專利名稱：：克隆關(guān)聯(lián)抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是涉及一種連接來自尤其富有表面抗原標記的細胞群的編碼VH及VL的序列的關(guān)聯(lián)對(cognatepairs)的方法。該連接方法涉及一種能夠連接與擴增有關(guān)的感興趣核苷酸序列的多重分子擴增方法(procedure),尤其為聚合酶鏈反應(多重PCR)。該方法尤其有利于產(chǎn)生來自免疫球蛋白的編碼可變區(qū)的序列的關(guān)聯(lián)對文庫以及組合文庫。本發(fā)明亦是涉及產(chǎn)生嵌合人類/非人類抗體的方法及由該方法產(chǎn)生的表達文庫。
背景技術(shù)：
：WO2005/042774(Symphogen)揭示一種使用多重分子方法連接感興趣核苷酸序列(尤其編碼Vh和VL序列的關(guān)聯(lián)對)的方法。優(yōu)選地在有限稀釋或其它細胞分離技術(shù)后將感興趣序列自分離的單細胞擴增及連接。參考案揭示各種富集含淋巴細胞的細胞群以獲得尤其適于多重分子擴增方法的的漿細胞群的方式。發(fā)明概要本發(fā)明致力于產(chǎn)生來自非人類動物的編碼免疫球蛋白序列的文庫的方法，及以適于高產(chǎn)量克隆及篩選篩選的少數(shù)步驟產(chǎn)生編碼包含人類恒定區(qū)及非人類可變區(qū)的嵌合抗體的載體文庫的方法。在第一方面中，本發(fā)明是是關(guān)于一種產(chǎn)生包含連接的可變區(qū)的編碼序列的關(guān)聯(lián)對文庫的方法，該方法包含a)提供來自供體的包含淋巴細胞的細胞部分(fraction);b)獲得分離的單細胞群，其包含將來自該細胞部分的細胞個別地分布于多個容器中，其中至少細胞子群表達CD43和CD138抗原或MHCII和B220抗原；及c)藉由以多重分子擴增程序使用由來源于分離單細胞或同基因細胞群的模板擴增感興趣的核苷酸序列，從而擴增該分離的單細胞群中所包含的編碼可變區(qū)的序列及實現(xiàn)該分離的單細胞群中所包含的編碼可變區(qū)的序列的連接；且實現(xiàn)(effecting)經(jīng)擴增的感興趣核苷酸序列的連接。此方法提供一種關(guān)聯(lián)對抗體或抗體片段的文庫。在另一方面中，本發(fā)明是關(guān)于一種隨機連接多個非鄰接(non-contiguous)感興趣核普酸序列的方法，該方法包含a)以多重分子擴增程序使用來源于基因多樣化細胞群的模板擴增感興趣核香酸序列；b)其中基因多樣化細胞系來源于來自供體的包含淋巴細胞的細胞部分(lymphocyte-comprisingcellfraction);c)其中至少細胞子群表達CD43和CD138抗原或MHCII和B220抗原；及d)實現(xiàn)步驟a)中經(jīng)擴增的感興趣核苷酸序列的連接。此方法提供一種隨機組合的重鏈可變域(domain)及輕鏈可變域的組合文庫。本申請中提供的實驗證據(jù)確定使用多重分子擴增方法自小鼠脾細胞分離且對所列表面抗原呈陽性的細胞群提供良好起始物質(zhì)用于克隆編碼抗體的序列。本發(fā)明的方法可容易地應用于其它表達CD43和CD138或MHCII和B220的直向同源物的物種，該方法尤其可應用于其它諸如大鼠的嚙齒動物。該方法提供優(yōu)于替代方法(即產(chǎn)生雜交瘤)的若干益處。當由經(jīng)免疫小鼠制備雜交瘤時，確定的細胞系將編碼不同抗體同型的集合(repertoire)。隨后將不得不篩選雜交瘤細胞系的功能(例如，與特異抗原結(jié)合，中和病原體的功效)及抗體同型。因此需要兩步篩選程序以選擇具有特定抗體同型且在功能鑒定中具有特定作用的雜交瘤。最終，為了產(chǎn)生生產(chǎn)細胞系(producercellline)，由所選雜交瘤分泌的抗體在轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)細胞系之前將需要經(jīng)克隆及測序。使用本發(fā)明的方法，抗體同型(isotype)是由多重分子擴增所用的引物確定，且因此此將無需確定?？贵w同型亦可藉由隨后將恒定域(恒定區(qū))與經(jīng)克隆可變序列連接或剪接而確定(且可變化)。此外，本發(fā)明方法提供可容易地測序和/或插入載體(諸如表達、轉(zhuǎn)移、呈現(xiàn)或穿梭載體)中的多核香酸文庫，從而一旦選擇特定抗體，則其已克隆，其序列已知且其可容易地轉(zhuǎn)移至適當表達載體以產(chǎn)生抗體。預期根據(jù)所提供的方案分選出的細胞提供高親和力抗體源，其潛在地具有皮摩爾(picomolar)范圍內(nèi)的親和力。雜交瘤的單克隆抗體不具有皮摩爾范圍內(nèi)內(nèi)的親和力，且將需要綜合地親和力成熟以達到此等親和力。根據(jù)一個具體實例，此等方法進一步包含在多重分子擴增之前評定包優(yōu)選CD43和CD138抗原的細胞。該方法亦可包括在多重分子擴增之前使該包含淋巴細胞的細胞部分富集表達CD43和CD138抗原或MHCII和B220的淋巴細胞群。該方法優(yōu)選進一步包含在多重分子擴增之前自該包含淋巴細胞的群分離表達CD43和CD138抗原或MHCII和B220抗原的細胞。在優(yōu)選具體實例中，分離的細胞或細胞子群相對于包含淋巴細胞的細胞部分為CD138高(High)/CD43高或CD138中等/CD43高。更加優(yōu)選地，分離的細胞或細胞子群相對于包含淋巴細胞的細胞部分為CD138高/CD43高。富集或分離優(yōu)選包含諸如MACS或FACS的自動分選程序。在另一方面中，本發(fā)明是關(guān)于一種產(chǎn)生編碼具有人類恒定區(qū)及非人類可變區(qū)的嵌合抗體的載體的方法，該方法包含a)提供來自非人類動物的包含淋巴細胞的細胞部分；b)獲得分離的單細胞群，包含將來自該細胞部分的細胞個別地分布于多個容器中；c)藉由以多重分子擴增程序使用來源于分離的單細胞或同基因細胞群的模板擴增該核酸，從而擴增該分離的單細胞群中所包含的編碼可變區(qū)的核酸及實現(xiàn)該分離的單細胞群中所包含的編碼可變區(qū)的核酸的連接；且實現(xiàn)編碼重鏈及輕鏈可變區(qū)的經(jīng)擴增核酸的連接；d)實現(xiàn)經(jīng)擴增可變區(qū)與人類恒定區(qū)的連接；及e)將所獲得的核酸插入載體中。非人類動物優(yōu)選為小鼠。就本發(fā)明方法應用于小鼠細胞而言，該方法稱為Mouse-Symplex或mSymplexTM。本發(fā)明的此方面提供一種產(chǎn)生嵌合人類/非人類抗體文庫的新穎方法。此藉由組合多重分子擴增且隨后與連接和/或剪接人類重鏈及輕鏈恒定域以克隆入載體骨架中而成為可能。傳統(tǒng)上，在產(chǎn)生嵌合人類/非人類抗體的方法中，嵌合為已確定且篩選雜交瘤且已克隆編碼抗體后的最后步驟。嵌合可影響抗體的結(jié)合特異性和/或親和力，因此存在好的單克隆小鼠抗體在嵌入人類/小鼠抗體中時損失其功效的風險。藉由提供一種直接產(chǎn)生嵌合抗體的抗體的方法，可對在臨床前研究及臨床研究之前無需進一步修飾的產(chǎn)物進行篩選?？梢苑肿訑U增步驟提供恒定人類區(qū)或其可作為載體骨架的部分得以提供，在分子擴增后可變區(qū)克隆入該載體骨架中。在優(yōu)選具體實例中，該方法包含另一擴增步驟，其中將具有能夠提供與可變輕鏈的連接的重疊的編碼人類恒定輕鏈或其片段的多核苷酸與能夠擴增按順序包含鼠科動物VH鏈、接頭、鼠科動物Vt鏈及人類恒定輕鏈的構(gòu)建體的引物組一起添加至PCR混合物中。在另一具體實例中，該方法包含另一擴增步驟，其中將具有能夠提供與可變重鏈的連接的重疊的編碼人類恒定重鏈或其片段的多核苷酸與能夠擴增按順序包含人類恒定重鏈、鼠科動物VH鏈、接頭及鼠科動物Vi鏈的構(gòu)建體的引物組一起添加至PCR混合物中。因此，亦提供一種編碼嵌合抗體的載體文庫，各抗體成員由編碼非人類免疫球蛋白可變區(qū)的序列，及人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈恒定區(qū)(或其片段)組成。優(yōu)選地，載體為能夠表達用于隨后篩選的文庫的抗體成員的表達載體。更加優(yōu)選地，表達載體是用于哺乳動物表達?？山逵杀景l(fā)明方法獲得文庫的載體。在一具體實例中，輕鏈恒定區(qū)為K恒定區(qū)。非人類序列可來自已描述免疫方案(immunisationprotocol)的大鼠、綿羊、山羊、兔、豚鼠或其它合適動物，其序列信息可得以允許設(shè)計合適引物，且其合適細胞分選技術(shù)可分選漿細胞以供單細胞多重分子擴增以連接可變區(qū)序列的關(guān)聯(lián)對。在一個具體實例中，非人類序列為非人類靈長類動物源,諸如石蟹獼猴(cynomolgousmonkey)、獼猴(Rhesusmonkey)、黑猩猩或短尾猴(maqaque)。非人類序列優(yōu)選為嚙齒動物，諸如鼠科動物或大鼠。在另一具體實例中，非人類序列為兔序列。抗體的可變區(qū)優(yōu)選為關(guān)聯(lián)對。在另一方面中，本發(fā)明是關(guān)于一種編碼針對特定靶顯示所要結(jié)合特異性的抗體的子文庫(sub-library),其選自本發(fā)明的文庫。圖l鼠科動物-mSymplexPCR:多重重疊延伸RT-PCR以供單細胞的重鏈及輕鏈抗體基因的擴增及關(guān)聯(lián)連接。用于RT-PCR及嵌套式PCR的例示性引物混合物詳細描述于表2及表3(或表5)中。圖2鼠科動物庫(repertoire)克隆藉由重疊延伸剪接使編碼來自單漿細胞的VH/V^基因?qū)Φ膍SymplexPCR產(chǎn)物池與編碼人類k恒定輕鏈的基因剪接。將編碼完全人類-小鼠嵌合抗體的基因池插入表達載體中，隨后插入雙向啟動子序列盒(2xCMV)。用于人類k剪接的引物混合物詳細描述于表6中。圖3A小鼠脾細胞的分選。(A)為了分離定義為CD43高、CD138高的漿細胞，在底部左圖中排除PI(碘化丙啶)陽性或死細胞(非P1)。漿細胞在底部右圖中門控(gated)為CD43高、CD138高(P2)。最后，在SSC-H、SSC-W曲線頂部右圖中排除成對物(doublet)(P3)。將對所有三個閘門(gate)呈陽性的細胞分選為ELISPOT板。(B)為了分離定義為MHCII中等、B220中等的成漿細胞，在底部左圖中排除PI(碘化丙啶)陽性或死細胞(非PI)。接著在底部右圖中，成漿細胞門控為MHCII中等、B220中等(P2)。在SSC-H、SSC-W曲線頂部右圖中排除成對物(P3),且最終細胞在頂部左圖中門控尺寸(P4)。將對所有四個閘門呈陽性的細胞分選為ELISPOT板。圖4小鼠脾細胞的分選。首先，在底部左圖中排除PI陽性或死細胞(Pl)。在頂部右點圖(dotplot)中，描述CD138PE及CD43FITC。四個閘門是基于不同表達型細胞群設(shè)定P2為CD138中等，CD43高。P3為CD138高，CD43高。P4為CD138高，Cd43負。P5為CD138中等，CD43低。將對Pl及四個閘門中的每一者呈陽性的10,000個細胞分選于測試試管中且冷凍以供symplex評估。圖5來自4個經(jīng)分選部分的細胞溶解產(chǎn)物的SymplexPCR滴定的PCR產(chǎn)物的凝膠電泳。P2、P3、P4及P5為根據(jù)圖4分選的閘門。M為分子量標記。圖4A6為表達哺乳動物全長抗體的載體00-VP-002的圖示。Amp及Amppro,抗氨節(jié)青霉素(ampicillin)基因及其啟動子；pUC源，復制的pUC源；CMV，驅(qū)使輕鏈及重鏈的表達的哺乳動物啟動子；IGHV前導序列，基因組人類重鏈前導序列；H填充，與編碼重鏈可變區(qū)的序列交換的插入物；IGHG1，編碼基因組免疫球蛋白同型Gl重鏈恒定區(qū)的序列(附錄l中所示的序列)；兔B-珠蛋白A，兔(3-珠蛋白polyA序列；IGKV前導序列，鼠科動物K前導序列；L填充，與編碼輕鏈的序列交換的插入物；SV40終止子，猿(simian)病毒40終止子序列；FRT,Flp識別耙位點；Neo,抗新霉素(neomycin)基因；SV40polyA,猿病毒40polyA信號序列。