本發(fā)明屬于化學技術(shù)領域，特別涉及一種多孔磁性鎳離子金屬螯合載體及利用該載體固定化酶。

背景技術(shù)：

磁性高分子微球是指通過適當方法使有機高分子與磁性材料相結(jié)合所形成的具有一定磁性和特殊結(jié)構(gòu)的微球。這種磁性載體具有兩個顯著的特點：一是它的超順磁性，即在磁場存在時顯示出磁性，當磁場撤走時磁性又迅速消失；二是具有高分子粒子的特性，可以對其表面進行化學修飾從而賦予其表面多種功能團(如-OH、-COOH、-NH₂等)。與非磁性材料相比，經(jīng)磁性材料制得的固定化酶可以穩(wěn)定的分散于水中進行催化反應，并通過外加磁場來控制其在底物中的運動方向和方式，進行連續(xù)反應，這不僅進一步提高了催化效率還可用于大規(guī)模生產(chǎn)，簡化分離和提純工藝，最重要的是通過此方法制得的固定化酶可以回收重復利用，大大降低生產(chǎn)成本。

金屬螯合親和層析(Immobilized metal affinity chromatography，IMAC)是近三十年發(fā)展起來的一項十分常用的分離技術(shù)。其原理是金屬鰲合配體與蛋白質(zhì)表面的供電子氨基酸：氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰醇基、色氨酸的吲哚基等(其中以組氨酸最為重要)以配位作用緊密結(jié)合，達到對蛋白質(zhì)進行分離和純化的目的。金屬螯合磁性載體含有非?；顫姷挠H電子離子，可以不需連接劑活化，能在特定溫度與酶分子反應形成配位鍵，在較溫和的條件下使酶固定化，減少了固定化過程中酶活力的損失。一方面載體具有親水性可以穩(wěn)定地分散于水中進行催化反應；另一方面利用載體的磁響應性特點，能在外加磁場下輕易地將酶從反應體系中分離出來。通過此技術(shù)制得的固定化酶載體，能夠克服傳統(tǒng)的固定化載體和固定化方法中的某些不足。

大豆分離蛋白是以低溫脫溶大豆粕為原料生產(chǎn)的一種全價蛋白類食品添加劑。其蛋白質(zhì)含量在90％以上，氨基酸種類有近20種，并含有人體必需氨基酸。為了充分利用蛋白質(zhì)資源，對蛋白質(zhì)進行水解是十分有必要的。

但目前尚沒有穩(wěn)定合適的載體來固定化酶，在大豆蛋白的分離水解中達到很好的反映效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對以上缺點，提供了一種環(huán)氧基密度高，結(jié)構(gòu)合理的磁性載體，以達到利用該載體固定化酶，酶的催化效率高的目的。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取下述技術(shù)方案來實現(xiàn)：

本發(fā)明提供一種多孔磁性鎳離子金屬螯合載體，所述載體為以殼聚糖粉末為原料，F(xiàn)e₃O₄作為磁性材料，SiO₂為致孔劑，環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑進行反應，合成多孔磁性殼聚糖微球；多孔磁性殼聚糖微球以環(huán)氧氯丙烷為活化劑，以羧甲基化天冬氨酸為螯合配基，再與過渡態(tài)的金屬鎳離子進行螯合，制備得到的多孔磁性鎳離子金屬螯合載體。

本發(fā)明還提供一種多孔磁性鎳離子金屬螯合載體的制備方法，所述方法以殼聚糖粉末為原料，F(xiàn)e₃O₄作為磁性材料，SiO₂為致孔劑，環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑進行反應，合成多孔磁性殼聚糖微球；然后，以環(huán)氧氯丙烷為活化劑，以羧甲基化天冬氨酸為螯合配基，再與過渡態(tài)的金屬鎳離子進行螯合，制備得到多孔磁性鎳離子金屬螯合載體。

進一步，所述制備方法包括以下步驟：

步驟a，多孔磁性殼聚糖微球載體的制備，向殼聚糖粉末中，加入乙酸溶液，室溫下緩慢攪拌至殼聚糖完全溶解后；加入納米Fe₃O₄，攪拌至均勻，加入致孔劑SiO₂，攪拌幾分鐘后，加入液體石蠟，攪拌后升溫至50℃，滴加Span80作為乳化劑，乳化至形成殼聚糖液滴，隨后升溫70℃至溫度恒定，調(diào)節(jié)溶液pH值為9-11，保持為堿性，緩慢的逐滴滴加環(huán)氧氯丙烷進行反應；反應后對產(chǎn)物進行洗滌，直至pH值為中性，然后加入NaOH的溶液，80℃的加熱2h，停止加熱后，反復使用蒸餾水進行洗滌，再用稀鹽酸洗滌一次，最后蒸餾水洗至中性，得到多孔磁性殼聚糖微球載體，烘干后備用；

