本發(fā)明涉及甲基對(duì)硫磷降解酶的突變體，進(jìn)一步涉及編碼甲基對(duì)硫磷降解酶突變體的基因，屬于甲基對(duì)硫磷降解酶突變體的構(gòu)建及其應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著人類對(duì)生活要求的提高和工業(yè)生產(chǎn)的日益發(fā)展，許多人工合成且難以被天然微生物迅速降解的化合物進(jìn)入自然界中。其中，在國內(nèi)外大量生產(chǎn)并大面積用做殺蟲劑的有機(jī)磷農(nóng)藥可以破壞乙酰膽堿酯酶的活性，從而引發(fā)一系列神經(jīng)中毒癥狀，甚至死亡。因此，隨著人們生活質(zhì)量的提高和環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)，有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)于環(huán)境的污染和生態(tài)平衡的破壞越來越受到人們的關(guān)注，如何有效的去除有機(jī)磷農(nóng)藥殘留、降低其毒性成為世界各國研究人員普遍關(guān)注并努力攻克的熱點(diǎn)問題。

有機(jī)磷降解酶(Organophosphorus hydrolase，EC3.1.8.1)是一種可以水解磷酯鍵的酶。一方面，它可以斷裂有機(jī)磷農(nóng)藥的磷酯鍵使其脫毒；另一方面，由于不同種類有機(jī)磷農(nóng)藥的區(qū)別大都是取代基不同，所以一種有機(jī)磷降解酶往往可水解多種有機(jī)磷農(nóng)藥。其中，甲基對(duì)硫磷水解酶(Methyl parathion hydrolase，MPH)的最適底物是甲基對(duì)硫磷，酶分子結(jié)構(gòu)解析和進(jìn)化樹分析結(jié)果表明它屬于β內(nèi)酰胺酶家族(PFAM accession no.PF00753)。

甲基對(duì)硫磷水解酶大都是在中國發(fā)現(xiàn)和分離得到的，測(cè)定了水解活性和酶學(xué)性質(zhì)的只有4個(gè)，其中來源于Pseudomonas sp.WBC-3、Plesiomonas sp.M6和Ochrobactrum sp.M231的甲基對(duì)硫磷水解酶(MPH)氨基酸序列相似性很高，約為98％，它們?cè)诿笇W(xué)性質(zhì)上表現(xiàn)出的共同特點(diǎn)是催化甲基對(duì)硫磷的效率高，堿性條件利于催化，熱穩(wěn)定性較差。只有從Pseudomonas pseudoalcaligenes分離出的OPHC2具有較好的熱穩(wěn)定性，但是與上述幾個(gè)MPH的氨基酸序列最高相似性僅有58.5％，催化甲基對(duì)硫磷的能力也相對(duì)較差。

研究人員對(duì)于MPH的異源表達(dá)進(jìn)行了多方面的探索，但目前的研究結(jié)果顯示MPH的表達(dá)水平還不足以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。針對(duì)酶蛋白表達(dá)水平優(yōu)化方面，研究者應(yīng)用蛋白質(zhì)工程等相關(guān)技術(shù)進(jìn)行了多種設(shè)計(jì)方案的探索和研究。常用的策略主要包括理性設(shè)計(jì)策略，定向進(jìn)化策略。定向進(jìn)化技術(shù)就是在實(shí)驗(yàn)室中人為創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然界進(jìn)化機(jī)制(如突變、重組)使基因發(fā)生大量突變，然后定向選擇出所需性質(zhì)的蛋白質(zhì)，這種技術(shù)的應(yīng)用不僅可以在短時(shí)間內(nèi)完成了自然界幾百年才能完成的事情，而且還不需要了解蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和功能，適合一切蛋白質(zhì)的改造，大大擴(kuò)寬了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計(jì)所不能解決的問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命力?，F(xiàn)在普遍為大家使用的定向進(jìn)化技術(shù)為：易錯(cuò)PCR(error-prone PCR)，DNA改組(DNA shuffling)，寡核苷酸突變(oligonucleotide-directed mutagenesis)，增加平截雜合酶制造法(incemental truncation for the creation of hybridenzymes，ITCHY)，交錯(cuò)延伸(stagger extension process，StEP)和隨機(jī)引物體外重組法(RPR)，其中前三種是最為廣泛應(yīng)用。