圖5嵌合抗hEGFR抗體的庫的分析。在450-620nm處吸光率差異的群集分析。如克隆編號后的號碼(1至4)所示，藉由活性/反應性使上清液群集。深灰色表示代謝活性細胞數(shù)目減少，而淺灰色表示代謝活性細胞數(shù)目增加。黑色表示對代謝活性細胞數(shù)目無影響的上清液。發(fā)明描述本發(fā)明著手提供使用WO2005/042774所揭示的擴增及連接法提供自非人類動物收集抗體載體的其它可能性。此等改良使得具有可變區(qū)關(guān)聯(lián)對的編碼人類/非人類嵌合抗體的序列的克隆能與高產(chǎn)量格式保持一致。此基本上藉由提供用于擴增及連接法的新穎起始物質(zhì)且藉由提供用于產(chǎn)生具有可變區(qū)關(guān)聯(lián)對的嵌合人類/非人類抗體文庫的方法來實現(xiàn)。本發(fā)明的一方面為一種連接重鏈及輕鏈可變序列的方法，其包含以多重分子擴增程序使用來源于分離的單細胞、同基因細胞群或基因多樣化細胞群的模板擴增相關(guān)核苷酸序列且實現(xiàn)經(jīng)擴增序列隨后的連接。定義術(shù)語r關(guān)聯(lián)對(cognatepair)」描述單細胞所包含或來源于單細胞的感興趣非鄰接(non-contigous)核酸的初始對。在優(yōu)選具體實例中，關(guān)聯(lián)對包含兩個編碼可變區(qū)的序列，其共同編碼結(jié)合蛋白可變域且該基因序列是來源于相同細胞。因此，當表達為完全結(jié)合蛋白或其穩(wěn)定片段時，其保持此細胞初始所表達的結(jié)合蛋白的結(jié)合親和力及特異性。關(guān)聯(lián)對可(例如)由與與來自相同細胞的編碼T細胞受體p鏈的序列締合的編碼a鏈的序列構(gòu)成。關(guān)聯(lián)對文庫為該關(guān)聯(lián)對的集合。術(shù)語r熱啟動聚合酶(hot-startpolymerase"描述在用于逆轉(zhuǎn)錄的溫度下為無活性的或具有極低活性的聚合酶。該聚合酶需要藉由高溫(卯至95。C)活化而起作用。此為(例如)單步驟RT-PCR程序的優(yōu)勢，因為此阻止聚合酶與逆轉(zhuǎn)錄酶反應的干擾。術(shù)語「同基因細胞群(isogenicpopulationofcells)」描述遺傳上相同的細胞群。詳言的，由克隆擴充(clonalexpansion)分離的單細胞衍生的同基因細胞群受本發(fā)明所關(guān)注。術(shù)語r分離的單細胞(isolatedsinglecell)」描述對應于r單獨容器中的單細胞」的與細胞群物理分離的細胞。當將細胞群個別地分布于多個容器中時，獲得分離的單細胞群。如名為r模板源(Templatesources)」的部分中所說明，具有單細胞的容器的比例不必為100%以稱為單細胞群。來源于與擴增有關(guān)的r連接(link或linkage)」的術(shù)語描述將感興趣核酸序列編碼為單個區(qū)段的經(jīng)擴增核酸序列的締合。與關(guān)聯(lián)對相比，區(qū)段包抗體重鏈可變區(qū)的核酸序列。連接可與擴增同時完成或作為擴增后的緊接步驟。對區(qū)段的形式或功能性無要求，其可為線性的，環(huán)狀的，單鏈的或雙鏈的。連接亦不必為永久的，若需要則可自區(qū)段分離感興趣核酸序列中的一者，編碼可變區(qū)的序列中的一者可(例如)與關(guān)聯(lián)對區(qū)段分離。然而，只要構(gòu)成關(guān)聯(lián)對的初始可變區(qū)不與其它可變區(qū)混雜，則盡管其未共同連接至單個區(qū)段中仍認為其是關(guān)聯(lián)對。連接優(yōu)選為核苷酸磷酸二酯鍵(nucleotidephosphodiesterlinkage)。然而，亦可藉由不同化學交聯(lián)程序獲得連接。術(shù)語「多重分子擴增」描述在同一反應中同時擴增兩個或兩個以上靶序列。合適擴增方法包括聚合酶鏈反應(PCR)(U.S.4,683,202)、連接酶鏈反應(ligasechainreaction,LCR)(^Wu及^Vallace,1989,Genomics4，560-9)、鏈置換擴增(stranddisplacementamplification,SDA)技術(shù)(Walker等人，1992，Nucl.AcidsRes.20,1691-6)、自主序歹'J復制(self-sustainedsequencereplication)(Guatelli等人，1990,Proc.Nat,Acad.Sci.U.S.A.,87，1874-8)及基于核酸的序列擴增(NASBA)(ComptonJ.,1991，Nature350,91-2)。后兩種擴增法涉及基于等溫轉(zhuǎn)錄的等溫反應，其產(chǎn)生單鏈RNA(ssRNA)及雙鏈DNA(dsDNA)。術(shù)語「多重PCR」描述PCR的變體，其中兩個或兩個以上靶序列藉由在同一反應中包括一組以上引物而同時擴增，例如在同一PCR反應中的一組適于擴增重鏈可變區(qū)的引物及一組適于擴增K鏈可變區(qū)的引物。另外或或者，可將適于擴增？l鏈可變區(qū)的引物組與此等引物組組合。術(shù)語「多重RT-PCR」描述在逆轉(zhuǎn)錄(RT)步驟之前的多重PCR反應。多重RT-PCR可以在多重PCR之前分開進行RT步驟的兩步法進行，或以單步法進行，其中RT及多重PCR的所有組份在單個試管中組合。術(shù)語r多重重疊延伸PCR」及「多重重疊延伸RT-PCR」暗示多重PCR或多重RT-PCR是利用多重重疊延伸引物混合物擴增靶序列來進行，藉此使靶序列能夠同時擴增及連接。術(shù)語「多個容器」描述能夠進行單細胞與細胞群的物理分離的任何對象(或?qū)ο蠹?。此可為試管、多孔培養(yǎng)盤(例如96孔、384孔、微量滴定盤或其它多孔培養(yǎng)盤)、數(shù)組/陣列(arrays)、微陣列、微芯片、凝膠或凝膠基質(zhì)。優(yōu)選地，對象可適用于PCR擴增。本文所用的術(shù)語「多克隆蛋白」或「多克隆性J是指包含不同但同源的蛋白質(zhì)分子的蛋白質(zhì)組合物，其優(yōu)選選自免疫球蛋白超家族。因此，各蛋白質(zhì)分子與組合物的其它分子同源，但亦含有可變多肽序列的一或多個延伸，該(等)多肽序列的特征在于多克隆蛋白的個別成員之間的氨基酸序列差異。該多克隆蛋白的已知實例包括抗體或免疫球蛋白分子、T細胞受體及B細胞受體。多克隆蛋白可由蛋白質(zhì)分子的經(jīng)定義子組組成，其已由諸如對所要靶的共享結(jié)合活性的共同特征定義，例如對所要靶抗原展示結(jié)合特異性的多克隆抗體。本文所用的術(shù)語r基因多樣化細胞群」是指細胞群中的個別細胞關(guān)于基因組程度(genomiclevel)此此不同的細胞群。該基因多樣化細胞群為(例如)來源于供體的細胞群或該細胞的部分，例如含有B淋巴細胞或T淋巴細胞的細胞部分。術(shù)語r引物組」與術(shù)語「引物對」可互換使用，且描述能夠共同引發(fā)感興趣核苷酸序列(亦即，關(guān)聯(lián)對的一員)的擴增的兩個或兩個以上引物。不同家族的實例為抗體K輕鏈、X輕鏈、重鏈可變區(qū)及a、卩、y或ST細胞受體可變區(qū)。用于擴增含有編碼可變區(qū)的序列的核苷酸序列家族的引物組通常構(gòu)成多個引物，其中若干引物可為簡并(degenerate)引物。術(shù)語「序列同一性」表示為指示兩個序列的最短長度上的核酸序列之間的一致程度的百分比。其可計算為(Nref-Ndif)xlOO。/。/Nref，其中Nref為較短序列中的殘基數(shù)，且其中Ndif為在兩個序列之間Nref長度最佳比對匹配的殘基中不一致殘基總數(shù)。因此，DNA序列AGTCAGTC(序列號32)與序列TAATCAATCGG(序列號33)將具有75%的序列同一性(Ndif^2且Nref^8X下劃線展示最佳比對，且粗體表示8個殘基中有兩個不同殘基)。關(guān)于連接的術(shù)語「隨機地」或r隨機」是指核苷酸序列的連接，該序列并非來源于相同細胞但在基因多樣化細胞群中橫向連接。若感興趣核苷酸序列為編碼可變區(qū)的序列，則此將導致經(jīng)連接序列的組合文庫。另一方面，若感興趣核苷酸序列編碼非多樣化異質(zhì)(heteromeric)蛋白，則經(jīng)隨機連接的序列將看似與來自單細胞的經(jīng)連接序列類似。關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄的術(shù)語「來源于分離的單細胞的模板」是關(guān)于該分離的細胞內(nèi)的核酸。核酸可(例如)為RNA、mRNA、DNA或基因組DNA形式。核酸可自細胞分離或仍與細胞的剩余內(nèi)容物一起，其中細胞為完整形式或溶解形式。術(shù)語rCD43」是指在包括3E8抗原、A630014B01Rik、B細胞分化抗原LP-3、Cd43、CD43抗原、Galgp、白血球唾液酸糖蛋白、增白細胞蛋白(leukosialin)、增白細胞蛋白前體、Ly48、Ly-48、涎福林(Sialophorin)以及來自其它動物的直向同源表面標記的眾多同義詞下已知的小鼠表面抗原。術(shù)語rCD138」是指在包括Syndecan-l、AA408134、AA409076、CD138、syn-l、Synd、Syndl、SYND1、Synd-l、Syndecan-l前體以及來自其它動物的直是同源表面標記的眾多同義詞下已知的小鼠表面抗原。術(shù)語「MHCII」是指在包括CD74抗原、CLIP、DHLAG、H-2第II類組織兼容性抗原y鏈、HLADG、HLA-DR-GAMMA、與Ia抗原締合的不變鏈(invariantchain)、Ia-GAMMA、Ii、與MHC第II類有關(guān)的恒定鏈以及來自其它動物的直是同源表面標記的眾多同義詞下已知的小鼠表面抗原。術(shù)語「B220」是指在包括B220、Cd45、CD45、CD45抗原、CD45R、L-CA、白血球共同抗原前體、loc、Ly-5、淋巴細胞共同抗原Ly-5、Lyt-4、T200以及直是同源表面標記的眾多同義詞下已知的小鼠表面抗原。本發(fā)明的詳細描述擴增及連接法本發(fā)明的一個特征利用兩個或兩個以上靶序列在同一試管中同時擴增的PCR變體藉由在同一反應中包括一組以上引物(例如，使編碼可變區(qū)的序列擴增所必需的所有引物)減少使感興趣核苷酸序列擴增所必需的試管數(shù)。一般而言，此方法稱作多重聚合酶鏈反應(多重PCR)。本發(fā)明的另一特征為由多重PCR擴增的兩個或兩個以上耙序列在緊接著擴增法的后連接。詳言的，編碼可變區(qū)的序列的關(guān)聯(lián)對是由此方法連接。本發(fā)明的一具體實例開發(fā)設(shè)計多重引物混合物以在重疊延伸PCR程序中起作用，導致感興趣核苷酸序列的同時擴增及連接。此多重重疊延伸PCR技術(shù)用于減少使感興趣核苷酸序列(尤其經(jīng)連接可變區(qū)的關(guān)聯(lián)對)分離及連接所必需的反應數(shù)。本發(fā)明的其它具體實例藉由使用接合或重組作為藉由多重重疊延伸PCR連接的替代來施加連接。在此等程序中，連接未與多重PCR擴增同時進行，而是作為緊接著擴增的后的步驟進行。然而，連接仍可在與進行多重PCR相同的試管中進行。多重重疊延伸PCR需要存在兩個或兩個以上引物組(多重引物混合物)，其中各組的至少一個引物裝配有重疊延伸尾(overlap-extensiontail)。重疊延伸尾使擴增期間由各引物組產(chǎn)生的產(chǎn)物可連接。該引物混合物稱為多重重疊延伸？1物混合物。多重重疊延伸PCR與常規(guī)重疊延伸PCR的區(qū)別在于待連接的序列是在同一試管中同時產(chǎn)生，藉此提供擴增期間靶序列的緊接連接而無任何中間純化。本發(fā)明的另一特征為利用來源于分離的單細胞或同基因細胞群的模板且在多重PCR或多重重疊延伸PCR擴增之前的逆轉(zhuǎn)錄(RT)步驟。本發(fā)明的另一特征為使用來源于分離的單細胞或同基因細胞群的核苷酸序列作為多重PCR擴增的模板。