本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種簡便制備活性人KGF-2D31的方法。

背景技術(shù)：

角質(zhì)細胞生長因子-2于1996年由Yamasaki等人從鼠的胚胎中發(fā)現(xiàn)，因與角質(zhì)細胞生長因子關(guān)系密切，故命名為角質(zhì)細胞生長因子-2(KGF-2，下文均以此簡稱代表)，又稱成纖維細胞生長因子-10(FGF-10)。人角質(zhì)細胞生長因子-2由624個核苷酸組成，編碼208氨基酸，理論分子量為19.3kDa。KGF-2主要由間質(zhì)細胞合成，能夠特異性結(jié)合靶細胞表面的成纖維細胞生長因子受體2Ⅲb(FGFR2Ⅲb)和成纖維細胞生長因子受體1Ⅲb(FGFR1Ⅲb)，兩個受體觸發(fā)傳導信號，從而發(fā)揮生理作用。

KGF-2能夠促進上皮細胞的增生和發(fā)育，其刺激角質(zhì)細胞增殖的能力比TGF和EGF強2至10倍，是多種組織器官中上皮細胞的特異性的有絲分裂源。KGF-2能夠通過刺激表皮細胞的增殖、遷移和分化直接促進傷口的愈合，也能通過刺激血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和成纖維細胞生長因子等的表達間接作用于組織的重塑。KGF-2在輻射對正常肌體和細胞造成的損傷修復方面有顯著的作用，它能提高骨髓對全身輻射的耐受性，降低輻射引起的胃腸道操作，同時調(diào)節(jié)和維持干細胞的分裂和存活。在潰瘍和腸炎治療上，KGF-2也有很好的療效。此外，在發(fā)育生物學中，KGF-2也被發(fā)現(xiàn)可刺激胎兒肺部液體分泌、促進起始肢芽的形成和增長，同時也參與卵泡發(fā)育及子宮內(nèi)膜著床的調(diào)節(jié)。

正由于KGF-2這些生物學功能，它在醫(yī)學臨床和美容方面有巨大的應用前景。在醫(yī)學臨床上，KGF-2已經(jīng)被證實可用于靜脈潰瘍、化療造成的粘膜炎、潰瘍性的大腸炎、燒傷等皮膚創(chuàng)口愈合等方面有顯著的療效。而在美容領(lǐng)域，由于KGF-2可促進上皮細胞的生長、分化和遷移的同時，會啟動上皮細胞對皮下組織的協(xié)同信號反饋，促進皮膚各組織的新陳代謝平衡，改善皮膚各組織的功能，增加皮膚的彈性，正在成為美容產(chǎn)品領(lǐng)域的研發(fā)熱點。然而重組KGF-2卻存在對酸和熱不穩(wěn)定，易降解，半衰期短，不易存儲，KGF-2的不穩(wěn)定性對其在醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域的應用帶來困難。但是在N段刪除部分氨基酸可提高其穩(wěn)定性，其中，成熟KGF-2N段刪除31個氨基酸后Ser69-Ser208(KGF-2D31)能在液態(tài)情況下保持穩(wěn)定10個月。

當今KGF-2一般通過基因工程的方法獲取重組的人角質(zhì)細胞生長因子-2(rhKGF-2)，基本都是通過大腸桿菌表達系統(tǒng)來進行生產(chǎn)，并且已經(jīng)能夠通過包涵體表達、可溶性表達和分泌表達等多種方式進行表達生產(chǎn)。但是無論是包涵體表達還是可溶性表達或分泌表達，rhKGF-2的純化方式一般使用親和層析、凝膠過濾層析、疏水層析等方式的較多步驟的不同組合，需要純化4-5步才能得到高純度的蛋白，費力、耗時的同時，也增加了產(chǎn)品的損耗率。

