本發(fā)明屬于血液樣本處理領(lǐng)域，特別涉及一種從血液樣本中富集絲狀真菌的方法。
背景技術(shù)：
隨著社會人口老齡化進程加快，使罹患老年性慢性疾病的人群增加，同時，廣譜抗生素廣泛使用，導(dǎo)管介入性治療、組織活檢等侵入性醫(yī)療操作增多，以及腫瘤、艾滋病、白血病、器官移植等免疫力低下患者的數(shù)量不斷擴大。因此，近年來，深部真菌感染的發(fā)病率大幅增加，特別是深部絲狀真菌感染的發(fā)病率正逐年明顯增加，在某些特定人群中其發(fā)病率甚至高于酵母菌感染率。由于深部真菌感染早期缺乏特征性的臨床癥狀，難以在發(fā)病早期獲得病原學(xué)診斷，當(dāng)患者出現(xiàn)持續(xù)高熱而抗生素治療數(shù)日無效時，往往提示真菌感染已經(jīng)擴散到數(shù)個器官，錯過搶救患者的最佳時機；臨床實踐表明，不同真菌對抗真菌藥物的敏感性存在較大差異，甚至部分真菌對常用抗真菌藥物天然耐藥或不敏感，致使真菌引起的深部感染死亡率很高。因此，及時、正確地診斷深部真菌感染、尤其是絲狀真菌感染，對成功搶救患者生命，具有非常重要的現(xiàn)實意義。
現(xiàn)行臨床實驗室真菌檢測方法相對滯后。診斷深部真菌感染的傳統(tǒng)方法有形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)、血清學(xué)等方法。形態(tài)學(xué)檢查包括真菌直接鏡檢和培養(yǎng)，是目前絲狀真菌病診斷的最常用的方法。但，從血培養(yǎng)陽性的血液培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)種平板至培養(yǎng)出絲狀真菌典型菌落，一般需要3天至2周，甚至更長時間。
分子生物學(xué)技術(shù)以其靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，近年得到飛速發(fā)展，現(xiàn)有檢測真菌感染的分子生物學(xué)方法也日益成熟，如核酸測序，基因芯片，以及采用質(zhì)譜技術(shù)直接鑒定真菌。因此，從血液樣本中直接富集和分離絲狀真菌，采用分子生物學(xué)方法進行直接檢測，而不再依賴于轉(zhuǎn)種沙保弱平板獲取真菌純培養(yǎng)，是目前臨床微生物學(xué)實驗室研究的熱點。然而，絲狀真菌在血液中形成纖細的菌絲，且在患者循環(huán)血液中含量很少，生長緩慢。菌絲與細菌或真菌孢子不同，采用同樣的實驗條件，很難有效地從血液中高效地富集、分離出這類菌絲。
目前臨床常用血液樣本消化處理液中，溶血劑多為氯化銨、醋酸銨等為有毒或微毒物品，如刺激皮膚、粘膜、眼睛、鼻腔、咽喉，損傷眼睛；高濃度刺激肺，可導(dǎo)致肺積水；而且，血液樣本中存在較高濃度蛋白質(zhì)，甚至有淋巴細胞在血液培養(yǎng)瓶中繼續(xù)生長、繁殖，氯化銨、醋酸銨容易引起蛋白質(zhì)沉淀，使溶液渾濁，粘滯度增加，不利于絲狀真菌的分離。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種從血液樣本中富集絲狀真菌的方法，該方法富集真菌菌絲效率高，富集到的真菌雜質(zhì)少，可用于真菌核酸提取，亦可用于質(zhì)譜技術(shù)直接鑒定真菌，具有廣闊的應(yīng)用空間。
本發(fā)明的一種從血液樣本中富集絲狀真菌的方法，包括：
(1)從血液培養(yǎng)陽性培養(yǎng)瓶中抽取1-2ml血液樣本，注入離心管；
(2)向離心管中加入50-150mg石英砂(AR級，25-50目)和10-20ml富集稀釋液，混勻，靜置，離心得到沉淀；其中，富集稀釋液由體積比為10-30:1的80-200g/L尿素溶液(使用前配制)和500-600mM EDTA(pH 8.0)組成；
(3)將沉淀震蕩，離心，隨后加入十二烷基硫酸鈉SDS溶液和滅菌蒸餾水，震蕩，除去石英砂；離心，洗滌，即得富集的絲狀真菌。
所述步驟(2)中的靜置時間為5-10min。
所述步驟(3)中的十二烷基硫酸鈉SDS溶液的濃度為0.5％-10％，與沉淀的體積比為1:10-15。
所述步驟(3)中的滅菌蒸餾水與沉淀的體積比為1:0.5-1。
所述步驟(3)中的洗滌具體為采用1.5ml滅菌蒸餾水洗滌3次。
所述步驟(2)和(3)中的離心速度為12000r/min，離心時間為1-2min。
本發(fā)明的特點在于：