優(yōu)選地，在多重PCR之前將來自單細胞的RNA逆轉(zhuǎn)錄進cDNA中。對于一些感興趣的核酸序列的擴增而言，基因組DNA可用作mRNA的替代。藉由使用分離的單細胞或由分離的單細胞克隆擴充所產(chǎn)生的同基因細胞群作為模板源，可避免編碼感興趣異質(zhì)蛋白的核苷酸序列的不規(guī)則性，其中核苷酸序列來源于細胞群內(nèi)不同細胞。若期望獲得感興趣序列的初始組合物，則此尤其重要。尤其對于產(chǎn)生編碼可變區(qū)的序列的關(guān)聯(lián)對而言，使用分離的單細胞或同基因細胞群作為模板源為重要特征。另外，本發(fā)明促進產(chǎn)生感興趣經(jīng)經(jīng)連接核酸序列的文庫，尤其組合文庫及可變區(qū)的關(guān)聯(lián)對文庫。此外，本發(fā)明利用來源于單細胞的核酸，其優(yōu)選為在用作模板之前無需自剩余細胞內(nèi)容物分離的RNA形式。本發(fā)明的一具體實例涵蓋多個非鄰接感興趣核苷酸序列的連接。該方法包含以多重PCR或多重RT-PCR擴增程序使用來源于分離的單細胞或同基因細胞群的模板擴增感興趣核苷酸序列且實現(xiàn)經(jīng)擴增感興趣核香酸序列的連接。此外，該方法包含進行連接產(chǎn)物的另一擴增的任選地步驟。本發(fā)明的另一具體實例涵蓋一種產(chǎn)生包含編碼經(jīng)連接可變區(qū)的序列的關(guān)聯(lián)對文庫的方法。該方法包含由供體提供包含淋巴細胞的細胞部分，該供體視情況任選富集來自該細胞部分的特定淋巴細胞群或其中特定淋巴細胞群已自該細胞部分分離。此外，分離的單細胞群是藉由將來自含淋巴細胞的細胞部分或富集細胞部分的細胞單獨分布于多個容器中而獲得。在分離的單細胞群中進行包含于分離的單細胞群中的編碼可變區(qū)的序列的多重分子擴增(多重RT-PCR擴增)且實現(xiàn)編碼可變區(qū)的序列對的連接，其中可變區(qū)序列的個別對是來源于單細胞。此外，該技術(shù)包含兩個任選地步驟在第一步驟中，單細胞群中個別分離的單細胞在進行多重RT-PCR擴增之前擴展為同基因細胞群。藉此獲得具有不同同基因細胞群的多個容器(一個容器中一種同基因細胞群)。第二任選地步驟涵蓋進行編碼經(jīng)連接可變區(qū)的序列的另一擴增。在本發(fā)明的優(yōu)選具體實例中，該包含編碼免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的序列的關(guān)聯(lián)對文庫的個別成員與編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的序列締合(associate),其源自相同細胞或具有編碼T細胞受體結(jié)合域的序列，由與P鏈可變區(qū)締合的a鏈可變區(qū)或與S鏈可變區(qū)締合的Y鏈可變區(qū)構(gòu)成，其中締合可變區(qū)源自相同細胞。本發(fā)明的多重RT-PCR擴增可以其中逆轉(zhuǎn)錄(RT)分開于多重PCR擴增(或替代的多重分子擴增)的兩步法或其中以RT與多重PCR擴增步驟在一個試管中以相同引物進行的單步法進行。逆轉(zhuǎn)錄(RT)是以含有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶進行，導致由來自分離的單細胞的總RNA、mRNA或靶特異性RNA產(chǎn)生cDNA。可用于逆轉(zhuǎn)錄的引物為(例如)寡dT引物、隨機(random)六聚物、隨機十聚物、其它隨機引物或?qū)Ω信d趣核苷酸序列具有特異性的引物。兩步多重RT-PCR擴增程序允許RT步驟中產(chǎn)生的cDNA分布于一個以上可在進行擴增之前儲存模板部分的容器中。另外，將cDNA分布于一個以上試管中允許對來源于同一模板的核酸進行一個以上多重PCR擴增。盡管此導致增加分開反應的數(shù)目，但是此可能會降低多重引物混合物的復雜性(若需要)。此兩步法可(例如)用于在一個試管中擴增及連接編碼重鏈可變區(qū)與k輕鏈可變區(qū)的序列且在不同試管中利用同一模板擴增及連接編碼重鏈可變區(qū)及X輕鏈可變區(qū)的序列。單細胞一般僅表達輕鏈中的一者。然而，通常將易于同時進行反應而非在進行另一反應之前等待一個反應中的結(jié)果。此外，k及人兩者皆擴增用作內(nèi)部負控制組，因為預期僅k或X自單細胞擴增。在單步多重RT-PCR程序中，逆轉(zhuǎn)錄及多重PCR擴增是在同一容器中進行。將以單步進行逆轉(zhuǎn)錄及多重PCR必需的所有組份初始添加至容器中且進行反應。一般而言，一旦反應開始則無需添加額外組份。單步多重RT-PCR擴增的優(yōu)勢在于其進一步減少產(chǎn)生本發(fā)明的經(jīng)連接核苷酸序列所必需的步驟數(shù)。當對單細胞數(shù)組進行多重RT-PCR時此尤其適用，其中需要在多個容器中進行相同反應。同樣，藉由利用多重引物混合物中存在的多重PCR擴增所需的反向引物作為逆轉(zhuǎn)錄的引物進行單步多重RT-PCR。一般而言，單步多重RT-PCR所需的組合物包含核酸模板、具有逆轉(zhuǎn)錄活性的酶、具有DNA聚合酶活性的酶、脫氧核苷三磷酸混合物(包含dATP、dCTP、dGTP及dTTP的dNTP混合物)及多重引物混合物。核酸模板優(yōu)選為來源于分離的單細胞的總RNA或mRNA，其為經(jīng)純化形式、細胞溶解產(chǎn)物形式或仍在完整細胞內(nèi)。一般而言，反應混合物的精確組合物需要對各多重引物混合物進行一些最優(yōu)化以用于本發(fā)明。此適用于兩步及單步多重RT-PCR程序兩者。對于一些單步多重RT-PCR反應而言，在反應期間添加其它組份可為有利地。舉例而言，在RT步驟后添加聚合酶。其它組份可為(例如)dNTP混合物或可能與不同引物組合物混合的多重引物。此又可認為是單試管多重RT-PCR,其一般與單步多重RT-PCR具有相同益處，因為其亦限制獲得所要經(jīng)連接產(chǎn)物必需的試管數(shù)。藉由多重RT-PCR擴增的感興趣的核普酸序列可藉由若干方法此此連接，諸如使用不同多重引物混合物的多重重疊延伸RT-PCR、接合或重組。優(yōu)選地，多重RT-PCR擴增及連接法為單步或兩步法。然而，亦可以多步法進行連接法，使用(例如)填充片段(stufferfragment)以PCR、接合或重組來連接感興趣的核酸序列。該填充片段可含有順式組件、啟動子組件或有關(guān)編碼序列或識別序列。在優(yōu)選具體實例中，連接法是在與多重RT-PCR擴增相同的容器中進行。在本發(fā)明的一具體實例中，多個感興趣的非鄰接核苷酸序列的連接是與多重PCR擴增聯(lián)合利用多重重疊延伸引物混合物進行。此導致把序列的經(jīng)組合擴增及連接。一般而言，多重重疊延伸PCR所需的組合物包含核酸模板、具有DNA聚合酶活性的酶、脫氧核苷三磷酸混合物(包含dATP、dCTP、dGTP及dTTP的dNTP混合物)及多重重疊延伸引物混合物。在本發(fā)明的特定具體實例中，多個感興趣非鄰接核苷酸序列的連接是藉由多重重疊延伸RT-PCR使用來源于分離的單細胞或同基因細胞群的模板而進行。此外，該方法包含進行連接產(chǎn)物的額外分子擴增的任選地步驟。優(yōu)選地，多重重疊延伸RT-PCR是以單步/單試管反應進行。本發(fā)明的多重重疊延伸引物混合物包含至少兩個能引發(fā)至少兩個編碼可變區(qū)的序列的擴增及連接的引物組，例如使來自免疫球蛋白重鏈可變區(qū)家族的序列與k或I輕鏈可變區(qū)家族擴增或連接，或使來自T細胞受體家族a、(3、Y或S的序列擴增及連接。在本發(fā)明的另一具體實例中，藉由多重RT-PCR擴增的多個感興趣的核苷酸序列是藉由接合而連接。為實現(xiàn)此目的，設(shè)計用于多重RT-PCR的多重引物混合物使得經(jīng)擴增靶序列可經(jīng)適當限制酶裂解，且可進行藉由DNA接合的共價連接(引物設(shè)計描述于「引物混合物及設(shè)計」部分中)。在以該多重引物混合物進行多重RT-PCR擴增的后，向混合物中添加形成耙序列兼容端(compatibleend)所需的限制酶以及連接酶。盡管可進行純化，但在此步驟之前無需PCR產(chǎn)物的純化。組合限制裂解及接合的反應溫度大約介于0與40。C之間。然而，若混合物中仍存在來自多重PCR反應的聚合酶，則低于室溫的培養(yǎng)溫度為優(yōu)選的，最佳為介于4與16。C之間的溫度。在本發(fā)明的另一具體實例中，藉由多重RT-PCR擴增的多個感興趣的核苷酸序列是藉由重組而連接。在此方法中，所擴增的靶序列可使用相同重組位點連接。接著藉由添加促進重組的重組酶來進行連接。一些合適的重組酶系統(tǒng)為具有不同F(xiàn)RT位點的Flp重組酶、具有不同lox位點的Cre重組酶、進行attP位點與attB位點之間的重組的整合酶OC31、(3-重組酶-六系統(tǒng)以及Gin-gix系統(tǒng)。已例示兩個核苦酸序列(與V^連接的Vh)的重組連接(Chapal,N.等人，1997BioTechniques23，518-524)。在本發(fā)明的優(yōu)選具體實例中，感興趣的核苷酸序列包含編碼可變區(qū)的序列且連接產(chǎn)生編碼可變區(qū)的序列的關(guān)聯(lián)對。該關(guān)聯(lián)對除可變區(qū)的外可包含一或多個編碼恒定區(qū)的序列。優(yōu)選地，恒定區(qū)為人類起源的且可變區(qū)關(guān)聯(lián)對為不同起源的，諸如小鼠、大鼠或兔。在本發(fā)明的甚至更優(yōu)選具體實例中，感興趣核苷酸序列包含編碼免疫球蛋白可變區(qū)的序列且連接產(chǎn)生編碼輕鏈可變區(qū)及重鏈可變區(qū)的序列的關(guān)聯(lián)對。該關(guān)聯(lián)對除可變區(qū)的外可包含一或多個編碼恒定區(qū)的序列。此外，可自來源于含有淋巴細胞的細胞部分(諸如全血、單核細胞或白血球)所富集的B-淋巴細胞謙系的細胞的模板分離該關(guān)聯(lián)對。在本發(fā)明的另一具體實例中，感興趣的核苷酸序列包含編碼TcR可變區(qū)的序列且連接產(chǎn)生編碼a鏈可變區(qū)及P鏈可變區(qū)的序列或編碼Y鏈可變區(qū)及5鏈可變區(qū)的序列的關(guān)聯(lián)對。該關(guān)聯(lián)對除可變區(qū)的外可包含一或多個編碼恒定區(qū)的序列。此外，可自來源于含有淋巴細胞的細胞部分(諸如全血、單核細胞或白血球)所富集的T-淋巴細胞i普系的細胞的模板分離該關(guān)聯(lián)對。本發(fā)明的另一方面為利用基因多樣化細胞群作為模板源的多重RT-PCR。大多數(shù)編碼異質(zhì)蛋白的序列不隨細胞變化，來自結(jié)合蛋白的編碼可變區(qū)的序列亦如此。因此，當利用本發(fā)明來克隆該編碼非可變的異質(zhì)蛋白的序列時，無需進行單細胞的最初分離。在本發(fā)明的此具體實例中，多個感興趣的非鄰接核苷酸序列是藉由包含如下步驟的方法隨機連接使用來源于基因多樣化細胞群的模板進行感興趣核香酸序列的多重RT-PCR擴增且實現(xiàn)經(jīng)擴增的感興趣核苷酸序列的連接。此外，該方法包含進行連接產(chǎn)物的另一擴增的任選地步驟。與單細胞法一樣，連接可利用用于擴增的多重重疊延伸引物混合物或或者藉由接合或重組進行。優(yōu)選地，來源于細胞群的模板不嚴格包含于細胞內(nèi)。細胞群可(例如)被溶解。對表達變異結(jié)合蛋白的細胞群應用隨機連接的方法使得可簡化產(chǎn)生編碼可變區(qū)序列的組合文庫。優(yōu)選地，細胞群由表達可變區(qū)結(jié)合蛋白的細胞(諸如B淋巴細胞、T淋巴細胞、雜交瘤細胞、漿細胞、成漿細胞或此等細胞的混合物)構(gòu)成。上述具體實例中的細胞群可(例如)經(jīng)滲透或溶解而無需另外純化，或模板核酸可藉由標準程序自細胞分離。單步多重RT-PCR程序優(yōu)選。然而，具體實例中亦可使用兩步程序。