DNA shuffling技術(shù)介紹：(稱DNA改組技術(shù)，DNA體外隨機(jī)拼接或稱為有性PCR)，1994年由Stemmer等首次提出，該法是對(duì)一組基因群體(進(jìn)化上相關(guān)的DNA序列或曾篩選出的性能改進(jìn)序列)進(jìn)行重組創(chuàng)造新基因的方法。因?yàn)樵摲ㄔ贒NA片段組裝過程中也可能引入點(diǎn)突變，所以它對(duì)從單一序列指導(dǎo)進(jìn)化蛋白質(zhì)也是有效的。這種方法產(chǎn)生的多樣性文庫，可以有效積累有益突變，排除有害突變和中性突變，同時(shí)也可實(shí)現(xiàn)目的蛋白多種特性的共進(jìn)化。正是由于該技術(shù)包括了DNA重新組裝的過程，使它與以往的誘變技術(shù)有了很大不同。此法的一般過程為：將單基因或一組不同來源的基因DNA或一組來自同一基因的具有不同突變部位的突變體DNA，用DNA酶I進(jìn)行隨機(jī)切割，獲得較小的DNA片段混合體。以此混合體在不加引物的情況下直接進(jìn)行PCR，DNA酶I切割的DNA片段通過相互間的同源性進(jìn)行隨機(jī)互補(bǔ)并以此為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得DNA分子的復(fù)制，由此獲得大量DNA不同區(qū)域間的隨機(jī)重新組合的新DNA突變體；完成這一PCR隨機(jī)擴(kuò)增后，再加入特定引物進(jìn)行最后的PCR擴(kuò)增，便可獲得全長基因的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物在一定寄主細(xì)胞中表達(dá)并篩選出希望獲得的突變體，如此進(jìn)行多次循環(huán)，直到篩選出理想突變體。

本發(fā)明人一直致力于有機(jī)磷降解酶方面的研究工作，從農(nóng)藥污染的土壤中分離得到一些高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的細(xì)菌，并且分離得到兩個(gè)編碼甲基對(duì)硫磷水解酶的基因：來源于假產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的OPHC2(GenBank登錄號(hào)：Accession No.CAE53631)和來源于蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.)的MPH-Och(GenBank登錄號(hào)：Accession No.ACC63894)。其中MPH-Och與已報(bào)道的來源于Pseudomonas sp.WBC-3的MPH相似性很高，達(dá)到98.2％，酶學(xué)性質(zhì)也基本相同。比較MPH-Och與OPHC2發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)酶蛋白氨基酸序列相似性為58.1％。

本發(fā)明人應(yīng)用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了OPHC2的高效表達(dá)，3L發(fā)酵罐可OPHC2的分泌表達(dá)量達(dá)到5.5g/L。MPH-Och在常溫下對(duì)甲基對(duì)硫磷的催化效率明顯優(yōu)于OPHC2，它的比活性是4.3U/mg，約是OPHC2的3倍。但是，該基因在畢赤酵母系統(tǒng)中只表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)，不能有效地分泌，對(duì)后續(xù)的蛋白質(zhì)分離純化造成了極大的困難以及成本提升。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種提供編碼甲基對(duì)硫磷降解酶突變體的基因，該突變體基因能夠在畢赤酵母系統(tǒng)中有效地分泌；

