本發(fā)明屬于植物學(xué)和基因技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及調(diào)控植物的種子粒形、抗蟲(chóng)性和耐鹽性的miRNA及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著全球耕地面積的逐年減少，農(nóng)作物的產(chǎn)量難以維持人類的發(fā)展。雖然糧食作物的畝產(chǎn)在增加，但總產(chǎn)量難以維持增勢(shì)。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織發(fā)布的報(bào)告，全球面臨較大的糧食危機(jī)。一些主要糧食作物、油料作物的品種改良顯得極為迫切。

禾本科植物，特別是水稻，是世界主要糧食作物，稻米也是中國(guó)居民的主要食糧和重要的出口農(nóng)產(chǎn)品。隨著人民生活水平的提高和稻米市場(chǎng)的開(kāi)放，我國(guó)稻米的品質(zhì)問(wèn)題顯得日益突出。稻米品質(zhì)關(guān)系到食品安全、糧食出口量和人民生活水平的提高，改良我國(guó)稻米品質(zhì)已經(jīng)成為一項(xiàng)意義重大且十分緊迫的任務(wù)。因此，從分子角度研究稻米品質(zhì)形成的機(jī)制和遺傳特性，有利于為水稻優(yōu)質(zhì)品種選育提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。稻米的品質(zhì)與粒形緊密關(guān)聯(lián)，品質(zhì)的改變會(huì)影響到粒形，反之亦然。因此，對(duì)水稻粒形的研究和品質(zhì)研究往往密不可分。

褐飛虱是以水稻和普通野生稻為食的單食性昆蟲(chóng)，危害嚴(yán)重時(shí)，可造成顆粒無(wú)收，是中國(guó)和許多亞洲國(guó)家當(dāng)前水稻上的首要害蟲(chóng)。因此，發(fā)掘抗褐飛虱的基因，開(kāi)發(fā)抗褐飛虱的水稻品種，對(duì)于水稻抗蟲(chóng)研究具有重要意義和實(shí)踐價(jià)值。

隨著全球環(huán)境的不斷惡化，土壤的鹽堿化問(wèn)題已日益威脅著人類賴以生存的有限的土壤資源。土壤中的過(guò)高鹽分嚴(yán)重影響農(nóng)作物的正常生長(zhǎng)以及人類的健康。研究具有耐鹽性的基因，對(duì)于實(shí)踐中開(kāi)發(fā)能適應(yīng)高鹽環(huán)境的優(yōu)良抗鹽品種具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種調(diào)控植物的種子粒形、抗蟲(chóng)性和耐鹽性的miRNA及其應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種改良禾本科植物的性狀的方法，所述方法包括：下調(diào)禾本科植物中miR396或其前體的表達(dá)。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的改良禾本科植物的性狀包括：

促進(jìn)種子的粒長(zhǎng)增加；

促進(jìn)種子的長(zhǎng)/寬比增加；

提高植物的抗蟲(chóng)性；

提高植物的耐鹽性；

提高植物中的花青素含量；和/或

提高植物的產(chǎn)量。

在另一優(yōu)選例中，所述的下調(diào)禾本科植物中miR396或其前體的表達(dá)包括：利用干擾分子特異性下調(diào)miR396或其前體的表達(dá)，或利用基于target mimicry技術(shù)的miR396沉默體下調(diào)miR396或其前體的表達(dá)。

在另一優(yōu)選例中，所述的干擾分子是以miR396或其前體抑制或沉默靶標(biāo)的dsRNA、反義核酸、小干擾RNA、微小RNA，或能表達(dá)或形成所述dsRNA、反義核酸、小干擾RNA、微小RNA的構(gòu)建物。

在另一優(yōu)選例中，所述利用基于target mimicry技術(shù)的miR396沉默體下調(diào)miR396表達(dá)的方法包括：

(1)將mimicry miR396序列置于ips基因序列中，獲得ips-MIM396b序列片段；

(2)將ips-MIM396b序列片段轉(zhuǎn)入禾本科植物中，獲得轉(zhuǎn)基因植物，其為改良的禾本科植物。

在另一優(yōu)選例中，采用農(nóng)桿菌發(fā)將ips-MIM396b序列片段轉(zhuǎn)入禾本科植物中。

在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，將mimicry miR396序列置于ips基因序列中的CCTCTAGAAA和AGCTTCGGTT之間的位點(diǎn)內(nèi)；或所述的mimicry miR396序列如SEQ ID NO:14所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的提高植物的抗蟲(chóng)性是提高植物對(duì)昆蟲(chóng)的抗性，所述的昆蟲(chóng)是半翅目飛虱科昆蟲(chóng)。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種miR396或其前體的下調(diào)劑的用途，用于改良禾本科植物的性狀，包括：

