本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，進一步涉及單克隆抗體的體外表達技術(shù)，具體涉及一種呼吸道合胞病毒單克隆抗體制備方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的定義，呼吸道合胞病毒感染是一種傳染性病毒疾病，為嬰兒及幼兒所患嚴重呼吸道疾病中最重要的一種病因。該病癥的主要表現(xiàn)為支氣管炎、肺部小氣道炎癥或病毒性肺炎。
在發(fā)達國家，呼吸道合胞病毒已成為導(dǎo)致嬰兒住院的首要病因，但至今尚未有能夠預(yù)防該病的疫苗。目前只有兩種藥物(帕利珠單抗和利巴韋林)可供患者選擇，而這兩種藥也存在著極大的缺陷。
呼吸道合胞病毒藥物未能滿足臨床需求，為全球各國的衛(wèi)生保健系統(tǒng)帶來了極大的負擔。許多兒童在出生后的第二年即感染呼吸道合胞病毒，在早產(chǎn)兒、幼齡兒童、老年人身上，感染的癥狀更加嚴重，這些癥狀包括噴嚏、咳嗽、發(fā)燒和喘鳴。嬰幼兒感染該病毒可能會引發(fā)肺炎以及嚴重的呼吸問題，在少數(shù)病例中可能具有致命性。
WHO數(shù)據(jù)顯示，全球每年的呼吸道合胞病毒感染者約有6400萬例，16萬例死亡。呼吸道合胞病毒所面臨的種種挑戰(zhàn)主要緣自該領(lǐng)域的研究工作基礎(chǔ)薄弱。不過，隨著阿斯利康醫(yī)學(xué)免疫公司和美國生物制藥公司諾瓦瓦克斯的疫苗候選物的研發(fā)，該領(lǐng)域的前景似乎也并不昏暗。此外，盡管抗病毒藥物的研發(fā)正處于早期階段，但具有良好的潛力。
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)屬副黏病毒科肺炎屬，1956年Morris從一只有感冒癥狀的實驗動物黑猩猩的鼻咽分泌物中分離出第一株RSV。1957年Chanock先后從Baltimore市2例分別患肺炎和有喘息癥狀患兒的咽拭子中分離到。因其在組織培養(yǎng)中能形成特殊的細胞融合病變而得名。呼吸道合胞病毒是嬰幼兒呼吸道感染最常見的病原體，特別是2～6個月小嬰兒RSV感染后常發(fā)生嚴重毛細支氣管炎和肺炎。通常在冬、春季節(jié)流行。在世界不同地區(qū)每年因RSV感染而需住院治療的患兒為1‰～5‰，住院病人病死率為1‰～3‰。有這種感染的嬰兒或兒童，可能有一個或多個下列癥狀：1，咳嗽；2，流鼻涕；3，發(fā)燒；4，喘息。長期以來，抗感染一直是治療呼吸道合胞病毒疾病的不二選擇，但如今疫苗的開發(fā)也在加速。相關(guān)疫苗可快速提供給嬰兒，并解決呼吸道合胞病毒疾病導(dǎo)致的醫(yī)療衛(wèi)生負擔問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種呼吸道合胞病毒單克隆抗體制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種呼吸道合胞病毒單克隆抗體體外表達方法的技術(shù)問題。
本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是在獲得了整合有呼吸道合胞病毒單克隆抗體表達基因的重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，質(zhì)粒在表達系統(tǒng)中的表達效率較低。
為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種呼吸道合胞病毒單克隆抗體制備方法，包括以下步驟：
1)從呼吸道合胞病毒感染后又康復(fù)者的血清中提取記憶性B細胞，活化培養(yǎng)后通過酶聯(lián)免疫方法篩選RSV抗體陽性細胞；
2)提取RSV抗體陽性細胞的RNA，分別用一步法RT-PCR方法擴增抗體重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)基因Vκ或Vλ；
3)將VH基因通過酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgH連接得到重鏈可變區(qū)基因重組質(zhì)粒，將Vκ基因通過酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgκ連接或?qū)λ基因通過酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgλ連接得到輕鏈可變區(qū)基因重組質(zhì)粒；
4)擴增步驟3)所得的重組質(zhì)粒，而后篩選表達抗體重鏈和輕鏈的陽性質(zhì)粒；
5)制備減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株的感受態(tài)細胞，取步驟4)所得的陽性質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入其中，篩選陽性克隆，得到重組細菌；
6)取HEK293-T細胞與步驟5)所得的重組細菌，以二者的細胞量為1:20～1:200的比例在細胞培養(yǎng)板中混合，培養(yǎng)4～16h，而后將細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40～56h。
