檢測(cè)甲基對(duì)硫磷的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)甲基對(duì)硫磷(MP)的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)水果、蔬菜、農(nóng)作物等中的甲基對(duì)硫磷(MP)含量或殘留量。屬于免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]甲基對(duì)硫磷(Parath1n methyl)也叫0，0_ 二甲基_0_對(duì)硝基苯硫代磷酸酯，是一種產(chǎn)量大、應(yīng)用廣的高毒有機(jī)磷酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑，由于其毒性較高，近年來(lái)已在蔬菜水果上禁止使用。但在蔬菜生產(chǎn)中仍存在農(nóng)藥亂用、濫用的現(xiàn)象，在農(nóng)產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易、食品安全的監(jiān)督檢測(cè)中，甲基對(duì)硫磷(MP)仍然是常規(guī)檢測(cè)的重點(diǎn)。
[0003]甲基對(duì)硫磷(MP)殘留分析一般使用氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)及氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/MS)，這些方法靈敏、準(zhǔn)確，可以同時(shí)測(cè)定多種藥物，但需要昂貴的儀器，樣品前處理復(fù)雜、繁瑣費(fèi)時(shí)、檢測(cè)成本較高，而且需專(zhuān)業(yè)人員操作，很難滿(mǎn)足對(duì)樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)、批量、快速檢測(cè)的需要。因此，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單快速、適用于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控的分析方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0004]化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)是化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法結(jié)合的產(chǎn)物，因此同時(shí)具有化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)的高靈敏性和免疫分析技術(shù)的高特異性。本發(fā)明通過(guò)特有的免疫動(dòng)物制備具有高親和力、高特異性的甲基對(duì)硫磷抗體，并采用酶標(biāo)記抗體，建立一種可以檢測(cè)甲基對(duì)硫磷的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，將為水果、蔬菜、農(nóng)作物等中甲基對(duì)硫磷藥物留檢測(cè)提供新方法，本方法具有操作簡(jiǎn)便、快捷，靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明主要是利用抗原與抗體的特異性免疫反應(yīng)的基本原理來(lái)實(shí)現(xiàn)的?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法結(jié)合的產(chǎn)物，因此同時(shí)具有化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高特異性。在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，樣品中甲基對(duì)硫磷含量越高，反應(yīng)體系中發(fā)光強(qiáng)度越弱；反之，樣品中甲基對(duì)硫磷含量越少，發(fā)光強(qiáng)度越聞。
[0006]本發(fā)明是一種檢測(cè)甲基對(duì)硫磷(ΜΡ)的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于含有以下成份:
1、包被有甲基對(duì)硫磷-載體蛋白偶聯(lián)物的不透明白色酶標(biāo)板；所述甲基對(duì)硫磷-載體蛋白偶聯(lián)物是將甲基對(duì)硫磷與載體蛋白通過(guò)混合酸酐法或碳二亞胺法偶聯(lián)得到，所述載體蛋白為人血清白蛋白、牛血清白蛋白、雞蛋白蛋白、鼠血清蛋白或兔血清蛋白；
2、甲基對(duì)硫憐標(biāo)準(zhǔn)品；
3、甲基對(duì)硫磷-過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體:該成分為用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的甲基對(duì)硫磷抗體，所述甲基對(duì)硫磷抗體為單克隆抗體或多克隆抗體；
4、發(fā)光底物液:該發(fā)光底物液是以魯米諾貨異魯米諾為發(fā)光劑的化學(xué)發(fā)光底物液，分為Α液和B液保存，在使用前按1:1混合使用；其中A液位發(fā)光增強(qiáng)劑加魯米諾貨發(fā)光增強(qiáng)劑加異魯米諾，B液為過(guò)氧化氣溶液或尿素過(guò)氧化氣溶液；
5、2倍濃縮稀釋液；
6、20倍濃縮洗滌液。
[0007]本發(fā)明中，所述的不透明白色酶標(biāo)板為96孔的可拆卸或不可拆卸的不透明白色酶標(biāo)板。
[0008]本發(fā)明中，所述的甲基對(duì)硫磷(MP)標(biāo)準(zhǔn)品，由一系列不同濃度的甲基對(duì)硫磷(MP)標(biāo)準(zhǔn)品組成，濃度為0.0Γ25 ng/mL的濃度區(qū)間。
[0009]本發(fā)明中，所述的甲基對(duì)硫磷-過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體為用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的甲基對(duì)硫磷抗體，如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的甲基對(duì)硫磷抗體。
[0010]本發(fā)明中，所述的發(fā)光底物液為商品化的任一種以魯米諾貨異魯米諾為發(fā)光劑的化學(xué)發(fā)光底物液。
[0011]本發(fā)明中，所述所述2倍濃縮稀釋液，其成分為0.01mol/L, pH7.4的磷酸緩沖液、甘氨酸-HC1緩沖液或Tris-HCl緩沖液，使用前請(qǐng)按1:1稀釋(1份濃縮樣品稀釋液+1份去離子水)。
[0012]本發(fā)明中，所述20倍濃縮洗滌液，其包含0.05%吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間，使用前請(qǐng)按1:19稀釋(1份濃縮稀釋液+19份去離子水)。
[0013]本發(fā)明的甲基對(duì)硫磷(MP)的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒應(yīng)用于甲基對(duì)硫磷的檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)步驟為:
(1)預(yù)處理待測(cè)樣品，即將待測(cè)試的樣品處理為液體樣品，或者用有機(jī)溶劑提取待測(cè)樣品，氮?dú)獯蹈刹⑵鋸?fù)溶于樣品稀釋液工作液中；
(2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20?25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
(3)取包被甲基對(duì)硫磷抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/待測(cè)樣品50μ?7孔到對(duì)應(yīng)的微孔中，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品每個(gè)濃度做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)；
(4)加入甲基對(duì)硫磷抗體工作液，50μ?7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)45 min ；
(5)小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250μ?7孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)；
(6)加入發(fā)光底物液混合液(Α液與Β液在使用前按1:1混合)100μ?/孔，輕輕振蕩混勻，混合好后在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀內(nèi)檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度(RLU)；
(7)檢測(cè)結(jié)果的計(jì)算:用所獲得的標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液發(fā)光值與空白溶液的比值進(jìn)行計(jì)算。見(jiàn)下式:
相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度=RLU/RULmax 式中:
RLU=標(biāo)準(zhǔn)(或樣品)溶液的發(fā)光強(qiáng)度值；
RLUmax=空白(濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)溶液)的發(fā)光強(qiáng)度值。
[0014]將計(jì)算的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度值對(duì)應(yīng)甲基對(duì)硫磷&g/L)的自然對(duì)數(shù)作半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖。各待測(cè)樣品的甲基對(duì)硫磷濃度根據(jù)其RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出，或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)的方程計(jì)算得出。如樣品處理中有稀釋?zhuān)瑧?yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度要再乘以其稀釋倍數(shù)。即為樣本中甲基對(duì)硫磷的實(shí)際濃度。
[0015]本發(fā)明的試劑盒可用于水果、蔬菜、農(nóng)作物等樣品中甲基對(duì)硫磷的殘留量檢測(cè)。與現(xiàn)有的其它檢測(cè)甲基對(duì)硫磷殘留量的實(shí)驗(yàn)方法比較，本發(fā)明的試劑盒有以下優(yōu)點(diǎn):
(1)采用化學(xué)發(fā)光免疫法的本發(fā)明試劑盒，比色譜方法(高效液相、液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用)、毛細(xì)管電泳方法更為快速簡(jiǎn)便，所需儀器更為簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本更為低廉，同時(shí)具有高通量的特點(diǎn)；
(2)采用化學(xué)發(fā)光免疫法的本發(fā)明試劑盒，比ELISA方法更為靈敏，可以檢測(cè)出更低濃度和含量的甲基對(duì)硫磷殘留，同時(shí)線性范圍更寬；
(3)采用化學(xué)發(fā)光免疫法的本發(fā)明試劑盒，減少了二抗的使用環(huán)節(jié)，從而縮短了檢測(cè)時(shí)間；不透明白色酶標(biāo)板增加了化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀靈敏度。另外，用甲基對(duì)硫磷(MP)-載體蛋白偶聯(lián)物而非甲基對(duì)硫磷(MP)抗體來(lái)包被不透明白色酶標(biāo)板，減少了甲基對(duì)硫磷(MP)抗體的不穩(wěn)定性，保證了試劑盒的長(zhǎng)期有效性。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0017]實(shí)施例1
1、試劑盒各組分的制備
(1)甲基對(duì)硫磷半抗原的制備:將甲基對(duì)硫磷(MP)酸化，在4°C無(wú)光低溫環(huán)境中與亞硝酸鈉作用，生成含重氮基正離子的中間體。重氮化的甲基對(duì)硫磷(MP)作為半抗原，用于后面合成免疫抗原與包被抗原；
(2)甲基對(duì)硫憐-牛血清白蛋白(BSA)免疫原的制備:將甲基對(duì)硫憐與牛血清白蛋白(BSA)采用重氮化法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫抗原。
[0018]甲基對(duì)硫磷-卵血清白蛋白(0VA)包被抗原的制備:將甲基對(duì)硫磷與卵血清白蛋白(0VA)采用重氮化法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被抗原。
[0019]甲基對(duì)硫磷-過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體的制備:對(duì)6~8周齡的雌性BALB/c小鼠(體重18~20 g)，大劑量免疫方案為，首次免疫用160 μg ΜΡ-BSA與等量弗氏完全佐劑混勻，皮下注射。3周后，再用80 PgMP-BSA與等量弗氏完全佐劑混勻，皮下注射。此后每隔3周用80PgMP-BSA與等量弗氏完全佐劑混勻，腹腔注射。最后一次脾內(nèi)免疫80 PgMP-BSA作為加強(qiáng)免疫。三天后處死小鼠，取其脾臟，與骨髓瘤細(xì)胞融合。用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。通過(guò)小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞來(lái)大量制備小鼠腹水,腹水經(jīng)過(guò)過(guò)濾、離心初步純化后，采用辛酸法和親和層析法純化腹水，再經(jīng)透析得到純化的甲基對(duì)硫磷單克隆抗體。甲基對(duì)硫磷單克隆抗體與辣根過(guò)氧化物