本申請是申請日為2015年11月4日，名稱為“一種基于下一代測序技術(shù)檢測EGFR/KRAS/BRAF基因突變位點(diǎn)的多重PCR引物和方法及應(yīng)用”的中國專利申請201510740906.1的分案。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種基于下一代測序技術(shù)檢測EGFR、KRAS和/或BRAF基因突變位點(diǎn)的多重PCR引物和方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是位于7號染色體短臂上的原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表達(dá)產(chǎn)物，是表皮生長因子受體家族(HER)中的4個成員之一，HER家族在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的突變主要發(fā)生在18～21號外顯子，其中19和21號外顯子突變占總突變的90％。EGFR信號傳導(dǎo)的異常是導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生的原因。研究表明，EGFR在多種腫瘤中都有表達(dá)，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌等。K-ras基因是一種原癌基因，長約35kb，位于12號染色體短臂上，是ras基因家族成員之一，編碼KRAS蛋白。K-ras基因常見的突變位點(diǎn)位于2號外顯子的12號密碼子和13號密碼子上、3號外顯子的6l號密碼子，其中有7個突變熱點(diǎn)：G12C、G12R、G12S、G12V、G12D、G12A、G13V/D，占K-ras基因總突變的98％以上。研究表明體細(xì)胞K-ras基因突變與多種人類惡性腫瘤，如肺癌、白血病、黏蛋白腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌有關(guān)，而生殖細(xì)胞K-ras基因突變與努南綜合征和心臟-面部-皮膚(cardio-facio-cutaneous，CFC)綜合征相關(guān)。BRAF基因是一種原癌基因，定位于7號染色體上，編碼絲/蘇氨酸特異性激酶。約90％的BRAF基因突變發(fā)生在外顯子15的1799位核苷酸上，T突變?yōu)锳，導(dǎo)致纈氨酸被谷氨酸取代(V600E)。BRAF基因突變在黑色素瘤、結(jié)直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤、卵巢癌、乳腺癌以及肺癌等腫瘤細(xì)胞系中的發(fā)生率依次為59％、18％、11％、9％、14％、2％、3％；此外，BRAFV600E在甲狀腺乳頭狀癌中的發(fā)生率高達(dá)35.8％。BRAF基因突變是晚期及復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌最重要的預(yù)后指標(biāo)之一，與患者較差的總體生存期密切相關(guān)。目前常見的檢測這三個基因突變的方法有Sanger測序法和熒光定量PCR法。Sanger測序法中，單對引物可檢測多個突變，但對多個基因、或同一基因的不同外顯子上的突變位點(diǎn)就需分別進(jìn)行擴(kuò)增測序，操作繁瑣，并且靈敏度較低約20％，假陰性率較高。熒光定量PCR法雖然靈敏度高，但每對引物只能檢測一種突變，且每種突變需單獨(dú)建立一個PCR反應(yīng)體系，同時檢測多個樣本多個突變位點(diǎn)操作繁瑣。這兩種方法對樣本的需要量都較大，不適合同時檢測多個基因突變位點(diǎn)。技術(shù)實現(xiàn)要素：鑒于此，本發(fā)明提供了一種多重PCR引物及應(yīng)用。第一方面，本發(fā)明提供了一種多重PCR引物。該多重PCR引物由以下引物對組成：SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示引物對、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示引物對、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示引物對、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示引物對、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示引物對以及SEQIDNO:19和SEQIDNO:20所示引物對。發(fā)明人基于目標(biāo)序列特點(diǎn)多次設(shè)計，以及多次組合試驗篩選，確定了這一組多重PCR引物，利用該多重PCR引物，能夠一次性高效擴(kuò)增獲得EGFR上的多個外顯子的序列，繼而能夠用于檢測EGFR上的多個外顯子上的基因突變位點(diǎn)。其中的SEQIDNO:1和SEQIDNO:2引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)EGFR基因的外顯子18的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:5和SEQIDNO:6引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)EGFR基因的外顯子19的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:9和SEQIDNO:10引物對以及SEQIDNO:13和SEQIDNO:14引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)EGFR基因的外顯子20的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:15和SEQIDNO:16引物對以及SEQIDNO:19和SEQIDNO:20引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)EGFR基因的外顯子21的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述多重PCR引物還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：根據(jù)本發(fā)明的實施例，該多重PCR引物還包括以下引物對中的至少一對：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示引物對、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示引物對、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示引物對、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18所示引物對、SEQIDNO:21和SEQIDNO:22所示引物對、SEQIDNO:23和SEQIDNO:24所示引物對，SEQIDNO:25和SEQIDNO:26引物對以及SEQIDNO:27和SEQIDNO:28所示引物對。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該多重PCR引物還包括以上所列引物對中的兩對、三對、五對或者全部八對。其中，SEQIDNO:3和SEQIDNO:4引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)EGFR基因的外顯子18的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:7和SEQIDNO:8引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)EGFR基因的外顯子19的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:11和SEQIDNO:12引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)EGFR基因的外顯子20的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:17和SEQIDNO:18引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)擴(kuò)增EGFR基因的外顯子21的區(qū)域，SEQIDNO:21和SEQIDNO:22引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)KRAS基因的外顯子2的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:23和SEQIDNO:24引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)KRAS基因的外顯子2的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:25和SEQIDNO:26引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)BRAF基因的外顯子15的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:27和SEQIDNO:28引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)BRAF基因的外顯子15的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述多重PCR引物中，至少包括擴(kuò)增EGFR、KRAS和BRAF基因中任意兩個基因的引物對，所述引物對能夠用于擴(kuò)增所述基因的至少一個外顯子區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，若多次設(shè)計摸索以及多次試驗篩選確定的多重PCR引物組能夠在同一反應(yīng)體系中、同時互不干擾地實現(xiàn)目標(biāo)片段的擴(kuò)增，其中的任一部分引物組合也能于同一反應(yīng)體系中發(fā)揮各自的功能，即互不影響地同時實現(xiàn)相應(yīng)目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述多重PCR引物為SEQIDNO:1～SEQIDNO:28所示的核苷酸序列組成的引物組。一次性獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物可全面覆蓋EGFR18～21號外顯子、KRAS2號外顯子和BRAF15號外顯子區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，若多次設(shè)計摸索以及多次試驗篩選確定的多重PCR引物組(比如，SEQIDNO:1～SEQIDNO:28所示的核苷酸序列組成的引物組)獲得了較佳的擴(kuò)增效果，一般情況下，設(shè)計引物的時候，適當(dāng)?shù)膶⒍嘀豍CR引物組中任一一條引物的長度延長或截短0～3個堿基，也可以獲得不錯的多重PCR擴(kuò)增效果，也應(yīng)納入本發(fā)明保護(hù)范圍。第二方面，本發(fā)明提供了前面本發(fā)明一方面或者任一實施例中的多重PCR引物在獲得和/或檢測EGFR、KRAS和/或BRAF基因序列中的用途。上述對本發(fā)明一方面或者任一實施例中的多重PCR引物的技術(shù)特征和效果的描述，同樣適用本發(fā)明這一方面的用途，在此不再贅述。第三方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒。該試劑盒包含前面本發(fā)明一方面或者任一實施例中的多重PCR引物。