步驟b，多孔磁性殼聚糖微球載體的活化，向步驟a中制得的多孔磁性殼聚糖微球中，加入NaOH溶液和環(huán)氧氯丙烷，以及二甲亞砜和硼氫化鈉，在40℃的恒溫反應4h；活化反應后，用去離子水洗滌，去除未反應的環(huán)氧氯丙烷和氫氧化鈉；

步驟c，多孔磁性鎳離子金屬螯合載體的制備，向活化好的多孔磁性殼聚糖微球載體中，加入pH值為11的天冬氨酸水溶液，80℃恒溫反應4h，得到連接上天冬氨酸的多孔磁性殼聚糖微球；然后將連接上天冬氨酸的多孔磁性殼聚糖微球分散入由NaOH，水，溴乙酸及Na₂CO₃組成的pH值為10的溶液中，室溫攪拌10h后濾出殼聚糖微球羧甲基化的天冬氨酸多孔磁性殼聚糖微球，分散于NiCl₂溶液中，25℃恒溫反應24h得到多孔磁性鎳離子金屬螯合載體。

進一步，步驟a中乙酸溶液的質(zhì)量分數(shù)為4％。

進一步，步驟b中二甲基亞砜的體積分數(shù)為6％。

進一步，步驟b中氫氧化鈉溶液的濃度為0.6mol/L。

進一步，步驟b中環(huán)氧氯丙烷的體積分數(shù)為45％。

本發(fā)明還提供一種利用多孔磁性鎳離子金屬螯合載體固定化木瓜酶的方法，向多孔磁性鎳離子金屬螯合載體中，加入木瓜蛋白酶溶液，室溫下振蕩4h，用PBS洗滌數(shù)次至上清中檢測不到酶活，得到固定化的木瓜蛋白酶。

本發(fā)明還提供一種利用上述方法制得的固定化木瓜酶在大豆分離蛋白水解中的應用。

進一步，所述應用為將大豆分離蛋白溶于水中，形成底物濃度為4％的水分散液，在80℃水浴鍋中保溫20min。迅速冷卻至酶解溫度，攪拌30min，調(diào)節(jié)pH至8，按底物比例加入6000-9000U/g的固定化木瓜蛋白酶，緩慢攪拌反應至少4h。

總之，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的載體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，利用此載體制得的固定化酶催化效率高，還可用于大規(guī)模生產(chǎn)，制得的固定化酶可以回收重復利用，大大降低生產(chǎn)成本，同時本發(fā)明利用該載體制得的固定化木瓜酶在大豆蛋白的分離水解中效果很好。