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供上述突變體基因所編碼的甲基對(duì)硫磷降解酶；

本發(fā)明的第三個(gè)技術(shù)問題是提供所述的甲基對(duì)硫磷降解酶突變體在降解有機(jī)磷中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明公開了編碼甲基對(duì)硫磷降解酶突變體編碼基因；優(yōu)選的，其核苷酸序列為SEQ ID No.1所示。甲基對(duì)硫磷降解酶突變體基因的5’端含ophc2基因5’端的207個(gè)核苷酸，此后為mph的核酸序列，即突變酶的N端含OPHC2 N端的69個(gè)氨基酸。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種甲基對(duì)硫磷降解酶突變體；優(yōu)選的，其氨基酸序列為SEQ ID No.2所示。

本發(fā)明還進(jìn)一步公開了甲基對(duì)硫磷降解酶突變體編碼基因的重組表達(dá)載體以及含有所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞是畢赤酵母細(xì)胞。

本發(fā)明所述甲基對(duì)硫磷降解酶突變體的制備方法包括：

1、DNA Shuffling獲得突變基因；

2、構(gòu)建大腸桿菌突變體庫；

3、酵母突變體庫的建立；

4、甲基對(duì)硫磷降解酶活性測(cè)定篩選有益突變酶；

5、突變酶的序列測(cè)定及分析。

本發(fā)明所述的甲基對(duì)硫磷降解酶突變體及其編碼基因、重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞在降解有機(jī)磷中具有廣泛的應(yīng)用前景。

本發(fā)明技術(shù)方案具有以下有益效果：

本發(fā)明甲基對(duì)硫磷降解酶突變體的在酵母中表達(dá)時(shí)其分泌到上清液中的酶活性與在細(xì)胞內(nèi)酶活性比值與MPH相比顯著提高，并且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵到96h的時(shí)候，胞外活性與胞內(nèi)活性的比值可以到達(dá)2.89。對(duì)培養(yǎng)上清樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。發(fā)現(xiàn)突變體菌株有明顯的目的條帶，說明突變酶與野生型MPH相比在酵母上清液中分泌能力顯著增加。

本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義

除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。

術(shù)語“多核苷酸”或“核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA(肽核酸)、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè)以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實(shí)現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

術(shù)語“重組宿主細(xì)胞”或“宿主細(xì)胞”意指包含本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞，而不管使用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對(duì)或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。

術(shù)語“表達(dá)”意指內(nèi)源性基因或轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。

附圖說明

圖1為畢赤酵母重組菌株搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)胞外與胞內(nèi)酶活比值圖；

圖2為畢赤酵母重組菌株搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)上清SDS-PAGE電泳；其中1：野生型MPH培養(yǎng)上清，2：突變體7號(hào)培養(yǎng)上清。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1甲基對(duì)硫磷降解酶突變體的制備

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1菌株及質(zhì)粒

質(zhì)粒pET30a(+)-ophc2，pET30a(+)-mph、菌株E.coli BL21、E.coli Top10和菌株P(guān)ichia pastors GS115由實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pPIC9購自Invitrogen公司，載體pGM-T購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2試劑

質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒購自Axygen公司，Taq polymeras購自天根生化科技(北京)有限公司，T₄-連接酶、限制性內(nèi)切酶購自NEB公司，重組酶、Fast Pfu購自全式金生物技術(shù)有限公司，蛋白胨(Tryptone)和酵母提取物(Yeast extract)購自英國Oxford公司，YNB購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3試驗(yàn)儀器

恒溫?fù)u床(太倉市科技器材廠)、PCR儀(美國Bio-Rad公司)、恒溫箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)、連接儀(卡尤迪生物科技有限公司)、恒溫金屬浴(金銀杏生物技術(shù)有限公司)、漩渦振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、真空冷凍干燥器(德國Christ公司)、高壓蒸汽滅菌鍋(日本SANYO公司)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、立式高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司)、電熱恒溫水浴鍋(上海一恒儀器有限公司)、電擊轉(zhuǎn)化儀(美國Bio-Rad公司)、酶標(biāo)儀(芬蘭Thermo公司)、蛋白質(zhì)電泳儀(北京六一儀器廠)、萊馳MM400研磨儀(德國Retsch公司)。