上述對本發(fā)明一方面或者任一實施例中的多重PCR引物的技術(shù)特征和效果的描述，同樣適用本發(fā)明這一方面的試劑盒，在此不再贅述。第四方面，本發(fā)明提供了前面任一實施例中的試劑盒在獲得和/或檢測EGFR、KRAS和/或BRAF基因序列中的用途。第五方面，本發(fā)明提供了一種擴(kuò)增基因序列目標(biāo)區(qū)域的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括利用前面所述的多重PCR引物進(jìn)行所述擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述方法還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，所述多重PCR反應(yīng)的體系中，各引物等摩爾混合。根據(jù)本發(fā)明的再一具體實施例，所述多重PCR反應(yīng)的體系中，模板量為50ng～1μg/50μl體系。根據(jù)本發(fā)明的再一具體實施例，所述多重PCR反應(yīng)的程序為：上述程序具體為：95℃預(yù)變性15min，95℃變性15s，60℃退火2min，72℃延伸3min，循環(huán)30～40次(優(yōu)選為35次)，最后72℃后延伸10min。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所述多重PCR反應(yīng)結(jié)束后，電泳，割膠回收片段長度為150bp的DNA片段。第六方面，本發(fā)明提供了一種EGFR、KRAS和/或BRAF基因檢測的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：(1)利用前面所述的方法對待樣品中的至少一部分核酸進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)分析所述擴(kuò)增產(chǎn)物，以獲得EGFR、KRAS和/或BRAF基因檢測結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述EGFR、KRAS和/或BRAF基因檢測的方法還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述核酸為DNA和/或RNA。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述RNA為(優(yōu)選采用RNA試劑盒)提取人外周血單個核細(xì)胞獲得的總RNA。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述核酸為RNA，步驟(1)包括：(1-1)利用所述多重PCR引物中的上游或下游引物將所述RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以及(1-2)利用所述多重PCR引物中相應(yīng)的下游或上游引物對所述cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，當(dāng)所述核酸為RNA，步驟(1)包括：先以下游引物組為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA；然后以合成的cDNA為模板，加入上游引物組，進(jìn)行多重PCR，擴(kuò)增cDNA，獲得多重PCR產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的再一具體實施例，當(dāng)所述核酸為RNA，步驟(1)包括：先以上游引物組為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA；然后以合成的cDNA為模板，加入下游引物組，進(jìn)行多重PCR，擴(kuò)增cDNA，獲得多重PCR產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟(2)包括：(2-1)對所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序；以及(2-2)將測序結(jié)果分別與EFGR、KRAS和/或BRAF基因野生型序列比對，以確定EFGR、KRAS和/或BRAF基因突變位點(diǎn)。如本發(fā)明所述的，所述“EGFR、KRAS和/或BRAF基因突變位點(diǎn)”或“EGFR/KRAS/BRAF基因突變位點(diǎn)”表示EGFR、KRAS、BRAF三個基因中的一個或多個。第八方面，本發(fā)明提出了一種檢測癌癥的方法，根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：利用前面所述的EGFR、KRAS和/或BRAF基因檢測的方法進(jìn)行EFGR、KRAS和/或BRAF基因檢測，獲得檢測結(jié)果，所述待測樣品來自受檢者；以及依據(jù)檢測結(jié)果，評估受檢者的患癌風(fēng)險。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述檢測癌癥的方法還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述檢測結(jié)果包含以下突變中的至少之一：EGFRc.2156G>A、EGFRc.2235_2249del15、EGFRc.2240_2257del18、EGFRc.2369C>T、EGFRc.2573T>G、EGFRc.2582T>A、EGFRc.34G>T、KRASc.34G>T、KRASc.34G>A、KRASc.34G>C、KRASc.35G>T、KRASc.35G>A、KRASc.35G>C、KRASc.38G>A和BRAFc.1799T>A，則指示受檢者患有癌癥。