本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中用于克隆全長基因的成套試劑及方法。

背景技術(shù)：

基因是細(xì)胞內(nèi)DNA分子上具有遺傳效應(yīng)的特定核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應(yīng)的DNA分子片段?；蚩刂频鞍踪|(zhì)合成，是不同物種以及同一物種的不同個體表現(xiàn)出不同的性狀的根本原因?；蛲ㄟ^DNA復(fù)制及細(xì)胞分裂把遺傳信息傳遞給下一代，并通過控制蛋白質(zhì)的合成使遺傳信息得到表達(dá)。因此，人們對生物體的研究都集中于對于基因功能的研究。而研究基因的功能的前提是要必須獲得候選基因，即需要先進(jìn)行候選基因的克隆。

伴隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多獲得新基因的方法和手段，如圖譜技術(shù)、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)、mRNA差異顯示技術(shù)、二減法技術(shù)以及cDNA文庫篩選技術(shù)等，但上述方法大多具有實驗周期長、技術(shù)步驟繁瑣且工作量大等缺點。cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends,RACE)是一種基于PCR從低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增cDNA的5'和3’末端的有效方法，為目前廣泛應(yīng)用的基因全長克隆的方法。

然而，RACE技術(shù)中，獲得基因的3’端相對比較容易，但是獲得基因的5’端就非常困難，經(jīng)常會有嚴(yán)重的非特異性擴(kuò)增，增加了很多的克隆篩選的工作。另外，基因5’端的獲得，需要購買5’RACE試劑盒，但是不同公司研發(fā)的5’RACE試劑盒原理不盡相同，而且價格非常昂貴。目前急需一種可以簡單快速克隆基因全長的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何克隆目的基因的全長。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了用于克隆全長基因的成套試劑。

本發(fā)明所提供的用于克隆全長基因的成套試劑，由接頭A和通用引物組成；

所述接頭A是由正向鏈和反向鏈組成的接頭，所述接頭A的正向鏈為序列1所示的單鏈DNA，所述接頭A的反向連為為序列2所示的單鏈DNA，序列2與序列1的第22-37位反向互補(bǔ)；

所述通用引物為序列1的第1-26位所示的單鏈DNA。

其中，序列1、2、3和4的從第1位至最后1位的方向均為相應(yīng)單鏈DNA的從5’端至3’端的方向。

上述成套試劑中，所述接頭A的反向鏈的5’末端可被磷酸化修飾。

上述成套試劑中，所述基因的來源可為植物、動物、微生物或病毒。

上述成套試劑中，所述接頭A和所述通用引物均可獨(dú)立包裝。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述接頭A或所述通用引物。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了用于克隆全長基因的系統(tǒng)。

本發(fā)明所提供的用于克隆全長基因的系統(tǒng)，包括所述成套試劑和用于克隆全長基因的其他試劑和/或儀器。

上述系統(tǒng)中，所述用于克隆全長基因的其他試劑和/或儀器可為提取RNA、合成cDNA第一鏈或第二鏈、DNA片段的連接、對含有粘性末端的DNA片段進(jìn)行末端補(bǔ)平、對DNA片段加dATP、DNA純化和/或PCR擴(kuò)增所需的試劑和/或儀器。

上述系統(tǒng)中，所述基因的來源為植物、動物、微生物或病毒。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了克隆目的基因的方法。

本發(fā)明所提供的克隆目的基因的方法，包括如下1)-3)：

1)以生物總RNA為模板獲得雙鏈cDNA；

2)對步驟1)的雙鏈cDNA依次進(jìn)行末端補(bǔ)平、加dATP和連接所述接頭A，得到含有接頭A的連接產(chǎn)物；

3)以步驟2)的連接產(chǎn)物為模板，用目的基因的特異引物和所述通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的基因。

上述方法中，步驟1)還可包括對所述雙鏈cDNA進(jìn)行純化。

上述方法中，步驟2)還可包括對所述含有接頭A的連接產(chǎn)物進(jìn)行純化。

上述方法中，所述1)可包括如下11)和12)：

11)以生物總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取第一鏈cDNA；

12)以步驟11)的第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，得到雙鏈cDNA。

上述方法的操作流程圖如圖2所示。

上述方法步驟2)中，所述的末端補(bǔ)平體系可使用NEB公司的Quick Blunting kit進(jìn)行；所述加dATP的體系可包括：dATP，加A緩沖液，加dATP的聚合酶，所述的dATP的濃度為5mM，所述聚合酶在所述的反應(yīng)體系中的濃度為0.5U/μl；所述的接頭A的連接體系包括：接頭A、ATP和連接酶，所述的接頭A的濃度為10μM，所述的ATP的濃度為1.7mM，所述連接酶在所述連接體系中的濃度為0.5U/μl。

