本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的成套試劑和高通量測(cè)序開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的方法。

背景技術(shù)：

RAD(restriction association site DNA)是酶切位點(diǎn)附近的DNA序列標(biāo)簽。RAD可以作為一種分子標(biāo)記應(yīng)用于基因定位，圖譜繪制等。RAD標(biāo)記的密度可以通過(guò)在分離的過(guò)程中應(yīng)用不同的內(nèi)切酶獲得。RAD標(biāo)記技術(shù)與第二代測(cè)序技術(shù)的完美結(jié)合，能夠快速而且高通量的實(shí)現(xiàn)標(biāo)記開(kāi)發(fā)，圖譜繪制等。RAD標(biāo)記技術(shù)能夠降低基因組的復(fù)雜度，不受基因組序列有無(wú)的限制，操作簡(jiǎn)便，能夠快速的開(kāi)發(fā)出大量的分子標(biāo)記，從而廣泛應(yīng)用于群體的遺傳研究。

普通的RAD技術(shù)所使用的限制性內(nèi)切酶切割識(shí)別位點(diǎn)，對(duì)于一個(gè)給定的樣品，其核苷酸序列中含有的酶切位點(diǎn)數(shù)目是一定的，通過(guò)普通的RAD技術(shù)能夠獲得的分子標(biāo)記的數(shù)目是固定的，不能變化。而在實(shí)際的科學(xué)研究和應(yīng)用中常常需要對(duì)獲得的標(biāo)記的數(shù)目能夠自由選擇，目前急需一種可對(duì)獲得的標(biāo)記的數(shù)目能夠自由選擇的技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的成套試劑和方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的成套試劑。

本發(fā)明所提供的用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的成套試劑，由接頭A、接頭B和限制性內(nèi)切酶BcoDI組成；

所述接頭A是由正向鏈和反向鏈組成的接頭，所述接頭A的正向鏈為序列1所示的單鏈DNA，所述接頭A的反向連為在序列2的第8-26位所示單鏈DNA的5’末端添加1-10個(gè)核苷酸得到的單鏈DNA，序列2的第8-26位與序列1的第5-23位反向互補(bǔ)；

所述接頭B是由正向鏈和反向鏈組成的接頭，所述接頭B的正向鏈為序列3所示的單鏈DNA，所述接頭B的反向連為在序列4的第1-18位所示單鏈DNA的3’末端添加1-10個(gè)核苷酸得到的單鏈DNA，序列4的第1-18位與序列3的第40-57位反向互補(bǔ)。

其中，序列1、2、3和4的從第1位至最后1位的方向均為相應(yīng)單鏈DNA的從5’端至3’端的方向。

上述用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的成套試劑中，所述接頭A的反向連的序列為序列2；所述接頭B的反向鏈的序列為序列4。

上述用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的成套試劑中，所述接頭A的正向鏈從5’末端到3’末端 依次由如下部分組成：與Illumina公司的測(cè)序平臺(tái)測(cè)序序列P7相同的寡核苷酸片段和與待測(cè)DNA的3’端互補(bǔ)的粘性酶切位點(diǎn)序列；所述接頭A的反向鏈與正向鏈除了突出的粘性末端外，其余序列與正向鏈互補(bǔ)。所述接頭A的結(jié)構(gòu)如圖1所示。所述接頭A中的與Illumina公司的測(cè)序平臺(tái)測(cè)序序列p7相同的寡核苷酸片段，為序列表中序列1的第5-68位；所述接頭A中的與待測(cè)DNA的3’端互補(bǔ)的粘性酶切位點(diǎn)序列，為序列表中序列1的第1-4位。

上述用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的成套試劑中，可在所述接頭A的正向鏈5’末端進(jìn)行磷酸化修飾，具體可為將序列表中序列1的第1位脫氧核糖核苷酸進(jìn)行磷酸化修飾。

上述用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的成套試劑中，所述接頭B的正向鏈從5’末端到3’末端依次由如下部分組成：與Illumina公司的測(cè)序平臺(tái)測(cè)序序列P5相同的寡核苷酸片段和與待測(cè)DNA的3’端互補(bǔ)的一個(gè)脫氧核糖核苷酸突出末端；所述接頭B的反向鏈與正向鏈的一部分序列互補(bǔ)并在5’末端進(jìn)行磷酸化修飾。接頭B的結(jié)構(gòu)如圖2所示。所述接頭B的與Illumina公司的測(cè)序平臺(tái)測(cè)序序列P5相同的寡核苷酸片段，為序列表中序列3的第1-57位；所述接頭B的與待測(cè)DNA的3’端互補(bǔ)的一個(gè)脫氧核糖核苷酸為序列表中序列3的第58位。