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DNA Shuffling獲得突變基因

以實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pET30a(+)-ophc2質(zhì)粒為模板，以ophc2-up-BamHI(ggatccGCCGCACCGGCACAACAGAAG)和ophc2-down-XhoI(ctcgagTCAGC GGTCGCTACGGATCGG)為引物擴(kuò)增獲得全長的ophc2基因；同時(shí)，以pET30a(+)-mph質(zhì)粒為模板，mph-up-BamHI(ggatccGCTGCTCCACAAGTTAGAACTTC)和mph-down-XhoI(ctcgagTTACTTTGGGTTAACGACGG)為引物，擴(kuò)增獲得全長的mph基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收試劑盒回收，最終回收產(chǎn)物的濃度應(yīng)達(dá)到30ng/μl?；厥盏漠a(chǎn)物用Dnase I進(jìn)行酶切消化，50μl體系：2U/mL DNaseI；約800ng回收DNA(ophc2和mph各400ng)；25℃酶切30min，75℃處理10min滅活Dnase I。酶切后的50-100bp的小片段DNA以低熔點(diǎn)膠法進(jìn)行回收，回收片段進(jìn)行無引物PCR。

50μl PCR反應(yīng)體系如下：

PCR程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30sec；45℃30sec；72℃1.5min；45個(gè)循環(huán)72℃10min。

再以上述無引物PCR產(chǎn)物為模板，加入引物(ophc2-up-SnaBI GACC TACGTAGCCGCACCGGCACAACAGAAG和mph-down-NotI ATAAGAATGCGGCCGCTTACTTTGGGTTAACGA CGG，)進(jìn)行有引物PCR。PCR程序?yàn)椋?4℃5min，1個(gè)循環(huán)，94℃30SeC 50℃30sec 72℃1min，30個(gè)循環(huán)，72℃10min。將900bp左右的PCR產(chǎn)物以回收試劑盒回收。

2.2構(gòu)建大腸桿菌突變體庫

將回收的PCR產(chǎn)物和pPIC9載體分別進(jìn)行SnaBI/NotI雙酶切，回收酶切后的片段，加入T₄連接酶進(jìn)行連接，連接體系如下：突變基因6μL，pPIC92μL，10×T₄DNA Ligase Buffer 1μL，T₄DNA Ligase 1μL，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌克隆菌株Top10。轉(zhuǎn)化后平板中長出的單克隆菌株經(jīng)37℃、200rpm震蕩培養(yǎng)10-12h，轉(zhuǎn)化所得菌株經(jīng)過質(zhì)粒提取，酶切鑒定，確定菌株的陽性率為62.5％。

2.3酵母突變體庫的建立

提取大腸突變體庫的混合質(zhì)粒，保證質(zhì)粒的量達(dá)到5-10μg。利用Bgl II，37℃酶切5h后將質(zhì)粒DNA線性化，取8μg線性化后的DNA與100μL酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm電擊杯(BioRad)底部，電擊儀設(shè)置：電壓2.5kV，電容25μF，電阻400Ω，點(diǎn)擊結(jié)束后，立即在電擊杯中加入1mL 4℃預(yù)冷的1mol/L山梨醇，混合均勻后，取200μL涂布MD平板，吹干后，倒置在30℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2-3天可得到約500個(gè)轉(zhuǎn)化子。

2.4甲基對(duì)硫磷降解酶活性測(cè)定篩選有益突變酶

轉(zhuǎn)化子初步篩選：

(1)挑取MD平板上長出的菌落，按編號(hào)依次挑到新的MD板上；

(2)按MD平板上對(duì)應(yīng)的編號(hào)依次挑到48孔深孔培養(yǎng)板中(每孔中含500μL BMGY)，3層砂布(長超出5孔寬超出1孔)封口，蓋上蓋子，用皮筋捆緊，28℃，200rpm搖床震蕩培養(yǎng)48h；