增加多重RT-PCR連接法的特異性、敏感性及產(chǎn)量的有效方式是藉由對由多重RT-PCR獲得的經(jīng)連接核苷酸序列進行額外分子擴增，隨后藉由接合或重組連接或使用多重重疊延伸RT-PCR連接而進行。此另一擴增優(yōu)選以PCR擴增利用適于擴增感興趣的經(jīng)連接核酸序列的引物混合物進行。所利用的引物混合物可為多重引物混合物或多重重疊延伸引物混合物的外部引物，意謂退火連接至編碼經(jīng)連接可變區(qū)的序列的有意義鏈的最外5'端及3'端的引物，藉此能夠進行整個連接產(chǎn)物的擴增。外部引物亦可描述為多重重疊延伸引物混合物的不含重疊延伸尾的引物。或者，嵌套式(nested)或半嵌套式引物(semi-nestedprimer)組可用于另一擴增經(jīng)連接核普酸序列。該嵌套式PCR尤其用于增加方法的特異性以及增加連接產(chǎn)物的量。對于本發(fā)明而言，認為半嵌套式PCR(如題為引物混合物及設(shè)計的部分所述)像嵌套式PCR—樣起作用。因此，需要(盡管對本發(fā)明而言不必要)優(yōu)選使用嵌套式PCR或半嵌套式PCR對來自多重重疊延伸RT-PCR的經(jīng)連接產(chǎn)物或藉由接合或重組連接的產(chǎn)物進行額外PCR擴增?？墒褂枚嘀刂丿B延伸RT-PCR反應產(chǎn)物或接合產(chǎn)物或重組產(chǎn)物的部分或全部或此等產(chǎn)物中任一者的部分或使用來自此等反應中任一者的經(jīng)部分純化的連接產(chǎn)物(例如)藉由進行連接產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳且切除對應于預期尺寸的編碼經(jīng)連接可變區(qū)的序列的片段直接進行另一擴增。對于藉由多重重疊延伸RT-PCR連接的產(chǎn)物，優(yōu)選對來自多重重疊延伸RT-PCR反應的部分直接進行另一擴增，因為此將幫助在第一反應中未連接的個別靶序列得以連接。感興趣的序列本發(fā)明感興趣的核苷酸序列可選自編碼不同子單元或域的序列，其在表達時形成蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分。該由至少兩個不同子單元構(gòu)成的蛋白質(zhì)稱為異質(zhì)蛋白。異質(zhì)蛋白常見于所有物種中。該蛋白質(zhì)所屬的類別中的一些為(例如)酶、抑制劑、結(jié)構(gòu)蛋白、毒素、通道蛋白、G蛋白、受體蛋白、免疫球蛋白超家族蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白等。編碼該異質(zhì)蛋白的核苷酸序列為非鄰接的，意謂(例如)其源自不同基因或不同mRNA分子。然而，本發(fā)明所用的非鄰接亦可意謂編碼同一蛋白域的核苷酸序列，其中該蛋白域是由非感興趣的核苷酸序列隔開。在本發(fā)明的一實施例中，感興趣的核苷酸序列含有來自免疫球蛋白超家族(諸如免疫球蛋白(抗體))、B細胞受體及T細胞受體(TcR)的編碼可變區(qū)的序列。來自免疫球蛋白的編碼可變區(qū)的序列尤其受關(guān)注。該編碼可變區(qū)的序列包含全長抗體以及Fab、Fv、scFv及編碼可變區(qū)的序列的片段組合，例如互補決定區(qū)(CDR)、連接基因(joininggenes)或V基因或其本申請案使得能夠僅連接編碼產(chǎn)生Fv或scFv的重鏈及輕鏈可變域的序列?；蛘撸麄€輕鏈與重鏈可變區(qū)+恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域CHI+鉸鏈區(qū)的部分的連接產(chǎn)生Fab、Fab'或F(ab)2。此外，可能會向可變重鏈中添加重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的任何區(qū)，藉此產(chǎn)生編碼全長抗體的序列或編碼截斷抗體的序列。在人類/非人類抗體，優(yōu)選為具有人類恒定區(qū)的嵌合抗體。在本發(fā)明的另一具體實例中，編碼可變區(qū)的序列包含編碼一個類型的免疫球蛋白輕鏈(k或人)的序列及編碼一個免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的序列。此是藉由選擇僅擴增輕鏈及重鏈的一個同型的引物實現(xiàn)。該同型亦可藉由自一或多個特定重鏈及輕鏈同型連接或剪接人類恒定區(qū)來確定。來源于T細胞受體(TcR)的編碼可變區(qū)的序列亦受到關(guān)注。該編碼TcR的序列包含全長a及(3鏈或y及s鏈以及可溶TcR或僅此等鏈或其單鏈融合蛋白的可變域(例如單鏈a(3或單鏈"y5)的編碼序列。模板源本發(fā)明的一特征為連接來源于未分離入單獨容器中的分離的單細胞、同基因細胞群或基因多樣化細胞群的核苷酸序列的能力。本發(fā)明的優(yōu)選特征為將分離的單細胞或同基因細胞群用作模板源，因為可避免感興趣核酸序列的不規(guī)則性，尤其編碼可變區(qū)的序列的不規(guī)則性。若希望獲得(例如)編碼可變區(qū)的序列的初始對，則此為重要的。本發(fā)明的另一優(yōu)選特征為自包含淋巴細胞的細胞部分(諸如B淋巴細胞、T淋巴細胞、漿細胞和/或不同發(fā)育階段的此等細胞鐠系)獲得單細胞或單細胞群。表達來自免疫球蛋白超家族的結(jié)合蛋白的其它細胞群亦可用于獲得單細胞。諸如雜交瘤細胞、B淋巴細胞或T淋巴細胞譜系的細胞系或病毒永生化細胞系的細胞系或供體來源的參與免疫反應的細胞亦可應用于本發(fā)明。供體來源的含有淋巴細胞的細胞部分可自該細胞中富集的自然組織或液體(例如血液、骨髓、淋巴結(jié)、脾臟組織、扁桃體組織)或自胂瘤的中或周圍的滲入物或發(fā)炎組織滲入物獲得。優(yōu)選地，在非人類動物的狀況下，使用脾臟組織或骨髓。對于所要耙而言，供體可為未免疫(naiVe)供體或高免疫供體。對所要靶具有結(jié)合特異性的抗原結(jié)合蛋白的分離而言，高免疫供體優(yōu)選。該高免疫供體可為經(jīng)靶或靶片段免疫的供體，或其可為恢復期患者或?qū)Π羞\行自然免疫反應的不健康個體(例如自體免疫患者、癌癥患者)、患有傳染性疾病的患者(例如HIV患者、A型、B型或C型肝炎患者、SARS患者等)或患有慢性疾病的患者。然而，在尤其優(yōu)選具體實例中，供體為經(jīng)諸如癌癥中涉及的人類蛋白(諸如EGFR)的人類自體抗原免疫的非人類動物。對用于本發(fā)明而言，細胞供體與待以可由本發(fā)明的經(jīng)連接核苷酸序列獲得的產(chǎn)物處理的物種可為相同物種。優(yōu)選地，細胞供體為家庭動物、寵物、人類。本發(fā)明的特定特征為其使得能夠產(chǎn)生用以產(chǎn)生人類治療中所用的嵌合抗體的嵌合人類/非人類抗體文庫。當抗體是針對所謂自體抗原(亦即人類抗原)時，該方法為優(yōu)選的。供體亦可為轉(zhuǎn)基因動物，尤其為轉(zhuǎn)基因小鼠。攜帶人類免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動物描述于美國專利第6，111，166號及Kuroiwa，Y.等人NatureBiotechnology;2002;20:889-893中。該轉(zhuǎn)基因動物能夠產(chǎn)生人類免疫球蛋疫技術(shù)產(chǎn)生。此允許產(chǎn)生編碼對于較為困難的靶(諸如對其不存在自然人類抗體反應或存在有限自然人類抗體反應的人類抗原)具有特異性的結(jié)合蛋白的文庫。該轉(zhuǎn)基因動物同樣可經(jīng)研發(fā)以產(chǎn)生人類T細胞受體。在本發(fā)明的另一具體實例中，含有淋巴細胞的細胞部分是由自供體所獲得的全血、骨髓、單核細胞或白血球構(gòu)成?？勺匝?、骨髓、淋巴結(jié)、脾臟、癌細胞周圍的滲入物及發(fā)炎滲入物分離單核細胞。可藉由例如發(fā)克梯度(Ficollgradient)的密度離心技術(shù)分離單核細胞。若單核細胞是自由組織構(gòu)成的樣本分離，則在進行梯度離心分離之前使組織分解。舉例而言，可藉由諸如研磨、電穿孔的機械方法和/或藉由諸如酶處理的化學方法進行分解?？墒褂冒准毎コg(shù)(leukopheresis)自供體直接分離白血球。本發(fā)明亦可使用(例如)含有淋巴細胞的骨髓或組織的未加工制劑。該制劑將需要(例如)如上文所述經(jīng)分解以促進單細胞分布。本發(fā)明的另一特征為含有淋巴細胞的細胞部分(例如全血、單核細胞、白血球或骨髓)相對于特定淋巴細胞群(諸如來自B淋巴細胞或T淋巴細胞錯系的細胞)的富集?？?例如)使用磁珠細胞分選(MACS)或熒光活化細胞分選(FACS)利用譜系特異性細胞表面標記蛋白(諸如CD19)或其它B細胞譜系特異性標記(諸如B220)進行B淋巴細胞的富集。T淋巴細胞的富集可(例如)利用諸如CD3的細胞表面標記或其它T細胞鐠系特異性標記進行。本發(fā)明的優(yōu)選特征為使富集的B淋巴細胞進一步分選以獲得漿細胞，隨后將細胞分別分布于多個容器中。漿細胞的分離一般是藉由MACS分選或FACS分選利用諸如CD19的表面標記進行。亦可利用其它漿細胞特異性表面標記或其組合，例如CD138、CD43、CD19、MHC-II，標記的精確選擇視漿細胞源(例如脾臟、扁桃體、血液或骨髓)而定。表面標記的精確選擇當然亦視分離出細胞的物種而定。在本發(fā)明的一方面中，用于分選和/或選擇細胞的標記為CD43和CD138或MHCII和B220或直向同源物。優(yōu)選地，標記組合為CD43和CD138,且所選擇的細胞優(yōu)選相對于選擇或分離出細胞的包含淋巴細胞的細胞群中等或高表達此等標記。更加優(yōu)選地，CD43和CD138的表達含量相對于選擇或分離出細胞的包含淋巴細胞的細胞群為高的。亦可自由任何此等來源所獲得的含有非富集淋巴細胞的細胞群獲得漿細胞。與血液分離的漿細胞有時稱為早期漿細胞或成漿細胞。在本發(fā)明中，此等細胞亦稱為漿細胞。漿細胞為分離編碼免疫球蛋白的序列的關(guān)聯(lián)對所需，因為較高頻率的此等細胞產(chǎn)生對所要抗原反映獲得的免疫性的抗原特異性抗體且大多數(shù)細胞已經(jīng)歷體細胞超突變且因此編碼高親和力抗體。此外，漿細胞的mRNA含量相較于剩余B淋巴細胞群升高，因此使用單漿細胞時逆轉(zhuǎn)錄程序更為有效。作為漿細胞分離的替代，可利用諸如CD27及IgG的細胞表面標記使記憶B細胞自含有淋巴細胞的細胞部分分離。本發(fā)明的替代特征是在將細胞分布于多個容器中之前選擇富集的B淋巴細胞用于抗原特異性。藉由使富集的B淋巴細胞與所要抗原接觸使抗原能與表面暴露的免疫球蛋白結(jié)合，隨后使結(jié)合物分離來進行抗原特異性B淋巴細胞的分離。舉例而言，此可藉由生物素標記所要抗原隨后進行合適細胞分選技術(shù)來進行。若需要，則可針對抗原特異性使?jié){細胞以及B淋巴細胞、非富集單核細胞、白血球、全血、骨髓或組織制劑分離。本發(fā)明的另一特征為使用諸如CD27的表面標記分選富集的T淋巴細胞(例如，CD3陽性細胞)以獲得記憶T細胞的部分。亦可使用MHC肽復合物針對MHC抗原特異性選擇T淋巴細胞(例如，Callan，M.F等人1998.J.Exp.Med.187,1395-1402;Novak，E丄等人1999.J.Clin.Invest104，R63-R67)。作為分選表達某些表面標記的細胞(亦即陽性選擇)的替代，可以想象未表達標記的細胞自細胞組合物耗盡，留下實際上表達該標記的細胞。本發(fā)明的另一特征為上文所述的任一分離的細胞部分(例如，B淋巴細胞、漿細胞、記憶細胞或T淋巴細胞)的永生化(immortalization)。可在細胞分布之前(例如)以Epstein-Barr病毒進行永生化(Traggiai，E.等人，2004.NatMed10，871-875)?；蛘?，分離的單細胞可在逆轉(zhuǎn)錄之前經(jīng)永生化及擴展。Traggiai等人，NatMed.2004Aug;10(8):871-5。本發(fā)明的另一特征為將所要細胞群(例如，雜交瘤細胞、B淋巴細胞或T淋巴細胞鐠系的細胞系、全血細胞、骨髓細胞、單核細胞、白血球、B淋巴細胞、漿細胞、抗原特異性B淋巴細胞、記憶B細胞、T淋巴細胞、肽/MHC-特異T淋巴細胞或記憶T纟田月包)分別分布于多個容器中以獲得分離的單細胞群。