促進(jìn)種子粒長(zhǎng)增加；

促進(jìn)種子的長(zhǎng)/寬比增加；

提高植物的抗蟲(chóng)性；

提高植物的耐鹽性；

提高植物中的花青素含量；或

提高植物的產(chǎn)量。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的下調(diào)劑是特異性下調(diào)miR396或其前體表達(dá)的干擾分子，或是基于target mimicry技術(shù)的miR396沉默體。

在另一優(yōu)選例中，所述的禾本科植物是禾本科谷類作物。

在另一優(yōu)選例中，所述的禾本科谷類作物例如包括水稻，大麥、小麥、燕麥、黑麥等。

在另一優(yōu)選例中，所述的禾本科植物是禾本科稻屬植物如水稻，禾本科小麥屬植物如小麥。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于改良禾本科植物性狀的miR396沉默體，所述miR396沉默體基于target mimicry技術(shù)建立，其包括ips基因序列中以及位于該序列中的mimicry miR396序列。

在另一優(yōu)選例中，所述的miR396沉默體中，所述的mimicry miR396序列位于ips基因序列中CCTCTAGAAA和AGCTTCGGTT之間的位點(diǎn)內(nèi)。

在本發(fā)明的另一方面，提供包含所述miR396沉默體的表達(dá)載體。

在本發(fā)明的另一方面，提供包含所述miR396沉默體的宿主細(xì)胞。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種miR396或其前體的用途，用于作為鑒定 禾本科植物性狀的分子標(biāo)記；所述的性狀包括：種子粒長(zhǎng)、粒寬，植物抗蟲(chóng)性，植物的耐鹽性，植物花青素含量。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。

附圖說(shuō)明

圖1、PBSK(pBluescript II SK(+))載體的圖譜。

圖2、MIM396b質(zhì)粒構(gòu)建的示意圖。

圖3、MIM396b轉(zhuǎn)基因植株的表型。

A、MIM396b轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)粒長(zhǎng)增加的表型；

B、MIM396b轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)出粒寬減小的表型；

C、MIM396b轉(zhuǎn)基因植株粒長(zhǎng)、粒寬和長(zhǎng)寬比的統(tǒng)計(jì)圖；

D、MIM396b轉(zhuǎn)基因植株種子的淀粉顆粒掃描電鏡；

E、ZH11種子的淀粉顆粒掃描電鏡；

F、MIM396b轉(zhuǎn)基因植株的種子千粒重的統(tǒng)計(jì)圖。

圖4、MIM396b轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)明顯的抗褐飛虱的表型。MIM396b-1與MIM396b-2為兩株轉(zhuǎn)基因植株。

圖5、MIM396b轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)明顯的耐鹽的表型。

圖6、MIM396b轉(zhuǎn)基因植株的花青素含量測(cè)定。

A、花青素的粗提物；

B、花青素含量用分光光度計(jì)測(cè)定的結(jié)果。

圖7、p1301-35SNOS載體的圖譜。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，發(fā)現(xiàn)miR396與禾本科植物的種子性狀、抗蟲(chóng)性、耐鹽性及花青素含量密切相關(guān)，下調(diào)miR396可增加種子粒長(zhǎng)、促進(jìn)植物抗蟲(chóng)性和耐鹽性，以及增加植物花青素含量。因此，miR396或調(diào)節(jié)miR396的物質(zhì)和方法可應(yīng)用于實(shí)現(xiàn)植物品種的改良。

如本文所用，所述的“植物”是表達(dá)miR396或其前體的植物。所述的植物包括：禾本科植物。比如，所述的禾本科植物包括但不限于：禾本科稻屬植物如水稻，禾本科小麥屬植物如小麥，禾本科玉米屬植物如玉米等。