同時，現(xiàn)在國內(nèi)外有關(guān)于KGF-2生物學活性檢測方法上并沒有統(tǒng)一、公認的方法。因為KGF-2與FGFR2Ⅲb、FGFR1Ⅲb兩種受體能特異性的結(jié)合，所以，眾多研究文獻和一些生產(chǎn)商品化專供科研用KGF-2的公司多采用轉(zhuǎn)受體FGFR2Ⅲb的穩(wěn)定表達細胞株來進行KGF-2的生物學活性檢測，其中使用最多的是轉(zhuǎn)受體FGFR2lllb的BaF₃。雖然轉(zhuǎn)受體FGFR2lllb的BaF3在檢測KGF-2時的效果好、靈敏度高(EC50<0.5～1ng/mL，≥1～2×10⁶units/mg)，但是ATCC已暫停出售，市場上也沒有商品化的轉(zhuǎn)受體FGFR2lllb的BaF₃出售，想使用這種方法，仍需要花費較長的時間(3-6個月)、精力來構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞株。一些研究文獻和生產(chǎn)商也采用了諸如NRK52E、4MBr-5、ICE-6、RTE等上皮細胞來進行KGF-2的活性檢測，這些細胞雖然不需要進行轉(zhuǎn)受體穩(wěn)定表達細胞株的構(gòu)建，但檢測范圍不一，而且一般都比較孤立，細胞應用范圍有限，重復性也較差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種簡便制備活性人KGF-2D31的方法：

(1)菌株的制備表達和誘導表達

該步驟可采用常規(guī)的操作進行，

其中，使用的表達菌株是E.coli，包括但不限于Rosetta^TM(DE3)pLysS，這種菌株是攜帶氯霉素抗性質(zhì)粒BL21的衍生菌，可補充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子(AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA)對應的tRNA，提高外源基因尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平，

進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時，可使用LB培養(yǎng)基或其它培養(yǎng)基(如SOB、SOC、2×YT)，需要添加的氨芐青霉素、氯霉素的終濃度分別為60μg/mL和170μg/mL，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方法采用電轉(zhuǎn)法、CaCl₂法均可，參照現(xiàn)有方法進行轉(zhuǎn)化、驗證、凍存即可，

冷凍的菌種不要直接用于誘導表達，而是取少部分菌液進行大量稀釋后，涂于平板上培養(yǎng)過夜來獲取單菌落接入培養(yǎng)基(也可直接將幾μL的冷凍菌液直接接入培養(yǎng)基中)，37℃以200-250rpm振蕩培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)(最少要培養(yǎng)5hrs以上)，過夜培養(yǎng)的菌液以1:500的體積接入大體積的含2×YT培養(yǎng)基的搖瓶中，37℃以200-250rpm振蕩培養(yǎng)4-5hrs，菌液的OD600即可達到0.6-0.8，冰浴搖瓶，加IPTG至0.2mM，調(diào)整搖床轉(zhuǎn)數(shù)至160～180rpm，在25℃過夜振蕩培養(yǎng)16～18hrs，即可完成誘導表達，

本發(fā)明中誘導表達的條件是經(jīng)過實驗摸索的，也可使用37℃、30℃作為誘導表達的溫度、IPTG的濃度為0.2M，但是培養(yǎng)時間不要長于6hrs，30℃條件下的表達量要高于37℃，但低于25℃過夜誘導表達，25℃過夜誘導時IPTG的終濃度為0.1mM與0.2mM時，蛋白表達量無明顯區(qū)別，綜上，優(yōu)選的KGF-2D31的誘導表達方案：用0.2mM濃度的IPTG在160rpm震蕩下于25℃溫度條件下進行過夜誘導表達，

用于誘導表達的培養(yǎng)基為2×YT培養(yǎng)基，也可使用LB、SOB、SOC等培養(yǎng)基，但是2×YT培養(yǎng)基所能得到的菌體濕重更高，一般能達到9g/1L菌液；

