一種來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體、編碼基因及其應(yīng)用的制作方法

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導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明涉及一種脂肪酶及應(yīng)用，特別涉及一種來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體、編碼基因及在不對(duì)稱拆分2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯合成普瑞巴林關(guān)鍵手性中間體(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用。

(二)

背景技術(shù)：

普瑞巴林(Pregabalin，PGB)，商品名化學(xué)名為(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是一種鈣離子通道調(diào)節(jié)劑，能夠有效抑制與神經(jīng)病理性疼痛、癲癇等相關(guān)的神經(jīng)元過度興奮及神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加的疾病(Curr.Opin.Pharmacol.2006,6:108-113)。目前已被FDA批準(zhǔn)用于帶狀皰疹后神經(jīng)痛、糖尿病外周神經(jīng)痛、癲癇、纖維肌痛等疾病的治療。與加巴噴丁等傳統(tǒng)類似藥物相比，普瑞巴林使用劑量低、服用次數(shù)少、副作用小、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、耐受性強(qiáng)(Curr.Med.Res.Opin.2006,22:375-384)，因此被多個(gè)國(guó)際指南推薦為神經(jīng)病理性疼痛治療的一線藥物。

目前已有大量普瑞巴林關(guān)鍵中間體合成方法的報(bào)道。其中，化學(xué)法包括不對(duì)稱合成法、手性拆分法、手性配體法和手性源法等?；瘜W(xué)法合成普瑞巴林存在原子經(jīng)濟(jì)性低，有機(jī)溶劑使用量大，生產(chǎn)條件苛刻等缺陷，限制了其大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。美國(guó)輝瑞公司研發(fā)的新一代普瑞巴林生產(chǎn)工藝以Novozymes公司商品化脂肪酶為催化劑不對(duì)稱拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)合成關(guān)鍵手性中間體(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，后者再經(jīng)過脫羧、堿水解、氫化等步驟制得普瑞巴林成品。該路線脂肪酶作為生物催化劑，提高了原料利用率，減少“三廢”排放，有機(jī)溶劑使用量減少90％，產(chǎn)物ee值可達(dá)98％。

脂肪酶(Lipase,EC 3.1.1.3)，是一類能夠催化三酯酰甘油酯鍵水解的酶。除了水解酯鍵以外，還能催化酯合成、轉(zhuǎn)酯化、氨解等反應(yīng)。脂肪酶生物催化具有選擇性高，副反應(yīng)少及反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，在生物催化尤其是在光學(xué)純化合物制備領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景。

定向進(jìn)化技術(shù)包括易錯(cuò)PCR和DNA shuffling等，是蛋白質(zhì)分子改造的重要手段。從易錯(cuò)PCR技術(shù)出發(fā)，篩選引起酶催化性能改變的突變點(diǎn)，并結(jié)合定點(diǎn)突變分析該突變點(diǎn)在酶功能實(shí)現(xiàn)中的作用，對(duì)提高脂肪酶催化合成普瑞巴林手性中間體的性能具有重要意義。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是通過易錯(cuò)PCR結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶進(jìn)行分子改造，獲得一種高效動(dòng)力學(xué)拆分外消旋CNDE合成普瑞巴林關(guān)鍵手性中間體(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的突變體。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種來源于嗜熱踝節(jié)菌(Talaromyces thermophilus)的脂肪酶(TTL)突變體，所述突變體是將SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位、207位和259位氨基酸中的一位或多位進(jìn)行突變后獲得。

進(jìn)一步，優(yōu)選所述突變體是將SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼岷?或第207位脯氨酸突變?yōu)楸奖彼岷?或第259位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?，更?yōu)選所述突變體是將SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?，?07位脯氨酸突變?yōu)楸奖彼?，同時(shí)第259位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?/p>

進(jìn)一步，優(yōu)選所述突變體氨基酸序列為SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9之一所示。

本發(fā)明還提供一種所述來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體編碼基因，所述編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8或SEQ ID No.10之一所示。

本發(fā)明還涉及一種含所述來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體編碼基因的重組基因工程菌。

本發(fā)明還提供一種所述來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯合成(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，具體所述的應(yīng)用為：將含來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體編碼基因的重組基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)，取培養(yǎng)液離心后的上清提取純酶，以所述的純酶為催化劑，以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯為底物，添加醋酸鋅，以純水(或100mM，pH 8.0的Tris-HCl緩沖液)為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，于35℃、200rpm反應(yīng)，反應(yīng)過程維持pH為7.0，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸；所述反應(yīng)體系中，底物終濃度為3M，醋酸鋅終濃度50mM，純酶用量為300U/mL。