附圖說明

圖1是二甲基亞砜對環(huán)氧基密度的影響。

圖2是反應溫度對環(huán)氧基密度的影響。

圖3是反應時間對環(huán)氧基密度的影響。

圖4是環(huán)氧氯丙烷體積分數(shù)對環(huán)氧基密度的影響。

圖5是NaOH溶液濃度對環(huán)氧基密度的影響。

圖6是溫度對木瓜蛋白酶固定化的影響。

圖7是給酶量對木瓜蛋白酶固定化的影響。

圖8是pH對木瓜蛋白酶固定化的影響。

圖9是固定化時間對酶固定化的影響。

圖10是溫度對水解度的影響。

圖11是pH對水解度的影響。

圖12是時間對水解度的影響。

圖13是底物濃度對水解度的影響。

圖14是給酶量對水解度的影響。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進行詳細描述。

一、多孔磁性鎳離子金屬螯合載體的制備

1.多孔磁性殼聚糖微球載體(PCMM)的制備

稱取1g的殼聚糖粉末于250mL的四頸瓶中，加入25mL的質(zhì)量分數(shù)為4％的乙酸溶液，室溫下緩慢攪拌至殼聚糖完全溶解后，加入0.3g納米Fe₃O₄，攪拌至均勻，加入致孔劑SiO₂，攪拌幾分鐘后，加入100mL的液體石蠟，打開攪拌器(300r/min)，攪拌一段時間后升溫至50℃，滴加幾滴Span80作為乳化劑，乳化一定的時間，直至形成細小的殼聚糖液滴，隨后升溫70℃至溫度恒定，滴加2mol/L的NaOH溶液，使溶液pH調(diào)至9-11的范圍，保持為堿性，緩慢的逐滴滴加4mL的環(huán)氧氯丙烷(ECH)。反應5h后，停止反應，待溫度冷卻到室溫，再依次用石油醚、無水乙醇、丙酮洗滌多次，最后用蒸餾水反復洗至pH值為中性。加入適量的質(zhì)量分數(shù)10％NaOH的溶液，放入80℃的水浴鍋中，加熱2h，停止加熱后，反復使用蒸餾水進行洗滌，再用適量的稀鹽酸洗滌一次，最后蒸餾水洗至中性。將制得的多孔磁性殼聚糖微球(PCMM)放于50℃的真空干燥箱中至恒重、備用。

2.多孔磁性殼聚糖微球(PCMM)活化工藝研究

稱取0.5g多孔磁性殼聚糖微球(PCMM)放入錐形瓶中，加入適量的1mol/L的NaOH溶液和一定量的體積分數(shù)45％的環(huán)氧氯丙烷(ECH)，以及適量的體積分數(shù)為6％的二甲亞砜(DMSO)和一定量的硼氫化鈉，在40℃的恒溫水浴搖床中反應4h。

PCMM經(jīng)活化反應后，用大量的去離子水進行洗滌，去除未反應的環(huán)氧氯丙烷和氫氧化鈉。洗滌液中殘留的環(huán)氧基和氫氧根用以下方法進行檢測：量取約2mL洗滌液，加入1滴酚酞指示劑，振蕩后溶液不變紅，則氫氧根已清洗干凈；量取約2mL洗滌液，加入1滴酚酞指示劑，再加入2mL 1.3mol/L硫代硫酸鈉溶液，劇烈振蕩后溶液不變紅，則表明殘留的環(huán)氧基已被清洗干凈。

2.1多孔磁性殼聚糖微球(PCMM)環(huán)氧基活化密度的測定

多孔磁性殼聚糖微球(PCMM)的環(huán)氧基活化密度通常采用硫代硫酸鈉滴定法測定，將活化好的微球用布氏漏斗抽干，稱取0.5g的微球于25mL的錐形瓶中，并加入適量的1.3mol/L硫代硫酸鈉和酚酞指示劑1-2滴，在室溫下放在恒溫震蕩器中反應0.5h，再用鹽酸標準溶液(0.1mol/L)進行滴定，直至溶液由紅色變?yōu)闊o色，停止滴定，并記錄滴定前后消耗的鹽酸標準溶液的體積。根據(jù)環(huán)氧基與硫代硫酸鈉反應并釋放出OH^-，以標準HCl溶液中和滴定OH^-，即可得出每克多孔磁性殼聚糖微球(PCMM)上包含的環(huán)氧基的量，即環(huán)氧基密度。環(huán)氧基活化密度計算公式如下：

式中：

S-環(huán)氧基修飾密度，mmol·g^-1；

C_HCl-標準HCl溶液濃度，mol.L^-1；

V_a-滴定前標準HCl的體積，mL；

V_b-滴定后標準HCl的體積，mL；

M-活化微球質(zhì)量，g。

2.2多孔磁性殼聚糖微球(PCMM)最佳活化工藝條件的確定

(1)二甲基亞砜(DMSO)體積分數(shù)對微球環(huán)氧基活化密度的影響

固定活化溫度30℃，NaOH溶液濃度為0.4mol·L^-1，環(huán)氧氯丙烷(ECH)體積分數(shù)35％，活化反應時間3h，按上述方法活化后計算環(huán)氧基密度值，結(jié)果如圖1所示PCMM活化反應的最佳二甲基亞砜的體積分數(shù)為6％。

(2)反應溫度對微球環(huán)氧基活化密度的影響

固定環(huán)氧氯丙烷體積分數(shù)為35％，二甲亞砜(DMSO)體積分數(shù)6％，活化時間為3h，NaOH溶液濃度為0.4mol·L^-1，測定方法同上，如圖2所示PCMM活化反應的最佳溫度為40℃。