上述用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的成套試劑中，可在所述接頭B的反向鏈5’末端進(jìn)行磷酸化修飾，具體可為將序列表中序列4的第1位的脫氧核糖核苷酸進(jìn)行磷酸化修飾。

上述用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的成套試劑中，限制性內(nèi)切酶BcoDI、所述接頭A和所述接頭B均可獨(dú)立包裝。所述接頭A和所述接頭B的比例可為1:1。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的成套接頭。

本發(fā)明所提供的用于高通量測(cè)序的成套接頭，由所述接頭A和所述接頭B組成。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了所述接頭A。

其中，所述接頭A的正向鏈中，序列1的第1-4位可不為aatt。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的系統(tǒng)。

本發(fā)明所提供的用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的系統(tǒng)，包括所述成套試劑和用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的其他試劑和/或儀器。

上述系統(tǒng)中，所述用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的其他試劑和儀器可為進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切、進(jìn)行DNA連接、對(duì)含有粘性末端的DNA片段進(jìn)行末端補(bǔ)平、對(duì)DNA片段加dATP、進(jìn)行PCR擴(kuò)增、進(jìn)行DNA純化所需的試劑、打碎DNA、DNA定量和/或進(jìn)行高通量測(cè)序所需的試劑和儀器。

上述系統(tǒng)中，所述用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的其他試劑可為由序列5所示的單鏈DNA和序列6所示的單鏈DNA組成的引物對(duì)。

上述系統(tǒng)中，所述用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的儀器可為Illumina測(cè)序平臺(tái)，如Illumina 公司的二代測(cè)序平臺(tái)或Illumina Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了高通量測(cè)序開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的方法。

本發(fā)明所提供的高通量測(cè)序開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的方法，包括：將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶BcoD I進(jìn)行酶切后，分步連接所述接頭A和所述接頭B，構(gòu)建DNA文庫(kù)；對(duì)所述DNA文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記。

上述方法具體可包括如下1)-5)：

1)將用于標(biāo)記開(kāi)發(fā)的所述基因組DNA用限制性內(nèi)切酶BcoDI消化，得到消化產(chǎn)物，將所述接頭A與所述消化產(chǎn)物連接，得到含有接頭A的連接產(chǎn)物；

2)將步驟1)得到的連接產(chǎn)物打碎為300-700bp的DNA片段，得到打碎產(chǎn)物；

3)對(duì)步驟2)得到的打碎產(chǎn)物依次進(jìn)行末端補(bǔ)平、加dATP和連接所述接頭B，得到含有接頭B的連接產(chǎn)物；

4)對(duì)步驟3)得到的連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；

5)進(jìn)行生物信息分析后，確定遺傳標(biāo)記(酶切位點(diǎn)SNP或INDEL等標(biāo)記)。

上述方法的流程圖如圖3所示。

上述方法中，步驟2)還可包括對(duì)所述打碎產(chǎn)物進(jìn)行純化。

上述方法中，步驟3)還可包括對(duì)所述含有接頭B的連接產(chǎn)物進(jìn)行純化。

上述方法中，步驟4)還可包括對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。

上述方法步驟1)中，所述將基因組DNA消化的酶切體系包括：酶切緩沖液、限制性內(nèi)切酶、0.1—1μg的基因組DNA，所述限制性內(nèi)切酶在酶切體系中的濃度為0.5U/μl；所述的連接體系包括：所述消化產(chǎn)物、所述接頭A、ATP、連接酶，所述接頭A的濃度為100nM，所述的ATP的濃度為1mM，所述連接酶在所述連接體系中的濃度為0.5U/μl。

上述方法步驟2)中，所述打碎可用covaris打碎儀器進(jìn)行，所述打碎的條件可為使用covaris打碎儀器調(diào)整的相應(yīng)的參數(shù)。

上述方法步驟3)中，所述的回收打碎產(chǎn)物的方法為采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒進(jìn)行回收；所述的末端補(bǔ)平體系為使用NEB公司的Quick Blunting kit進(jìn)行；所述的加dATP的體系包括：dATP，加A緩沖液，加dATP的聚合酶，所述的dATP的濃度為5mM，所述的聚合酶在所述的反應(yīng)體系中的濃度為0.5U/μl；所述的接頭B的連接體系包括：接頭B、ATP和連接酶，所述的接頭B的濃度為10μM，所述的ATP的濃度為1mM，所述連接酶在所述連接體系中的濃度為0.5U/μl。