本發(fā)明所述催化劑按如下方法制備：將含來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體編碼基因的重組基因工程菌接種至YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)16-22h，獲得種子液；然后將種子液以體積濃度1％的接種量轉(zhuǎn)接至BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)16-22h后，5000rpm離心去上清，將菌體(即沉淀)用BMMY培養(yǎng)基重懸后，每隔12h添加體積濃度1％的甲醇，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5天后，將培養(yǎng)液8000rpm離心5min；取上清，在冰浴條件下利用硫酸銨鹽析法沉淀目的蛋白，沉淀過夜后，8000rpm離心10min，將沉淀的粗蛋白用50mM、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液重懸后，透析于Tris-HCl(50mM，pH 8.0)過夜；將酶液(即截留液)上樣于Tris-HCl(50mM，pH 8.0)平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用含0-0.5M NaCl的50mM、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液線性洗脫，收集0.2～0.3M NaCl濃度下洗脫的目的蛋白，透析于Tris-HCl(50mM，pH 8.0)過夜，取截留液即為純酶；所述YPD培養(yǎng)基組成為：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，溶劑為去離子水，pH 7.0；所述BMGY培養(yǎng)基組成：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB 13.4g/L，甘油10g/L，0.1mol/L pH 6.0磷酸緩沖液，115℃滅菌后加入4×10^-5％生物素；所述BMMY培養(yǎng)基組成為：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB13.4g/L，0.1mol/L pH 6.0磷酸緩沖液，115℃滅菌后加入4×10^-5％生物素。

本發(fā)明利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)脂肪酶TTL編碼基因(SEQ ID No.2)進(jìn)行隨機(jī)突變，首先利用T7引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行隨機(jī)突變，得到脂肪酶突變體核苷酸序列，連接至表達(dá)載體pET-28b(+)后轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主，誘導(dǎo)表達(dá)后通過高通量篩選方法檢出正突變子，然后結(jié)合定點(diǎn)突變的方法，得到活力進(jìn)一步提高的突變體。從而獲得能夠高效催化CNDE立體選擇性水解合成(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的突變體。

其中，所述的取代較佳的氨基酸位點(diǎn)為：將SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?；所述氨基酸序列中的?07位脯氨酸突變?yōu)楸奖彼?；所述氨基酸序列中的?59位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?/p>

具體方法如下：嗜熱踝節(jié)菌脂肪酶TTL(GenBank accession No.AEE61324.1)即SEQ ID No:1，由269個(gè)氨基酸殘基組成，其核苷酸序列SEQ ID No:2所示。將構(gòu)建獲得的pET-28b-TTL表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中表達(dá)。采用易錯(cuò)PCR方法進(jìn)行隨機(jī)突變，并重組至表達(dá)載體pET-28b(+)，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)中，構(gòu)建突變文庫。挑選突變文庫中的單菌落至96孔板中誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，利用溴百里香酚藍(lán)作為指示劑篩選活力高于對(duì)照組的菌株。將活力提高的菌株進(jìn)行測(cè)序分析，獲得突變體序列信息。將活力提高的突變體蛋白進(jìn)一步進(jìn)行定點(diǎn)突變，通過氣相色譜測(cè)定水解CNDE的活力，將篩選得到的高活力突變體菌株進(jìn)行測(cè)序分析，經(jīng)過對(duì)上述構(gòu)建的突變文庫篩選以及理性設(shè)計(jì)方法，獲得了活力提高的突變體為：L259F(氨基酸序列SEQ ID No:3，核苷酸序列SEQ ID No:4所示)、L206F/259F(氨基酸序列SEQ ID No:5，核苷酸序列SEQ ID No:6所示)、P207F/L259F(氨基酸序列SEQ ID No:7，核苷酸序列SEQ ID No:8所示)和L206F/P207F/L259F(氨基酸序列SEQ ID No:9，核苷酸序列SEQ ID No:10所示)。

將野生型和上述篩選得到的突變體在畢赤酵母宿主中進(jìn)行分泌表達(dá)以克服在大腸桿菌宿主表達(dá)時(shí)出現(xiàn)包涵體的現(xiàn)象，從而實(shí)現(xiàn)蛋白的可溶性表達(dá)與催化活力的提高。