(3)活化時間對微球環(huán)氧基活化密度的影響

固定活化溫度40℃，環(huán)氧氯丙烷(ECH)體積分數(shù)為35％，二甲亞砜(DMSO)體積分數(shù)6％，NaOH溶液濃度為0.4mol·L^-1，測定方法同上，結(jié)果如圖3所示PCMM活化反應的最佳時間為4h。

(4)環(huán)氧氯丙烷體積分數(shù)對微球環(huán)氧基活化密度的影響

固定活化溫度40℃，NaOH溶液濃度為0.6mol·L^-1，二甲亞砜(DMSO)體積分數(shù)4％，活化反應時間4h，測定方法同上，結(jié)果如圖4所示定PCMM活化反應的最佳環(huán)氧氯丙烷體積分數(shù)為45％。

(5)氫氧化鈉溶液濃度對微球環(huán)氧基活化密度的影響

固定活化溫度40℃，環(huán)氧氯丙烷(ECH)體積分數(shù)為45％，二甲亞砜(DMSO)體積分數(shù)6％，活化反應時間4h，測定方法同上，結(jié)果如圖5所示PCMM活化反應的最佳NaOH溶液濃度為0.6mol·L^-1。

選取上述最優(yōu)條件活化后的多孔磁性殼聚糖微球(PCMM)表面上的環(huán)氧基密度最高0.268mmol·g^-1。

3.PCMM-CM-Asp-Ni²⁺金屬螯合載體的制備

稱取0.5g活化好的PCMM放入100mL的四頸瓶中，在冰水浴下配置有2.15g、60mL H₂O、4.6g L-Aspartase組成的溶液，再用一定量的Na₂CO₃調(diào)制pH值為11，將其加入100mL四頸瓶中，升溫80℃轉(zhuǎn)子速度為250r/min，反應4h，冷卻至室溫，然后在抽濾漏斗上濾干，再用超純水洗數(shù)次，再用質(zhì)量分數(shù)10％的Na₂CO₃溶液洗，用漏斗過濾，抽干，即得到連接上L-Aspartase的多孔磁性殼聚糖微球。將連接完L-Aspartase的多孔磁性殼聚糖微球分散入由4.5g NaOH，60mL水，15g溴乙酸及適量Na₂CO₃組成的pH值為10的溶液中，室溫攪拌10h后濾出殼聚糖微球，依次用蒸餾水、稀鹽酸、蒸餾水洗滌多次、濾干，即得到羧甲基化的天冬氨酸多孔磁性殼聚糖微球(PCMM-CM-Asp)，放入50℃的烘箱中烘干、備用。稱取15mg的PCMM-CM-Asp分散于30mL0.5mg/mL NiCl₂溶液中，放入25℃250r/min的恒溫振蕩器反應24h。反應結(jié)束后，用大量的蒸餾水反復沖洗，即制得PCMM-CM-Asp-Ni²⁺載體。

二、固定化木瓜酶

稱取一定量的PCMM-CM-Asp-Ni²⁺多孔磁性金屬螯合載體，置于50mL的碘量瓶中，加入適量的1mg/mL的木瓜蛋白酶溶液(溶于0.1mol/L磷酸緩沖液，pH＝7.0)，室溫下振蕩4h，用0.1mol/LPBS洗滌數(shù)次至上清中檢測不到酶活，即得固定化的木瓜蛋白酶，放于4℃的冰箱中保存，備用。

固定化過程如下：

1.酶蛋白固載量的測定：

用0.1mol/L的PBS緩沖液(pH＝7.0)配制1mg/mL的木瓜蛋白酶標準液，取7支25mL的比色管并編號，按表3-1加入1mg/mL的木瓜蛋白酶標準液和蒸餾水，配制成不同濃度的木瓜蛋白酶溶液。

表3-1不同濃度的木瓜蛋白溶液

Tab.3-1 Papain solution of different concentration

用蒸餾水定容至25mL，充分搖勻，靜置10min，以0號比色管為參比，通過紫外分光光度計掃描測得其最佳波長λ為278nm。在此波長下測定吸光度OD₂₇₈。以木瓜蛋白酶濃度為橫坐標，吸光值OD₂₇₈為縱坐標，繪制木瓜蛋白酶標準曲線，得到的線性方程為y＝1.416x+0.0037(R²＝0.9999)