上述突變是根據(jù)HGVS等命名法標(biāo)注該位點(diǎn)在參考cDNA上的位置來表示的，一個突變位點(diǎn)還可以有其它表示方式，如GenBankSNP數(shù)據(jù)庫的命名方法，是以“rs”開頭的SNP位點(diǎn)表示方式，rs671與ALDH2基因c.1510G>A(G1510A)表示同一個位點(diǎn)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，采用其它命名方式比如以該突變在參考gDNA上的位置來標(biāo)注指代與本發(fā)明一樣的突變也屬于本發(fā)明范圍。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述癌癥包括選自結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、白血病、黏蛋白腺癌、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤、卵巢癌和乳腺癌的至少之一。本發(fā)明提供的基于下一代測序技術(shù)檢測EGFR/KRAS/BRAF基因突變位點(diǎn)的多重PCR引物及方法的有益效果為：本發(fā)明提供了檢測EGFR、KRAS和BRAF基因突變位點(diǎn)的多重PCR引物，包含了分別擴(kuò)增這三個基因的一個或多個外顯子區(qū)域的引物對，能夠覆蓋EGFR18～21號外顯子、KRAS2號外顯子和BRAF15號外顯子，包括了EGFR、KRAS和BRAF基因的主要突變位點(diǎn)。所設(shè)計的目標(biāo)序列在每個DNA樣品中均得到有效的擴(kuò)增，在所設(shè)計的KRAS、EGFR和BRAF基因的各個外顯子中均能真實的檢測出突變，從而反映出所提供的檢測方案具有較好的特異性和適用性。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。附圖說明本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：圖1為本發(fā)明實施例提供的單獨(dú)引物PCR的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為本發(fā)明實施例提供的多重PCR的瓊脂糖凝膠電泳圖；以及圖3為本發(fā)明實施例提供的測序深度的生物信息學(xué)分析結(jié)果。具體實施方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。材料及試劑說明：癌癥(如肺癌、結(jié)直腸癌等)患者：來源于深圳第六人民醫(yī)院，患者知情同意。非特殊說明，本發(fā)明實施例采用的試劑均為市售商品，本發(fā)明實施例采用的數(shù)據(jù)庫均為公開的在線數(shù)據(jù)庫。具體地，本發(fā)明引物如表1所示。表1：多重PCR引物序列設(shè)計引物：采用Oligo7.0和MFEprimer-2.0對引物二聚體以及莖環(huán)錯配進(jìn)行分析，在包含突變位點(diǎn)的外顯子兩端設(shè)計引物，擴(kuò)增的序列平均長度在150bp左右，且14對引物的退火溫度基本一致。本實施例提供的引物組覆蓋了EGFR18～21號外顯子、KRAS2號外顯子和BRAF15號外顯子基因突變位點(diǎn)。由于很小的序列變化將導(dǎo)致引物擴(kuò)增效果顯著降低，發(fā)明人分別針對不同目的區(qū)域的不同區(qū)段設(shè)計了多組多重PCR引物組，在經(jīng)過預(yù)實驗篩選后，綜合產(chǎn)物片段長度和點(diǎn)突變覆蓋范圍，本發(fā)明選取了擴(kuò)增效果最佳的引物組，如上表1所示。表1各對引物單獨(dú)PCR結(jié)果如圖1所示。其中，表1中14對引物分別進(jìn)行擴(kuò)增驗證的PCR體系及PCR參數(shù)如下：反應(yīng)體系如表2所示：參照QIAGEN公司MultiplexPCR試劑盒(貨號：206143)配置。表2：多重PCR緩沖液(MultiplexBuffer,2×)25μlQ溶劑(Qsolution,5×)10μl引物5μlDNA10μlTotal50μl循環(huán)參數(shù)：實施例1本發(fā)明實施例1提供了一種待測DNA樣品的制備方法，包括如下步驟：從醫(yī)院獲取包含癌細(xì)胞的組織，采用QIAampDNAMiniKit(51304)試劑盒提取基因組DNA，并用Nanodrop2000(Thermo)測定DNA的濃度及純度，然后保存基因組DNA。實施例2本發(fā)明實施例2提供了一種采用檢測EGFR/KRAS/BRAF基因突變位點(diǎn)的多重PCR引物構(gòu)建EGFR/KRAS/BRAF基因突變測序文庫的方法，包括如下步驟：1、多重PCR：以實施例1所得基因組DNA為擴(kuò)增模板采用SEQIDNO:1～SEQIDNO:28所示14對引物對，再采用QIAGEN公司MultiplexPCR試劑盒(貨號：206143)，按試劑盒說明書配置兩管多重PCR體系，多重PCR體系如表3所示。表3：反應(yīng)體系：多重PCR緩沖液(MultiplexBuffer,2×)25μlQ溶劑(Qsolution,5×)10μl引物5μlDNA10μlTotal50μl各引物分兩組進(jìn)行等摩爾混合，引物總濃度是10微摩爾。第一組引物包括：引物編號1、2、5、6、9、10、13、14、15、16、21、22、25和26；第二組引物包括：引物編號3、4、7、8、11、12、17、18、19、20、23、24、27和28。模板量可以調(diào)整，本實施例中采用200ng。再按下述多重PCR的條件設(shè)置PCR儀器程序，進(jìn)行多重PCR：PCR結(jié)束后，4℃保存PCR產(chǎn)物并電泳檢測，在紫外下切下約150bp左右的目的片段。將第一組引物和第二組引物的PCR產(chǎn)物合在一起回收，得到32uL純化后的產(chǎn)物，膠回收步驟采用QIAGEN公司QIAquick膠純化試劑盒，按常規(guī)實驗室操作進(jìn)行。