此單細胞的分離是指以單獨容器含有單細胞，或微陣列、芯片或凝膠基質(zhì)以產(chǎn)生單細胞的方式裝載的方式自細胞群物理分離細胞。可將細胞藉由限制稀釋法直接分布于眾多容器中，諸如單獨容器的數(shù)組中。本發(fā)明所用的單獨容器優(yōu)選為此等可用于PCR(例如，PCR管及96孔或384孔PCR培養(yǎng)盤或較大容器數(shù)組)中者。然而，亦可使用其它容器。當將單細胞分布于大量單獨容器(例如，384孔培養(yǎng)盤)中時，獲得單細胞群。例如，可藉由將一定量分配于平均包括1、0.5或0.3個細胞的細胞濃度的單獨容器中，藉此獲得平均含有單細胞或更少的容器來進行該分布。因為藉由限制稀釋法進行的細胞分布為統(tǒng)計學事件，所以部分容器會為空，大部分將含有單細胞且小部分將含有兩個或兩個以上細胞。當容器中存在兩個或兩個以上細胞時，存在于容器中的細胞中可發(fā)生一些編碼可變區(qū)的序列的不規(guī)則性。然而，因為此為次要事件，所以此將不影響本發(fā)明的全面效用。此外，不具有所要結(jié)合親和力及特異性的編碼可變區(qū)的序列的組合最不可能被選擇且因此在篩選過程期間被消除。因此，不規(guī)則性的次要事件將不會顯著影響本發(fā)明的最終文庫。存在藉由(例如)使用諸如FACS機器或可經(jīng)程序化以將單細胞精確分配于單獨容器中的機器人的細胞分選器的限制稀釋法進行細胞分布的替代。此等替代為優(yōu)選的，因為其較不費力且在均一獲得單細胞至單個容器中的分布方面更為有效。進行上文所述的富集、分選及分離程序使得大部分細胞保持完整。富集及分選期間細胞的破裂可能會導致編碼可變區(qū)的序列的不規(guī)則性。然而，不預期此為難題，因為預期破裂的頻率較低。在分布于單獨容器中之前洗滌且可能的細胞RNAse處理將會移除任何在加工中泄漏的RNA。此外，當慮及如何分布細胞以獲得單獨容器群中的單細胞群的上文的描述時，不應將其解釋為每一容器必須含有單細胞的絕對必需特征。更確切言的，其表明大多數(shù)容器含有單細胞，例如具有兩個或兩個以上細胞的容器數(shù)目低于所分布細胞總量的25%,或甚至優(yōu)選其低于10%。本發(fā)明的另一特征為使用來源于分別分布于多個容器中的細胞的模板進4亍逆轉(zhuǎn)錄。為逆轉(zhuǎn)錄(RT)起見，根據(jù)本發(fā)明，認為用作RT的模板源的單細胞內(nèi)的核酸是來源于單細胞，盡管其不必自此單細胞的剩余內(nèi)容物分離。當已進行單細胞至其單獨容器的最終分布時，單細胞可經(jīng)擴展以在逆轉(zhuǎn)錄之前獲得同基因細胞群。此方法產(chǎn)生較多待用作模板的mRNA,若待擴增及連接稀有靶則其可為重要的。然而，細胞在擴展期間應保持與靶基因遺傳上一致。分離的細胞或同基因細胞群可保持完整或經(jīng)溶解，只要逆轉(zhuǎn)錄的模板未降解。優(yōu)選地，細胞經(jīng)溶解以便于接下來的逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴增。在本發(fā)明的不同具體實例中，所揭示的多重重疊延伸RT-PCR法或多重RT-PCR隨后藉由接合或重組連接亦可用于來源于基因多樣化細胞群的模板，該細胞未分離入單獨容器中但所有均保持在一起以作為細胞池。此方法可用于產(chǎn)生組合文庫。該方法將不需要分布單細胞。然而，可用于此方法的細胞與此等描述用于單細胞法者相同，例如經(jīng)分選B淋巴細胞或T淋巴細胞的群(池)。當對該細胞群進行單步多重重疊延伸RT-PCR或單步多重RT-PCR隨后藉由接合或重組進行連接時，優(yōu)選在反應之前使細胞溶解，且若需要則可自溶解產(chǎn)物分離總RNA或mRNA。本發(fā)明的單步多重重疊延伸RT-PCR的敏感性使得能夠使用極低量的模板，例如對應于單細胞溶解產(chǎn)物的模板的量。引物混合物及設(shè)計本發(fā)明的引物混合物包含形成引物組(2x2)的至少四個引物，其能擴增至少兩個感興趣的不同靼序列。兩個或兩個以上該引物組的混合物構(gòu)成多重引物混合物。優(yōu)選地，多重混合物包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150個引物組(引物對)。尤其對于編碼可變區(qū)的序列的擴增而言，多重引物混合物內(nèi)的個別引物組可構(gòu)成若干兩個以上引物。優(yōu)選地，個別引物組包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、45、50、60、70、80、卯、100、110、120、130、140、150、160、170、180、l卯、200220、240、260、280或300個引物。優(yōu)選地，多重引物混合物中的引物總數(shù)至少為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、45、50、60、70、80、90、100、125、150或200個且最多為225、250、275、300、325、350、375或400個引物。本發(fā)明的所有引物包含基因特異性區(qū)，且優(yōu)選所有引物在引物5'端另外裝配有引物尾，亦即與基因特異性引物部分的3'端融合的5'非編碼序列。該引物尾大約為6至50個核苷酸長，但若需要其亦可更長。在擴增后，將引物尾添加至把序列中。本發(fā)明的引物尾(例如)為克隆尾及連接尾，諸如適于藉由接合連接的尾，適于藉由重組連接的尾或重疊延伸尾?？寺∥部蔀?至20個核苷酸長或更長，且包含限制位點和/或重組位點，其適用于將經(jīng)連接產(chǎn)物插入適當載體中。為了能夠藉由接合連接，多重引物混合物的引物組經(jīng)設(shè)計以使得第一引物組的一部分(正向或反向引物)裝配有含有限制位點的連接尾，其在裂解后將與位于第二引物組的一部分的連接尾中的限制位點兼容。為了連接兩個以上靶序列，第二引物組的第二部分裝配有限制位點，其在裂解時將與位于第三引物組的一部分中的限制位點兼容。位于第二引物組的第二限制位點應與第一引物組的此等不相容。相當數(shù)目的靶序列可藉由以此方式設(shè)計引物組而連接。應選擇靶序列中具有低頻率或不發(fā)生的限制位點此外，兼容限制位點最好不同，使得連接位點對于所用的特定限制酶變得具有裂解抗性。此將驅(qū)使反應連接靶序列l(wèi)與靶序列2，因為相同靶序列之間的連接將會被限制酶裂解。合適限制位點對為(例如)Spel與Xbal(或者Nhel或AvrII可取代此等中的一者或兩者)、Ncol與BspHI、EcoRI與Mfel或Pstl與Nsil。對于連接而言，Spel可(例如)位于靶序列1中，Xbal可位于靶序列2中，Ncol可位于靶序列2的另一端，且BspHI在靶序列3中，等等。為進一步簡化該方法，若限制酶在相同緩沖液中起作用則為有利的。為使得能夠藉由重組進行連接，多重引物混合物的引物組可(例如)如以引用的方式并入本文中的Chapal的論文(1997BioTechniques23,518-524)中所例示設(shè)計。為使得能夠以與多重PCR擴增相同的步驟連接感興趣的核苷酸序列，向多重引物混合物的各引物組的至少一個引物中添加適于重疊延伸PCR的尾，藉此產(chǎn)生多重重疊延伸引物混合物。重疊延伸尾通常較長，長度在8至75個核苦酸的范圍且可含有限制位點或重組位點，其允許隨后在諸如scFv中插入調(diào)節(jié)組件(諸如啟動子、核糖體結(jié)合位點、終止序列或接頭序列)。若需要，則重疊延伸尾亦可含有終止密碼子。一般而言，存在三種類型的重疊延伸尾，如WO2005/042774的圖1中所說明。在I型中，兩個引物組的重疊延伸尾僅此此重疊。兩個重疊延伸尾的所有核苷酸不必均此此互補。在本發(fā)明的一方面中，互補核芬酸代表60至85。/。重疊延伸尾。在II型重疊延伸尾中，4至6個5'核苦酸與相鄰靶序列的基因特異性區(qū)互補。在III型重疊延伸尾中，整個重疊部分與相鄰靶序列互補。當調(diào)節(jié)組件及其類似物隨后待插入經(jīng)連接耙序列之間時，I型及II型重疊延伸尾優(yōu)選。若靶序列待如scFv所見由限定接頭連接，則II型重疊延伸尾優(yōu)選。若扭序列待此此符合讀框地連接，則m型重疊延伸尾優(yōu)選。重疊延伸尾的設(shè)計視序列特征而定，諸如長度、相對GC含量(GC0/。)、限制位點的存在、回文序列、解鏈溫度、其所偶合的基因特異性部分，等。重疊延伸尾的長度應介于8與75個核苷酸長之間，其優(yōu)選為15至40個核苷酸長。甚至更加優(yōu)選地，其為22至28個核苷酸長。極長重疊延伸尾(50至75個核苷酸)的使用可利于由各引物組所產(chǎn)生的產(chǎn)物的連接。然而，重疊延伸尾與基因特異性區(qū)長度之間的比例在使用極長重疊延伸尾時可能將需要經(jīng)調(diào)整。GC。/。的選擇視重疊延伸尾的長度而定。因為較短尾具有較短的互補區(qū)域，其比較長的尾需要較高GC。/。以增強相互作用。同樣應遵守引物設(shè)計的其它原則，例如引物二聚及發(fā)夾形成應最小化。其亦不應參與到錯誤引發(fā)(falsepriming)中。此外，已知TaqDNA聚合酶通常在新近合成的DNA鏈的3'端添加腺苦(A)，且此可藉由使重疊延伸尾能容納3'非模板A添加而適用于重疊延伸尾設(shè)計。選擇攜帶連接尾(例如，重疊延伸尾、適于藉由接合(ligation)連接的尾或適于藉由重組連接的尾)的引物可界定靶序列的連接的順序及方向。對于本發(fā)明而言，引物組時正向引物還是反向引物還是可能為裝配有連接尾的正向及反向引物兩者并非必要。然而，無論如何應對此進行一些考慮，因為最終產(chǎn)物中靶序列的順序及方向可能具有相關(guān)性，例如對于插入諸如對于兩個感興趣核苷酸序列的連接而言，可向用于各靶序列的PCR擴增的各引物組的反向引物或正向引物中添加連接尾。本發(fā)明例示重疊延伸尾及適于藉由接合連接的尾向各組的mVH及mVK正向引物中的添加。此導致產(chǎn)物的連接方向為5'至5'(頭對頭及雙向)。然而，亦可向各組的反向引物中添加連接尾。此導致產(chǎn)物的連接方向為3'至3'(尾對尾及雙向)。第三選擇為向第一引物組的反向引物及第二引物組的正向引物中添加連接尾或向第一引物組的正向引物及第二引物組的反向引物中添加連接尾。此導致3'至5'方向(頭對尾及單向)。當連接兩個以上感興趣的核苷酸序列時，一些引物組需要在正向及反向引物兩者上皆具有連接尾，使得一個尾與先前引物組的尾互補且另一尾與隨后引物組的一個引物互補。此原則適用于擴增待在兩個其它靶序列之間連接的靶序列的所有引物組?；蛱禺愋砸锊糠值脑O(shè)計一般應遵循已知引物設(shè)計規(guī)則，諸如使引物二聚、發(fā)夾形成及非特異性退火最小化。此外，若可能則應避免多個G或C核苷酸為3'堿基。引物組中基因特異區(qū)的解鏈溫度(Tm)優(yōu)選應等于此此力o/減5。C。在本發(fā)明中，介于45。C與75。C之間的Tm值為所要的且約60。C的Tm值對于多數(shù)應用為最佳的。有利地，可藉由針對此任務研發(fā)的計算機程序幫助初始引物設(shè)計。然而，引物設(shè)計一般需要實驗室測試及路徑優(yōu)化。舉例而言，此可藉由分析尺寸、限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)及使用引物組獲得的擴增產(chǎn)物的測序來實現(xiàn)。當以可變區(qū)擴增序列或當探求屬于特定類別蛋白的新家族成員時，在引物內(nèi)使用簡并位置(degenerateposition)為適用方法。簡并位置數(shù)亦可能需要優(yōu)化。本發(fā)明的一特征為由至少兩個引物組構(gòu)成的引物混合物，其能夠引發(fā)擴增且促進至少兩個感興趣的核苦酸序列的連接。本發(fā)明的引物混合物能夠引發(fā)來自例如屬于酶、抑制劑、結(jié)構(gòu)蛋白、毒素、通道蛋白、G蛋白、受體蛋白、免疫球蛋白超家族蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白等類別的異質(zhì)蛋白(優(yōu)選為免疫球蛋白)的至少兩個子單元或域擴增。