如本文所用，所述的“禾谷類作物”或“禾本科谷類作物”可以是禾本科植物或有芒植物(作物)。例如是水稻，大麥、小麥、燕麥、黑麥。有芒植物是指種子殼上存在針狀物植物。

如本文所用，所述的“飛虱科昆蟲(chóng)”包括但不限于：褐飛虱(Brown planthopper，BPH)，白背飛虱(white back planthopper,WBPH)及灰飛虱(small brown planthopper，SBPH)。

如本文所用，所述的“miR396”指稻屬植物的miR396。多種來(lái)源于稻屬植物的miR396的基因以及相應(yīng)的成熟miR396的序列被列于表1中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，鑒于這些miRNA(或它們的前體)之間具有很高的序列相同性，下調(diào)這些miRNA均能實(shí)現(xiàn)對(duì)禾本科植物的種子性狀、抗蟲(chóng)性、耐鹽性及花青素含量的調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)與本發(fā)明實(shí)施例中所驗(yàn)證的下調(diào)miR396b相同的技術(shù)效果。

表1、源于水稻(osa)的編碼miR396的基因以及相應(yīng)的成熟miR396的序列

本發(fā)明涉及的miR396在理論研究和植物改良中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。這個(gè)序列可以被應(yīng)用于特定植物如水稻的抗蟲(chóng)性、耐鹽性、產(chǎn)量研究；并且，其還與調(diào)控植物體內(nèi)的花青素含量相關(guān)。

一種改良禾本科植物的性狀的方法，所述方法包括：下調(diào)禾本科植物中miR396或其前體的表達(dá)。

在得知了所述的miR396的用途后，可以采用本領(lǐng)域人員熟知的多種方法來(lái)下調(diào)所述的miR396的表達(dá)，這些方法均可被包含在本發(fā)明中。比如，可以采用本領(lǐng)域人員熟知的多種方法來(lái)干擾miR396的表達(dá)或使之缺失表達(dá)。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，提供了一種降低植物中miR396的表達(dá)的方法，所述的方法包括：

(1)構(gòu)建基于target mimicry技術(shù)的miR396沉默體，其包括ips基因序列中以及位于該序列的CCTCTAGAAA(SEQ ID NO:10)和AGCTTCGGTT(SEQ ID NO:11)之間的位點(diǎn)內(nèi)的mimicry miR396序列；

(2)將(1)獲得的miR396沉默體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官或種子，獲得轉(zhuǎn)化入所述干擾分子的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；

(3)將步驟(2)獲得的轉(zhuǎn)入了所述miR396沉默體的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。

較佳地，所述方法還包括：

(iii)選擇出轉(zhuǎn)入了所述載體的植物細(xì)胞、組織或器官；和

(iv)將步驟(iii)中的植物細(xì)胞、組織或器官再生成植物。

其它抑制miR396或其前體的方法是本領(lǐng)域周知的。

本發(fā)明還提供了用于下調(diào)所述的miR396或其前體的物質(zhì)，其通過(guò)下調(diào)miR396或其前體從而發(fā)揮改良植物的性狀的功能。所述物質(zhì)可以是：核酸抑制物、拮抗劑、下調(diào)劑、阻滯劑、阻斷劑等，只要它們能夠下調(diào)miR396或其前體的表達(dá)水平。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。

用于下調(diào)所述的miR396或其前體的物質(zhì)可以是任何可阻止miR396(特別是其中的結(jié)合關(guān)鍵位點(diǎn))或其前體與其靶向序列結(jié)合、降低miR396或其前體的活性、降低miR396或其前體的穩(wěn)定性、下調(diào)miR396或其前體的表達(dá)、減少miR396或其前體有效作用時(shí)間的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對(duì)于下調(diào)miR396有用的物質(zhì)。例如，所述的抑制劑是：核酸抑制物，蛋白抑制劑，抗體，配體，核酸酶，核酸結(jié)合分子，只要其能夠下調(diào)miR396的表達(dá)。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述物質(zhì)包括特異性下調(diào)miR396或其前體的干擾分子或基于target mimicry技術(shù)的miR396沉默體。更佳地，將mimicry miR396序列置于ips基因序列中的CCTCTAGAAA(SEQ ID NO:10)和AGCTTCGGTT(SEQ ID NO:11)之間的位點(diǎn)內(nèi)，獲得ips-MIM396b序列片段，將該片段置于合適的載體中，轉(zhuǎn)化植物，從而獲得性狀改良的轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明還提供包含所述ips-MIM396b序列的表達(dá)載體，優(yōu)選植物表達(dá)載體；更優(yōu)選適合于進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)基因操作(如應(yīng)用農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作)的表達(dá)載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含有本發(fā)明所述的啟動(dòng)子和/或目的基因序列的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。