(3)取出紗布，蓋上蓋子，用封口膜封住。將深孔培養(yǎng)板4000rpm離心10min，棄上清，再加入400μL BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基，更換新紗布，28℃，200rpm搖床震蕩培養(yǎng)48h；

(4)4000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中，進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶活性分析，從中篩選出具有酶活性的陽性重組子。

甲基對(duì)硫磷水解酶酶活性測(cè)定方法：取100μL酶液加入含有5μL10mg/mL甲基對(duì)硫磷和900μL 50mmol/L Tris-Cl(pH8.0)緩沖液的體系中，37℃保溫10min，加入1mL 10％三氯乙酸終止反應(yīng)，再加入1mL 10％Na2CO3溶液顯色，410nm測(cè)定光吸收值，計(jì)算水解產(chǎn)物對(duì)硝基酚的含量和酶的活性。

一個(gè)酶活性單位(U)定義為：在37℃，每分鐘釋放出1μmol對(duì)硝基酚所需的酶量。

2.5突變酶的序列測(cè)定及分析

采用熱堿法破碎7號(hào)畢赤酵母重組菌株，即挑取畢赤酵母菌落于試管中，微波爐加熱10min，加入NaOH溶液40uL，于熱水中煮沸10min后，取12000rpm/min離心后的上清作為PCR模板，用通用引物5’AOX和3’AOX進(jìn)行PCR。

PCR程序?yàn)椋?4℃5min；94℃40s；55℃40s；72℃30s；29個(gè)循環(huán)；72℃10min。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1產(chǎn)生甲基對(duì)硫磷降解酶有益突變菌株篩選

通過篩選500個(gè)轉(zhuǎn)化子，從中獲得30個(gè)酶活性較好的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)入復(fù)篩。

挑取初篩中30株酶活性較高的畢赤酵母菌株在搖瓶水平上進(jìn)行跟蹤誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)接種野生型MPH酵母表達(dá)菌株為對(duì)照。

首先，在45mL BMGY中培養(yǎng)48h，然后，5000rpm離心5min，棄去上清，置換成15mL BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基，從誘導(dǎo)后第24h開始取樣，每隔24h取樣一次，并補(bǔ)加甲醇至終濃度為0.5％。每次取出1mL的樣品，1，2000rpm離心5min，上清吸出備用，菌體用0.9％(m/v)的生理鹽水清洗兩次，然后用與吸出時(shí)相同體積的Tris-HCl(50mmol/L，pH 8.0)緩沖液重懸。分別測(cè)定培養(yǎng)上清中的甲基對(duì)硫磷水解酶酶活性與菌體細(xì)胞中的甲基對(duì)硫磷水解酶酶活。

通過比較發(fā)現(xiàn)，7號(hào)突變酶在酵母中表達(dá)時(shí)其分泌到上清液中的酶活性與在細(xì)胞內(nèi)酶活性比值與MPH相比顯著提高(圖1)，并且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵到96h的時(shí)候，7號(hào)的胞外活性與胞內(nèi)活性的比值可以到達(dá)2.89。同時(shí)，我們對(duì)培養(yǎng)上清樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(圖2)。發(fā)現(xiàn)7號(hào)菌株有明顯的目的條帶，這些結(jié)果均說明突變酶與野生型MPH相比在酵母上清液中分泌能力顯著增加。

3.2突變酶基因堿基序列分析

PCR產(chǎn)物在作物遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分析顯示：7號(hào)突變體基因的5’端含ophc2基因5’端的207個(gè)核苷酸，此后為mph的核酸序列，即7號(hào)突變酶的N端含OPHC2 N端的69個(gè)氨基酸。7號(hào)突變體基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的甲基對(duì)硫磷水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京森根比亞生物工程技術(shù)有限公司