本發(fā)明的另一特征為包含引物組的多重重疊延伸引物混合物，其中各引物組的至少一個引物組成員包含能夠與第二引物組的引物組成員的重疊延伸尾雜交的重疊延伸尾。重疊延伸尾使感興趣的核苷酸在多重重疊延伸PCR擴增期間能夠藉由此不意謂在此第一PCR擴增期間必須發(fā)生連接。視反應裝^(reactionsetup)而定，大多數(shù)實際連接可在與第一PCR擴增的外部引物進行另一擴增(多重PCR擴增)期間進行。本發(fā)明的另一特征為經(jīng)設(shè)計以擴增含有編碼可變區(qū)的序列的核苷酸序列家族的引物組。該家族的實例為來自免疫球蛋白的k輕鏈(例如，小鼠中的VK1-19)、X輕鏈(例如，小鼠中的VLl-8)及可變重鏈(例如，小鼠中的Vh1-15)及oup、y或STcR可變區(qū)。用于擴增含有編碼可變區(qū)的序列的核苷酸序列家族的引物組通常包含多個引物，其中若千引物可為簡并引物(degenerateprimer)。編碼免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的序列家族的擴增是(例如)使用由與k鏈的可變區(qū)的5'端(mVK引物)或k前導序列和/或入鏈或？i前導序列(正向引物)以及恒定區(qū)k(mKapparl引物)和/或人引物(反向引物)互補的多個引物或多個該引物構(gòu)成的引物組進行?；蛘?，輕鏈連接區(qū)引物可用作反向引物而非恒定區(qū)引物。或者，可使用在可變輕鏈之前導序列之前的UTR區(qū)中退火的正向引物。同樣，編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的序列的家族可利用各種引物組合以一個引物組擴增。舉例而言，多個引物與重鏈可變區(qū)的5'端(hiVh引物)或此區(qū)之前導序列(正向引物)以及多個重鏈連接區(qū)引物或重鏈恒定區(qū)引物(反向引物)互補。mCH引物可為同型特異性的且原則上可使用任何mCH引物，亦可使用將產(chǎn)生全長重鏈者。優(yōu)選地，使用不擴增全長重鏈的mCH引物以使能夠添加人類重鏈恒定區(qū)?；蛘撸墒褂迷诳勺冎劓溨皩蛄兄暗腢TR區(qū)中退火的正向引物。若觀測到可變區(qū)引物歸因于高程度序列相似性的交叉雜交(cross-hybridization),則使用在前導序列中而非可變區(qū)的5'端退火的正向引物尤其適用。將會自最終蛋白消除由于使用前導引物的交叉雜交而產(chǎn)生的突變，因為前導序列在細胞內(nèi)蛋白加工期間裂解。本發(fā)明的一特征為在編碼可變區(qū)的序列之前之前導編碼序列(leaderencodings叫uence)的3'端退火的引物，及其用于擴增編碼可變區(qū)的序列的用途。在本發(fā)明的一具體實例中，用于多重重疊延伸PCR且亦可能會用于逆轉(zhuǎn)錄步驟的多重重疊延伸？I物混合物包含a)至少一個與編碼免疫球蛋白輕鏈區(qū)的序列的有意義鏈互補的mKapparl或hmJK引物；b)至少一個與編碼免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的序列或輕鏈可變區(qū)前導序列的反義鏈互補且能夠與步驟a)中的引物形成引物組的mVK引物；a)至少一個與編碼免疫球蛋白重鏈域的序列的有意義鏈互補的mCHrevl、mHCrevl-ext或mJH引物；及b)至少一個與編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的序列或重鏈可變區(qū)前導序列的反義鏈互補且能夠與步驟c)中的引物形成引物組的mVH引物。在本發(fā)明的一具體實例中，輕鏈引物適于擴增編碼k及X輕鏈可變區(qū)的序列。在本發(fā)明的另一具體實例中，免疫球蛋白mVK引物攜帶連接尾，該連接尾優(yōu)選為互補重疊延伸尾的形式。此產(chǎn)生以頭對尾方式連接的編碼可變區(qū)的序列。對于編碼可變區(qū)的序列的頭對頭方式的連接而言，mKapparl及mVH引物含有連接尾或mVK及mCHrevl引物含有連接尾，該連接尾優(yōu)選為互補重疊延伸尾的形式。對于編碼可變區(qū)的序列的尾對尾方式的連接而言，mCH及mKapparl引物含有連接尾，該連接尾優(yōu)選為互補重疊延伸尾形式。優(yōu)選地，本發(fā)明的包括多重重疊延伸引物混合物的多重引物混合物包含兩個引物組。因此，多重引物混合物包含至少四個不同引物。在本發(fā)明的另一方面中，多重引物混合物包含四個以上不同引物。本發(fā)明的多重引物混合物是用于在單獨容器中擴增靶序列。舉例而言，k、X及重鏈可變區(qū)可在同一容器中擴增。本發(fā)明亦涵蓋用于由多重RT-PCR隨后藉由接合或重組連接或藉由多重重疊延伸RT-PCR獲得的連接產(chǎn)物的額外PCR擴增的引物。可使用適于擴增經(jīng)連接靶序列的引物混合物進行此額外PCR擴增。該引物混合物可包含多重引物混合物或多重重疊延伸引物混合物的外部引物，意謂退火至經(jīng)連接核苷酸序列的有意義鏈的最外5'端及3'端的引物，藉此能夠選擇性進行整個連接產(chǎn)物的擴增。此方法一般用于增加由多重RT-PCR隨后藉由接合或重組連接或由多重重疊延伸RT-PCR獲得的連接產(chǎn)物的量?；蛘?，相較于初級多重RT-PCR或多重重疊延伸RT-PCR反應中所用的外部引物為嵌套式的引物組可用于另一擴增經(jīng)連接核苷酸序列。在本發(fā)明中，該引物組稱為嵌套式引物組。嵌套式引物的設(shè)計一般遵循與先前所述的基因特異性引物相同的設(shè)計規(guī)則，其中例外為其將3'部分或完全引發(fā)至多重RT-PCR或多重重疊延伸RT-PCR中所用的外部引物的連接位置。由嵌套式PCR產(chǎn)生的產(chǎn)物因此可比由經(jīng)多重RT-PCR隨后藉由接合或重組連接或藉由多重重疊延伸RT-PCR獲得的經(jīng)連接產(chǎn)物短。除增加連接產(chǎn)物的量以外，嵌套式PCR進一步用于增加總體特異性，尤其多重重疊延伸RT-PCR技術(shù)的特異性。然而，應注意，當進行另一擴增時并非所有先前所述的多重引物混合物/多重重疊延伸引物混合物適于與嵌套式引物組組合。在該狀況下，多重引物混合物/多重重疊延伸引物混合物的外部引物可用于另一擴增，或半嵌套式PCR可如隨后所述應用。在本發(fā)明的一具體實例中，JL與JH引物的混合物是用作編碼經(jīng)連接免疫球蛋白可變區(qū)的序列的另一擴增的嵌套式引物。本發(fā)明的嵌套式引物組亦可包含來自第一多重引物混合物/多重重疊延伸引物混合物的反向(或正向)外部引物及引發(fā)3'至第一多重引物混合物/多重重疊延伸引物混合物的正向(或反向)引物的退火位置的第二嵌套式引物。將該引物組用于額外PCR擴增一般稱為半嵌套式PCR。若因為引物必須在互補決定區(qū)(CDR)中退火而難以在一個特異性區(qū)(例如，可變區(qū)序列)中設(shè)計該嵌套式引物則可應用(例如)半嵌套式PCR。此外，當想要保持經(jīng)連接序列的一端完整(例如為克隆目的)時，可使用半嵌套式PCR。多重重疊延伸PCR的最優(yōu)化兩步及單步程序的多重重疊延伸PCR步驟的參數(shù)中，可使若干參數(shù)最優(yōu)化(例如參見Henegariu,O.等人1997.BioTechniques23，504-511;Markoulatos，R等人2002.J.Clin.Lab,Anal.16，47-51)。一般而言,相同的最優(yōu)化參數(shù)適用于多重RT-PCR,盡管外部與內(nèi)部引物之間的比率對于該反應而言較不重要。a.引物濃度攜帶重疊延伸尾的引物(例如，Vh和Vl引物)的濃度優(yōu)選低于無重疊延伸尾的外部引物(例如，JH及k引物)的濃度。若靶序列中的一者因(例如)較高GC。/。而以低于其它者的效率擴增，則可能均衡擴增功效。此可藉由使用較高濃度的以低效率介導擴增的引物組或藉由降低其它引物的濃度來實現(xiàn)。舉例而言，編碼重鏈可變區(qū)的序列傾向于具有較高GC。/。且因此比輕鏈可變區(qū)具有較低的擴增效率。此預示使用比VH引物濃度低的Vl引物。此外，當使用大量引物時，總引物濃度可為一個問題。藉由滴定實驗實驗性測定上限。對于來自AppliedBiosystems的rAmpliTaqGold」PCR系統(tǒng)而言，發(fā)現(xiàn)上限為1.1^M寡核苷酸總濃度，然而對于其它系統(tǒng)而言，其可高達2.4pM。該寡核苦酸總濃度的上限影響個別引物的最大濃度。若個別引物濃度過低，則可能會引起不良PCR敏感性。亦已發(fā)現(xiàn)寡核苷酸引物的質(zhì)量對于多重重疊延伸PCR為重要的。經(jīng)HPLC純化的寡核香酸已產(chǎn)生最佳結(jié)果。b.PCR循環(huán)條件循環(huán)條件優(yōu)選如下變性10-30s94°C退火30-60s50-70°C比引物的Tm低約5。C延伸lminxEPL65-72°CEPL為預期產(chǎn)物長度以kb計循環(huán)數(shù)30-80最終延伸10min65-72°C對于單步多重重疊延伸RT-PCR而言，在上文列出的擴增循環(huán)之前在循環(huán)程序中建立以下步驟逆轉(zhuǎn)錄30min42-60°C當進行分開逆轉(zhuǎn)錄時亦使用此等條件。聚合酶活化10-15min95°C在單步RT-PCR中有利為熱啟動聚合酶。根據(jù)制造商進行活化?？赡軙顾写说葏?shù)最優(yōu)化。退火溫度尤其重要。因此，待構(gòu)成最終引物混合物的所有個別引物組最初應經(jīng)分開測試以鑒別最佳退火溫度及時間，以及延伸(elongation)及變性次數(shù)。此將產(chǎn)生關(guān)于此等參數(shù)于其中可針對多重重疊延伸引物混合物最優(yōu)化的窗口的好辦法?？山逵墒褂么罅繜嵫h(huán)來克服例如由于低引物濃度或模板濃度產(chǎn)生的不良PCR敏感性的問題。大量熱循環(huán)由35與80個循環(huán)之間的循環(huán)優(yōu)選約40個循環(huán)構(gòu)成。此外，較長延伸時間可改良多重重疊延伸PCR法。相較于正常1min延伸而言，長延伸時間由1.5-5minxEPL構(gòu)成。c.佐劑的使用可藉由使用諸如DMSO、甘油、甲酰胺或甜菜堿的松弛DNA因此使模板易于變性的PCR添加劑來顯著改良多重PCR反應。d.dNTP及MgCl2脫氧核苷三磷酸(dNTP)質(zhì)量及濃度對于多重重疊延伸PCR為重要的。最佳dNTP濃度是介于200與400的各dNTP(dATP、dCTP、dGTP及dTTP)之間，高于此最佳濃度則擴增迅速受到抑制。較低dNTP濃度(各dNTP為100)足以實現(xiàn)PCR擴增。dNTP儲備液對融化/冷凍循環(huán)敏感。三至五次該循環(huán)后，多重PCR通常不能良好運作。為避免該問題，可制成dNTP小等分試樣且在-20。C下保持冷凍。Mg"濃度的最優(yōu)化為關(guān)鍵的，因為多數(shù)DNA聚合酶為鎂依賴性酶。除DNA聚合酶的外，模板DNA引物及dNTP結(jié)合Mg2+。因此，最佳Mg^農(nóng)度將視dNTP濃度、模板DNA及樣本緩沖液組成而定。若引物和/或模板DNA緩沖液含有諸如EDTA或EGTA的螯合劑，則表觀Mg^最佳值可能會改變。過量的Mg"濃度使DNA雙鏈穩(wěn)定化且防止DNA完全變性，其會降低產(chǎn)量。過量Mg"亦可使引物偽退火于錯誤模板位點穩(wěn)定，藉此降低特異性。另一方面，不足Mg"濃度會降低產(chǎn)物的量。dNTP與MgCb之間的良好平衡約為200至400dNTP(每一者)至1.5至3mMMgCl2。e.PCR緩沖液濃度一般而言，基于KC1的緩沖液滿足多重重疊延伸PCR;然而基于其它諸如(NH4)2S04、MgS04、Tris-HCl或其組合的組份的緩沖液亦可最優(yōu)化以對多重重疊延伸PCR起作用。