上述方法步驟3)中，所述的PCR體系包括：引物，聚合酶混合物，以及步驟2)中得到的連接產(chǎn)物。所述的引物的濃度為0.2μM，所述聚合酶混合物在所述PCR體系中所占的50％的體積。

上述方法所述的RNA可為任何單倍體、二倍體或多倍體生物或非生物材料的來源的RNA，如動物、植物、微生物或病毒的RNA。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述成套試劑、所述接頭A、所述通用引 物或所述系統(tǒng)在基因克隆中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述基因可來源于植物、動物、微生物或病毒。

本發(fā)明中，申請人提出了一種全新的基因克隆的新技術(shù)，即使用人工合成接頭，同時進(jìn)行5’和3’末端擴(kuò)增，而后進(jìn)行全長擴(kuò)增的新技術(shù)。實驗證明，本發(fā)明提供的接頭分子A，能夠連接到雙鏈cDNA片段的兩端，運(yùn)用本發(fā)明的克隆方法與用于克隆全長基因的成套試劑，成功的擴(kuò)增到目的基因的5’和3’末端，并進(jìn)一步成功的擴(kuò)增到了全長序列。同時，本發(fā)明可以同時進(jìn)行多個目的基因的擴(kuò)增。本發(fā)明提供了一種方便、高效、特異的基因克隆方法，在未知基因克隆、啟動的擴(kuò)增、未知側(cè)翼序列的獲取、插入位點的鑒定等方面均具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為接頭A的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為基因克隆流程示意圖。

圖3為提取的構(gòu)樹葉片總RNA的電泳圖。

圖4為3’端和5’端擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。其中，泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為5’端擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，泳道2為3’端擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

圖5為PCR擴(kuò)增目的基因全長cDNA得到的產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。其中，泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中所述方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用核苷酸序列均由上海Invitrogen生物公司合成。所用試劑如無特別說明均為NEB公司的產(chǎn)品，所用水均為超純水。

用用于克隆全長基因的成套試劑克隆目的基因的方法，包括如下1)-3)：

1)以生物總RNA為模板獲得雙鏈cDNA；

2)對步驟1)的雙鏈cDNA依次進(jìn)行末端補(bǔ)平、加dATP和連接接頭A，得到含有接頭A的連接產(chǎn)物；

3)以步驟2)的連接產(chǎn)物為模板，用目的基因的特異引物和通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的基因。

其中，用于克隆全長基因的成套試劑，由接頭A和通用引物組成；

接頭A是由正向鏈和反向鏈組成的接頭，接頭A的正向鏈為序列1所示的單鏈DNA，接頭A的反向連為為序列2所示的單鏈DNA，序列2與序列1的第22-37位反向互補(bǔ)；

通用引物為序列1的第1-26位所示的單鏈DNA。

下面以構(gòu)樹的基因A為例，具體闡述克隆基因全長的方法。

實施例1、用于克隆全長基因的成套試劑克隆A

1.總RNA的提取

本實驗中使用構(gòu)樹葉片為實驗材料，進(jìn)行總RNA的提取。提取之后使用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，所提取的RNA有兩條明顯的電泳條帶，從上到下依次為28S RNA和18S RNA，表明獲得了純度較高、較完整的總RNA。

2.cDNA第一鏈的合成

以上述步驟1提取的總RNA為模板，用PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesized Kit試劑盒(Takara公司)并參照試劑盒說明書的要求，反轉(zhuǎn)合成其第一鏈cDNA。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下：Oligo-dT(10pmol/μl)1μl，Total RNA(≤1μg)2μl，dNTP Mixture(10mmol/l each)1.0μl，5×Buffer 4.0μl，RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl，PrimeScript RTase(200U/μl)0.5μl，RNase-free distilled water 11μl；65℃5min,42℃45min,70℃15min。將合成的第一鏈cDNA貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

3.cDNA第二鏈的合成和純化

cDNA第二鏈的合成：第一鏈合成完畢后，直接進(jìn)行第二鏈的合成。在第一鏈合成體系中分別加入2.5×第二鏈緩沖液40μl，DNA聚合酶Ⅰ23μl、RNase H 0.8μl、加水至100μl，25℃下放置2小時；70℃，10min后置于冰浴，得到雙鏈cDNA。

