本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地涉及一種低氧輔助熱療殺滅腫瘤細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

活性氧自由基（ROS）是需氧細(xì)胞在代謝過(guò)程中產(chǎn)生一系列活性氧簇。研究發(fā)現(xiàn)ROS 可雙向調(diào)控某些腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖。其中，濃度的ROS能夠影響細(xì)胞的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。機(jī)體內(nèi)的自由基通過(guò)其濃度調(diào)節(jié)著機(jī)體細(xì)胞的生死平衡，除了引起細(xì)胞凋亡、壞死的功能，低濃度的ROS 更廣泛的生理意義在于其對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的激活以及對(duì)細(xì)胞增殖、分化的促進(jìn)。但是中、高濃度的ROS通過(guò)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死。另外，許多的重要細(xì)胞活動(dòng)都與ROS的存在有所關(guān)聯(lián)，其中包括基因表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子活動(dòng)，細(xì)胞增殖等。但是，過(guò)量的產(chǎn)生活性氧自由基會(huì)激活導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡的細(xì)胞活動(dòng)。此外，也曾有報(bào)道顯示，細(xì)胞缺氧處理往往伴隨著活性氧自由基的產(chǎn)生。特別是，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境是有超過(guò)一般細(xì)胞的ROS含量。但是這種ROS含量不足以殺死腫瘤細(xì)胞，甚至對(duì)腫瘤細(xì)胞有增值的作用。更為重要的是，腫瘤的低氧環(huán)境對(duì)放化療有免疫作用，降低了放化療的效果。因此，開發(fā)針對(duì)低氧環(huán)境的治療手段具有重要的研究?jī)r(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供一種低氧環(huán)境殺滅腫瘤細(xì)胞的方法，該方法將腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境中培養(yǎng)一定時(shí)間后，通過(guò)激光照射加熱細(xì)胞，從而殺滅腫瘤細(xì)胞。該方法操作簡(jiǎn)單，適合大規(guī)模推廣。

為了實(shí)現(xiàn)這樣的目的，在本發(fā)明的技術(shù)方案中，首先將腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境中培養(yǎng)，然后通過(guò)激光器照射腫瘤細(xì)胞，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞的生存狀態(tài)。

本發(fā)明的方法包括如下步驟：

一種低氧輔助熱療殺滅腫瘤細(xì)胞的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

（1）取腫瘤細(xì)胞凍存液若干，復(fù)蘇后加入1ml，DMEM培養(yǎng)基，各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基，在1000轉(zhuǎn)/min的速率下離心3-5分鐘后，倒掉上清液，再加入1ml新鮮培養(yǎng)基，吹打均勻后轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基5-6ml，將培養(yǎng)瓶放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

（2）在培養(yǎng)箱孵育24小時(shí)后，待細(xì)胞完全貼壁后，再將貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)移至低氧濃度的三氣培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間，將細(xì)胞取出，然后用激光器照射細(xì)胞一段時(shí)間；

（3）照射后，吸出多余的培養(yǎng)基，加入100微升10%的2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽（CCK-8）試劑，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2-4小時(shí)后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度。

所述的步驟（2）中，低氧濃度為0.5%-20%。

所述的步驟（2）中，培養(yǎng)時(shí)間為4-48小時(shí)。

所述的步驟2中，激光器波長(zhǎng)為780-980 nm。

所述的步驟（2）中，輻照時(shí)間為5-15分鐘。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：（1）腫瘤本身就處于低氧環(huán)境，再進(jìn)行低氧處理能有效降低腫瘤細(xì)胞的生存能力，使其達(dá)到凋亡或者死亡的臨界。（2）低氧處理后的腫瘤細(xì)胞再熱療時(shí)，能降低熱療的時(shí)間，達(dá)到快速殺滅的效果，降低了正常細(xì)胞的損傷幾率。本發(fā)明不添加外來(lái)物質(zhì)，生物安全性高、毒性小，方法簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

1.取腫瘤細(xì)胞凍存液若干，復(fù)蘇后加入1ml，DMEM培養(yǎng)基，在1000轉(zhuǎn)/min的速率下離心3分鐘后，倒掉上清液，再加入1ml新鮮培養(yǎng)基，吹打均勻后轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基5 ml，將培養(yǎng)瓶放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.在培養(yǎng)箱孵育24小時(shí)后，待細(xì)胞完全貼壁后，再將貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1%濃度的三氣培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。將細(xì)胞取出，然后用980 nm激光器照射細(xì)胞5分鐘。

3.照射后，吸出多余的培養(yǎng)基，加入100μ10%的CCK-8試劑，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2-4小時(shí)后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度。

檢測(cè)結(jié)果：OD值=0.65。

實(shí)施例2

1.取腫瘤細(xì)胞凍存液若干，復(fù)蘇后加入1ml，DMEM培養(yǎng)基，在1000轉(zhuǎn)/min的速率下離心3分鐘后，倒掉上清液，再加入1ml新鮮培養(yǎng)基，吹打均勻后轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基6 ml，將培養(yǎng)瓶放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.在培養(yǎng)箱孵育24小時(shí)后，待細(xì)胞完全貼壁后，再將貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1%濃度的三氣培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。將細(xì)胞取出，然后用980 nm激光器照射細(xì)胞10分鐘。

3.照射后，吸出多余的培養(yǎng)基，加入100μ10%的CCK-8試劑，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2-4小時(shí)后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度。

檢測(cè)結(jié)果：OD值=0.32。

實(shí)施例3

1.取腫瘤細(xì)胞凍存液若干，復(fù)蘇后加入1ml，DMEM培養(yǎng)基，在1000轉(zhuǎn)/min的速率下離心5分鐘后，倒掉上清液，再加入1ml新鮮培養(yǎng)基，吹打均勻后轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基6 ml，將培養(yǎng)瓶放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.在培養(yǎng)箱孵育24小時(shí)后，待細(xì)胞完全貼壁后，再將貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)移至5%濃度的三氣培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。將細(xì)胞取出，然后用780 nm激光器照射細(xì)胞10分鐘。

3.照射后，吸出多余的培養(yǎng)基，加入100μ10%的CCK-8試劑，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2-4小時(shí)后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度。

檢測(cè)結(jié)果：OD值=0.26。

實(shí)施例4

1.取腫瘤細(xì)胞凍存液若干，復(fù)蘇后加入1ml，DMEM培養(yǎng)基，在1000轉(zhuǎn)/min的速率下離心5分鐘后，倒掉上清液，再加入1ml新鮮培養(yǎng)基，吹打均勻后轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基6 ml，將培養(yǎng)瓶放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.在培養(yǎng)箱孵育24小時(shí)后，待細(xì)胞完全貼壁后，再將貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15%濃度的三氣培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。將細(xì)胞取出，然后用780 nm激光器照射細(xì)胞10分鐘。

3.照射后，吸出多余的培養(yǎng)基，加入100μ10%的CCK-8試劑，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2-4小時(shí)后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度。

檢測(cè)結(jié)果：OD值=0.57。