樣品中木瓜蛋白酶固載量的測定：酶固載量是原始加入的酶量減去剩余酶液(上清液和洗脫液的混合液)的酶量得到的。取適量的樣品待測液，在波長為278nm處用測其吸光度，通過木瓜蛋白酶溶液的標準曲線，確定待測液中的酶蛋白的濃度。根據(jù)下式計算木瓜蛋白酶的固載量Q_e：

式中，Q_e：酶固定量(mg/g)；C₀：固定前溶液中酶含量(mg/mL)；

C_e：固定后溶液中酶含量(mg/mL)；C₁：PBS洗滌液中酶含量(mg/mL)；

V₀：固定化所用酶溶液體積(mL)；V₁：所用PBS洗滌液體積(mL)；

m：用于固定化酶多孔磁性金屬螯合載體的質(zhì)量(g，干重)

2.酶活性的測定方法

游離酶活性的測定方法：將一定量的木瓜蛋白酶溶于0.1mol/L PBS(pH＝7.0)的緩沖溶液中，配成1mg/mL的酶液。在碘量瓶中加入1mL的木瓜蛋白酶溶液，再加入5mL的酶激活劑(內(nèi)含5mmol/L的L-半胱氨酸和2mmol/L乙二胺四乙酸)，在37℃水浴中，預熱10min后，再加入5mL的5％的底物酪蛋白溶液，在37℃水浴中，反應10min，然后迅速加入10mL 5％的三氯乙酸溶液(TCA)，終止反應，劇烈搖動混合均勻后，在37℃水浴中放置30min后，進行離心分離，然后用紫外分光光度計在275nm處測定吸光值，并計算木瓜蛋白酶活力。空白對照組在加入木瓜蛋白酶溶液之前，先加入10mL5％TCA，其余步驟相同。

固定化酶活力測定方法：取等當量的固定化木瓜蛋白酶加入5mL的酶激活劑(內(nèi)合5mmol/L的L-半胱氨酸和2mmol/L乙二胺四乙酸)，在37℃水浴中，預熱10min后，再加入5mL的5％的底物酪蛋白溶液，在37℃水浴中，反應10min，然后迅速加入10mL 5％的三氯乙酸溶液(TCA)，終止反應，劇烈搖動混合均勻后，在37℃水浴中放置30min后，進行離心分離，然后用紫外分光光度計在275nm處測定吸光值，并計算固定化木瓜蛋白酶活力?？瞻讓φ战M在加入木瓜蛋白酶溶液之前，先加入10mL 5％TCA，其余步驟相同。酶活力的計算公式為：

式中：

A：樣品溶液中的吸光度值；

A0：對照溶液的吸光度值；

V：反應溶液的總體積mL；

t：反應時間min；

N：稀釋倍數(shù)；

K：L-酪氨酸標準曲線的斜率；

M：樣品的重量(mg)。

3.固定化條件優(yōu)化

(1)固定化溫度對酶固定化的影響

平行取多孔磁性金屬螯合載體15.0mg多份，在其它固定化條件相同的情況下，改變固定化溫度分別為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃，然后制備固定化酶，探討溫度對酶固定化的影響。

結(jié)果如圖6所示，PCMM-CM-Asp-Ni²⁺載體的最佳酶固定化溫度為30℃。

(2)給酶量對酶固定化的影響

平行取多孔磁性金屬螯合載體15.0mg多份，在其它固定化條件相同的情況下，分別加入不同量的木瓜蛋白酶，使給酶量為0.5mg/15.0mg載體、1.0mg/15.0mg載體、1.5mg/15.0mg載體、2.0mg/15.0mg載體和2.5mg/15.0mg載體，然后制備固定化酶，探討給酶量對酶固定化的影響。

結(jié)果如圖7所示PCMM-CM-Asp-Ni²⁺載體的最佳給酶量2.0mg/15mg。

(3)pH對酶固定化的影響

配置一系列濃度為0.1mg/mL的木瓜蛋白酶溶液，用不同pH緩沖液(pH＝4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，平行取多孔磁性金屬螯合載體15.0mg多份，分別加入25mL上述不同pH值的木瓜蛋白酶溶液，在其它固定化條件相同的情況下，然后制備固定化酶，探討pH對酶固定化效果的影響。

結(jié)果如圖8所示，PCMM-CM-Asp-Ni²⁺載體最佳的緩沖溶液pH值為7。

(4)固定化時間對酶固定化的影響

平行取多孔磁性金屬螯合載體15.0mg多份，改變固定化時間分別為1h、2h、3h、4h、5h和6h，在其它固定化條件相同的情況下，然后制備固定化酶，探討固定化時間對酶固定化的影響。

