH 4Ac、30-40g/L的NaAc 和10-30g/L的KAc中的至少一種。
[0017] 本發(fā)明中，除了葡萄糖和含乙酸根離子源以外，所述酵母篩選培養(yǎng)基優(yōu)選還含有 氯化物（可以為氯化鈉、氯化鉀和氯化銨中的至少一種）、硫酸鹽（可以為硫酸鈉和/或硫 酸鉀）、碳原子數(shù)為2-8的醛（如糠醛）和碳原子數(shù)為6-16的酚（如苯酚）中的至少一種。 更優(yōu)選地，所述酵母篩選培養(yǎng)基還含有25-95g/L (最優(yōu)選為20-60g/L)的氯化物、0. 5-10g/ L (最優(yōu)選為4-6g/L)的硫酸鹽、0. 1-lg/L (最優(yōu)選為0. 1-0. 5g/L)的碳原子數(shù)為2-8的醒 和0. Ι-lg/L (最優(yōu)選為0. 1-0. 5g/L)的碳原子數(shù)為6-16的酚中的至少一種。
[0018] 為了獲得抗逆性更佳的酵母菌株，在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述酵母篩選培 養(yǎng)基還含有 l-6g/L 的 Na2S04、20-60g/L 的 NaCl、10-30g/L 的 KCl 和 0· 1-0. 5g/L 的糠醛中 的至少一種。最優(yōu)選地，所述酵母篩選培養(yǎng)基還含有4-6g/L的Na2S04、35-40g/L的NaCl和 20-30g/L的KCl中的一種或兩種；或者，所述酵母篩選培養(yǎng)基還含有0. 15-0. 3g/L的糠醛。
[0019] 本發(fā)明中，所述酵母篩選培養(yǎng)基還可以含有蛋白胨和酵母抽提物，為菌株提供氮 源和生長因子等。其中，蛋白胨的含量優(yōu)選為5-20g/L，酵母抽提物的含量優(yōu)選為2-8g/L。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的酵母篩選培養(yǎng)基含有A組分和B組分， 其中，所述A組分為10-80g/L的葡萄糖和l-3g/L的乙酸，所述B組分為4-6g/L的Na 2S04、 35-40g/L 的 NaCl、20-30g/L 的 KCl、20-40g/L 的 NH4Ac、30-40g/L 的 NaAc 和 10-30g/L 的 KAc中的一種或兩種。
[0021] 本發(fā)明還提供了上述酵母篩選培養(yǎng)基在篩選酵母菌株中的用途。本發(fā)明的酵母篩 選培養(yǎng)基尤其適用于篩選具有高抗逆性的釀酒酵母。
[0022] 此外，本發(fā)明還提供了一種篩選酵母菌株的方法，其中，該方法包括：將待篩選的 酵母菌株在上述本發(fā)明的酵母篩選培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
[0023] 本發(fā)明中，只要在本發(fā)明的酵母篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母細胞即可實現(xiàn)本發(fā)明的目 的，對培養(yǎng)的具體條件沒有特別的限定，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)條件。優(yōu)選情況下，所 述培養(yǎng)的條件包括：溫度為28-33°C，時間為24-72小時。
[0024] 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，在培養(yǎng)結(jié)束后，可以挑取能夠在本發(fā)明的酵母篩 選培養(yǎng)基中繁殖的酵母細胞進行擴大培養(yǎng)并進行菌種保存，從而完成酵母菌株的篩選。
[0025] 以下將通過實施例對本發(fā)明進行詳細描述。以下實施例中的實驗和檢測方法，如 無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用儀器，如無特殊說明，均為常規(guī)檢測和操作儀器；所用 的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑公司購買得到的；以下實施例中的定量試 驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。實施例中采用的培養(yǎng)基等如下：
[0026] 實施例中使用的酵母菌株-釀酒酵母（Saccharomyces cerevis