2、加尾：取純化后的PCR產(chǎn)物，在產(chǎn)物3’末端加A尾，配置體系如表4所示(其中，Klenowexo-購自NEB，貨號：M0212)：表4：10×NEB2BUFFER5μldATP(1mM)10μlKlenowexo-3μlDNA32μlTotal50μl將該體系置于37℃下30min。利用QIAGEN公司QIAquick膠純化試劑盒純化加A尾的PCR產(chǎn)物。3、加接頭：在DNA兩端加上測序用的接頭，配置體系如表5所示(其中，Quickligase購自NEB，M2200L)。表5：5×quickligasebuffer10μlAdaptor1μlQuickligase5μl加A尾的PCR產(chǎn)物25μlH2O9μlTotal50μl其中，Adaptor的序列SEQIDNO：29所示：5’-/5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC/ideoxyU/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’(SEQIDNO：29)。隨后將該體系置于20℃下15min。然后加入3μL的USER，37℃放置15min。最后通過QIAGEN公司QIAquick膠回收試劑盒純化連接產(chǎn)物。4、產(chǎn)物上加入測序用的標(biāo)簽序列，配置體系如表6所示(具體步驟參照illumina高通量測序文庫構(gòu)建說明書)。表6：5×Q5Solutionbuffer10μldNTP(10mM)1μlP1(P5序列+common序列+接頭序列)1μlIndex(P7序列+標(biāo)簽序列Index+接頭序列)1μlQ5酶0.5μl純化后的連接產(chǎn)物36.5ulTotal50μl將配置的體系按下述程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：PCR結(jié)束后，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物富集片段的大小，選取270bp的目的片段進(jìn)行切膠回收，并純化至30μL。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖2所示。在圖2中，S1～S4(分別代表不同的樣本)泳道可以明顯看到在250bp-300bp之間有一條帶，為加上接頭的片段(270bp，箭頭所指處)，與理論相符。5、將步驟4獲得的純化產(chǎn)物直接用Miseq平臺測序進(jìn)行測序。測序結(jié)果是fastq格式的數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析獲得EGFR、BRAS和KRAF三個基因多突變位點(diǎn)情況。測序深度見圖3。本實施例使用PE150試劑盒進(jìn)行測序，即片段兩端各測序150bp。生物信息學(xué)分析測序深度如圖3所示，橫坐標(biāo)是EGFR、BRAS和KRAF每對引物得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，縱坐標(biāo)是測序深度。由圖3可知，本實施例測序結(jié)果中覆蓋了所有引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物，并且分布比較平均。效果實施例1參照實施例2的方法，對100例肺癌癌癥樣品(包含癌細(xì)胞的樣品)分別進(jìn)行多重PCR、加A尾、加接頭、加標(biāo)簽序列、高通量測序及生物信息學(xué)分析，獲得如下結(jié)果，如表7所示：表7：癌癥樣品基因突變位點(diǎn)檢測如表7所示，在測試的100例癌癥樣品中，三個基因的主要突變位點(diǎn)均有檢測到。特別值得注意的是，經(jīng)過對樣品測序的數(shù)據(jù)分析，證實所設(shè)計的目標(biāo)序列在每個DNA樣品中均得到有效的擴(kuò)增，從突變結(jié)果中也可看出，在所設(shè)計的KRAS、EGFR和BRAF基因的各個外顯子中均檢測到了突變，從而反映出所提供的檢測方案具有較好的特異性和適用性。在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個”的含義是兩個或兩個以上。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示意性實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。SEQUENCELISTING<110>深圳市瀚海基因生物科技有限公司<120>同時獲取以及檢測多個目標(biāo)區(qū)域序列的引物、試劑盒和方法<130>PI2015017_4<160>29<170>PatentInversion3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-18-No.1-F）<400>1cccttgtctctgtgttcttg20<210>2<211>19<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-18-No.1-R）<400>2cttatacaccgtgccgaac19<210>3<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-18-No.2-F）<400>3gagaagctcccaaccaagct20<210>4<211>18<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-18-No.2-R）<400>4agaccatgagaggccctg18<210>5<211>19<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-19-No.3-F）<400>5gcagcatgtggcaccatct19<210>6<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-19-No.3-R