本發(fā)明涉及一種用于植物病害防控技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種葡萄內(nèi)生真菌及其防治葡萄灰霉病的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

葡萄在世界水果生產(chǎn)中占有重要的位置，我國鮮食葡萄年產(chǎn)量多年來一直位居世界各國首位，而葡萄灰霉病不僅是生產(chǎn)田中常見病害，更是產(chǎn)后貯藏過程中的毀滅性病害。因此，葡萄灰霉病已經(jīng)是制約我國葡萄生產(chǎn)的一大障礙，更是保護(hù)地葡萄生產(chǎn)和葡萄貯藏期最為重要的病害種類之一，每年該病造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

葡萄灰霉菌，有性態(tài)為富氏葡萄孢盤菌[Botryotinia fuckeliana(de Bary)Whetzel.]，屬子囊菌亞門葡萄孢盤菌屬。無性態(tài)為灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea Pers.)，屬半知菌亞門葡萄孢屬。主要危害葡萄葉片，花穗和果實。葉片受害，初期即出現(xiàn)綠豆粒大的灰色斑點，擴(kuò)大后成為淡褐色不規(guī)則斑片，潮濕時生有不規(guī)則灰霉層；花序發(fā)病后軟腐并萎蔫，甚至整個花序壞死；果粒發(fā)病時出現(xiàn)褐色褪色斑點，病斑果皮易裂開，果皮易與果肉分離脫落?；颐共【詮?qiáng)，寄主范圍廣，不同寄主植物間的灰霉病菌可相互引發(fā)灰霉病。

目前，對灰霉病菌的防治主要以化學(xué)防治為主，輔以生物防治和生態(tài)防治?；瘜W(xué)防治往往導(dǎo)致病菌對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，效果下降，使用濃度不斷增多，導(dǎo)致環(huán)境和食品安全等諸多問題?；移咸焰呔蚱渚哂懈叩幕蚱茲摿洼^大的種群尺度，容易產(chǎn)生抗藥性。無公害、綠色農(nóng)產(chǎn)品越來越受到人們的重視，而生物防治由于低污染、低殘留的特性，成為目前研究的重點。研究表明一些真菌(如木霉菌和鏈霉菌)和細(xì)菌(如芽孢桿菌)對灰霉菌有一定的拮抗作用。

植物是篩選天然藥物最主要的原料，內(nèi)生真菌是指能夠在健康植物組織內(nèi)并與植物建立和諧關(guān)系的一類微生物，能夠定殖在植物細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)，但不會對植物造成實質(zhì)性的危害。植物內(nèi)生菌長期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中，與宿主協(xié)同進(jìn)化，在演化過程中二者形成了穩(wěn)定的生態(tài)關(guān)系，一方面內(nèi)生菌可從宿主中吸收營養(yǎng)供自己生長需要，另一方面內(nèi)生菌在宿主的生長發(fā)育和系統(tǒng)演化過程中起重要作用，可通過自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對植物體產(chǎn)生影響。內(nèi)生菌具有種類繁多、易于定殖、發(fā)揮作用持久等特點，使得其在防治病害的過程中發(fā)揮了重大作用。有研究表明內(nèi)生菌可以增強(qiáng)宿主植物的抗病性，是現(xiàn)代藥物的重要來源之一。

目前已經(jīng)有防治葡萄灰霉病的報道，如通過化學(xué)殺菌劑組合物防治葡萄灰霉病(中國專利，公開號CN201410543678.4，CN201310299766.X)，另外還有通過加強(qiáng)栽培管理技術(shù)減輕葡萄灰霉病的發(fā)生(中國專利，公開號CN201510374105.8，CN201310347735.7，CN201410493625.6，CN201410566149.6)；生物防治方面，主要利用蛇莓青色果實研磨液防治葡萄灰霉病(中國專利，公開號CN201410096937.3)。目前，尚未出現(xiàn)利用葡萄自身的內(nèi)生真菌進(jìn)行生物防治葡萄灰霉病的研究報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種葡萄內(nèi)生真菌及其防治葡萄灰霉病的應(yīng)用，該葡萄內(nèi)生真菌對葡萄灰霉病防治效果好，具有重要的農(nóng)業(yè)應(yīng)用價值。

為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案：

一種葡萄內(nèi)生真菌，其特征在于，該內(nèi)生真菌命名為疣孢漆斑菌，其DNA序列是：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAAACTCCCAAACCCTTTGTGAACCTTACCATATTGTTGCTTCGGCGGGACCGCCCCGGCGCCTTCGGGCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGCCCCAAACTCTTATGTCTTTAGTGGTTTTCTCCTCTGAGTGACACATAAACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCCCCCAGTGCCTGGTGTTGGGGATCGGCCCAGCCTTCTCGCAAGGCCGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGTCCTCCTCTGCGTAGTAGCACAACCTCGCAGTTGGAACGCGGCGGTGGCCATGCCGTTAAACACCCCACTTCTGAAAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA。