結(jié)果如圖9所示，PCMM-CM-Asp-Ni²⁺載體對木瓜蛋白酶最佳固定化時間為3h。

在如上述最佳的固定化條件下進行3次重復批次試驗進行酶的固定化活性驗證，得到PCMM-CM-Asp-Ni²⁺載體的平均固定化酶活為7.299U/mg，測得的酶的固載量89.16mg/g，酶活力回收率達到81.63％。

三、大豆分離蛋白水解的應用

將適量的大豆分離蛋白溶于水中，形成不同底物濃度的水分散液，在85℃水浴鍋中保溫20min。迅速冷卻至酶解溫度，攪拌30min，調(diào)節(jié)pH至一定值，加入一定量的固定化木瓜蛋白酶，緩慢攪拌反應一定的時間。反應過程中以0.1mol/L NaOH標準溶液進行滴定，保持溶液pH變動范圍在±0.1內(nèi)，同時記錄水解過程消耗的堿液量。水解結(jié)束后，酶解液在沸水中維持10min進行滅酶，然后迅速冷卻至室溫，在10000r/min下離心分離10min。傾倒出上清液，記錄總體積。

大豆分離蛋白水解度的測定方法

由于pH-stat法操作簡單，快速，可重復性高等優(yōu)點，本實驗采用pH-stat法，測定大豆分離蛋白的水解度，公式如下^[130]：

式中：V：NaOH消耗量，mL；C：NaOH濃度，mol/L，α：大豆分離蛋白氨基的平均解離度，α＝10pH-pK/(1+10pH-pK)，pK大豆分離蛋白α-氨基的pK值；m：樣品中蛋白質(zhì)的重量；h_tot：每克蛋白質(zhì)底物具有的肽鍵毫摩爾數(shù)，大豆分離蛋白h_tot＝7.75。

(1)溫度對大豆分離蛋白水解度的影響

先取適量的大豆分離蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)5％，進行預處理(85℃、20min)，pH 8，固定化木瓜蛋白酶添加量5000U/g，溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的條件下，進行酶解試驗，反應2h時間，之后分別對水解產(chǎn)物離心分離，取上清液，采用pH-stat法，測定上清液的水解度。結(jié)果如圖10所示。

(2)pH對大豆分離蛋白水解度的影響

先取適量的大豆分離蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)5％，進行預處理(85℃、20min)，固定化木瓜蛋白酶添加量5000U/g，溫度70℃，pH分別調(diào)至6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，進行酶解試驗，反應2h時間，之后分別對水解產(chǎn)物離心分離，取上清液，采用pH-stat法，測定上清液的水解度。結(jié)果如圖11所示。

(3)水解時間對大豆分離蛋白水解度的影響

取適量的大豆分離蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)5％，進行預處理(85℃、20min)，固定化木瓜蛋白酶添加量5000U/g，溫度70℃，pH 8.0，水解時間分別為1h、2h、3h、4h、5h、6h進行酶解試驗，之后分別對水解產(chǎn)物離心分離，取上清液，采用pH-stat法，測定上清液的水解度。結(jié)果如圖12所示。

(4)底物濃度對大豆分離蛋白水解度的影響

取適量的大豆分離蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)分別為2％、3％、4％、5％、6％，進行預處理(85℃、20min)，固定化木瓜蛋白酶添加量5000U/g，溫度70℃，pH 8.0，水解時間2h，進行酶解試驗，之后分別對水解產(chǎn)物離心分離，取上清液，采用pH-stat法，測定上清液的水解度。結(jié)果如圖13所示。

(5)給酶量對大豆分離蛋白水解度的影響

取適量的大豆分離蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)為5％，進行預處理(85℃、20min)，溫度70℃，pH 8.0，固定化木瓜蛋白酶添加量分別為3000U/g、4000U/g、5000U/g、6000U/g、7000U/g、8000U/g、9000U/g，水解時間2h，進行酶解試驗，之后分別對水解產(chǎn)物離心分離，取上清液，采用pH-stat法，測定上清液的水解度。結(jié)果如圖14所示。

本發(fā)明雖然已以較佳實施例公開如上，但其并不是用來限定本發(fā)明，任何本領域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出可能的變動和修改，因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做出的任何簡單修改、等同變化及修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。