本發(fā)明屬于抗菌材料制備的生物環(huán)境領(lǐng)域，涉及一種低維碳納米材料/群體感應(yīng)淬滅酶復(fù)合薄膜材料的制備方法。
背景技術(shù)：
近些年的研究發(fā)現(xiàn),單個(gè)細(xì)菌之間存在著信息交流,并且通過這種信息交流對(duì)外界環(huán)境變化進(jìn)行群體性應(yīng)答。當(dāng)細(xì)菌的數(shù)量積聚增加到一定程度的時(shí)候,細(xì)菌會(huì)通過信號(hào)分子發(fā)信號(hào),改變和協(xié)調(diào)它們之間的行為,共同展示出它們的某些生理特性,從而表現(xiàn)出單個(gè)細(xì)菌無法從事的某些生理功能和調(diào)節(jié)機(jī)制。這一調(diào)控機(jī)制被稱為細(xì)菌的群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)。在眾多的群體感應(yīng)信號(hào)分子中，?；呓z氨酸內(nèi)酯類分子(Acyl-homoserine lactone,AHLs)是研究人員較為關(guān)注的一種，它能夠參與細(xì)菌生物學(xué)功能的調(diào)控，包括生物膜的形成、生物發(fā)光、色素產(chǎn)生、抗生素形成和質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移等。近年來，科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)，群體感應(yīng)抑制劑可以干擾信號(hào)分子系統(tǒng)的傳導(dǎo)，抑制細(xì)菌某種特性和機(jī)理的表達(dá)。
群體感應(yīng)抑制劑包括的種類很多，作用機(jī)制也各不相同。其中群體感應(yīng)淬滅酶就是比較常用的一種，許多的細(xì)菌、原核生物、真核生物中都含有各種淬滅酶，比如豬腎臟中的?；D(zhuǎn)移酶(acylase,EC-3.5.1.14)，這種酶能夠使C4-HSL(N-Butyry-l-homoserine lactone)和C8-HSL(N-Octancy-l-homoserine lactone)脫酰基化，產(chǎn)生L-高絲氨酸。另一種是在植物中發(fā)現(xiàn)的指狀褐藻能產(chǎn)生鹵素過氧化物酶催化產(chǎn)生鹵素氧化物破壞AHL信號(hào)分子。
利用群體感應(yīng)淬滅酶進(jìn)行細(xì)菌生物學(xué)機(jī)理的調(diào)控可以在某些特定條件下，達(dá)到控制生物膜生長，抑制生物污染等特定要求，在生物醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)等各個(gè)領(lǐng)域都有很廣泛的應(yīng)用前景。但是，在淬滅酶的使用過程中，淬滅酶存在著穩(wěn)定性不好，在水溶液中會(huì)迅速溶解等缺點(diǎn)，較好的解決辦法是在盡量保留酶活性的前提下，選擇合適的負(fù)載材料，將酶做成復(fù)合材料進(jìn)行應(yīng)用。另一方面，在復(fù)合材料的制備過程中，通過新型材料和酶之間的相互作用，形成具有新型結(jié)構(gòu)和特性的復(fù)合材料，對(duì)擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍提供了很好的方法。其中，有機(jī)/無機(jī)復(fù)合薄膜材料是一種重要的發(fā)展方向，尤其是納米材料作為無機(jī)材料的應(yīng)用，利用無機(jī)納米材料的特殊性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)酶蛋白類物質(zhì)的活性的保留和固定，同時(shí)借助無機(jī)納米材料的“空間位阻”，“結(jié)構(gòu)支撐”和“官能團(tuán)鍵能作用”，實(shí)現(xiàn)酶蛋白的多種生物學(xué)功能。
無機(jī)納米材料中，低維的碳納米材料是近幾年的研究熱點(diǎn)，主要包括氧化石墨烯、石墨烯、碳納米管等材料。低維碳納米材料由于其具有納米級(jí)尺寸、納米級(jí)片層結(jié)構(gòu)和良好的吸附特性，被應(yīng)用于許多領(lǐng)域，并得到了快速廣泛地推廣。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種低維碳納米材料/群體感應(yīng)淬滅酶復(fù)合薄膜材料制備方法及應(yīng)用，所得納米酶復(fù)合薄膜材料具有有序的復(fù)合結(jié)構(gòu)且易剝離。