上述疣孢漆斑菌是從野生山葡萄品種‘雙優(yōu)’上分離得到。

經(jīng)申請人的研究表明，上述葡萄內(nèi)生真菌可以用于防治葡萄灰霉病的應(yīng)用。

其具體的應(yīng)用是將疣孢漆斑菌制成生物防治菌劑噴施在葡萄品種上，防治效果明顯。

所述葡萄品種為歐洲葡萄‘紅地球’品種。

所述生物防治菌劑通過以下兩種方法制備：

(1)將疣孢漆斑菌接種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15天，待菌落表面產(chǎn)生不規(guī)則黑色斑點，用無菌手術(shù)刀輕輕刮取疣狀突起，溶于無菌水中，利用血球計數(shù)板計算孢子量，調(diào)整至1×10⁶個/mL，得到生物防治菌劑；

(2)將疣孢漆斑菌接種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，用直徑4mm的打孔器在菌落邊緣打孔，每150mL查氏液體培養(yǎng)基接種8個菌餅，25℃下黑暗振蕩培養(yǎng)15d，查氏液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)液經(jīng)4層紗布過濾，12000rpm離心10min，然后0.22μm過濾滅菌，得到生物防治菌劑。

所述的查氏液體培養(yǎng)基配方為：蔗糖：30g，KNO₃：2g，K₂HPO₄：1g，0.5g MgSO₄·7H₂O：0.5g，KCl：0.5g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O：0.01g，加蒸餾水定容至1000mL。

本發(fā)明的內(nèi)生真菌通過形態(tài)鑒定和分子鑒定，確定為疣孢漆斑菌，屬于半知菌類，漆斑菌屬。通過對峙培養(yǎng)和分泌物抑制實驗，發(fā)現(xiàn)該疣孢漆斑菌對葡萄灰霉菌具有較強(qiáng)的抑制作用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

(1)該生物防治菌株疣孢漆斑菌是葡萄自身攜帶的內(nèi)生真菌，可完全克服使用化學(xué)農(nóng)藥防治所帶來的諸多問題，有利于葡萄無公害、綠色生產(chǎn)、有利于提高葡萄果實的商品性、有利于節(jié)省成本，具有潛在的應(yīng)用前景。

(2)對峙培養(yǎng)和抑菌實驗都顯示該生物防治菌株對葡萄灰霉菌的生長發(fā)育有較好的抑制作用，活體實驗也顯示菌劑噴施在葡萄品種后，防治效果明顯，而且具有安全、無環(huán)境污染等優(yōu)點，可應(yīng)用于葡萄灰霉病的防治。

附圖說明

圖1是疣孢漆斑菌的菌落形態(tài)特征圖片。其中，A圖是在PDA培養(yǎng)皿上生長15天的菌落正面形態(tài)；B圖是在PDA培養(yǎng)皿上生長15天的菌落反面形態(tài)；C圖是在PDA培養(yǎng)皿上生長15天的菌絲形態(tài)，標(biāo)尺為500μm；D圖和E圖是菌落表面的漆狀黑色斑點的形態(tài)，D圖標(biāo)尺為1mm，E圖標(biāo)尺為200μm；F是疣孢漆斑菌的孢子形態(tài)，標(biāo)尺為10μm。

圖2是疣孢漆斑菌菌劑制備圖。其中，A圖是孢子懸浮液；B圖是疣孢漆斑菌液體培養(yǎng)15天的情況；C圖是疣孢漆斑菌發(fā)酵液。

圖3是疣孢漆斑菌拮抗葡萄灰霉菌的生長圖。其中，A圖是葡萄灰霉菌在正常的PDA培養(yǎng)皿上生長4天的形態(tài)；B圖是在有疣孢漆斑菌的PDA上葡萄灰霉菌生長4天的對峙情況；C圖是對峙培養(yǎng)1個月的情況。

圖4是疣孢漆斑菌分泌物對葡萄灰霉菌生長的抑制情況圖片。其中，A圖是葡萄灰霉菌在PDA上生長4天的情況；B圖是葡萄灰霉菌在含有疣孢漆斑菌分泌物的PDA上培養(yǎng)4天的情況。