較長產(chǎn)物的擴增中所涉及的引物對在較低鹽濃度(例如，20至50mMKCl)下作用優(yōu)選，而短產(chǎn)物的擴增中所涉及的引物對在較高鹽濃度(例如，80至100mMKCl)下作用優(yōu)選。將緩沖液濃度升至2倍而非1倍可改良多重反應的效率。f.DNA聚合酶本發(fā)明以Taq聚合酶例示?；蛘?，可使用其它類型的包括(例如)Pfii、Phusion、Pwo、Tgo、Tth、Vent、Deep-vent的耐熱DNA聚合酶。不具有或具有3'至5'外切核酸酶活性的聚合酶可單獨使用或可此此組合使用。載體及文庫連接根據(jù)本發(fā)明的感興趣核苷酸序列產(chǎn)生包含編碼免疫球蛋白可變區(qū)的經(jīng)連接核香酸序列的核苷酸區(qū)段。此外，該經(jīng)連接核酸序列的文庫是藉由本發(fā)明的方法產(chǎn)生，尤其為與人類恒定區(qū)(重鏈及輕鏈)序列類似或剪接的編碼非人類可變區(qū)的序列的文庫。本發(fā)明的一特征為將含有由本發(fā)明方法產(chǎn)生的經(jīng)連接感興趣核苷酸序列或經(jīng)連接感興趣核苷酸序列文庫的區(qū)段插入合適載體中。文庫可為編碼可變區(qū)的序列的組合文庫或更加優(yōu)選地為編碼可變區(qū)的序列的關(guān)聯(lián)對文庫。由外部引物、嵌套式引物或半嵌套式引物產(chǎn)生的限制位點優(yōu)選經(jīng)設(shè)計以匹配所選載體的適當限制位點。若半嵌套式、嵌套式引物或外部引物中的一者裝配有合適重組位點且所選載體亦含有一者，則經(jīng)連接的感興趣核酸序列亦可藉由重組插入載體中?；旧?，對于可用作由本發(fā)明的多重RT-PCR連接法中的一者產(chǎn)生的產(chǎn)物載體的載體無限制。所選載體可為適于在細胞內(nèi)(例如包括細菌、酵母、其它真菌、昆蟲細胞、植物細胞或哺乳動物細胞)擴增及表達的等等。該載體可用于促進其它克隆步驟，在栽體系統(tǒng)之間穿梭、呈現(xiàn)插入載體中的產(chǎn)物、表達所插入的產(chǎn)物和/或整合于宿主細胞的基因組中?？寺〖按┧筝d體優(yōu)選為細菌載體。然而，其它類型的載體亦可用于克隆及穿梭程序中。呈現(xiàn)載體可(例如)為源自fd、M13或fl絲狀噬菌體類別的噬菌體載體或噬菌粒載體。該載體能夠促進包括(例如)結(jié)合蛋白或其片段的蛋白質(zhì)在絲狀噬菌體表面上的呈現(xiàn)。適于在核糖體、DNA、酵母細胞或哺乳動物細胞上呈現(xiàn)的呈現(xiàn)載體亦為本領(lǐng)域中已知。此等包含(例如)病毒載體或編碼嵌合蛋白的載體。表達載體以所有提及的物種存在且一種待選擇的表達載體完全視待表達的蛋白質(zhì)而定。此外，一些表達載體能夠藉由隨機整合或藉由利用適當重組位點的位點特異性整合而整合于宿主細胞的基因組中。當引入適當宿主細胞中時，表達載體可經(jīng)設(shè)計以提供額外編碼序列，當經(jīng)連接產(chǎn)物符合讀框地插入此等序列時其使能夠表達較大蛋白(例如全長單克隆抗體)。此符合讀框的插入亦可促進嵌合蛋白的表達，該嵌合蛋白促進在絲狀噬菌體或細胞的表面上呈現(xiàn)。在噬菌體呈現(xiàn)系統(tǒng)中，經(jīng)連接的感興趣核苦酸序列可符合讀框地插入諸如pIII或pVIII的編碼包衣蛋白的序列中(Barbas,C.R等人1991.Proc,Natl.Acad.Sci.USA88，7978-7982;Kang,A.S.等人1991.Proc.Natl,Acad.Sci.USA88,4363-4366)。在本發(fā)明的一具體實例中，感興趣的經(jīng)連接核苷酸序列的個別區(qū)段包含于來自一個物種的編碼免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的序列締合的編碼重鏈可變區(qū)的序列，該序列插入含有編碼一或多個人類免疫球蛋白恒定域，優(yōu)選人類輕鏈及重鏈恒定區(qū)的序列的載體中。該插入經(jīng)生物工程設(shè)計使得編碼經(jīng)連接的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的序列符合讀框地插入編碼恒定區(qū)的序列中。該插入可(例如)產(chǎn)生Fab或F(ab')2表達載體、全長抗體表達載體或編碼全長抗體的片段的表達載體。優(yōu)選地，該載體為適于表達的表達載體(例如大腸桿菌(E.COli)、噬菌?；虿溉閯游镙d體)且編碼恒定區(qū)重鏈的序列是選自人類免疫球蛋白IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD或IgE類，藉此使得能夠表達Fab或全長重組抗體。除編碼恒定重鏈的序列外，載體亦可含有選自人類x或k鏈的編碼恒定輕鏈的序列。此在產(chǎn)生嵌合抗體時優(yōu)選，因為經(jīng)連接核苦酸序列在此等狀況下僅編碼來自非人類物種的編碼免疫球蛋白可變區(qū)的序列(Fv)。在替代具體實例中，在分子擴增程序的步驟中藉由向容器中添加提供與非人類序列的重疊的人類恒定區(qū)及確?？勺兗昂愣▍^(qū)的擴增符合讀框的適當引物使人類恒定區(qū)剪接或連接至非人類可變區(qū)。以此方式可添加人類恒定k或人鏈和/或可添加人類恒定重鏈。藉由使用此程序，無需在編碼序列內(nèi)提供限制位點，此為有利的。在本發(fā)明的另一具體實例中，經(jīng)連接核苷酸序列的個別區(qū)段包含于編碼(3鏈可變區(qū)的序列締合的編碼TcRa鏈可變區(qū)的序列或與編碼S鏈可變區(qū)的序列締合的編碼y鏈可變區(qū)的序列。優(yōu)選地，將此等經(jīng)連接序列插入含有編碼一或多個TcR恒定域的序列的載體中。插入是經(jīng)生物工程設(shè)計使得所插入的編碼經(jīng)連接可變區(qū)的序列與編碼相應TcR恒定區(qū)的序列符合讀框。在另一具體實例中，該載體為包含編碼與TcR恒定區(qū)符合讀框的亮氨酸拉鏈的序列的嵌合表達載體。已展示該構(gòu)建體可增加可溶TcR的穩(wěn)定性(Willcox，B.E.等人1999.ProteinSci8，2418-2423)。方法中，將單獨關(guān)聯(lián)對個別插入合適載體中。此載體文庫接著可分開保存或匯集。在第二方法中，在載體插入之前匯集所有關(guān)聯(lián)對，隨后整體插入產(chǎn)生載體的匯集文庫的合適載體中。該載體文庫包含編碼可變區(qū)的序列的多樣性對。本發(fā)明的一方面為一種具有編碼經(jīng)連接可變區(qū)的序列的關(guān)聯(lián)對的抗體文庫。優(yōu)選地，文庫的個別抗體包含與來自一個物種的編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的序列締合的編碼輕鏈可變區(qū)的序列及人類恒定區(qū)。另一優(yōu)選關(guān)聯(lián)對文庫包含編碼經(jīng)連接TcR區(qū)的序列，其中編碼個別TcR區(qū)的序列各自包含與編碼P鏈可變區(qū)的序列締合的編碼a鏈可變區(qū)的序列和/或與編碼5鏈可變區(qū)的序列締合的編碼TcRy鏈可變區(qū)的序列。本發(fā)明的具體實例為一種編碼經(jīng)連接可變區(qū)的序列的關(guān)聯(lián)對的子文庫，其編碼針對特定耙的所要結(jié)合特異性。優(yōu)選地，此等關(guān)聯(lián)對包含編碼經(jīng)連接免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)及重鏈可變區(qū)的序列、編碼TcRa鏈可變區(qū)及p鏈可變區(qū)的序列和/或編碼TcRy鏈可變區(qū)及S鏈可變區(qū)的序列。另一具體實例為一種選自如本發(fā)明全文所述的編碼可變區(qū)的序列的關(guān)聯(lián)對親本文庫的子文庫。本發(fā)明的優(yōu)選具體實例為編碼選自人類免疫球蛋白IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4或IgM類的全長嵌合免疫球蛋白的關(guān)聯(lián)對的文庫或子文庫。本發(fā)明的另一優(yōu)選特征為一種編碼可溶及穩(wěn)定TcR關(guān)聯(lián)對的文庫或子文庫。本發(fā)明的特征為該文庫的多樣性，其包含至少5、10、20、50、100、1000、104、105或106個不同關(guān)聯(lián)對抗體。在本發(fā)明的另一具體實例中，該編碼經(jīng)連接可變區(qū)的序列的關(guān)聯(lián)對文庫可藉由包含本文所述的步驟的方法獲得。此文庫亦稱為親本文庫(parentlibrary)。篩選及選擇期望利用本發(fā)明方法中的一者自供體所分離的編碼經(jīng)連接可變區(qū)的序列的對的親本文庫表達結(jié)合蛋白的多樣性，其中一些尤其對于組合文庫而言將為不相關(guān)的，亦即不與所要靶結(jié)合。因此，本發(fā)明涵蓋編碼針對特定靶的結(jié)合特異性的多樣性子組的子文庫的富集及篩選。對于關(guān)聯(lián)對文庫而言，預期文庫多樣性表達供體材料中所存在的多樣性，其中僅微量隨機連接的可變區(qū)。因此，在篩選由關(guān)聯(lián)對構(gòu)成的文庫中的靶特異性結(jié)合親和力之前，富集步驟可以不必要。在本發(fā)明的另一具體實例中，產(chǎn)生編碼經(jīng)連接可變區(qū)的序列對的文庫的方法進一步包含藉由選擇編碼具有所要靶特異性的結(jié)合蛋白的經(jīng)連接可變區(qū)序列對的子組形成子文庫。該編碼經(jīng)連接可變區(qū)的序列的選擇亦稱為靶特異性關(guān)聯(lián)對的文庫。在本發(fā)明的優(yōu)選具體實例中，將編碼可變區(qū)的序列的靶特異性關(guān)聯(lián)對文庫轉(zhuǎn)移至表達載體中。表達載體視用于篩選的細胞類型而定可為哺乳動物表達載體、酵母表達載體、真菌表達載體、植物表達載體、細菌表達載體。優(yōu)選地，表達載體為哺乳動物。免疫學鑒定一般適于選擇編碼靶特異性免疫球蛋白可變區(qū)的序列。該鑒定為現(xiàn)有技術(shù)中熟知且由(例如)FMAT、FLISA、ELISPOT、ELISA、膜鑒定(例如，西方墨點法)、濾紙上數(shù)組(arraysonfilters)或FACS構(gòu)成。鑒定可利用由編碼免疫球蛋白可變區(qū)的序列產(chǎn)生的多肽以直接方式進行。或者，免疫鑒定可與以下富集方法一起進行或在富集方法后進行，諸如噬菌體呈現(xiàn)、核糖體呈現(xiàn)、細菌表面呈現(xiàn)、酵母呈現(xiàn)、真核病毒呈現(xiàn)、RNA呈現(xiàn)或共價呈現(xiàn)(評論于FitzGerald，K.，2000.DrugDiscov.Today5,253-258)。同源Fab表達文庫及同源全長抗體表達文庫皆可進行篩選，藉此產(chǎn)生陽性克隆的子文庫。該篩選鑒定及富集程序亦適于Fv或scFv片段或經(jīng)連接可變區(qū)的組合文庫。除免疫篩選的外，本發(fā)明的特定特征為能夠使用各種類型的功能篩選來選擇具有所要特性的分泌抗體的克隆。該篩選鑒定包括(但不限于)增殖鑒定、病毒滅活鑒定、細胞殺傷鑒定等。優(yōu)選地，可使用來自以本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)染的細胞的上清液以高產(chǎn)量(high-throughput)形式進行功能鑒定。在本發(fā)明的優(yōu)選具體實例中，對編碼可變區(qū)的序列的靶特異性關(guān)聯(lián)對或組合對的子文庫的選擇是藉由使用高產(chǎn)量篩選鑒定進行。高產(chǎn)量篩選鑒定可為(但不限于)以半自動或全自動設(shè)備進行的ELISA鑒定。此亦可為膜鑒定，其中細菌經(jīng)機器人揀選且在產(chǎn)生表達抗原結(jié)合分子的菌落陣列的瓊脂培養(yǎng)盤頂部在適當膜上劃刪格。