上述方法步驟4)中，所述的PCR擴(kuò)增體系包括：所述引物對(duì)，聚合酶混合物，以及步驟3)中得到的連接產(chǎn)物。所述引物對(duì)每條引物的濃度為0.2μM，所述聚合酶 混合物在所述PCR體系中所占的50％的體積。

上述方法中，所述基因組DNA為任何單倍體或二倍體材料的DNA，如動(dòng)物、植物、微生物等。所述植物具體可為擬南芥。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了下述X1或X2的應(yīng)用：

X1、所述成套試劑、所述成套接頭、所述接頭A或所述系統(tǒng)在開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記中的應(yīng)用；

X2、所述成套試劑、所述成套接頭、所述接頭A、所述系統(tǒng)或所述方法在分子育種中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記可為開(kāi)發(fā)動(dòng)物、植物或微生物的遺傳標(biāo)記；所述分子育種可為動(dòng)物或植物分子育種。

本發(fā)明中，所述限制性內(nèi)切酶BcoDI具體可為NEB產(chǎn)品。

本發(fā)明提出了基于使用異位切割限制性內(nèi)切酶的SRAD(selective restriction association site DNA)技術(shù)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的用于高通量測(cè)序的成套試劑中的接頭A和接頭B，能夠連接到DNA片段的兩端，運(yùn)用本發(fā)明的用于高通量測(cè)序的成套試劑以及建庫(kù)方法，成功的構(gòu)建了DNA文庫(kù)，并成功的運(yùn)用在Illumina公司的二代測(cè)序的測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，獲得大量的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)；同時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣本的混合建庫(kù)，根據(jù)需要調(diào)整獲取的遺傳標(biāo)記的數(shù)目。本發(fā)明提供的用于高通量測(cè)序的成套試劑以及建庫(kù)方法在居群遺傳、圖譜繪制、種質(zhì)評(píng)價(jià)和鑒定等研究和應(yīng)用領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為接頭A的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為接頭B的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3為建庫(kù)流程示意圖。

圖4為基因組DNA酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，泳道CK為酶切前的基因組DNA，泳道BcoDI為酶切后的產(chǎn)物。

圖5為對(duì)酶切基因組DNA產(chǎn)物加上接頭A之后的打碎產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。左圖為切膠回收前，右圖為切膠回收后。

圖6為對(duì)加上接頭B的連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中所用核苷酸序列均由上海Invitrogen生物公司合成。所用試劑如無(wú)特別說(shuō)明均為NEB公司的產(chǎn)品，所用水均為超純水。

實(shí)施例1、用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的成套試劑在開(kāi)發(fā)擬南芥遺傳標(biāo)記中的應(yīng)用

用于開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記的成套試劑，由接頭A、接頭B和限制性內(nèi)切酶BcoDI組成，所述接頭A由序列1所示的單鏈DNA和序列2所示的單鏈DNA組成，所述接頭B由序列3所示的單鏈DNA和序列4所示的單鏈DNA組成。

1、基因組DNA的酶切和接頭A的連接

1)樣品濃度測(cè)定

提取擬南芥基因組DNA，使用Qubit(美國(guó))對(duì)樣品DNA濃度測(cè)定，進(jìn)行精準(zhǔn)定量，并使用0.8％瓊脂糖凝膠，120v電壓，電泳1小時(shí)，檢測(cè)樣品質(zhì)量，確保擬南芥基因組DNA樣品完整無(wú)降解。

2)以步驟1)檢測(cè)的擬南芥基因組DNA 100ng-1μg為模板進(jìn)行限制性酶切。

反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：樣品DNA(150-250ng/μl)0.1-1μg，Restriction Enzyme(BcoDI)1μl，10×NEB Buffer 25μl，補(bǔ)加H₂O至總體積為50μl，將上述混合液37℃處理15min-2h后，65℃處理20min。取出10μl進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，酶切充分，得到均勻彌散的條帶，如附圖4，泳道M為trans15k marker，CK為沒(méi)有被酶切的DNA作為對(duì)照，BcoDI為酶切產(chǎn)物的泳道。

3)接頭A的連接

在步驟2)得到的消化產(chǎn)物中，補(bǔ)加ATP，T4連接酶，連接緩沖液以及接頭A，在室溫連接。具體的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：步驟2)中的消化產(chǎn)物50μl，100mM ATP1μl，10×NEB Buffer 21μl，(1000u)T4DNA Ligase 0.5μl，加H₂O 5μl，100nM Adaptor12.5μl，總共60μl，室溫(或16℃)下連接2h；連接產(chǎn)物65℃20min，連接酶活性失活。