(2)菌體的收集和裂解

菌體收集采用冷凍離心法，將步驟(1)中完成誘導表達后所得體系于10000rpm下在4℃下離心20min，收集菌體、稱重，為了不影響后續(xù)純化實驗的進行，需要去除菌體中殘留的NaCl，因此使用不含NaCl(或含NaCl低于500mM)的PBS、Tris-Cl或檸檬酸緩沖液清洗一次后，再次離心，棄上清收集菌體，離心獲得的菌體可冷凍于-80℃，經(jīng)過凍融更有助于菌體的裂解，

裂解緩沖液采用檸檬酸緩沖體系，同時加入PMSF和DNase 1來防止目的蛋白被分解和去除核酸污染，配方為：20mM檸檬酸-檸檬酸鈉，500mM NaCl，1mM EDTA，PMSF 1mM，DNase 1(20μg/mL)，pH6.2，

平均濕重菌體每克加15mL該裂解緩沖液進行重懸，而后置于冰中進行超聲波破碎，然后12000rpm于4℃離心30min，收集上清液用于蛋白純化；

(3)純化

采用強陽離子交換層析，具體使用的是SP Bestarose Fast Flow，

本發(fā)明在進行實驗方法摸索時，也曾使用過Tris-HCl和磷酸鹽緩沖體系，但這些體系純化所得來的蛋白易在后續(xù)的透析步驟中產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)沉淀，所以本發(fā)明優(yōu)選方案是純化所用溶液均采用檸檬酸緩沖體系，主要為20mM檸檬酸-檸檬酸鈉，其中檸檬酸與檸檬酸鈉的物質(zhì)的量比例為1：4，

其中，洗滌緩沖液：20mM檸檬酸-檸檬酸鈉、500mM NaCl、1mM EDTA、pH6.2；

洗脫緩沖液：20mM檸檬酸-檸檬酸鈉、1mM EDTA、NaCl濃度為600mM～1M、pH6.2，

具體過程與一般的強陽離子交換層析基本相同，用5倍～10倍柱體積的洗滌緩沖液進行洗滌，即可將多數(shù)雜質(zhì)蛋白洗下，含600mMNaCl的洗脫緩沖液即已可以將KGF-2D31洗脫，而700mM～800mM的NaCl是洗脫的最佳濃度，本專利采用柱體積的5～10倍的洗脫液進行洗脫，效果較好，

純化全程處于4℃環(huán)境中，經(jīng)過陽離子交換層析純化獲得的粗制蛋白量一般為100mg/1L菌液(即9g濕重的菌體)；

(4)透析

洗脫獲得的KGF-2D31濃度較高、NaCl的濃度也比較高，KGF-2D31易產(chǎn)生聚集，同時溶液中也含有少量分子量較小的雜質(zhì)，NaCl鹽濃度需要進行降低，

本發(fā)明采用透析的方法進行除鹽，用透析緩沖液(20mM檸檬酸-檸檬酸鈉、150mM NaCl、1mM EDTA、pH6.2)于4℃環(huán)境中進行透析，在透析前，初步檢測一下KGF-2D31洗脫液中蛋白的濃度，以洗滌緩沖液(20mM檸檬酸-檸檬酸鈉、500mM NaCl、1mM EDTA、pH6.2)稀釋至約1mg/mL再裝入透析袋(透析袋截留分子量在10000kDa左右即可)中進行透析，

透析完成后，以12000rpm于4℃離心30min，收集上清，上清中的KGF-2D31濃度一般略低于1mg/mL，這時可采用一些方法進行濃縮，鑒于KGF-2D31對于酸、熱等條件比較敏感，同時也為避免KGF-2D31的損耗，優(yōu)選的方法是超濾膜濃縮法，較小體積的KGF-2D31溶液使用冷凍離心機和超濾管即可完成濃縮，

調(diào)整完濃度的KGF-2D31隨后可通過SDS-PAGE和紫外分光光度計來進行純度和最終濃度的檢測，一般蛋白的產(chǎn)率為每1L菌液能獲取70mg以上的KGF-2D31，純度可達到95％左右，