<120> 甲基對(duì)硫磷降解酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用

<130> BJ-3010-150604A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 897

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 1

gccgcaccgg cacaacagaa gacccaggta ccgggctact accgtatggc actcggtgac 60

ttcgaagtca ccgctctgta tgacggctac gtcgacctgc ctgccagcct gctcaagggc 120

atcgatgaca aggacctgca atcgctgctg gctcgcatgt tcgtggcgtc ggagaaaggc 180

gtgcagactg cggtcaacgc ctacctggtc aacactggtt ccaagttggt tttggtcgac 240

actggtgctg ccggtttgtt cggaccaacc ttgggtagac ttgctgccaa cttgaaggcc 300

gctggttacc aaccagagca agttgacgag atttacatca ctcacatgca tcctgaccac 360

gttggaggtt tgatggttgg tgagcaattg gctttcccaa acgctgtcgt tagagctgac 420

caaaaggagg ccgatttctg gctttctcaa accaacttgg acaaggctcc tgacgattct 480

aaaggtttct tcaagggtgc catggcttcc cttaacccat acgttaaggc cggtaagttc 540

aagcctttct cgggtaacac tgacttggtt cctggtatta aagctttggc ctcccacgga 600

cacaccgctg gtcacactac ctacgttgtt gaatctcaag gtcaaaagct tgccttgttg 660

ggtgacttga tcttggtcgc tgctgttcaa ttcgacgatc catccgttac tagccaattg 720

gactctgact ccaagtctgc tgccgttgag agaaagaaag ctttcgctga tgccgctaag 780

ggaggttacc ttatcgctgc tgcccacttg tccttcccag gtattggtca catcagagct 840

gaaggtaagg gataccgttt cgttcctgtc aactactccg tcgttaaccc aaagtaa 897

<210> 2

<211> 298

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 2

Ala Ala Pro Ala Gln Gln Lys Thr Gln Val Pro Gly Tyr Tyr Arg Met

1 5 10 15

Ala Leu Gly Asp Phe Glu Val Thr Ala Leu Tyr Asp Gly Tyr Val Asp

20 25 30

Leu Pro Ala Ser Leu Leu Lys Gly Ile Asp Asp Lys Asp Leu Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Ala Arg Met Phe Val Ala Ser Glu Lys Gly Val Gln Thr Ala

50 55 60

Val Asn Ala Tyr Leu Val Asn Thr Gly Ser Lys Leu Val Leu Val Asp

65 70 75 80

Thr Gly Ala Ala Gly Leu Phe Gly Pro Thr Leu Gly Arg Leu Ala Ala

85 90 95

Asn Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Gln Pro Glu Gln Val Asp Glu Ile Tyr

100 105 110

Ile Thr His Met His Pro Asp His Val Gly Gly Leu Met Val Gly Glu

115 120 125

Gln Leu Ala Phe Pro Asn Ala Val Val Arg Ala Asp Gln Lys Glu Ala

130 135 140

Asp Phe Trp Leu Ser Gln Thr Asn Leu Asp Lys Ala Pro Asp Asp Ser

145 150 155 160

Lys Gly Phe Phe Lys Gly Ala Met Ala Ser Leu Asn Pro Tyr Val Lys

165 170 175

Ala Gly Lys Phe Lys Pro Phe Ser Gly Asn Thr Asp Leu Val Pro Gly

180 185 190

Ile Lys Ala Leu Ala Ser His Gly His Thr Ala Gly His Thr Thr Tyr

195 200 205

Val Val Glu Ser Gln Gly Gln Lys Leu Ala Leu Leu Gly Asp Leu Ile

210 215 220

Leu Val Ala Ala Val Gln Phe Asp Asp Pro Ser Val Thr Ser Gln Leu

225 230 235 240

Asp Ser Asp Ser Lys Ser Ala Ala Val Glu Arg Lys Lys Ala Phe Ala

245 250 255

Asp Ala Ala Lys Gly Gly Tyr Leu Ile Ala Ala Ala His Leu Ser Phe

260 265 270

Pro Gly Ile Gly His Ile Arg Ala Glu Gly Lys Gly Tyr Arg Phe Val

275 280 285

Pro Val Asn Tyr Ser Val Val Asn Pro Lys

290 295