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一種來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體、編碼基因及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:11899145閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種來源于嗜熱踝節(jié)菌(Talaromyces thermophilus)的脂肪酶突變體,其特征在于所述突變體是將SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位、207位和259位氨基酸中的一位或多位進行突變后獲得。

2.如權(quán)利要求1所述來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體,其特征在于所述突變體是將SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼岷?或第207位脯氨酸突變?yōu)楸奖彼岷?或第259位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?/p>

3.如權(quán)利要求1所述來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體,其特征在于所述突變體是將SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?07位脯氨酸突變?yōu)楸奖彼?,同時第259位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?/p>

4.如權(quán)利要求1所述來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體,其特征在于所述突變體氨基酸序列為SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9之一所示。

5.一種權(quán)利要求1所述來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體編碼基因。

6.如權(quán)利要求5所述編碼基因,其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列為SEQ IDNo.4、SEQ IDNo.6、SEQ IDNo.8或SEQ IDNo.10之一所示。

7.一種含權(quán)利要求5所述來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體編碼基因的重組基因工程菌。

8.一種權(quán)利要求1所述來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯合成(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用。

9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用,其特征在于所述的應(yīng)用為:將含來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體編碼基因的重組基因工程菌進行發(fā)酵培養(yǎng),取發(fā)酵培養(yǎng)液離心后的上清提取純酶,以所述的純酶為催化劑,以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯為底物,添加醋酸鋅,以純水為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系,于35℃、200rpm反應(yīng),反應(yīng)過程維持pH為7.0,反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液分離純化,獲得(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸;所述反應(yīng)體系中,底物終濃度為3M,醋酸鋅終濃度50mM,純酶添加量為300U/mL。

10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用,其特征在于所述催化劑按如下方法制備:將含來源于嗜熱踝節(jié)菌的脂肪酶突變體編碼基因的重組基因工程菌接種至YPD培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)16-22h,獲得種子液;然后將種子液以體積濃度1%接種量轉(zhuǎn)接至BMGY培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)16-22h后,5000rpm離心去上清,取沉淀用BMMY培養(yǎng)基重懸后,每隔12h添加體積濃度1%甲醇,30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5天后,將培養(yǎng)液8000rpm離心5min;取上清,在冰浴條件下利用硫酸銨鹽析法沉淀目的蛋白,沉淀過夜后,8000rpm離心10min,將沉淀用50mM、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液重懸后,透析于50mM、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液過夜;取截留液上樣于50mM、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液平衡的DEAE-Sepharose FF柱,用含0-0.5M NaCl的50mM、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液線性洗脫,收集0.2~0.3M NaCl濃度下洗脫的目的蛋白,透析于50mM、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液過夜,取截留液即為純酶;所述YPD培養(yǎng)基組成為:蛋白胨20g/L,酵母粉10g/L,葡萄糖20g/L,溶劑為去離子水,pH 7.0;所述BMGY培養(yǎng)基組成:酵母粉10g/L,蛋白胨20g/L,YNB 13.4g/L,甘油10g/L,0.1mol/L、pH 6.0磷酸緩沖液,115℃滅菌后加入4×10-5%生物素;所述BMMY培養(yǎng)基組成為:酵母粉10g/L,蛋白胨20g/L,YNB 13.4g/L,0.1mol/L、pH 6.0磷酸緩沖液,115℃滅菌后加入4×10-5%生物素。

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