在本發(fā)明制備的脂肪酶突變體的方法中，所獲得的脂肪酶突變體基因可以在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，也可以采用本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒▽?shí)現(xiàn)在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞胞外表達(dá)。

本發(fā)明制備脂肪酶突變的方法中，所述載體的宿主細(xì)胞為原核生物或真核生物。所述原核生物包括但不限于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌。所述真核生物包括但不限于畢赤巴斯德酵母、釀酒酵母和黑曲霉。

所述的脂肪酶突變體可以以純酶形式使用，也可以以未純化的粗酶液等方式使用。如果需要可以對(duì)其進(jìn)行固定化后進(jìn)行使用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：經(jīng)過蛋白質(zhì)分子改造，TTL立體選擇性水解CNDE的活力由4.50U/mg提高到160.55U/mg，遠(yuǎn)高于目前已報(bào)道的脂肪酶水解CNDE的活力。因此，本發(fā)明所獲得的突變體在高效催化CNDE合成普瑞巴林手性中間體(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中具有良好的應(yīng)用前景。

(四)附圖說明

圖1為野生型和突變后脂肪酶蛋白純化后的SDS-PAGE電泳圖。其中：泳道M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品；泳道1為野生型TTL蛋白純化樣品；泳道2為突變體L259F蛋白純化樣品；泳道3為突變體L206F/L259F蛋白純化樣品；泳道4為突變體P207F/L259F蛋白純化樣品，泳道5為突變體L206F/P207F/L259F蛋白純化樣品。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1構(gòu)建脂肪酶突變文庫

以克隆來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶基因(GenBank accession No.JF414585.1)并連接至pET-28b(+)的pET-28b-TTL質(zhì)粒為模版(核苷酸序列SEQ ID NO.2)，利用T7promoter和T7terminator為引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨機(jī)引入突變。PCR反應(yīng)體系(50μL)：模版0.5～20ng，1×Taq Buffer(不含Mg²⁺)，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，0.1mM dCTP，0.1mM dTTP，0.2mM MnCl₂，引物T7promoter與T7terminator各0.2μM，Taq DNA聚合酶5U。PCR條件(1)95℃預(yù)變性3min；(2)95℃變性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min，步驟(2)～(4)共30個(gè)循環(huán)；(5)最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析后切膠回收，利用NcoI和Xhol雙酶切，與同樣雙酶切pET-28b(+)表達(dá)載體連接，化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)，涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，得到單菌落即成功構(gòu)建突變文庫。

表1引物設(shè)計(jì)表

實(shí)施例2突變體的高通量篩選

挑取實(shí)施例1中的單菌落至96深孔板中培養(yǎng)，每個(gè)孔板加入200μL LB培養(yǎng)基(含有50μg/mL卡那霉素)，37℃培養(yǎng)2.5h至OD₆₀₀約為0.6左右時(shí)，加入終濃度為0.1mM IPTG誘導(dǎo)，并在28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)20h。將96深孔板的菌體離心15min(5000rpm，4℃)，棄上清后，用Tris-HCl(20mM，pH 8.0)緩沖液重懸菌體作為反應(yīng)的生物催化劑。將菌體懸液加入96淺孔板各孔中，每孔200μL，然后加入底物CNDE(終濃度100mM)，并以0.01％溴百里香酚藍(lán)作為指示劑，30℃反應(yīng)1-3h。

根據(jù)顏色變化的快慢程度挑取活力提高的菌體(以野生型菌株為對(duì)照)，利用氣相色譜復(fù)篩驗(yàn)證CNDE的催化活性。色譜柱類型：Astec CHIRALDEX^TM G-TA毛細(xì)管柱；色譜條件：柱溫135℃，進(jìn)樣室溫度220℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度220℃，載氣He流量：1mL/min，分流比：30:1。測(cè)序分析后確定活力提高突變體為L(zhǎng)259F，其氨基酸序列見序列表SEQ ID NO.3，其核苷酸序列見序列表SEQ ID No.4。