作為優(yōu)選，步驟1)中記憶性B細胞是通過以下方法提取的：將20ml新鮮EDTA抗凝全血樣本按照5ml/管加入淋巴細胞分離管中，2200r/min離心15min，吸取白色淋巴細胞層，即為人外周血單個核細胞，而后用人記憶性B細胞磁珠分選試劑盒從中分選出記憶性B細胞。
作為優(yōu)選，步驟1)所述活化培養(yǎng)包括以下步驟：將記憶性B細胞以200細胞/孔的密度接種96孔U型底培養(yǎng)板，培養(yǎng)液含2.5μg/ml的CpG2006、10ng/ml的IL-2和10ng/ml的IL-10，以25％的B958細胞培養(yǎng)上清和5000cGy照射滅活的同種異源的外周血單個核細胞50000/孔為飼養(yǎng)細胞，于37℃、5％CO2條件培養(yǎng)兩周。
作為優(yōu)選，步驟4)中對重組質(zhì)粒的擴增是將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)12-16h，而后取菌落置于5ml含氨芐抗生素100μg/ml的LB液體培養(yǎng)基的試管中，180r/min左右振搖培養(yǎng)過夜，收集菌液小提質(zhì)粒。
作為優(yōu)選，步驟6)中HEK293-T細胞的加入量為8000～12000個/孔。
作為優(yōu)選，步驟6)所述混合后，細胞培養(yǎng)板的每孔中液體總量為450～550μL。
作為優(yōu)選，步驟6)所述針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素是青霉素和鏈霉素。
作為優(yōu)選，步驟5)所述的電轉(zhuǎn)法包括以下步驟：取陽性質(zhì)粒與步驟1)所述感受態(tài)細胞在電轉(zhuǎn)杯中混合，而后以電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉(zhuǎn)4.7ms。
作為優(yōu)選，步驟5)中減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株的感受態(tài)細胞是通過以下方法制備的：
A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；
B)挑取單菌落接種于3～7ml LB液體培養(yǎng)基中，35～39℃振蕩培養(yǎng)10～14h；
C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:80～1:120的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值不小于0.4；
D)冰浴15～25min后，離心取沉淀用1/8～1/12體積預(yù)冷的無菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/80～1/120體積預(yù)冷的、8～12％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/80～1/120體積預(yù)冷的、8～12％(mL/mL)的甘油中。
作為優(yōu)選，步驟6)完成后繼續(xù)執(zhí)行以下步驟7)：取步驟6)所得的培養(yǎng)液上清1500r/min離心4min棄沉淀，而后用0.45μm濾器過濾，收集濾液并以1～2滴/秒的速度流過蛋白A純化柱，使IgG結(jié)合至蛋白A上；用PBS以5000g離心1min洗滌純化柱2～3次，棄液，加入400ul IgG洗脫液輕輕混合，將柱子放進已加入40μl PH7.5～9的Tris-鹽酸中和液的1.5ml離心管中，5000g離心1min，所得液體即為純化的單克隆抗體。
本發(fā)明提供了一種呼吸道合胞病毒單克隆抗體制備方法，該技術(shù)方案是從近期感染呼吸道合胞病毒但又康復(fù)者的外周血分離記憶性B細胞，進一步確定表達抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因，利用鼠傷寒感受態(tài)細胞VNP20009直接轉(zhuǎn)染293T細胞并使其在體外大量表達呼吸道合胞病毒抗體，經(jīng)鑒定后評價其對呼吸道合胞病毒的中和能力和殺傷能力，從而篩選出高效的可以產(chǎn)業(yè)化的呼吸道合胞病毒單克隆抗體。本發(fā)明的優(yōu)點是：直接以鼠傷寒感受態(tài)細胞VNP2009轉(zhuǎn)染293T細胞，與傳統(tǒng)方法相比較不僅節(jié)省了很多的時間而且還可以避免使用大量的轉(zhuǎn)染試劑就可以使單克隆抗體在體外表達。由于把外源性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進表達細胞是單克隆抗體體外表達的關(guān)鍵步驟，本發(fā)明可以用于呼吸道合胞病毒單克隆抗體的體外表達。
具體實施方式
以下將對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。
以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1