一種低維碳納米材料/群體感應(yīng)淬滅酶復(fù)合薄膜材料制備方法，包括下述步驟:
1)按照質(zhì)量比將包括氧化石墨烯、石墨烯或碳納米管的低維碳納米材料0.1～3.0mg分散在1L磷酸鹽緩沖溶液中，室溫超聲30～60min，得到低維碳納米材料的磷酸鹽溶液；
2)按照質(zhì)量比將淬滅酶0.2～6.0mg分散在1L磷酸鹽緩沖溶液中，室溫超聲30～60min，得到淬滅酶的磷酸鹽溶液；
3)按照淬滅酶磷酸鹽溶液與低維碳納米材料磷酸鹽溶液的質(zhì)量比為(2～12):1的比例混合超聲30～60min，攪拌下即得到制備低維碳納米材料/群體感應(yīng)淬滅酶復(fù)合薄膜用的混合原液；
4)采用涂覆的方法將混合原液覆蓋在硅片、云母片或者石英固體平面基底上，自然風(fēng)干，即得到覆蓋有低維碳納米材料/群體感應(yīng)淬滅酶復(fù)合薄膜的基底；
5)使用低頻超聲的方法，將覆蓋有低維碳納米材料/群體感應(yīng)淬滅酶復(fù)合薄膜的基底放在超純水中，將低維碳納米材料/群體感應(yīng)淬滅酶復(fù)合薄膜從其附著的基底上剝離下來并轉(zhuǎn)移到待保護(hù)固體的表面，即得低維碳納米材料/群體感應(yīng)淬滅酶復(fù)合薄膜材料。
進(jìn)一步，所述氧化石墨烯采用下述方法制備：
按照重量份數(shù)將2份天然鱗片石墨粉與6份硝酸鈉混合，緩慢加入184份濃硫酸，在4～6℃下充分?jǐn)嚢?0～40min；加入0.2份高錳酸鉀；常溫下在1h內(nèi)，分批加入8份高錳酸鉀。35±3℃下充分?jǐn)嚢?.5～2h，得到褐色懸浮液；
然后緩慢加入100份水，在40～45℃下再加入10份30％H2O2和55mL超純水的混合溶液，過濾，得到黃褐色濾餅；
用50份濃度為3％的稀鹽酸溶液將黃褐色濾餅多次洗滌，并分散于800份水中，然后離心，透析，低頻超聲10h，得到棕色混合溶液，離心30min，-40℃真空冷凍干燥24h，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
進(jìn)一步，所述氧化石墨烯所用的石墨粉為100～300目的粉末。
進(jìn)一步，所述石墨烯通過機(jī)械剝離法、氣相沉積法、熱解SiC法、氧化石墨烯還原法、碳管切割法或液相直接超聲剝離法制備石墨烯。
進(jìn)一步，所述碳納米管包括單壁，雙壁和多壁碳納米管，管徑為1～100nm，管長為0.5～100μm。
進(jìn)一步，所述磷酸鹽緩沖溶液為磷酸二氫鉀、氯化鈉和超純水按質(zhì)量比為0.68：0.12:1配置混合溶液。
進(jìn)一步，所述淬滅酶為包括氨基?；浮?nèi)酯酶或脫羧酶在內(nèi)的所有對(duì)細(xì)菌信號(hào)分子具有降解作用的淬滅酶。
進(jìn)一步，所述步驟1)中，在0～10℃下攪拌1～1.5h。
進(jìn)一步，所述涂覆的方法包括滴涂法、旋涂法、提拉法、刮涂法或噴涂法。
進(jìn)一步，將所述低維碳納米材料/群體感應(yīng)淬滅酶復(fù)合薄膜材料進(jìn)一步通過真空干燥，制備成為粉末狀顆粒，-40℃冷凍保存，作為群體感應(yīng)抑制劑使用。
本發(fā)明的有益效果在于：
(1)該低維碳納米材料改善了淬滅酶固定負(fù)載量效率低、擴(kuò)散限制作用、固定化酶活性不高，并且與傳統(tǒng)化學(xué)鍵結(jié)合時(shí)，酶活性受到限制而影響酶活等問題。
(2)低維碳納米材料易制備、易保存，比表面積大，對(duì)酶活不會(huì)造成大的破壞。
(3)低維碳納米材料/群體感應(yīng)淬滅酶復(fù)合薄膜材料制備方法簡單易行，可在生物、醫(yī)學(xué)、環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但并不作為對(duì)本發(fā)明做任何限制的依據(jù)。
一種低維碳納米材料/群體感應(yīng)淬滅酶復(fù)合薄膜材料制備方法，包括下述步驟:
1)氧化石墨烯、石墨烯或碳納米管的制備與選擇：
氧化石墨烯的制備采用的是Hummer改進(jìn)方法。所用的天然鱗片石墨粉為100目的粉末，純度為99.999。下述材料均按重量份數(shù)計(jì)。
將2份天然鱗片石墨粉與6份硝酸鈉混合，緩慢加入184份濃硫酸，在4～6℃下充分?jǐn)嚢?0～40min；加入0.2份高錳酸鉀；常溫下在1h內(nèi)，分批加入8份高錳酸鉀。35±3℃下充分?jǐn)嚢?.5～2h，得到褐色懸浮液；