實(shí)施例3定點(diǎn)突變與篩選

為了進(jìn)一步提高突變體酶活，利用定點(diǎn)突變繼續(xù)篩選更優(yōu)的復(fù)合突變體。以表達(dá)質(zhì)粒pET-28b-L259F為模版，通過全質(zhì)粒擴(kuò)增進(jìn)行定點(diǎn)突變。PCR體系(50μL)為：模版0.5～20ng，5×PrimeSTAR Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，突變引物(表1)各1μL，PrimeSTAR DNA Polymerase 0.5μL。PCR條件(1)95℃預(yù)變性3min；(2)95℃變性15s；(3)55℃退火10s；(4)72℃延伸5min，步驟(2)～(4)共30個(gè)循環(huán)；(5)最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，利用DpnI消化后導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)，涂布至含有50μg/mL卡那霉素的LB平板。利用氣相色譜檢測(cè)各突變體對(duì)CNDE的催化活性，確定活力提高突變體為L(zhǎng)206F/L259F，P207F/L259F和L206F/P207F/L259F，其氨基酸序列分別如序列表SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9所示，核苷酸序列分別如序列表SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示。其中，催化活力最高的為突變體L206F/P207F/L259F。

實(shí)施例4畢赤酵母表達(dá)脂肪酶

為了實(shí)現(xiàn)野生型和突變體的高效可溶性表達(dá)，提高其催化效率，將野生型和突變體在畢赤酵母宿主中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。以pET-28b表達(dá)質(zhì)粒為模版，利用畢赤酵母表達(dá)引物Pic-F和Pic-R將野生型和突變體基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系(50μL)：模版0.5～20ng，1×Pfu Buffer，0.2mM dNTP，引物各0.2μM，Pfu DNA聚合酶5U。PCR條件(1)95℃預(yù)變性3min；(2)95℃變性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min，步驟(2)～(4)共30個(gè)循環(huán)；(5)最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析后切膠回收，用XhoI和XbaI雙酶切，與同樣雙酶切后的pPICZα-A連接，化學(xué)轉(zhuǎn)化至E.coli JM109中，然后涂布至含有25μg/mL Zeocin^TM的LB平板。挑取單菌落測(cè)序，確定陽性克隆后提取質(zhì)粒用SacI線性化處理、乙醇沉淀，電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入購置于Invitrogen公司畢赤酵母X33宿主中，涂布至含有25μg/mL Zeocin^TM的YPDS平板。挑取單菌落驗(yàn)證陽性表達(dá)子，成功構(gòu)建表達(dá)野生型、突變體L259F、L206F/259F、P207F/L259F和L206F/P207F/L259F脂肪酶的重組畢赤酵母X33。

實(shí)施例5畢赤酵母表達(dá)野生型和突變體脂肪酶的表達(dá)純化

1、野生型和突變體脂肪酶在畢赤酵母中的表達(dá)

將實(shí)施例4中成功構(gòu)建的重組畢赤酵母X33接種至YPD培養(yǎng)基(蛋白胨20g/L；酵母粉10g/L；葡萄糖20g/L，溶劑為去離子水，pH 7.0)中。30℃培養(yǎng)16-22h，然后以體積濃度1％接種量轉(zhuǎn)接至BMGY培養(yǎng)基(酵母粉10g/L；蛋白胨20g/L；YNB13.4g/L；甘油10g/L；0.1mol/L pH 6.0磷酸緩沖液；115℃滅菌后加入4×10^-5％生物素)中。30℃培養(yǎng)16-22h后，5000rpm離心去上清，取菌體用BMMY培養(yǎng)基(酵母粉10g/L；蛋白胨20g/L；YNB13.4g/L；0.1mol/L pH 6.0磷酸緩沖液；115℃滅菌后加入4×10^-5％生物素)重懸后，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)，每12h添加甲醇誘導(dǎo)，甲醇體積添加量為1％。

2、畢赤酵母表達(dá)脂肪酶野生型和突變體的純化

畢赤酵母發(fā)酵5天后，將發(fā)酵液8000rpm離心5min。取上清，在冰浴條件下利用硫酸銨鹽析法沉淀目的蛋白。沉淀過夜后，8000rpm離心10min，將沉淀的粗蛋白用Tris-HCl(50mM，pH 8.0)進(jìn)行重懸后，透析于Tris-HCl(50mM，pH 8.0)緩沖液過夜。將酶液(即截留液)上樣于Tris-HCl(50mM，pH 8.0)緩沖液平衡的DEAE-Sepharose FF柱(1.6×20cm,GE)，用含0-0.5M NaCl的Tris-HCl(50mM，pH 8.0)線性洗脫，收集0.2～0.3M NaCl濃度下洗脫的目的蛋白，透析于Tris-HCl(50mM，pH 8.0)緩沖液過夜，取截留液即為純酶。通過SDS-PAGE分析目的蛋白，蛋白電泳結(jié)果如圖1所示。