本發(fā)明還提供遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其含有ips-MIM396b序列或含有包含ips-MIM396b序列的載體。宿主細(xì)胞通常是植物細(xì)胞。轉(zhuǎn)化植物一般可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法、水稻幼胚轉(zhuǎn)化法等；優(yōu)選的是農(nóng)桿菌法。對(duì)于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得相對(duì)于野生型而言性狀發(fā)生改變的植物。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的“miR396”是miR396b”，其是具有SEQ ID NO:2序列的RNA。

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，本發(fā)明人克隆了水稻miR396b基因，并通過(guò)target mimicry技術(shù)，構(gòu)建了miR396b競(jìng)爭(zhēng)性下調(diào)的轉(zhuǎn)基因植株(MIM396b)。通過(guò)分析表明，MIM396b植株種子粒長(zhǎng)明顯加長(zhǎng)、而粒寬明顯減小，從而可能對(duì)稻米的品質(zhì)造成影響。同時(shí)，通過(guò)鑒定證明MIM396b植株具有明顯的抗褐飛虱的特征和耐鹽的特征；進(jìn)一步的分析表明，MIM396b轉(zhuǎn)基因植物中花青素的含量上升，本發(fā)明人推測(cè)，MIM396b植株可能通過(guò)提高花青素的含量達(dá)到抗褐飛虱和耐鹽的效果。MIM396b轉(zhuǎn)基因植株對(duì)于改善稻米品質(zhì)和提高抗褐飛虱和耐鹽的能力，具有應(yīng)用價(jià)值。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1、MIM396b轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建

用IPSF和IPSR擴(kuò)增擬南芥的ips基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:18)，通過(guò)BamHI和SacI酶切，構(gòu)建到克隆載體pBSK(圖1)的BamHI和SacI位點(diǎn)中。

IPSF(BamHI)序列：5’-GTGGATCCaagaaaaatggccatcccctagc-3’(SEQ ID NO:12)。

IPSR(SacI)序列：5’-CTGGAGCTCgaggaattcactataaagagaatcg-3’(SEQ ID NO:13。

設(shè)計(jì)mimicry miR396b序列如下：

5’-TTCCACAGCTTtagaTCTTGAACTG-3’(SEQ ID NO:14)。

序列中，“taga”的加入使得MIM396結(jié)合靶基因的能力大大加強(qiáng)，從而使得正常的miR396在結(jié)合靶基因的時(shí)候不具備競(jìng)爭(zhēng)力，達(dá)到下調(diào)正常的 miR396的目的。

根據(jù)所述的mimicry miR396b以及ips基因中相關(guān)序列，設(shè)計(jì)如下MIM396b-I和MIM396b-II序列：

MIM396b-I序列：

5’-cgaagctTTCCACAGCTTtagaTCTTGAACTGtttctagagggagataa-3’(SEQ ID NO:15)；

MIM396b-II序列：

5’-cctctagaaaCAGTTCAAGATCTAAAGCTGTGGAAagcttcggttcccctcg-3’(SEQ ID NO:16)。

然后，以得到的質(zhì)粒為模板，以IPSF和MIM396b-I匹配、IPSR和MIM396b-II匹配，進(jìn)行overlapping PCR(Higuchi,R.,Krummel,B.,and Saiki,R.K.(1988).Nucleic Acids Res 16,7351-7367)，將mimicry miR396b替換到ips基因中miR399的不完全靶位點(diǎn)的位置(圖2中虛線框內(nèi)的堿基)。