KGF-2D31產(chǎn)品經(jīng)液氮速凍后，于-80℃保存。

本發(fā)明還提供了一種對上述所得的KGF-2D31進行生物活性檢測的方法：

(1)Balb/c 3T3的培養(yǎng)

Balb/c 3T3培養(yǎng)時一定不能接觸抑制，凡是接觸抑制的細胞不能用于繼續(xù)傳代和活性檢測實驗，

其中，Balb/c 3T3的培養(yǎng)使用含胎牛血清(FBS)的Balb/c 3T3培養(yǎng)用培養(yǎng)基：10％胎牛血清(FBS)、1×雙抗、基礎(chǔ)培養(yǎng)為DMEM(H)，含1.5g/L NaHCO₃，pH7.2～7.4進行培養(yǎng)時，生長速度較快，優(yōu)選的培養(yǎng)周期是細胞傳代培養(yǎng)接種密度為1.8×10⁵/100mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)48hrs換液一次，培養(yǎng)72h后傳代；同時用于鋪板的細胞與正常傳代的細胞分開培養(yǎng)，用于鋪板的細胞培養(yǎng)接種密度為3.2×10⁵/100mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)48h后接種細胞于96孔板中，Balb/c3T3培養(yǎng)時另一個注意事項，接種時需要細胞貼壁均勻，避免局部細胞過多而接觸抑制，

Balb/c 3T3細胞對溫度和培養(yǎng)基中的pH變化較為敏感，所以優(yōu)選的方法是先將培養(yǎng)基充分預熱后，在含5％(氣體體積含量，下同)CO₂的培養(yǎng)箱中平衡15min以上后使用，同時處理、重懸后的細胞在未進行接種時，可放入水浴或培養(yǎng)箱中保持37℃溫度恒定，消化Balb/c3T3使用的胰酶濃度不宜過高，優(yōu)選的方案是以D-Hanks為母液配制的0.1％胰酶、0.01％EDTA，pH為7.4的消化液，消化時間一般為室溫(25℃)消化2～3min即可，這樣會殘留少量細胞在皿底，但多數(shù)細胞會被消化下來且細胞狀態(tài)不會受影響；

(2)細胞的種板、體克

Balb/c 3T3在復蘇后培養(yǎng)2～3代的細胞即可用于種板，一般使用解凍后培養(yǎng)12代以內(nèi)的細胞，

種板用的培養(yǎng)基：10％胎牛血清(FBS)、1×雙抗、基礎(chǔ)培養(yǎng)為DMEM(H)，含2.5g/LNaHCO₃和15mM HEPES，pH 7.2～7.4，接種密度優(yōu)選方案為4000～5000個細胞/孔，

種板24hrs后進行換液休克，休克用培養(yǎng)基為1.5％胎牛血清(FBS)、1×雙抗、基礎(chǔ)培養(yǎng)為DMEM(H)，含2.5g/L NaHCO₃和15mM HEPES，pH 7.2～7.4，休克時間一般為16～18hrs，

無論種板還是休克用培養(yǎng)基在使用前均需要在含5％CO₂的培養(yǎng)箱中平衡15min以上后使用；

(3)KGF-2D31的梯度稀釋

KGF-2D31稀釋用的培養(yǎng)基與休克用培養(yǎng)基相同，稀釋時采用梯度稀釋的方法進行，但優(yōu)選的方案是進行倍比稀釋，從20μg/mL濃度開始進行2倍的稀釋，作10個梯度，

換液時，每個孔中的培養(yǎng)基可留大約10μL左右(這樣可以避免孔中細胞過干死亡)，加入的含不同濃度KGF-2D31的培養(yǎng)基的體積為200μL/孔；

(4)KGF-2D31的生物學活性檢測

加入KGF-2D31后一般培養(yǎng)48hrs即可進行檢測，向步驟(3)的每個孔中加入MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)反應4hrs后即可去除孔中培養(yǎng)基，并加入DMSO，

