本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種與卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA ABHD11-AS1的siRNA和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌都是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，近年來(lái)呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著我國(guó)女性的生命健康。早期篩查與及時(shí)診治對(duì)卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后及療效至關(guān)重要。目前，用于臨床的早期篩查方法及診斷指標(biāo)（如CA125）尚不理想。

近年來(lái)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）在腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥中的作用，成為醫(yī)藥行業(yè)的研究熱點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸且不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，能夠通過(guò)多種途徑和分子機(jī)制調(diào)控基因表達(dá)，參與多種生物學(xué)功能。lncRNA的表達(dá)及調(diào)節(jié)異常與許多惡性腫瘤密切相關(guān)，它在細(xì)胞增殖、分化及凋亡中的重要作用也逐漸被證實(shí)。隨著對(duì)lncRNA 功能研究的不斷深入，lncRNA與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究，也取得了令人矚目的成果。

然而，卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的分子機(jī)制尚不清楚，深入研究卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌相關(guān)基因的異常表達(dá)機(jī)制，將有助于其早期診斷、預(yù)防及治療，具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種與卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA ABHD11-AS1的siRNA和應(yīng)用。該長(zhǎng)鏈非編碼RNA與癌細(xì)胞的增殖、凋亡能力相關(guān)，針對(duì)其設(shè)計(jì)的siRNA可應(yīng)用于抗腫瘤的藥物的制備。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種與卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA ABHD11-AS1，其DNA序列如SEQ.ID. NO.1所示；針對(duì)該長(zhǎng)鏈非編碼RNA設(shè)計(jì)的siRNA，所述的siRNA的sense和antisense的核苷酸序列分別如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示。

SEQ.ID.NO.2 ： GCUACGAGAUCAUGAGCCA。

SEQ.ID.NO.3 ： UGGCUCAUGAUCUCGUAGC。

所述的與卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長(zhǎng)非編碼RNA的siRNA可以用于制備抗卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌藥物。

本發(fā)明的有益效果。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)LncRNA ABHD11-AS1在卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌患者中的表達(dá)均高于正常卵巢組織和子宮內(nèi)膜組織；LncRNA ABHD11-AS1表達(dá)異常和卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與發(fā)展的相關(guān)性，為卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的LncRNA的臨床治療和科學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。

本發(fā)明提供的與卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的LncRNA，是由上海SIGMA生物公司獨(dú)家的Rosetta算法，確?；蛟O(shè)計(jì)時(shí)的高效特異性基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)siRNA序列；其質(zhì)粒序列由蘇州吉瑪基因股份有限公司設(shè)計(jì)。分別將質(zhì)粒載體和si-RNA干擾片段轉(zhuǎn)染到卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、OVCAR3及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1B、Ishikawa中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖活性上升/下降，因此認(rèn)為該基因的功能與癌細(xì)胞的增殖能力相關(guān)。

附圖說(shuō)明

圖1利用qRT-PCR檢測(cè)ABHD11-AS1在卵巢癌及正常組織中的表達(dá)情況。

圖2利用MTT法檢測(cè)ABHD11-AS1過(guò)表達(dá)/干擾對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響。

圖3檢測(cè)ABHD11-AS1過(guò)表達(dá)/干擾對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響。

圖4利用qRT-PCR檢測(cè)ABHD11-AS1在子宮內(nèi)膜癌及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況。

圖5利用MTT法檢測(cè)ABHD11-AS1過(guò)表達(dá)/干擾對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響。

圖6檢測(cè)ABHD11-AS1過(guò)表達(dá)/干擾對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的影響。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于對(duì)本發(fā)明的了解，但這些實(shí)施例僅為了對(duì)本發(fā)明加以說(shuō)明，本發(fā)明并不限于這些內(nèi)容。在實(shí)施例中未作特殊說(shuō)明的操作方法均為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)操作方法。

實(shí)施例1。

一、Lnc RNA ABHD11-AS1在卵巢癌組織、正常卵巢組織及子宮內(nèi)膜癌組織、正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況。

1、標(biāo)本采集。

在患者知情的情況下，于術(shù)中采集卵巢癌、正常卵巢組織及子宮內(nèi)膜癌組織、正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本，生理鹽水清洗后，保存于液氮或-80℃超低溫冰箱中，備用；組織標(biāo)本于2014年6月-2016年6月，在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)室，由陳醫(yī)生采集。