圖5是疣孢漆斑菌在葡萄葉片上的防治圖片。圖中，MV代表疣孢漆斑菌。

圖6是疣孢漆斑菌在葡萄果實上的防治圖片，為接種8天后的發(fā)病狀態(tài)，標(biāo)尺為2cm。

以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

具體實施方式

實施例1：內(nèi)生真菌疣孢漆斑菌的分離和鑒定

經(jīng)發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，中國野生山葡萄品種‘雙優(yōu)’對葡萄灰霉病具有較強(qiáng)的抗性，因此，取田間中國野生山葡萄品種‘雙優(yōu)’葡萄葉片，用無菌水漂洗3次，濃度為70％的酒精表面消毒30s，濃度為2.5％的次氯酸鈉消毒3min后，再用無菌水漂洗3次。葉片剪取3mm×5mm大小的組織，放置在PDA平板上25℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。待葉片組織周圍長出內(nèi)生菌絲后，挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基上，產(chǎn)孢后通過單孢分離純化內(nèi)生真菌。

提取該內(nèi)生真菌株的DNA，通過ITS引物擴(kuò)增(正向引物：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGA-3’，反向引物：5’-TCCTACCTGATCCGAGGTCA-3’)，產(chǎn)物片段大小為544bp，測序該產(chǎn)物片段的DNA序列如下：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAAACTCCCAAACCCTTTGTGAACCTTACCATATTGTTGCTTCGGCGGGACCGCCCCGGCGCCTTCGGGCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGCCCCAAACTCTTATGTCTTTAGTGGTTTTCTCCTCTGAGTGACACATAAACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCCCCCAGTGCCTGGTGTTGGGGATCGGCCCAGCCTTCTCGCAAGGCCGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGTCCTCCTCTGCGTAGTAGCACAACCTCGCAGTTGGAACGCGGCGGTGGCCATGCCGTTAAACACCCCACTTCTGAAAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA(核苷酸或氨基酸序列表，SEQ ID NO.1)。

將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，結(jié)果與疣孢漆斑菌的序列一致性最高，因此命名為疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)。

形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)該疣孢漆斑菌，25℃下，在PDA培養(yǎng)基上生長15天后，氣生菌絲為白色，疣孢漆斑菌菌落圓形扁平，邊緣整齊，氣生菌絲為白色，菌落表面產(chǎn)生不規(guī)則的疣狀突起，突起內(nèi)部有分生孢子。分生孢子寬梭狀(見圖1)。

實施例2：疣孢漆斑菌生物防治菌劑的制備

1、將疣孢漆斑菌接種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15天，待培養(yǎng)的菌落表面產(chǎn)生不規(guī)則黑色斑點，用無菌手術(shù)刀輕輕刮取漆狀黑色斑點，溶于無菌水中，利用血球計數(shù)板計算孢子量，調(diào)整至1×10⁶個/mL，得到生物防治菌劑備用(圖2A)。

2、將疣孢漆斑菌接種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，用直徑4mm的打孔器在菌落邊緣打孔，每150mL查氏液體培養(yǎng)基接種8個菌餅，25℃下黑暗振蕩(100rpm)培養(yǎng)15d(圖2B)。查氏液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)液經(jīng)4層紗布過濾，12000rpm離心10min，然后0.22μm過濾滅菌，得到生物防治菌劑備用。

查氏液體培養(yǎng)基配方：蔗糖：30g，KNO₃：2g，K₂HPO₄：1g，MgSO₄·7H₂O：0.5g，0.5g KCl：0.5g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O：0.01g，加蒸餾水定容至1000mL。

實施例3：疣孢漆斑菌對葡萄灰霉菌的拮抗活性測定

由于疣孢漆斑菌生長較慢，提前將疣孢漆斑菌接種于PDA培養(yǎng)基上，距離中心2-3cm左右，25℃下生長5天后，菌落直接達(dá)到2cm時，將葡萄灰霉菌接種于PDA培養(yǎng)皿的另一側(cè)，以不接種疣孢漆斑菌的PDA為對照，接種后4天拍照并計算菌落面積，連續(xù)觀察1個月。結(jié)果發(fā)現(xiàn)疣孢漆斑菌對葡萄灰霉菌的生長具有較強(qiáng)的抑制作用，培養(yǎng)4天后的葡萄灰霉菌菌落面積顯著低于對照，而且培養(yǎng)1個月后發(fā)現(xiàn)疣孢漆斑菌能產(chǎn)生一個明顯的抑菌圈(圖3)。

為了進(jìn)一步確認(rèn)疣孢漆斑菌分泌到培養(yǎng)基中的活性物質(zhì)是否對灰霉菌的生長發(fā)育有抑制作用。首先，將疣孢漆斑菌接種于鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上生長10天，然后去掉玻璃紙，把PDA培養(yǎng)基倒置，然后分別接種葡萄灰霉菌，接種后觀察菌落生長情況并統(tǒng)計菌落直徑，以無菌PDA為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)過疣孢漆斑菌的培養(yǎng)基上，葡萄灰霉菌無法生長(圖4)。