）<400>6ttccttgttggctttcggag20<210>7<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-19-No.4-F）<400>7tctctctgtcatagggactc20<210>8<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-19-No.4-R）<400>8cacagcaaagcagaaactcac21<210>9<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-20-No.1-F）<400>9atgcgaagccacactgacgt20<210>10<211>18<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-20-No.1-R）<400>10gatgagctgcacggtgga18<210>11<211>18<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-20-No.2-F）<400>11ctccctccaggaagccta18<210>12<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-20-No.2-R）<400>12attgtctttgtgttcccggac21<210>13<211>17<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-20-No.3-F）<400>13gcagctcatgcccttcg17<210>14<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-20-No.3-R）<400>14cgtatctcccttccctgatta21<210>15<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-21-No.1-F）<400>15tgaactacttggaggaccgt20<210>16<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-21-No.1-R）<400>16ccttactttgcctccttctg20<210>17<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-21-No.2-F）<400>17aaacaccgcagcatgtcaag20<210>18<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-21-No.2-R）<400>18aaatgctggctgacctaaagc21<210>19<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-21-No.4-F）<400>19attcggatgcagagcttcttc21<210>20<211>19<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-21-No.4-R）<400>20gatcttgacatgctgcggt19<210>21<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（KRAS-2-No.1-F）<400>21cgtcaaggcactcttgccta20<210>22<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（KRAS-2-No.1-R）<400>22ggtactggtggagtatttgat21<210>23<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（KRAS-2-No.4-F）<400>23ggtcctgcaccagtaatatg20<210>24<211>25<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（KRAS-2-No.4-R）<400>24aatataaacttgtggtagttggagc25<210>25<211>22<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（BRAF-15-No.1-F）<400>25gactttctagtaactcagcagc22<210>26<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（BRAF-15-No.1-R）<400>26cagtgaaatctcgatggagtg21<210>27<211>23<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（BRAF-15-No.2-F）<400>27ccagacaactgttcaaactgatg23<210>28<211>22<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（BRAF-15-No.2-R）<400>28gctctgataggaaaatgagatc22<210>29<211>65<212>DNA<213>Artificial<220><223>adaptor序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>磷酸化修飾<220><221>misc_feature<222>(32)..(32)<223>脫氧修飾<220><221>misc_feature<222>(65)..(65)<223>硫代磷酸酯修飾<400>1gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcuacactctttccctacacgacgctcttcc60gatct當(dāng)前第1頁1 2 3