2、引物設(shè)計(jì)。

PCR檢測(cè)所用引物。

上游引物（SEQ.ID.NO.4）：CTCCACCTGACAGCAACATC。

下游引物（SEQ.ID.NO.5）：TTCTTGGCAATGGCTTCA。

3、應(yīng)用qRT-PCR方法分別檢測(cè)ABHD11-AS1在卵巢癌、正常卵巢組織及子宮內(nèi)膜癌組織、正常子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)量。

3.1、收集的組織標(biāo)本總RNA提取。

將收集正常卵巢組織、卵巢癌組織以及正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本用Trizol浸泡，以備提取總RNA；加入 Trizol1/5體積量的氯仿，劇烈振蕩15秒，待溶液充分乳化后，室溫靜置5分鐘；4℃條件下，12,000g離心處理20分鐘，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)新的離心管中，向上清液中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在30℃下靜置10分鐘；4℃條件下，12,000g離心處理20分鐘，棄去上清，沿管壁加入lml的75％的乙醇，上下顛倒洗滌離心管管壁，4℃條件下12,000g離心處理10分鐘后，棄去乙醇，室溫干燥沉淀5-10分鐘，加入適量（10-20ul）的RNase-free水溶解沉淀后，用UV-2800A型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度（定量RNA濃度1ug/ul， OD260/OD280 1.8-2.0之間表示RNA純度較高）。

3.2、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

采用Promega GoScript 反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（A5000、A5001），按照以下操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA。

第一步：取一定量模板 RNA 加入引物。

RNA ( 1μg/ul) 5 μl。

Random Primers (0.5 μg /ul) 1 μl。

Oligo(dT)15 Primer (0.5 μg/ul) 1 μl。

Nuclease-Free Water (加至 10 μl) 3 μl。

第二步：將模板 RNA 與反轉(zhuǎn)錄引物（ Random Primers和Oligo(dT)15 Primer）的混合物進(jìn)行 70℃、5 min 預(yù)變性，完成后取出置于冰上。

第三步：配制 RT-Mix，向每個(gè)樣品管加入 10 μl。

組分 反轉(zhuǎn)錄混合液 終濃度。

Nuclease-Free Water 1.6 μl。

GoScript? 5X Reaction Buffer 4 μl 1X 。

MgCl₂ (25 mM) 2 μl 2.5mM 。

PCR Nucleotide Mix 1 μl 0.5mM 。

Recombinant RNasin? Ribonuclease Inhibitor 0.4 μl 20units。

GoScript? Reverse Transcriptase 1 μl。

第四步：設(shè)置反轉(zhuǎn)錄程序，包括退火、延伸、逆轉(zhuǎn)錄酶失活三步（退火25℃ 5min，延伸42℃ 60 min，失活70℃ 15 min，4℃ + ∞。程序完成后得到 cDNA。

3.3、Real-time PCR。

（1）按下列配置PCR反應(yīng)混合液（反應(yīng)液配置可在室溫進(jìn)行），并分至各反應(yīng)管，然后加入2ul模板。

組分 體積（20ul反應(yīng)體系） 終濃度。

Nuclease-Free Water 7 μl 。

上游引物（10 uM) 0.4ul 0.2uM。

下游引物（10 uM) 0.4ul 0.2uM。

GoTaq?qPCR Master Mix,2X 10ul 1X。

CXR 100X 0.2ul 1X。

（2）采用ABI PRISM?7500 Real-Time PCR System，兩步法進(jìn)行PCR標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增程序。

（3）導(dǎo)出數(shù)據(jù)，Realtime PCR結(jié)果用2-△△CT法進(jìn)行分析。利用Graphad Prism軟件分別繪制出卵巢癌和正常卵巢組織、子宮內(nèi)膜癌及正常子宮內(nèi)膜組織表達(dá)水平的圖表，結(jié)果如圖1-3和圖4；其中圖1-1表示lncRNA ABHD11-AS1表達(dá)在上皮性卵巢癌中比在正常卵巢組織中顯著更高；1-2表示lncRNA ABHD11-AS1表達(dá)與腫瘤分期呈正相關(guān)（根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)聯(lián)合會(huì)（FIGO）分期系統(tǒng)I/II期與III/IV期），1-3表示 lncRNA ABHD11-AS1在高分化程度組較在低/中度分化組低，^*P <0.05；圖4表示lncRNA ABHD11-AS1表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌中比在正常子宮內(nèi)膜組織中顯著增高。