A、鼠傷寒VNP20009細菌的活化：從-80℃冰箱取出于1.5mlEP管凍存的傷寒VNP20009細菌，融化后吸取100μl接種于盛有5mlLB培養(yǎng)液的滅菌離心管中，在恒溫培養(yǎng)箱匯中220r/min,37℃培養(yǎng)12～14h；
B、鼠傷寒VNP20009細菌感受態(tài)的制備：
1、將-80℃保存的LB5000和SL3261甘油菌劃線接種于無抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)18h；
2、挑取單個菌落于2ml LB中，37℃振蕩培養(yǎng)12h；
3、按1：100比例接種于50ml LB中振蕩培養(yǎng)至細菌OD600約為0.4左右；
4、倒入50ml無菌離心管中冰浴20min，4℃，3000rpm,離心10min；
5、棄上清，加入預(yù)冷的無菌去離子水充分重懸菌體，4℃，3000rpm，離心10min，棄上清；重復(fù)該步驟2次，以充分洗滌菌體；
6、用冰浴的10％甘油充分懸浮菌體，4℃，3000rpm，離心10min，棄上清；
7、將細菌重懸于2ml預(yù)冷的10％的甘油中，分裝于預(yù)冷的滅菌EP管(150μL/管)，現(xiàn)用或-80℃?zhèn)溆茫?/p>
C、血樣PBMC的分離和記憶性B細胞的分選：將20ml新鮮EDTA抗凝全血樣本按照5ml/管加入淋巴細胞分離管中，2200r/min離心15min，吸取白色淋巴細胞層，即為人外周血單個核細胞。然后用人記憶性B細胞磁珠分選試劑盒分選出記憶性B細胞；
D、記憶性B細胞的活化培養(yǎng)：將分選所得的記憶性B細胞按照200細胞/孔的密度接種96孔U型底培養(yǎng)板，培養(yǎng)液中含2.5μg/ml的CpG2006、10ng/ml的IL-2和10ng/ml的IL-10,25％的B958細胞培養(yǎng)上清和5000cGy照射滅活的同種異源的外周血單個核細胞50000/孔作為飼養(yǎng)細胞，在37℃,5％CO2條件下培養(yǎng)兩周，讓記憶性B細胞活化成為抗體分泌細胞，收集上清用于下一步檢測
E、RSV陽性孔的篩選和抗體輕鏈類型的確定:
1、RSV陽性孔的篩選：
使用酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法檢測B細胞上清特異性；
2、抗體輕鏈類型的確定：
(1)用100ng/孔的D7324和100ng/孔gp41包被酶標板，4℃過夜。洗板機洗板5遍；
(2)加入5％脫脂奶200μl/孔，37℃封閉2h，洗板5遍；
(3)加入適當稀釋的含gp120和FLSC的細胞上清，50μl/孔，37℃放置1h。洗板5遍；
(4)加入適當稀釋的待測抗體，37℃放置1h，洗板5遍；
(5)其中2孔加入HRP標記的κ抗體、另外2孔加入HRP標記的λ抗體，50μl/孔，37℃放置45min，洗板5遍；
(6)加入TMB顯色液100μl/孔，室溫避光顯色30min；
(7)加入2mol/L硫酸50μl/孔終止顯色反應(yīng)，檢測OD450nm，參考波長為630nm。
F、抗體可變區(qū)基因的擴增、篩選和分析：
1、陽性孔B細胞RNA的提取：用QIAGEN RNeasy Mini Kit試劑盒提取陽性B細胞的RNA；
2、抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因的擴增：
(1)用一步法RT-PCR方法擴增抗體重鏈可變區(qū)VH和輕鏈基因可變區(qū)Vκ或Vλ；
(2)PCR產(chǎn)物取3μl用1.2％瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，目的基因條帶在300bp-500bp位置，切膠回收目的條帶，具體操作參照試劑盒QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit(250)(QIAGEN Cat.NO.28606)說明書；
G、陽性孔細胞抗體基因重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)迷你文庫的構(gòu)建：
1、酶切回收之后的可變區(qū)基因片段；
2、用切膠回收試劑盒回收這些酶切之后的目的基因片段，具體操作見試劑盒QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit(250)(QIAGEN Cat.NO.28606)說明書；
3、同時酶切恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgH(p19EH-AS6for VH)、pIgκ(p14B7K-SN1for Vκ)或pIgλ(pA32L-SN5for Vλ)，首先使用BioTek全波長酶標儀和Take3session軟件測定質(zhì)粒濃度：先用溶質(zhì)或純水調(diào)零，然后取2μl樣品滴到孔上，直接讀出濃度；然后換算成1.0μg所需要的體積，在50μl酶切體系中加入載體質(zhì)粒1.0μg；
4、酶切之后回收載體基因片段，具體操作見試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit(250)(QIAGEN Cat.NO.28706)說明書；
5、將酶切之后的目的基因片段與相應(yīng)酶切之后的恒定區(qū)載體pIgH(p19EH-AS6for VH)、pIgκ(p14B7K-SN1for Vκ)或pIgλ(pA32L-SN5for Vλ)連接；