之后，將該ips-MIM396b的片段(克隆到超表達(dá)載體p1301-35sNOS(圖7)的35Snos上(位于p1301-35sNOS的BamHI和SacI之間)，并采用農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化野生型水稻中花11，將該ips-MIM396b片段進(jìn)行超表達(dá)，從而構(gòu)建成miR396的target mimcry(簡(jiǎn)寫為MIM396b)轉(zhuǎn)基因植株。

ips-MIM396b的片段的完整序列為(SEQ ID NO:17)：

aaaacaccacaaaaacaaaagaaaaatggccatcccctagctaggtgaagaagaatgaaaacctctaatttatctagaggttattcatcttttaggggatggcctaaatacaaaatgaaaactctctaattaagtggttttgtgttcatgtaaggaaagcgttttaagatatggagcaatgaagactgcagaaggctgattcagactgcgagttttgtttatctccctctagaaaTTCCACAGCTTtagaTCTTGAACTGagcttcggttcccctcggaatcagcagattatgtatctttaattttgtaatactctctctcttctctatgctttgtttttcttcattatgtttgggttgtacccactcccgcgcgttgtgtgttctttgtgtgaggaataaaaaaatattcggatttgagaactaaaactagagtagttttattgatattcttgtttttcatttagtatctaataagtttggagaatagtcagaccagtgcatgtaaatttgcttccgattctctttatagtgaattcctctt

實(shí)施例2、MIM396b植株呈現(xiàn)出粒長(zhǎng)變長(zhǎng)、粒寬變小的表型特征

觀察實(shí)施例1獲得的轉(zhuǎn)基因植物(MIM396b)，并與野生型中花11相比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MIM396b植株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期沒(méi)有呈現(xiàn)出明顯的表型差異(數(shù)據(jù) 略)；但是在生殖生長(zhǎng)時(shí)期，MIM396b的種子形態(tài)發(fā)生了明顯的變化。MIM396b植株的粒長(zhǎng)(seed length)明顯加大(圖3A和C)，粒寬(seed width)相對(duì)減小(圖3B和C)，從而造成籽粒的長(zhǎng)/寬比(seed length/width)明顯變大(圖3C)。

同時(shí)，MIM396b轉(zhuǎn)基因植株的粒重(seed weight)明顯增加。野生型ZH11的籽粒千粒重為27.22667g，而MIM396b轉(zhuǎn)基因植株的千粒重為35.90333g，比野生型對(duì)照增長(zhǎng)30％多(圖3F)。

對(duì)籽粒中的淀粉顆粒進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中的淀粉顆粒跟對(duì)照相比，明顯變大(圖3D和E)。

實(shí)施例3、MIM396b植株呈現(xiàn)出明顯的抗褐飛虱特征

將MIM396b植物分單株進(jìn)行抗褐飛虱鑒定。水稻苗在人工氣候室生長(zhǎng)一個(gè)月左右，然后分單株移栽到小盆中，適應(yīng)一周左右，盡量剪除小的分蘗，然后每株放入10頭左右差不多大小的褐飛虱，罩以罩子。保證植株的正常生長(zhǎng)。在28℃左右轉(zhuǎn)到的氣候室中，觀察植株的死亡情況。

結(jié)果表明，當(dāng)野生型ZH11已經(jīng)由于褐飛虱的吸食而枯死的時(shí)候，MIM396b植株仍然生長(zhǎng)良好(圖4)，說(shuō)明MIM396b植株具有明顯的抗褐飛虱的特征。

實(shí)施例4、MIM396b植株呈現(xiàn)出明顯的耐鹽性

在植物生長(zhǎng)至發(fā)芽后14天左右，將MIM396b植株和野生型ZH11一起，用100mM NaCl處理7天，然后經(jīng)過(guò)3天的恢復(fù)。

MIM396b植株的耐鹽性測(cè)定結(jié)果如圖5，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，MIM396b植株具有明顯的耐鹽性。

實(shí)施例5、MIM396b植株中的花青素含量提高

由于觀察到MIM396b的種子具有紫色穎殼的特征，本發(fā)明人推測(cè)可能MIM396b中花青素的含量有變化。

因此，本發(fā)明人測(cè)定了MIM396b中花青素的含量，發(fā)現(xiàn)MIM396b中花青素含量是野生型ZH11中的兩倍多，如圖6。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。