實(shí)施例6脂肪酶活力測(cè)定

對(duì)實(shí)施例5中純化后的酶蛋白進(jìn)行酶活測(cè)定。脂肪酶活力檢測(cè)反應(yīng)體系(10mL)：緩沖液Tris-HCl(100mM，pH 8.0)，100mM底物CNDE，5mM醋酸鋅，純酶終濃度20μg/mL。反應(yīng)液于35℃、200rpm反應(yīng)1h。取樣200μL，加入50μL 1M的HCl終止反應(yīng)后用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相無水硫酸鈉處理后，利用氣相色譜(島津GC-14C)外標(biāo)法測(cè)定轉(zhuǎn)化液2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯轉(zhuǎn)化率和(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的對(duì)映體過量值。酶活定義(U)：在35℃，Tris-HCl緩沖液(100mM，pH 8.0)條件下，每分鐘催化生成1μmol(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸所需要的酶量定義為1U。野生型和突變體脂肪酶酶活測(cè)定結(jié)果參見表2。

表2：野生型和突變體嗜熱踝節(jié)菌脂肪酶活力

實(shí)施例7脂肪酶突變體在(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制備中的應(yīng)用

在100mL反應(yīng)體系中，加入23.5mL純水，3M底物CNDE(即765g/L)，醋酸鋅終濃度50mM，最優(yōu)突變體L206F/P207F/L259F純酶用量為300U/mL。反應(yīng)溫度35℃，反應(yīng)過程中通過滴加4M NaOH控制pH值維持7.0，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm。反應(yīng)過程中取樣200μL，加入50μL 1M的HCl終止反應(yīng)后用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用無水硫酸鈉處理后，利用氣相色譜測(cè)定轉(zhuǎn)化液2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯轉(zhuǎn)化率和(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的對(duì)映體過量值。從反應(yīng)結(jié)果可知，在高底物濃度條件下，最優(yōu)突變體L206F/P207F/L259F轉(zhuǎn)化6小時(shí)后，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到45.5％，產(chǎn)物的ee>95％。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工業(yè)大學(xué)

<120> 一種來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體、編碼基因及其應(yīng)用

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 269

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Ala

20 25 30

Asn Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile Gly Asn Ile Asn Leu Asp

85 90 95

Leu Lys Gly Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly Cys Lys Gly His Asp Gly

100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn Thr Leu Thr Gln Gln Val

115 120 125

Gln Asn Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Ser Leu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Ala Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser

210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Lys Asn Asp Ile Val Lys Val Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro Asn Thr Pro Asp Ile Ala

245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

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<210> 2

<211> 807

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

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tactgcgcta aaaacaacga cgctccggct ggtgctaacg ttacctgccg tggttctatc 120

tgcccggaag ttgaaaaagc tgacgctacc ttcctgtact ctttcgaaga ctctggtgtt 180

ggtgacgtta ccggtttcct ggctctggac aacaccaacc gtctgatcgt tctgtctttc 240

cgtggttctc gttctctgga aaactggatc ggtaacatca acctggacct gaaaggtatc 300

gacgacatct gctctggttg caaaggtcac gacggtttca cctcttcttg gcgttctgtt 360

gctaacaccc tgacccagca ggttcagaac gctgttcgtg aacacccgga ctaccgtgtt 420

gttttcaccg gtcactctct gggtggtgct ctggctaccg ttgctggtgc ttctctgcgt 480

ggtaacggtt acgacatcga cgttttctct tacggtgctc cgcgtgttgg taaccgtgct 540

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gacatcgttc cgcgtctgcc gccgcgtgaa ctgggttact ctcactcttc tccggaatac 660

tggatcacct ctggtaccct ggttccggtt accaaaaacg acatcgttaa agttgaaggt 720

atcgactcta ccgacggtaa caaccagccg aacaccccgg acatcgctgc tcacctgtgg 780

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<211> 269

<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列

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Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Ala

20 25 30

Asn Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

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65 70 75 80

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130 135 140

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180 185 190

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260 265

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<211> 807

<212> DNA

<213> unknown

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<223> 人工序列

<400> 4