6、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，放置于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)12-16h。觀察菌落生長狀況；
7、將培養(yǎng)碟中的全部菌落用棉簽輕刮下來，置于5ml含氨芐抗生素100ug/ml的LB液體培養(yǎng)基的試管中，180r/min左右振搖培養(yǎng)過夜。收集菌液3ml，小提質(zhì)粒，具體操作見試劑盒QIAGEN Plasmid Mini Kit(250)(QIAGEN Cat.NO.27106)說明書。用BioTek全波長酶標儀和Take3session軟件測定質(zhì)粒濃度；
H、抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因的篩選：
1、將mVH和mVL共轉(zhuǎn)染293T細胞，ELISA鑒定抗體特異性。對不同的單抗與RSV抗原結(jié)合活性的檢測使用不同的ELISA方法，檢測針對gp120和FLSC的抗體使用捕獲ELISA方法；檢測針對gp140或gp41的抗體使用間接ELISA方法；
2、若轉(zhuǎn)染上清中的RSV特異性抗體為陽性，則轉(zhuǎn)化攜帶mVH基因的質(zhì)粒提取攜帶單個重鏈基因的質(zhì)粒；
3、再用重鏈單個基因VHn和輕鏈基因的文庫mVL共轉(zhuǎn)染293T細胞篩選單個的陽性抗體重鏈基因。同樣轉(zhuǎn)化攜帶mVL基因的質(zhì)粒，挑取單克隆12個，用96孔板提取質(zhì)粒試劑盒提取攜帶單個輕鏈基因的質(zhì)粒，并用輕鏈單個基因VLn和重鏈基因的文庫mVH共轉(zhuǎn)染293T細胞篩選單個的陽性抗體輕鏈基因。若所挑取的單克隆數(shù)最后轉(zhuǎn)染均為陰性，則重新挑取12個單克隆，重復(fù)轉(zhuǎn)染和ELISA檢測步驟。最后將陽性VHn和VLn共轉(zhuǎn)染293T細胞，收獲上清，ELISA檢測抗體特性；
I、抗體的大量表達和純化以及活性鑒定：
1、單克隆抗體的大量表達：
將表達陽性抗體重鏈和輕鏈基因的質(zhì)粒在鼠傷寒感受態(tài)VNP2009中大量擴增，培養(yǎng)感受態(tài)細胞12～14h；挑取一個單克隆于5ml含氨芐抗生素100μg/ml的LB液體培養(yǎng)基中，180r/min左右振搖培養(yǎng)10～12h，再按照1:100接種于200ml含氨芐抗生素100μg/ml的LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，200r/min左右振搖培養(yǎng)10～14h，提取質(zhì)粒，具體操作參照質(zhì)粒大提試劑盒HiSpeed Plasmid Purification Kit(QIAGEN Cat.NO.12663)說明書；用BioTek全波長酶標儀測定質(zhì)粒濃度
2、單克隆抗體的制備和純化：
(1)消化293T細胞，將9μg的重鏈基因和9μg輕鏈基因質(zhì)?；旌?，加入到500μl無抗生素?zé)o血清的DMEM培養(yǎng)基中，室溫放置5min，加入轉(zhuǎn)染試劑Fugene HD 72μl，室溫放置20min。然后將混合液加入到提前一天鋪好細胞的T75細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃,5％CO2條件下培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后48～72h在轉(zhuǎn)染細胞瓶中補加含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液至50ml，繼續(xù)培養(yǎng)，至轉(zhuǎn)染后1周收集細胞上清；
(2)將上一步中收集的轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)上清1500r/min離心4min去沉淀，然后用0.45μm濾器過濾，收集濾液并以1～2滴/秒的速度流過蛋白A純化柱，使IgG結(jié)合至蛋白A上。用PBS以5000g離心1min洗滌純化柱2～3次，棄液，加入400ul IgG洗脫液輕輕混合，將柱子放進已加入40μl PH7.5～9的Tris-鹽酸中和液的1.5ml離心管中，5000g離心1min，所得液體即為純化的單克隆抗體，可反復(fù)洗滌2～3次，分別收集洗脫液。
實施例2
一種呼吸道合胞病毒單克隆抗體制備方法，包括以下步驟：
1)從呼吸道合胞病毒感染后又康復(fù)者的血清中提取記憶性B細胞，活化培養(yǎng)后通過酶聯(lián)免疫方法篩選RSV抗體陽性細胞；
2)提取RSV抗體陽性細胞的RNA，分別用一步法RT-PCR方法擴增抗體重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)基因Vκ或Vλ；