本發(fā)明優(yōu)選的方案是先以2500rpm離心孔中加有MTT溶液的細胞板5～10min后，培養(yǎng)反應4hrs后以針式1mL注射器沿壁吸除孔中液體，而不是使用移液槍吸除，這樣可避免孔中藍紫色結(jié)晶的損失，加入DMSO(100μL/孔)后，可先放置于培養(yǎng)箱避光孵育5min后，再放置于酶標儀上讀取570nm的吸光值，如有條件，酶標儀可在讀取前振蕩1～2min，

讀取數(shù)據(jù)后，即進行數(shù)據(jù)處理，擬合出生長曲線后可得到KGF-2D31的EC50，本發(fā)明采用GraphPad Prism 5進行數(shù)據(jù)的擬合，也可使用如origin、SPSS等其它的數(shù)據(jù)處理軟件進行擬合，KGF-2D31的EC50一般在2～10μg/mL之間。

本發(fā)明的有益效果在于：

純化、制備方法的簡便性：按照本領(lǐng)域的傳統(tǒng)認知，在高鹽濃度下所有蛋白與強陽離子樹脂幾乎無法相互作用，無法實現(xiàn)結(jié)合，而本申請中首先意識到，KGF-2D31不同于其他蛋白，在高鹽濃度下卻能夠與強陽離子樹脂很好地結(jié)合，因此本申請基于這一特點，利用了高鹽濃度(500mM NaCl)，使雜質(zhì)蛋白無法與強陽離子樹脂結(jié)合，而KGF-2D31與強陽離子樹脂結(jié)合在一起，只需通過一次強陽離子交換層析和透析即可獲得高純度的KGF-2D31蛋白，大大簡化了純化步驟和純化用時，減少了蛋白質(zhì)的損耗率；

本發(fā)明中的宿主菌也可成為后續(xù)發(fā)酵試驗的優(yōu)秀工程菌；

本發(fā)明全程使用了檸檬酸緩沖體系，在獲取較高表達量(70mg/1L菌液)的同時，也保證了蛋白的生物學活的穩(wěn)定；

本發(fā)明建立了以Balb/c 3T3細胞檢測人角質(zhì)細胞生長因子-2生物學活性的方法，提供了一種新的、簡便、通用的檢測方式。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中，25℃、30℃、37℃三種溫度下誘導表達量的15％SDS-PAGE檢測電泳圖，

對比了誘導前與25℃過夜誘導(IPTG分別為0.1M、0.2M)和30℃、37℃(誘導3、4、5、6hrs)時KGF-2D31表達量的差異，

“M”為Maker，從上至下的分子量分別為116.0、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4kDa。

圖2為本發(fā)明實施例中，2L 2×YT培養(yǎng)基25℃過夜培養(yǎng)誘導表達的KGF-2D31的強陽離子交換層析的15％SDS-PAGE電泳圖，

“M”為Maker，從上至下的分子量分別為116.0、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4kDa；

“上清”為裂解后離心所得上清液，“沉淀”為裂解后離心所得相應的沉淀物；

“FT”為步驟(3)中，菌體裂解上清液過柱后收集的穿流液；

W1、W2依次為500mM NaCl的洗滌緩沖液(根據(jù)流出先后順序的不同，分步收集、檢測，下同)，

E1、E2依次為600mM NaCl濃度的洗脫后的洗脫液，E3、E4依次為650mM NaCl濃度的洗脫后的洗脫液，E5、E6依次為800mM NaCl濃度的洗脫后的洗脫液，E7、E8、E9依次為1M NaCl濃度的洗脫后的洗脫液，均為25mL/管；

“SP”為經(jīng)洗脫后的強陽離子純化樹脂。

圖3：透析結(jié)束后離心所得上清液中KGF-2D31的15％SDS-PAGE電泳圖，

“M”為Maker，從上至下的分子量分別為116.0、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4kDa；