以上說(shuō)明lncRNA ABHD11-AS1與卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

二、體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。

1、卵巢癌細(xì)胞株A2780、OVCAR3購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1B購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/RPMI 1640和胎牛血清均購(gòu)自HyClone公司，ABHD11-AS1質(zhì)粒表達(dá)載體購(gòu)自蘇州吉瑪技術(shù)有限公司，siRNA干擾片段序列由上海SIGMA生物公司合成，RNA抽提試劑RNAiso Plus購(gòu)自寶生物工程有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits購(gòu)自Invitrogen公司，定量PCR試劑盒Power SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自Invitrogen公司，ABHD11-AS1基因和管家基因18S引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1、細(xì)胞培養(yǎng)：卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞用含10%的胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)基，于37℃，5%CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，利用ABHD11-AS1基因RNA干擾和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、OVCAR3和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1B，按照l(shuí)ipo2000說(shuō)明書(shū)分別將ABHD11-AS1的siRNA及ABHD11-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，進(jìn)行培養(yǎng)。

2、過(guò)表達(dá)∕干擾效率檢測(cè)：轉(zhuǎn)染效率結(jié)果采用QRT-PCR檢測(cè)，干擾效率在50%以上，過(guò)表達(dá)效率在5倍以上。

2.1、過(guò)表達(dá)∕干擾ABHD11-AS1后進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT）。

增殖實(shí)驗(yàn)：選取細(xì)胞系中ABHD11-AS1過(guò)表達(dá)∕干擾作為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞作為對(duì)照組，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞種到96孔板中，每孔3000個(gè)細(xì)胞，加100ul培養(yǎng)液，分別于0，24，48，72小時(shí)加入20ul 5 mg/mL MTT溶液細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2-4小時(shí)后，在37℃孵育4小時(shí)，棄掉上清液，再加入150ul DMSO，使用分光光度計(jì)在490nm下測(cè)OD值,整理數(shù)據(jù)繪制成折線(xiàn)圖，見(jiàn)圖2和圖5。

2.1.1、過(guò)表達(dá)ABHD11-AS1后的卵巢癌細(xì)胞系及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)圖2-1至圖2-4和圖5-1；其中圖2-1至圖2-2表示在卵巢癌A2780和OVCAR3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 ABHD11-AS1 質(zhì)粒，其表達(dá)升高；圖2-3至圖2-4表示ABHD11-AS1表達(dá)升高，細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)；其中圖5-1表示轉(zhuǎn)染ABHD11-AS1質(zhì)粒提高其在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。

可見(jiàn)，過(guò)表達(dá)ABHD11-AS1基因后, 卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。

2.1.2、ABHD11-AS1干擾后的卵巢癌細(xì)胞系及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2-5至2-8和圖5-2至圖5-4，其中圖2-5至圖2-6表示卵巢癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染si-ABHD11-AS1降低其表達(dá)；圖2-7至圖2-8表示沉默ABHD11-AS1，細(xì)胞增值能力明顯下降；圖5-2表示利用siRNA能夠沉默其在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)；圖5-3表示ABHD11-AS1表達(dá)增加，細(xì)胞增殖能力顯著提高；圖5-4表示沉默表達(dá)，細(xì)胞增殖能力受到抑制。

可見(jiàn)，干擾掉ABHD11-AS1基因后,卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力下降。

2.2 、干擾∕過(guò)表達(dá)ABHD11-AS1后細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞在6cm盤(pán)培養(yǎng)，加入處理因素(ABHD11-AS1基因RNA干擾或過(guò)表達(dá)質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞用不含EDTA胰蛋白酶消化，1500r離心處理5分鐘后收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌兩次，離心后，收集細(xì)胞約5×10 ⁵個(gè)，加入1×Binding Buffer，重懸細(xì)胞100ul，加入5μL Annexin V-FITC和5uL PI Staining Solution(干擾)或者5μL Annexin V-7AAD和5uL PE Staining Solution（高表達(dá)），輕輕混勻，室溫避光孵育10分鐘，再加入400μL 1×Binding Buffer，輕輕混勻；樣品在1小時(shí)內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.2.1、過(guò)表達(dá)ABHD11-AS1后的卵巢癌細(xì)胞系及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3-1至3-2和圖6-1；其中圖3-1至圖3-2表示ABHD11-AS1表達(dá)上升，卵巢癌細(xì)胞凋亡比例明顯下降；圖6-1表示在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中，ABHD11-AS1表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡比例明顯下降。