高濃度尿素溶液不僅能夠溶解紅細胞、白細胞等血液有型成分，而且能夠使紅細胞溶解后釋放的血紅蛋白迅速變性、與細胞碎片一起溶解而不形成沉淀,使溶液更加清亮，粘滯性小，有利于菌絲的沉淀富集。加入少量石英砂，有利于進一步機械性粉碎殘存的白細胞、血小板碎片，使其溶解除去，使離心沉淀中雜質(zhì)更少；同時，在首次離心除去上清液中大量雜質(zhì)時，石英砂為菌絲提供更多附著表面，減少離心洗滌過程中菌絲的丟失。而加入低濃度的SDS，為陰離子表面活性劑，具有強烈的除垢效果，有助于絲狀真菌菌絲從石英砂上洗脫，也有助于除去沉淀中可能殘存的尿素。實驗表明，真菌的細胞壁非常堅韌，在加入石英砂的條件下，酵母樣真菌的孢子在高速震蕩器需要連續(xù)震蕩約10min、絲狀真菌菌絲需要連續(xù)震蕩20-25min才能有效破壁釋出核酸。因此，在本發(fā)明的實驗條件下，不會引起真菌菌絲或孢子裂解。
特別是，對于真菌重癥血流感染患者，采用本發(fā)明的方法，通過多管法(3-5個富集管)，以增加用于富集真菌的血液標(biāo)本量至6-10ml，將富集到的真菌合并，不經(jīng)過血液培養(yǎng)，而是從患者外周血液中直接富集真菌，然后，采用分子生物學(xué)方法，也可以對血液樣本中的真菌進行檢測。本發(fā)明富集的真菌雜質(zhì)少，可以直接用于真菌核酸提取。
有益效果
本發(fā)明不僅能夠高效破壞血液有型成分，而且能夠使紅細胞溶解后釋放的血紅蛋白迅速變性、溶解,使富集稀釋液更加清亮，粘滯性小，有利于從血液樣本中富集微量絲狀真菌菌絲，從而顯著提高從血液樣本中分離、檢測絲狀真菌的陽性率；本發(fā)明富集真菌菌絲效率高，富集到的真菌雜質(zhì)少，可用于真菌核酸提取，亦可用于質(zhì)譜技術(shù)直接鑒定真菌，具有廣闊的應(yīng)用空間。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
實施例1
一、樣本準(zhǔn)備：
由于絲狀真菌血培養(yǎng)陽性血液樣本在臨床短期內(nèi)難以找到足夠數(shù)量，而標(biāo)本保存時間過久或不是在同一時間進行檢測，對實驗結(jié)果分析可能產(chǎn)生影響。本實施例采用模擬臨床標(biāo)本進行實驗：
1.選擇經(jīng)測序方法鑒定為白酵母菌和黑曲霉菌的臨床分離株作為實驗對象，分別取沙保弱培養(yǎng)基上兩種真菌菌落/菌絲，以RPMI1640培養(yǎng)基研磨、稀釋，以Marienfeld血球計數(shù)板分別對其中的孢子/菌絲進行計數(shù)，以調(diào)節(jié)兩種真菌的孢子/菌絲濃度為1000CFU/ml。
2.取健康志愿者血液約150ml，分A、B兩組，每組50ml血液，向A組血液中加入孢子濃度為1000CFU/ml白酵母菌菌液250μl；向B組血液中加入菌絲濃度為1000CFU/ml黑曲霉菌液250μl。將血液樣本充分混勻，此時，血液樣本中真菌孢子/菌絲的濃度約為5CFU/ml。
3.將每組血液樣本按照每瓶5ml分別注入10個Bact/ALERT血培養(yǎng)瓶。同時，取5ml未加入菌液的血液注入血培養(yǎng)瓶作為對照瓶。血培養(yǎng)瓶放入3D全自動血培養(yǎng)儀，待儀器提示培養(yǎng)陽性后取出，最后1瓶測試瓶報陽后與對照瓶一起取出；培養(yǎng)瓶中血液樣本充分混勻后(特別是黑曲霉培養(yǎng)測試瓶)，每瓶取3-5ml作為測試血液樣本，對照瓶繼續(xù)培養(yǎng)至14天。
二、真菌富集過程：
1.向預(yù)加入100mg石英砂的25ml無菌有蓋離心管加入1ml血液樣本，加入富集稀釋液20ml(100g/L尿素溶液與500mM EDTA按照體積比20:1混合)，混勻，靜置10min。
2.12000r/min離心2min，從上方小心移除上清液，留約1.5ml沉淀。
3.沉淀在高速振蕩器震蕩1min，以20ml滅菌蒸餾水12000r/min離心1min，棄上清液。
4.向管內(nèi)沉淀加入0.1ml 5％SDS溶液和1.4ml滅菌蒸餾水，震蕩0.5min，將管內(nèi)液體全部轉(zhuǎn)入1.5ml管內(nèi)，棄去石英砂。
5.12000r/min離心1min，棄上清液，再用1.5ml滅菌蒸餾水12000r/min離心1min，洗滌3次，棄上清液，沉淀即為從血液樣本中富集的絲狀真菌。
三、真菌富集結(jié)果檢測方法：
沉淀中加入1ml滅菌蒸餾水，充分混勻，取0.1ml涂片，干燥后革蘭染色鏡檢，計數(shù)全片中真菌菌絲/孢子數(shù)量。
四、實驗結(jié)果：
1.在血液樣本培養(yǎng)開始后的前3天內(nèi)，20瓶測試培養(yǎng)瓶儀器全部報陽，而對照瓶繼續(xù)培養(yǎng)至14天仍未報陽；
2.真菌菌絲/孢子計數(shù)結(jié)果見下表；
A組10個樣本中，0.1ml沉淀中檢出到白酵母菌孢子最多250個，最少136個，平均182個，相當(dāng)于每1ml血液樣本中富集到1820個真菌孢子；B組10個樣本中，0.1ml沉淀中檢出黑曲霉菌絲最多264條，最少102條，平均204條，相當(dāng)于每1ml血液樣本中富集到2040條真菌菌絲；兩組樣本富集的真菌均滿足真菌核酸提取或質(zhì)譜技術(shù)進行真菌鑒定對菌量的最低要求。