3)將VH基因通過酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgH連接得到重鏈可變區(qū)基因重組質(zhì)粒，將Vκ基因通過酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgκ連接或?qū)λ基因通過酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgλ連接得到輕鏈可變區(qū)基因重組質(zhì)粒；
4)擴增步驟3)所得的重組質(zhì)粒，而后篩選表達抗體重鏈和輕鏈的陽性質(zhì)粒；
5)制備減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株的感受態(tài)細胞，取步驟4)所得的陽性質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入其中，篩選陽性克隆，得到重組細菌；
6)取HEK293-T細胞與步驟5)所得的重組細菌，以二者的細胞量為1:20的比例在細胞培養(yǎng)板中混合，培養(yǎng)4h，而后將細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40h。
在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
步驟1)中記憶性B細胞是通過以下方法提取的：將20ml新鮮EDTA抗凝全血樣本按照5ml/管加入淋巴細胞分離管中，2200r/min離心15min，吸取白色淋巴細胞層，即為人外周血單個核細胞，而后用人記憶性B細胞磁珠分選試劑盒從中分選出記憶性B細胞。
步驟1)所述活化培養(yǎng)包括以下步驟：將記憶性B細胞以200細胞/孔的密度接種96孔U型底培養(yǎng)板，培養(yǎng)液含2.5μg/ml的CpG2006、10ng/ml的IL-2和10ng/ml的IL-10，以25％的B958細胞培養(yǎng)上清和5000cGy照射滅活的同種異源的外周血單個核細胞50000/孔為飼養(yǎng)細胞，于37℃、5％CO2條件培養(yǎng)兩周。
步驟4)中對重組質(zhì)粒的擴增是將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)12h，而后取菌落置于5ml含氨芐抗生素100μg/ml的LB液體培養(yǎng)基的試管中，180r/min左右振搖培養(yǎng)過夜，收集菌液小提質(zhì)粒。
步驟6)中HEK293-T細胞的加入量為8000個/孔。
步驟6)所述混合后，細胞培養(yǎng)板的每孔中液體總量為450μL。
步驟6)所述針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素是青霉素和鏈霉素。
步驟5)所述的電轉(zhuǎn)法包括以下步驟：取陽性質(zhì)粒與步驟1)所述感受態(tài)細胞在電轉(zhuǎn)杯中混合，而后以電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉(zhuǎn)4.7ms。
步驟5)中減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株的感受態(tài)細胞是通過以下方法制備的：
A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；
B)挑取單菌落接種于7ml LB液體培養(yǎng)基中，39℃振蕩培養(yǎng)14h；
C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:120的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值為0.4；
D)冰浴15min后，離心取沉淀用1/8體積預(yù)冷的無菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/80體積預(yù)冷的、8％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/80體積預(yù)冷的、8％(mL/mL)的甘油中。
步驟6)完成后繼續(xù)執(zhí)行以下步驟7)：取步驟6)所得的培養(yǎng)液上清1500r/min離心4min棄沉淀，而后用0.45μm濾器過濾，收集濾液并以1～2滴/秒的速度流過蛋白A純化柱，使IgG結(jié)合至蛋白A上；用PBS以5000g離心1min洗滌純化柱2次，棄液，加入400ul IgG洗脫液輕輕混合，將柱子放進已加入40μl PH7.5 的Tris-鹽酸中和液的1.5ml離心管中，5000g離心1min，所得液體即為純化的單克隆抗體。
實施例3
一種呼吸道合胞病毒單克隆抗體制備方法，包括以下步驟：
1)從呼吸道合胞病毒感染后又康復(fù)者的血清中提取記憶性B細胞，活化培養(yǎng)后通過酶聯(lián)免疫方法篩選RSV抗體陽性細胞；
2)提取RSV抗體陽性細胞的RNA，分別用一步法RT-PCR方法擴增抗體重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)基因Vκ或Vλ；