雙鏈cDNA的純化：在第二鏈合成后的體系中等體積加入酚\氯仿\異戊醇溶液(酚\氯仿\異戊醇溶液中酚、氯仿和異戊醇溶液的體積比為25:24:1)，混勻后，12000g，離心3min；上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管，加2倍體積的乙醇，1/10體積的乙酸鈉，-20℃放置30min后12000g，離心15min收集沉淀，使用70％乙醇洗沉淀，干燥，用滅菌的去離子水溶解。

4.雙鏈cDNA末端平齊化、加dATP

對上述步驟3中的純化后的雙鏈cDNA進(jìn)行末端補(bǔ)平。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：純化產(chǎn)物30μl，10×Blunting Buffer 5μl，1mM dNTP 10μl，Quick Blunting kit Enzyme Mix，1μl，加H₂O 9μl，總體系50μl；反應(yīng)條件：30℃孵育30min。對反應(yīng)產(chǎn)物使用天根生化科技(北京)有限公司的普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化回收。 然后對回收產(chǎn)物進(jìn)行加dATP，反應(yīng)體系和條件如下：回收產(chǎn)物22μl，100mM dATP 1μl，10×NEB Buffer 2 3μl，Klenow exo^-(NEB)(50，000units/ml)0.3μl，H₂O 3.7μl，總體積30μl；反應(yīng)條件：充分混勻，37℃孵育30min，75℃20min熱失活。對反應(yīng)產(chǎn)物使用天根產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化回收，使用30μl的洗脫緩沖液溶解洗脫，得到回收產(chǎn)物。

5.接頭A的連接

將上述步驟4的回收產(chǎn)物，加入接頭A，反應(yīng)體系和條件具體如下:回收產(chǎn)物30μl，100mM dATP 1μl，NEB Buffer 22μl，10μM接頭A 2.5μl，(1000u)T4DNA Ligase 0.5μl，加H₂O 15μl，總體積50μl，室溫(或16℃)下連接2小時，連接產(chǎn)物65℃20min，連接酶活性失活。對連接反應(yīng)產(chǎn)物使用天根產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化回收，使用30μl的洗脫緩沖液溶解洗脫。

6、PCR擴(kuò)增目的片段

將上述步驟5中純化回收的產(chǎn)物，用于目的基因擴(kuò)增的PCR反應(yīng)，得到的目的PCR產(chǎn)物。

5’端擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件如下：步驟5中純化回收的產(chǎn)物3μl，GSP Primer(gene-specific primer)1μl，通用引物Primer(序列1的第1-26位所示的單鏈DNA)1μl，2×Phusion PCR Master Mix 25μl，H₂O 20μl，總共50μl，反應(yīng)條件為：先98℃預(yù)變性1min；然后98℃10s，60℃30s，72℃60s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸5min。應(yīng)用于5’端擴(kuò)增的GSP Primer(即構(gòu)樹基因A的特異引物)的序列為5’-CTAGCTGTAGTGGTAGTGGTAGTAGT-3’。

3’端擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件如下：步驟5中純化回收的產(chǎn)物3μl，GSP Primer(gene-specific primer)1μl，通用引物Primer(序列1的第1-26位所示的單鏈DNA)1μl，2×Phusion PCR Master Mix 25μl，H₂O 20μl，總共50μl，反應(yīng)條件為：先98℃預(yù)變性1min；然后98℃10s，60℃30s，72℃60s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸5min。應(yīng)用于3’端擴(kuò)增的GSP Primer(即構(gòu)樹基因A的特異引物)的序列為5’-CCCTACTAGCTGCAGTACTCTTGCAGAG-3’。

反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4所示。其中，泳道M為TRANS2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1和2分別為5’端擴(kuò)增和3’端擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物?；厥詹⒓兓疨CR擴(kuò)增產(chǎn)物，將其連接到PMD-18T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，提取陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測序，對測序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析。

利用上述獲得的5’和3’端片段之間的重疊區(qū)，借助Contig軟件拼接得到的目的 基因的全長cDNA序列，并根據(jù)目的基因全長cDNA序列設(shè)計如下構(gòu)樹基因A的特異引物：

引物1：5′-ATCATCACTTCACTGTTTCAGCTCCAACTAAC-3′，

引物2：5′-TTCATTCCCACATATACCATAGTCACCA-3′。

以上述步驟2合成的第一鏈cDNA為模板，用引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖5所示。其中，泳道M為TRANS2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了目的基因的特異性擴(kuò)增的片段?；厥詹⒓兓摦a(chǎn)物，將其連接到PMD-18T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，提取陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物與上述拼接得到的序列在擴(kuò)增部分完全相同，為目的基因的序列。