2、連接產(chǎn)物的隨機(jī)打碎，補(bǔ)平，加dATP

1)將步驟1中得到的連接產(chǎn)物使用covaris(美國(guó))破碎至300-700bp，使用Qiagen PCR試劑盒回收打碎產(chǎn)物，具體步驟按照Qiagen試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。

2)對(duì)上述回收產(chǎn)物進(jìn)行末端補(bǔ)平。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：打碎產(chǎn)物DNA 30μl，10×Blunting Buffer 5μl，1mM dNTP 10μl，Quick Blunting kit Enzyme Mix，1μl，加H₂O 9μl，總體系50μl；反應(yīng)條件：30℃孵育30min。

3)對(duì)步驟2)的補(bǔ)平產(chǎn)物進(jìn)行純化：將上述產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，純化目的片段。1.0％瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收300-700bp范圍的條帶。整個(gè)回收過(guò)程按照Qiagen膠回收試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。如附圖5。泳道M為trans100bpladder marker，泳道1為補(bǔ) 平產(chǎn)物的電泳泳道。

4)對(duì)步驟3)中的純化產(chǎn)物進(jìn)行加dATP，反應(yīng)體系和條件如下：步驟3)中的補(bǔ)平產(chǎn)物22μl，100mM dATP 1μl，10×NEB Buffer 23μl，Klenow exo^-(NEB)(50，000units/ml)0.3μl，H₂O 3.7μl，總體積30μl；反應(yīng)條件：充分混勻，37℃孵育30min，75℃20min熱失活。

3、接頭B的連接

1)將步驟2中4)的連接產(chǎn)物，加入接頭B，反應(yīng)體系和條件具體如下:步驟2中4)的連接產(chǎn)物30μl，NEB Buffer 22μl，10μM接頭B 2.5μl，(1000u)T4DNA Ligase 0.5μl，加H₂O 15μl，總體積50μl，室溫(或16℃)下連接2小時(shí)，連接產(chǎn)物65℃20min，連接酶活性失活。

2)將步驟1)中的連接產(chǎn)物等體積AMPure XP Beads純化1次。純化過(guò)程嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書進(jìn)行。

3)將步驟2)中的回收產(chǎn)物進(jìn)行Qubit定量，用于下一步PCR反應(yīng)。

4、PCR擴(kuò)增目的片段

1)將步驟3中回收的產(chǎn)物，精準(zhǔn)定量10ng用于PCR反應(yīng)，得到的PCR產(chǎn)物，即為所構(gòu)建的文庫(kù)。反應(yīng)體系和條件如下：DNA樣品3μl，PCR Primer 11μl，PCR Primer 21μl，2×Phusion PCR Master Mix 25μl，H₂O 20μl，總共50μl，應(yīng)條件為：先98℃預(yù)變性1min；然后98℃10s，60℃30s，72℃30s，共10個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。Primer 1的序列為5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’(序列表中序列5)；Primer 2的序列為5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’(序列表中序列6)。

2)將步驟1)中的PCR產(chǎn)物等體積AMPure XP Beads純化兩次。純化過(guò)程嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書進(jìn)行。取出1μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，得到300—700富集的條帶，如附圖6，泳道M為trans100bpladder marker，泳道1為PCR產(chǎn)物的電泳泳道。

3)將步驟2)中的純化產(chǎn)物進(jìn)行Qμbit精準(zhǔn)定量。

5、文庫(kù)庫(kù)檢和上機(jī)

1)將步驟4中所得的純化產(chǎn)物稀釋到1ng/μl，取出1μl用于Agilent2100(美國(guó)Agilent公司)檢測(cè)，另外再取1μl用于QPCR(Biorad公司)檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，決定上機(jī)濃度。

2)根據(jù)步驟1)所得的濃度，將文庫(kù)稀釋到上機(jī)要求后，在Illumina公司的二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

6、測(cè)序結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

1)對(duì)擬南芥基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行BcoDI酶切位點(diǎn)分析，共192,332個(gè)；

2)對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)100M過(guò)濾出有酶切位點(diǎn)的reads，再將PEreads用BWA比對(duì)到擬南芥基因組上，所有數(shù)據(jù)含酶切位點(diǎn)的總數(shù)目為191，640個(gè)，即可以得到的遺傳標(biāo)記的數(shù)目為191，640個(gè)，有99.6％的酶切位點(diǎn)被覆蓋到。