3)將VH基因通過酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgH連接得到重鏈可變區(qū)基因重組質(zhì)粒，將Vκ基因通過酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgκ連接或?qū)λ基因通過酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgλ連接得到輕鏈可變區(qū)基因重組質(zhì)粒；
4)擴增步驟3)所得的重組質(zhì)粒，而后篩選表達抗體重鏈和輕鏈的陽性質(zhì)粒；
5)制備減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株的感受態(tài)細胞，取步驟4)所得的陽性質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入其中，篩選陽性克隆，得到重組細菌；
6)取HEK293-T細胞與步驟5)所得的重組細菌，以二者的細胞量為1:200的比例在細胞培養(yǎng)板中混合，培養(yǎng)16h，而后將細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)56h。
在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
步驟4)中對重組質(zhì)粒的擴增是將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)16h，而后取菌落置于5ml含氨芐抗生素100μg/ml的LB液體培養(yǎng)基的試管中，180r/min左右振搖培養(yǎng)過夜，收集菌液小提質(zhì)粒。
步驟6)中HEK293-T細胞的加入量為12000個/孔。
步驟6)所述混合后，細胞培養(yǎng)板的每孔中液體總量為550μL。
步驟5)中減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株的感受態(tài)細胞是通過以下方法制備的：
A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；
B)挑取單菌落接種于7ml LB液體培養(yǎng)基中，39℃振蕩培養(yǎng)14h；
C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:120的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值為0.6；
D)冰浴25min后，離心取沉淀用1/12體積預(yù)冷的無菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/120體積預(yù)冷的、12％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/120體積預(yù)冷的、12％(mL/mL)的甘油中。
步驟6)完成后繼續(xù)執(zhí)行以下步驟7)：取步驟6)所得的培養(yǎng)液上清1500r/min離心4min棄沉淀，而后用0.45μm濾器過濾，收集濾液并以1～2滴/秒的速度流過蛋白A純化柱，使IgG結(jié)合至蛋白A上；用PBS以5000g離心1min洗滌純化柱3次，棄液，加入400ul IgG洗脫液輕輕混合，將柱子放進已加入40μl PH9的Tris-鹽酸中和液的1.5ml離心管中，5000g離心1min，所得液體即為純化的單克隆抗體。
實施例4
一種呼吸道合胞病毒單克隆抗體制備方法，包括以下步驟：
1)從呼吸道合胞病毒感染后又康復(fù)者的血清中提取記憶性B細胞，活化培養(yǎng)后通過酶聯(lián)免疫方法篩選RSV抗體陽性細胞；
2)提取RSV抗體陽性細胞的RNA，分別用一步法RT-PCR方法擴增抗體重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)基因Vκ或Vλ；
3)將VH基因通過酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgH連接得到重鏈可變區(qū)基因重組質(zhì)粒，將Vκ基因通過酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgκ連接或?qū)λ基因通過酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgλ連接得到輕鏈可變區(qū)基因重組質(zhì)粒；
4)擴增步驟3)所得的重組質(zhì)粒，而后篩選表達抗體重鏈和輕鏈的陽性質(zhì)粒；
5)制備減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株的感受態(tài)細胞，取步驟4)所得的陽性質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入其中，篩選陽性克隆，得到重組細菌；
6)取HEK293-T細胞與步驟5)所得的重組細菌，以二者的細胞量為1:100的比例在細胞培養(yǎng)板中混合，培養(yǎng)10h，而后將細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h。
以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。