以上結(jié)果說明疣孢漆斑菌對葡萄灰霉菌的生長發(fā)育具有明顯的抑制拮抗作用。

實施例4：疣孢漆斑菌防治葡萄灰霉病的活體實驗

葉片防治實驗：采用接種葡萄灰霉菌菌餅和孢子2種方法進(jìn)行，疣孢漆斑菌培養(yǎng)液和孢子作為2種處理。取田間歐洲葡萄‘紅地球’品種一年生新梢頂端往下2-3節(jié)幼葉帶回實驗室，無菌水漂洗3次，用濃度70％的酒精消毒30秒，再用無菌水漂洗3次，用吸水紙擦干葉片表面水，分別用疣孢漆斑菌培養(yǎng)液和孢子(1×10⁶個孢子/mL)進(jìn)行處理，一方面用疣孢漆斑菌培養(yǎng)液處理12小時后分別接種葡萄灰霉菌菌餅和孢子(1×10⁶個孢子/mL)；另一方面用疣孢漆斑菌孢子接種3天后再分別接種葡萄灰霉菌菌餅和孢子，接種后的葉片放置在鋪有濕潤濾紙的方形鐵盤中，用保鮮膜覆蓋，保持濕度，然后將接種盤放置在25℃光照培養(yǎng)箱中，16小時光照/8小時黑暗。接種葡萄灰霉菌3天后觀察發(fā)病情況并拍照，統(tǒng)計病斑面積，以未處理直接接種葡萄灰霉病菌菌餅和孢子為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)疣孢漆斑菌的孢子和培養(yǎng)液處理歐洲葡萄‘紅地球’品種的葉片可明顯防治葡萄灰霉病的發(fā)生(圖5)。

果實防治實驗：樣品前期處理和培養(yǎng)方法同上，疣孢漆斑菌孢子(1×10⁶個孢子/mL)接種紅地球果實3天后，接種葡萄灰霉病菌孢子(1×10⁶個孢子/mL)10天后觀察發(fā)病情況，以只接種葡萄灰霉病菌孢子的果實為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用疣孢漆斑菌的孢子處理歐洲葡萄‘紅地球’品種的果實同樣具有較好的防治效果(圖6)。

核苷酸或氨基酸序列表

<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)

<120>一種葡萄內(nèi)生真菌及其防治葡萄灰霉病的應(yīng)用

<160>

<210>1

<211>544

<212>SEQ ID NO.1

<213>DNA

<220>

<400>1

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAAACTCCCAAACCCTTTGTGAACCTTACCATATTGTTGCTTCGGCGGGACCGCCCCGGCGCCTTCGGGCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGCCCCAAACTCTTATGTCTTTAGTGGTTTTCTCCTCTGAGTGACACATAAACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCCCCCAGTGCCTGGTGTTGGGGATCGGCCCAGCCTTCTCGCAAGGCCGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGTCCTCCTCTGCGTAGTAGCACAACCTCGCAGTTGGAACGCGGCGGTGGCCATGCCGTTAAACACCCCACTTCTGAAAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA

<210>2

<211>25

<212>正向引物

<213>

<220>

<400>2

5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGA-3

<210>3

<211>25

<212>反向引物

<213>

<220>

<400>2

5’-TCCTACCTGATCCGAGGTCA-3’

核苷酸或氨基酸序列表

<110> 西北農(nóng)林科技大學(xué)大學(xué)

<120>一種葡萄內(nèi)生真菌及其防治葡萄灰霉病的應(yīng)用

<160>

<210> 1

<211> 544

<212> SEQ ID NO. 1

<213> DNA

<220>

<400> 1

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAAACTCCCAAACCCTTTGTGAACCTTACCATATTGTTGCTTCGGCGGGACCGCCCCGGCGCCTTCGGGCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGCCCCAAACTCTTATGTCTTTAGTGGTTTTCTCCTCTGAGTGACACATAAACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCCCCCAGTGCCTGGTGTTGGGGATCGGCCCAGCCTTCTCGCAAGGCCGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGTCCTCCTCTGCGTAGTAGCACAACCTCGCAGTTGGAACGCGGCGGTGGCCATGCCGTTAAACACCCCACTTCTGAAAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA

<210> 2

<211> 25

<212>正向引物

<213>

<220>

<400> 2

5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGGA-3

<210> 3

<211> 25

<212>反向引物

<213>

<220>

<400> 2

5’- TCCTACCTGATCCGAGGTCA-3’