另一泳道為透析結(jié)束后離心所得上清液中KGF-2D31。

圖4：KGF-2D31純化樣品生物學活檢測擬合曲線圖。

具體實施方式

主要試劑和儀器

(1)主要試劑：

2×YT培養(yǎng)基：16g Tryptone、10g Yeast Extract、5g NaCl，加900mL超純水溶解，滴加1N NaOH，調(diào)節(jié)pH值至7.0，加超純水將培養(yǎng)基定容至1L，121℃高壓滅菌20min后，4℃保存；

IPTG：上海生工，1M(自配后分裝，-20℃保存)

氨芐青霉素、氯霉素：購自上海生工(自配后分裝，-20℃保存)

強陽離子交換層析(SP)介質(zhì)：SP Bestarose Fast Flow，購自上海博格隆公司

破菌緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩液：按相應配方配制后調(diào)節(jié)pH至6.2，0.45μm濾膜過濾后，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

DMEM(H)：Gibco，粉末，用前加入NaHCO₃或HEPES配制，0.22μm無菌濾器過濾后，4℃保存?zhèn)溆?/p>

FBS：Gibco，分裝，-20℃以下保存，用前4℃解凍

PBS：按《分子克隆實驗指南》中所列步驟進行配制

消化液：0.1％胰酶/EDTA

雙抗：Hyclone，分裝，-20℃保存

L-谷氨酰胺：Gibco，分裝，-20℃保存

MTT：5mg/mL(sigma公司)

(2)主要儀器

高速冷凍離心機、低速度冷凍離心機：上海安亭

CO₂培養(yǎng)箱：Thermo Fisher

酶標儀：Bio-Rad Synergy HT

倒置顯微鏡：Olympus

紫外分光光度計：北京普析

恒溫振蕩搖床：上海智誠

(3)菌株和細胞株

Rosetta^TM(DE3)pLysS：購自Novagen公司，貨號為71403

Balb/c 3T3：購自ATCC，貨號CCL-163

以下實施例所使用的試劑，如文中無特殊說明(或未具體提及)，則表明其為一般常用的分析純即可，配制方法可參見《分子克隆實驗指南》標識的方法、條件進行配制或按相應廠商所建議的條件；本發(fā)明所使用的儀器，如果文中無特殊說明(或未具體提及)，則表明只要能達到相應要求參數(shù)的儀器就可滿足需求，使用可按廠商所建議的條件；如果未注明具體的實驗條件、方法等，則表示可使用常規(guī)條件，例如《分子克隆實驗指南》標識的方法、條件或相應廠商建議的條件。

(1)菌株的制備表達和誘導表達

將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌Rosetta^TM(DE3)pLysS中，

進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時，使用LB培養(yǎng)基，添加的氨芐青霉素、氯霉素的終濃度分別為60μg/mL和170μg/mL，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方法采用電轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)化完成后凍存保存，

將上述冷凍的菌種進行大量稀釋后，涂于平板上培養(yǎng)過夜(培養(yǎng)12小時)來獲取單菌落接入培養(yǎng)基，37℃以220rpm振蕩培養(yǎng)過夜(培養(yǎng)8小時)，過夜培養(yǎng)的菌液以1:500的體積比接入大體積的含2×YT培養(yǎng)基的搖瓶中，37℃以240rpm振蕩培養(yǎng)5hrs，菌液的OD600即達到0.7，然后加入IPTG，搖瓶中以180rpm轉(zhuǎn)速進行培養(yǎng)完成誘導表達，

其中，分別以30℃、37℃進行誘導表達時，IPTG終濃度為0.2mM，誘導時間6hrs；以25℃進行過夜誘導表達時，IPTG終濃度為0.1mM和0.2mM，誘導時間均為16hrs，