然后緩慢加入100份水，在40～45℃下再加入10份30％H2O2和55mL超純水的混合溶液，過濾，得到黃褐色濾餅；
用50份濃度為3％的稀鹽酸溶液將黃褐色濾餅多次洗滌，并分散于800份水中，然后離心，透析，低頻超聲10h，得到棕色混合溶液，離心30min，-40℃真空冷凍干燥24h，得到氧化石墨烯儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
石墨烯通過機(jī)械剝離法、氣相沉積法(CVD)、熱解SiC法、氧化石墨烯還原法、碳管切割法或液相直接超聲剝離法制備石墨烯。
碳納米管采用包括單壁，雙壁和多壁碳納米管，管徑為1～100nm，管長為0.5～100μm。
2)將包括100～300目的氧化石墨烯、石墨烯或碳納米管的低維碳納米材料0.1～3.0mg分散在1L磷酸鹽緩沖溶液中，室溫超聲30～60min；按照質(zhì)量比將淬滅酶(氨基酰化酶、內(nèi)酯酶或脫羧酶)0.2～6.0mg分散在1L磷酸鹽緩沖溶液中，在0～10℃下攪拌1～1.5h；按照質(zhì)量比為(2～12):1的比例將淬滅酶緩沖溶液與低維碳納米材料緩沖溶液混合超聲30～60min，所得溶液即是制備薄膜用的混合原液；
磷酸鹽緩沖溶液為按質(zhì)量比0.68：0.12:1配置的磷酸二氫鉀、氯化鈉和超純水配置的混合溶液。
淬滅酶為包括氨基?；?、內(nèi)酯酶或脫羧酶在內(nèi)的所有對(duì)細(xì)菌信號(hào)分子具有降解作用的淬滅酶。
3)采用涂覆(包括滴涂法、旋涂法、提拉法、刮涂法或噴涂法)的方法將混合原液覆蓋在硅片、云母片或者石英固體平面基底上，待溶劑揮發(fā)之后，使用低頻超聲的方法，將低維碳納米管/群體感應(yīng)淬滅酶復(fù)合薄膜材料從其附著的基底上剝離下來并轉(zhuǎn)移到待保護(hù)固體的表面，即得低維碳納米材料/群體感應(yīng)淬滅酶復(fù)合薄膜材料。
本發(fā)明還可以將所述低維碳納米材料/群體感應(yīng)淬滅酶復(fù)合薄膜材料制備通過真空干燥制備成為粉末狀顆粒，-40℃冷凍保存，作為群體感應(yīng)抑制劑使用。
下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
實(shí)施例1：
(1)按照重量份數(shù)將2份天然鱗片石墨粉與6份硝酸鈉混合，緩慢加入184份濃硫酸，充分?jǐn)嚢?0min(5℃)；加入0.2份高錳酸鉀。在1h內(nèi)，分批加入8份高錳酸鉀(20℃)。35±3℃下充分?jǐn)嚢?h，得到褐色懸浮液。緩慢加入100mL100份水，再加入10份30％H2O2和55mL超純水的混合溶液(45℃)，過濾，得到黃褐色濾餅。用50份稀鹽酸(3％，45℃)將濾餅多次洗滌后分散于800份水中，然后離心，透析，超聲(200W)10h，棕色混合溶液離心30min，-40℃真空冷凍干燥24h，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
(2)氧化石墨烯溶液制備：將1mg氧化石墨烯分散在1L0.2M，pH-7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，室溫超聲30min，既得1.0mg/L氧化石墨烯溶液。
(3)淬滅酶溶液的準(zhǔn)備：群體感應(yīng)淬滅酶選擇氨基?；浮７Q取0.2mg氨基?；柑砑舆M(jìn)在1L0.2M，pH-7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，4℃下攪拌1h，獲得02mg/L的氨基?；溉芤骸?/p>
(4)氧化石墨烯/淬滅酶混合溶液的制備：
用微量進(jìn)樣器抽取適量的氨基?；溉芤海稳?0μl氧化石墨烯溶液中，加入超純水，使溶液中體積達(dá)到50μl，輕微震蕩混合均勻超聲30min，作為樣品制備的原始溶液使用。氧化石墨烯和氨基?；傅馁|(zhì)量比例如下：
1)氧化石墨烯溶液：氨基酰化酶溶液＝1:2
2)氧化石墨烯溶液：氨基?；溉芤海?:4
3)氧化石墨烯溶液：氨基?；溉芤海?:6
4)氧化石墨烯溶液：氨基?；溉芤海?:8
5)氧化石墨烯溶液：氨基?；溉芤海?:10
6)氧化石墨烯溶液：氨基?；溉芤海?:12；
(5)復(fù)合薄膜材料的制備：采用提拉法將云母片浸泡在適量氨基?；溉芤褐?0min,緩慢提拉，室溫靜置24h以上，待溶劑揮發(fā)之后，即形成多層穩(wěn)定的氧化石墨烯/氨基?；笍?fù)合薄膜。薄膜厚度約為0.1μm。