可見(jiàn)，過(guò)表達(dá)ABHD11-AS1基因后，卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡能力減弱。

2.1.2、ABHD11-AS1干擾后的卵巢癌細(xì)胞系及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3-3至3-4和圖6-2；其中圖3-3至圖3-4表示利用siRNA沉默ABHD11-AS1的表達(dá)，卵巢癌細(xì)胞系凋亡率增加顯著；圖6-2表示沉默ABHD11-AS1顯著促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡。

可見(jiàn)，干擾掉ABHD11-AS1基因后，卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡能力增加。

序列表

＜110＞中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院

＜120＞一種與卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA ABHD11-AS1的siRNA和應(yīng)用

＜160＞5

＜210＞1

＜211＞1660

＜212＞DNA

＜213＞長(zhǎng)鏈非編碼RNA ABHD11-AS1的核苷酸序列

＜400＞1

ctcgagtgaa gacggaaatg gggcggggct gcgagctagg gcgggagaag gagcgcgggg aggacgtacc 70

ttgtgagatg cgagccggcc aacagcttgc aagcatgctc cgctggaccc gagcctggag gctcccgcgt 140

gagggactcg gcccccacgg ccctagcttc gcgagggtgc ctgtcgcacc cagcagcagc agcggcggcc 210

gagggggcgc cgagccgagg ccgcttccgc tttcctacag gcttctggac ggggaggcag ccctcccggc 280

cgtcgtcttt ttgcagggct cttcggcagc aaaactaact tcaactccat cgccaagatc ttggcccagc 350

agacaggccg tgctgacggt ggatgctcgt aaccacggtg acagccccca cagcccagac atgagctacg 420

agatcatgag ccaggacctg caggaccttc tgccccagct gggcctggtg ccctgcgtcg tcgttggcca 490

cagcatggga ggaaagacag ccatgctgct ggcactacag agggtgagcc gcccatgtct ggggcctcct 560

cccattcagt atataccctg agggccctgc aggcaacctg ggactcacat gatcgttgga tgaccaagtt 630

caggctccag gagccatgcc tgagactccc tatgtctgcc taagactggt cccagttcgg ttctctccca 700

cagccagagc tggtggaacg tctcattgct gtagatatca gcccagtgga aagcacaggt gtctcccact 770

ttgcaaccta tgtggcagcc atgagggcca tcaacatcgc agatgagctg ccccgctccc gtgcccgaaa 840

actggcggat gaacagctca gttctgtcat ccaggacatg gccgtgcggc agcacctgct cactaacctg 910

gtagaggtag acgggcgctt cgtgtggagg gtgaacttgg atgccctgac ccagcaccta gacaagatct 980

tggctttccc acagaggcag gagtcctacc tcgggccaac actctttctc cttggtggaa actcccagtt 1050

cgtgcatccc agccaccacc ctgagattat gcggctcttc cctcgggccc agatgcagac ggtgccgaac 1120

gctggccact ggatccacgc tgaccgccca caggacttca tagctgccat ccgaggcttc ctggtctaag 1190

agttgctggc aagaagatgg ccgggcgtgg tggctcatgc ctgtaattcc agcactttgg gaggctaagg 1260

cgggaggatg acttgaggcc aggagttgga gaccagcctg gccaacatgg tgaaaccctg tctctactaa 1330

aaatacaaaa attagcctgg cgtggtggtg cacacctgta atcccagcta ctctggaggc tgaggcagga 1400

gaatcacttg aaccctggag gcagaggttg caatgagccg agatcacacc actacactcc agcctaggca 1470

acagagcaag actctgtctc aaaaaaaaca aaacaaaaag gaggcacaaa accccaggct tcaagtctct 1540

gcagcctgct ccacatttgg gcacagaagg actcagacag gcactgtgtg ggcacgaggt tttacagggg 1610

tggtcagacc tcaggcttta atgaataaag acactactcc caaaggtacc 1660

＜210＞2

＜211＞19

＜212＞RNA

＜213＞外引物sense

＜400＞2

gcuacgagau caugagcca 19

＜210＞3

＜211＞19

＜212＞RNA

＜213＞外引物antisense

＜400＞3

uggcucauga ucucguagc 19

＜210＞4

＜211＞20

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞4

ctccacctga cagcaacatc 20

＜210＞5

＜211＞18

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞5

ttcttggcaa tggcttca 18