取以上各個實驗組中不同誘導表達條件和表達時間的菌液2mL，以12000rpm于4℃離心10min，收集菌體，用2mL溶液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，100mM NaCl，8M Urea，pH8.0)將菌體重懸，取樣進行SDS-PAGE分析(圖1)：SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示25℃過夜誘導KGF-2D31的表達最高；30℃條件下表達量較高于37℃；但25℃下兩種IPTG濃度下KGF-2D31表達量無明顯差異。

(2)菌體的收集和裂解

將步驟(1)中以“25℃、加IPTG至0.2mM、誘導時間為16hrs”完成誘導表達后所得菌液于10000rpm下在4℃下離心20min，收集菌體，用PBS洗滌菌體一次，再次離心收集菌體，棄洗滌液，稱菌體濕重為17.2mg，冷凍于-80℃裂解(用前4℃解凍)，

每克菌體用15ml以裂解緩沖液(20mM檸檬酸-檸檬酸鈉、500mM NaCl、1mM EDTA、PMSF 1mM、DNase 1(20μg/mL)、pH6.2)進行重懸，重懸后置于冰中，進行超聲波破碎，然后以12000rpm于4℃離心30min，收集上清液進行蛋白純化。

(3)強陽離子交換層析一次

取5mL SP Bestarose Fast Flow到層析柱中，加50mL的洗滌緩沖液(20mM檸檬酸-檸檬酸鈉、500mM NaCl、1mM EDTA、pH6.2)平衡后，將步驟(2)中收集所得的上清液上柱，再以50mL的洗滌緩沖液(20mM檸檬酸-檸檬酸鈉、500mM NaCl、1mM EDTA、pH6.2)過柱洗滌兩次，以去除層析介質(zhì)上未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白等；再依次以600mM、650mM、800mM、1M的NaCl濃度的洗脫緩沖液(20mM檸檬酸-檸檬酸鈉、1mM EDTA、pH6.2)進行洗脫，其中，“600mM”、“650mM”、“800mM”每個梯度分兩次洗脫、每次用25mL，“1M”梯度分3次洗脫、每次用25mL，根據(jù)流出先后順序的不同，分步收集、檢測。

從菌體裂解開始各個步驟取樣進行SDS-PAGE分析檢測：如圖2所示，洗滌緩沖液(W1、W2)已將主要的雜質(zhì)蛋白洗脫，600mM的NaCl濃度已能洗脫KGF-2D31，但是也有較多的雜質(zhì)蛋白洗脫下來，所以取650mM～1M(E4～E9)洗脫后所得的雜質(zhì)少、KGF-2D31蛋白較集中的洗脫液進行合并(作為用于透析的蛋白)，使用紫外分光光度計對合并的洗脫液進行蛋白含量的測定，其中KGF-2D31粗測為200mg。

(4)透析

以洗滌緩沖液(20mM檸檬酸-檸檬酸鈉，500mM NaCl，1mM EDTA，pH6.2)稀釋步驟(3)中純化所得蛋白至KGF-2D31濃度為1mg/mL，再裝入透析袋中進行透析(以20mM檸檬酸-檸檬酸鈉、150mM NaCl、1mM EDTA、pH6.2的混合溶液為透析液)，每100mL的蛋白稀釋液放入4.5L的透析液中進行透析，每8hrs更換一次透析液，連續(xù)透析48hrs，

透析結(jié)束后，以12000rpm于4℃離心30min，收集上清，對該上清取樣進行SDS-PAGE檢測。如圖3，透析后的上清中雜質(zhì)蛋白會沉淀，通過高速離心去除，且留存的KGF-2D31蛋白無聚集，純度可達到95％。此次可收獲142mg的KGF-2D31。

使用超濾管以4000rpm在4℃下離心透析所得上清，去除一部分溶劑，調(diào)整KGF-2D31濃度為1mg/mL，液氮速凍后保存于-80℃。

KGF-2 D31的活性檢測

(1)Balb/c 3T3的培養(yǎng)