實(shí)施例2：
(1)氧化石墨烯的制備采用的是Hummer改進(jìn)方法，同實(shí)施例1所述。
(2)石墨烯的制備采用氧化石墨烯還原法(水合肼還原法)：將實(shí)施例1中的0.1mg氧化石墨烯分散到1L水溶液中，超聲分散40min，然后加入水合肼(2ml,50％w/v)，混合均勻后回流條件下反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，樣品過濾分離洗滌，并在60℃的真空烘箱中烘干。
(3)石墨烯溶液制備：將2mg石墨烯分散在1L0.2M，pH-7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，室溫超聲30min，既得2.0mg/L石墨烯溶液。
(4)淬滅酶溶液的準(zhǔn)備：群體感應(yīng)淬滅酶選擇氨基?；?。稱取0.3mg氨基酰化酶添加進(jìn)在1L0.2M，pH-7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，0℃下攪拌1.5h，獲得0.3mg/L的氨基?；溉芤骸?/p>
(5)石墨烯/淬滅酶混合溶液的制備：
用微量進(jìn)樣器抽取適量的氨基酰化酶溶液，滴入20μl石墨烯溶液中，加入超純水，使溶液中體積達(dá)到50μl，輕微震蕩混合均勻，作為樣品制備的原始溶液使用。石墨烯和氨基酰化酶的質(zhì)量比例如下：
1)石墨烯溶液：氨基?；溉芤海?:2
2)石墨烯溶液：氨基?；溉芤海?:4
3)石墨烯溶液：氨基?；溉芤海?:6
4)石墨烯溶液：氨基?；溉芤海?:8
5)石墨烯溶液：氨基?；溉芤海?:10
6)石墨烯溶液：氨基?；溉芤海?:12
(6)復(fù)合薄膜材料的制備：采用微量進(jìn)樣針吸取10μl混合原液，采用滴涂法(drop-casting)涂覆于硅片上，室溫靜置24h以上，待溶劑揮發(fā)之后，即形成多層穩(wěn)定的石墨烯/氨基酰化酶復(fù)合薄膜材料。薄膜厚度約為0.2μm。
實(shí)施例3：
(1)碳納米管為單壁式，碳含量＞90％，管徑1～2nm,管長0.5～2μm。
(2)碳納米管溶液制備：將3mg碳納米管分散在1L0.2M，pH-7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，室溫超聲60min，既得3.0mg/L石墨烯溶液。
(3)淬滅酶溶液的準(zhǔn)備：群體感應(yīng)淬滅酶選擇氨基?；浮７Q取6.0mg氨基?；柑砑舆M(jìn)在1L0.2M，pH-7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，10℃下攪拌1.5h，獲得6.0mg/L的氨基酰化酶溶液。
(4)碳納米管/淬滅酶混合溶液的制備：
用微量進(jìn)樣器抽取適量的氨基酰化酶溶液，滴入20μl氧化石墨烯溶液中，加入超純水，使溶液中體積達(dá)到50μl，輕微震蕩混合均勻，作為樣品制備的原始溶液使用。碳納米管和氨基?；傅馁|(zhì)量比例如下：
1)碳納米管溶液：氨基酰化酶溶液＝1:2
2)碳納米管溶液：氨基?；溉芤海?:4
3)碳納米管溶液：氨基?；溉芤海?:6
4)碳納米管溶液：氨基?；溉芤海?:8
5)碳納米管溶液：氨基?；溉芤海?:10
6)碳納米管溶液：氨基酰化酶溶液＝1:12
(5)復(fù)合薄膜材料的制備：采用微量進(jìn)樣針吸取10μl混合原液，采用滴涂法(drop-casting)涂覆于硅片上，采用厚度0.5μm的刮刀，用刮涂法(blade-coating)將溶液刮平，室溫靜置24h以上，待溶劑揮發(fā)之后，即形成多層穩(wěn)定的碳納米管/氨基?；笍?fù)合薄膜。薄膜厚度約為0.5μm。
以上所述，僅是本發(fā)明針對(duì)一種低維碳納米材料/群體感應(yīng)淬滅酶復(fù)合薄膜材料的制備方法及應(yīng)用的實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明做任何限制，凡是根據(jù)本發(fā)明技術(shù)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡單修改，變更以及等效結(jié)構(gòu)變化，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍內(nèi)。