使用含胎牛血清(FBS)的Balb/c 3T3培養(yǎng)用培養(yǎng)基(10％胎牛血清(FBS)、1×雙抗、基礎(chǔ)培養(yǎng)為DMEM(H)，含1.5g/L NaHCO₃，pH7.2)培養(yǎng)Balb/c 3T3細胞，

以細胞傳代培養(yǎng)接種密度為1.8×10⁵/100mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)48hrs換液一次，培養(yǎng)72h后傳代，傳代2次后以3.2×10⁵/100mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24hrs后換液一次，再培養(yǎng)24hrs后即可用于種板(培養(yǎng)后的細胞在未進行接種時，放入培養(yǎng)箱中保持37℃溫度恒定)，

上述培養(yǎng)基在使用前，經(jīng)充分預熱后在含5％(氣體體積含量，下同)CO₂、飽和濕度的培養(yǎng)箱中平衡20min后使用；

(2)細胞的種板、體克

將步驟(1)中培養(yǎng)有細胞的培養(yǎng)皿用PBS洗滌兩次，然后以0.1％胰酶、0.01％EDTA、pH為7.4的消化液室溫(25℃)消化2min，鏡下觀察多數(shù)細胞發(fā)生形變，從皿底開始解離即加入10mL的種板用培養(yǎng)基(10％胎牛血清(FBS)、1×雙抗、基礎(chǔ)培養(yǎng)為DMEM(H)，含2.5g/L NaHCO₃和15mM HEPES，pH 7.2)終止消化，用移液管輕輕吹打促進混勻，吸入到50mL無菌離心管中以1000rpm室溫離心5min，

離心結(jié)束后，棄上清，并向離心管中再加入3mL上述種板用培養(yǎng)基，移液管輕輕吹打，重懸離心管中細胞，取20μL計數(shù)，隨后以上述種板用培養(yǎng)基將細胞稀釋至400000個/mL，混勻，加入到無菌加樣槽中，用多道移液器將細胞稀釋液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，100μL/孔，放置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24hrs；

吸除上述細胞培養(yǎng)板孔內(nèi)的培養(yǎng)基，加入休克培養(yǎng)基(1.5％胎牛血清(FBS)、1×雙抗、基礎(chǔ)培養(yǎng)為DMEM(H)，含2.5g/L NaHCO3和15mM HEPES，pH 7.2，下同)100μL/孔，放置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中休克培養(yǎng)18hrs；

(3)KGF-2D31的梯度稀釋

取實施例部分所制備的上述KGF-2D31(1mg/mL)20μL，先加休克培養(yǎng)基80μL，混勻，再加900μL休克培養(yǎng)基，混均，稀釋KGF-2D31濃度至20μg/mL；此后，使用休克培養(yǎng)進行倍比稀釋，包括陰性對照在內(nèi)共設(shè)置10個濃度梯度(μg/mL)：0、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125；

(4)KGF-2D31的生物學活性檢測

將步驟(2)的細胞培養(yǎng)板孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸除，并且加入步驟(3)配制的各個濃度的KGF-2D31稀釋液200μL，每個濃度梯度3個重復(即每個梯度加入三個孔)，稀釋結(jié)束后將細胞培養(yǎng)板放置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48hrs，

向上述細胞培養(yǎng)板的每個孔中加入MTT溶液20μL/孔，于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育4hrs后，以2500rpm室溫下離心細胞板5min，再用1mL針管注射器針頭沿細胞孔孔壁插入孔中吸除孔中液體，而后加入DMSO100μL/孔，先放置于培養(yǎng)箱避光孵育5min后，再放置于酶標儀上振蕩2min，讀取570nm的吸光值，結(jié)果見表1。

表1

根據(jù)表1中數(shù)據(jù)，使用GraphPad Prism 5進行數(shù)據(jù)的擬合，所得到的EC50為2.741μg/mL，結(jié)果表明純化所得KGF-2D31具有良好的生物學活性。擬合圖可見圖4。