分子經(jīng)膜分泌于下部涂有抗原的第二膜上，其可分開顯色且用于鑒別向所要靶分泌抗原結(jié)合分子的克隆(deWildt，R.M,，等人2000.Nat.Biotechnol.18,989-994)。當已藉由適當技術(shù)選擇抗原結(jié)合克隆的關(guān)聯(lián)對或組合對的子文庫時，有可能藉由編碼經(jīng)連接免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)及重鏈可變區(qū)的序列的DNA測序進行額外分析。首先，該DNA測序?qū)⑻峁╆P(guān)于文庫多樣性的信息，諸如種系起源、家族分布及CDR區(qū)內(nèi)的成熟。該分析使得能夠選擇表達寬廣多樣性的克隆且略去重復克隆。其次，DNA測序?qū)衣斗蛛x過程期間引入的突變。當分析編碼可變區(qū)的序列時，在評定突變是否可接受時存在三種類型待考慮的突變i)最常見突變類型由交叉引發(fā)產(chǎn)生，其中V基因引物由于序列相似性引發(fā)與其完全不同源的生殖是序列。所引入的改變?yōu)橛谝惶囟ㄎ恢锰幾匀淮嬖诘拿艽a子的主要取代。由于V基因序列之間的高度序列同源性。一些此等改變?yōu)轱@著的，有時不具有自然對應物。該改變可藉由產(chǎn)生新抗原決定基而潛在地影響可變區(qū)的免疫原性。該改變可易于鑒別且隨后使用標準分子生物技術(shù)修復或該克隆可自文庫排除；ii)編碼恒定區(qū)的序列中由TaqDNA聚合酶所產(chǎn)生的誤差最易于鑒別且可容易地消除。然而，Taq引起的突變當然亦將存在于編碼可變區(qū)的序列中，其中其與自然存在的體細胞突變不可區(qū)別，該體細胞突變亦為編碼可變區(qū)的序列中隨機突變的結(jié)果。慮及突變?yōu)榉侨硇缘那覂H以獨特方式影響特定對，則看似有理由忽-現(xiàn)該改變。在本發(fā)明的另一具體實例中，將編碼經(jīng)連接免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)及重鏈可變區(qū)的序列靶特異性及可能經(jīng)序列分析對的子文庫轉(zhuǎn)移至哺乳動物表達載體。該轉(zhuǎn)移可在先前部分所述的任何載體中進行，使得能夠表達全長重組抗體。若以哺乳動物同源全長抗體表達文庫進行篩選，則可能不需要該轉(zhuǎn)移。在本發(fā)明的另一具體實例中，親本文庫是自富集T淋巴細胞的含淋巴細胞的細胞部分產(chǎn)生。構(gòu)成親本文庫的編碼經(jīng)連接可變區(qū)的序列對可經(jīng)選擇用于編碼由以所要靶特異性編碼結(jié)合蛋白的a及(3和/或y及5鏈構(gòu)成的經(jīng)連接可變區(qū)序列對的子組，產(chǎn)生關(guān)聯(lián)對或組合對的子文庫。隨后可使用諸如以四聚MHC肽復合物染色(例如，Callan,M.F等人1998.J.Exp.Med.187，1395-1402;Novak,E丄等人1999.J.Clin.Invest104，R63-R67)，藉由以IL-2釋放形式測量細胞反應或藉由更多復雜方式(諸如酵母或逆轉(zhuǎn)錄病毒呈現(xiàn)技術(shù))的標準技術(shù)自經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞池鑒別抗原特異性T細胞受體宿主細"包及表達本發(fā)明的文庫可轉(zhuǎn)移至適于表達及產(chǎn)生由感興趣的經(jīng)連接核酸序列所編碼的蛋白質(zhì)，尤其含有可變區(qū)的結(jié)合蛋白或其片段的載體。該載體描述于載體及文庫部分中，且提供用于表達(例如)全長抗體、Fab片段、Fv片段、scFv、膜結(jié)合或可溶TcR或所選物種的TcR片段。文庫或編碼連接的可變區(qū)的序列關(guān)聯(lián)對的單獨克隆引入宿主細胞中以供擴增和/或表達。宿主細胞可選自細菌、酵母、其它真菌、昆蟲細胞、植物細胞或哺乳動物細胞。為表達的目的，諸如中國倉鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO)細胞、COS細胞、BHK細胞、骨髓瘤細胞(例如Sp2/0細胞、NS0)、NIH3T3、纖維母細胞的哺乳動物細胞或諸如HeLa細胞、HEK293細胞或PER.C6的經(jīng)永生化的人類細胞優(yōu)選。將載體引入宿主細胞中可藉由此等熟習本領(lǐng)域此項技術(shù)者已知的多種轉(zhuǎn)型或轉(zhuǎn)染法實現(xiàn)，包括磷酸鈣沉淀、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)粒融合、RBC重像融合(RBCghostfusion)、原生質(zhì)粒融合、病毒感染及其類似方法。單克隆全長抗體、Fab片段、Fv片段及scFv片段的產(chǎn)生為熟知的。待用于處理的重組多克隆抗體的產(chǎn)生為相當新穎的領(lǐng)域。重組多克隆制造技術(shù)已描述于PCT申請案WO2004/061104中。簡言的，此技術(shù)涉及產(chǎn)生適用作制造細胞系的細胞集合。.以下技術(shù)描述是關(guān)于關(guān)聯(lián)對文庫，然而其亦可應用于組合文庫。細胞集合中的個別細胞能夠(例如)自關(guān)聯(lián)對文庫表達重組多克隆結(jié)合蛋白的獨特成員。為了確保個別細胞表達多克隆結(jié)合蛋白的單獨關(guān)聯(lián)對而非若干關(guān)聯(lián)對，將編碼關(guān)聯(lián)對的核酸序列引入至各個別細胞的基因組中的單獨位點特異性位點中。此為細胞集合的重要特征，因為此防止自各細胞表達的重鏈及輕鏈的不規(guī)則性，而且亦因為其產(chǎn)生實際上此此相同的細胞，其中例外為個別關(guān)聯(lián)對的可變區(qū)中的小差異。此特征將使得細胞集合在制造所必需的時間期間能夠無偏生長。為確保單獨位點特異性整合，應使用僅具有一個整合位點的宿主細胞系，其可為市售的(例如)含有單獨FRT位點的Invitrogen'sCHOFlp-In細胞。此細胞系的適當載體含有相應FRT位點且使用Flp重組酶將該載體引入至基因組中。存在可用于與其相應重組位點組合的若干其它已知重組酶，例如Cre、P-重組酶、Gin、Pin、PinB、PinD、R/RS、)i整合酶或噬菌體OC31整合酶。此外，適當栽體含有使能夠選擇位點特異性整合體的選擇標記?？山逵扇舾刹煌D(zhuǎn)染及制造策略產(chǎn)生多克隆制造細胞系及由該細胞系生成重組多克隆蛋白。一種方式為將一起混合入單獨組合物中的載體文庫用于以每個細胞單個整合位點來轉(zhuǎn)染宿主細胞系。此方法稱作主體轉(zhuǎn)染或以主體轉(zhuǎn)染。一般而言，先前所述的載體及宿主細胞設(shè)計將確保在適當選擇后將會獲得能夠無偏生長的多克隆細胞系。在起始重組多克隆蛋白制造之前將會產(chǎn)生多克隆細胞系的冷凍儲備液。另一方式為使用分裂為部分的載體文庫用于轉(zhuǎn)染，其中在組合物中含有約5至50個文庫個別載體。優(yōu)選地，文庫的部分由10至20個個別載體構(gòu)成。接著將各組合物轉(zhuǎn)染至宿主細胞等分試樣中。此方法稱為半主體轉(zhuǎn)染(semi-bulktransfection)。所轉(zhuǎn)染的等分試樣數(shù)將視文庫尺寸及各部分中個別載體數(shù)而定。若文庫(例如)由100個獨特關(guān)聯(lián)對構(gòu)成，其在組合物中分裂為含有20個獨特成員的部分，則5個宿主細胞等分試樣將需要以組成原始文庫的獨特部分的文庫組合物轉(zhuǎn)染。選擇宿主細胞等分試樣用于位點特異性整合。優(yōu)選地，分開選擇獨特等分試樣。然而，其亦可在選擇前匯集?？煞治龅确衷嚇拥目寺《鄻有郧覂H具有足夠多樣性的此等將用于產(chǎn)生多克隆關(guān)聯(lián)對文庫儲備液。為獲得用于制造的所要多克隆細胞系，可在產(chǎn)生冷凍儲備液之前、自儲備液重新獲得的后立即或在短增殖及適應時間(adaptationtime)的后將等分試樣混合。；阮情況而言，在整個制造過程中將細胞的等分試樣獨立保存，且藉由組合各等分試樣的產(chǎn)物而非制造之前的細胞等分試樣來聚集多克隆蛋白質(zhì)組合物。第三方式為高產(chǎn)量方法，其中使用構(gòu)成關(guān)聯(lián)對文庫的個別載體來分開轉(zhuǎn)染宿主細胞。此方法稱為個別轉(zhuǎn)染。優(yōu)選分開選擇經(jīng)個別轉(zhuǎn)染的宿主細胞用于位點特異性整合?？煞治鲞x擇后產(chǎn)生的個別細胞克隆的增殖時間，且優(yōu)選將此等具有類似生長速率者用于產(chǎn)生多克隆關(guān)聯(lián)對文庫儲備液?？苫旌蟼€別細胞克隆以在產(chǎn)生儲備液之前、自儲備液重新獲得的后立即或在短增殖及適應時間的后獲得所要多克隆細胞系。此方法可在轉(zhuǎn)染、整合及選擇期間消除任何可能的殘基序列偏誤(sequencebias)?；蛘撸谶M行選擇前混合個別轉(zhuǎn)染的宿主細胞，此將會使得能夠控制轉(zhuǎn)染引起的序列偏誤。上文略述的制造策略的共有特征為構(gòu)成重組多克隆蛋白的所有個別關(guān)聯(lián)對可在一個或有限數(shù)目的生物反應器中產(chǎn)生。僅有的差異為選擇產(chǎn)生構(gòu)成多克隆制造細胞系的細胞集合的階段?；蜃游膸斓乃拗骷毎?。在另一具體實例中，宿主細胞群包含利用多重RT-PCR擴增隨后藉由接合或重組連接或本發(fā)明的多重重疊延伸RT-PCR技術(shù)連接關(guān)聯(lián)對而自構(gòu)成淋巴細胞的分離的單細胞群獲得的文庫。庫或子文庫的宿主細胞群。本發(fā)明的宿主細胞群將涵蓋對應于細胞已轉(zhuǎn)型/轉(zhuǎn)染有的文庫多樣性的多樣性細胞群。優(yōu)選地，細胞群的各細胞僅構(gòu)成整個關(guān)聯(lián)對文庫的一個關(guān)聯(lián)對，且關(guān)聯(lián)對文庫的個別成員不超過50%以上，更優(yōu)選25%,或最佳10%由宿主細胞群所表達的個別成員總數(shù)。在本發(fā)明的優(yōu)選具體實例中，宿主細胞群為哺乳動物細胞。上文所述的宿主細胞群可用于表達重組多克隆結(jié)合蛋白，因為該群的個別細胞由具有不同多樣性的編碼可變區(qū)的序列構(gòu)成。本發(fā)明的一具體實例為由包含對編碼經(jīng)連接可變區(qū)的序列的多樣性關(guān)聯(lián)對進行編碼的載體文庫的宿主細胞群所表達的重組多克隆蛋白，其中該文庫可藉由本發(fā)明方法獲得。通常，本發(fā)明的重組多克隆蛋白包含至少2、5、10、20、50、100、1000、104、105或106種由不同關(guān)聯(lián)對構(gòu)成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)選具體實例為由包含對編碼重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的序列的多樣性關(guān)聯(lián)對進行編碼的載體文庫的宿主細胞群所表達的重組多克隆免疫球蛋白。本發(fā)明的另一優(yōu)選具體實例為由宿主細胞群所表達的重組多克隆TcR，該宿主細胞群包含對編碼與(3鏈可變區(qū)連接的TcRa鏈可變區(qū)的序列和/或編碼與5鏈可變區(qū)連接的TcRy鏈可變區(qū)的序列的多樣性關(guān)聯(lián)對進行編碼的載體文庫。本發(fā)明的另一具體實例為適于產(chǎn)生單克隆蛋白的宿主細胞。詳言的，單克隆抗體包含輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)的關(guān)聯(lián)對或單克隆TcR包含a可變區(qū)與卩可變區(qū)或5可變區(qū)與Y可變區(qū)的關(guān)聯(lián)對。優(yōu)選地，該單克隆產(chǎn)生細胞系不為雜交瘤細胞系。該單克隆抗體或TcR可藉由向連接多個非鄰接感興趣核苷酸序列的方法中添加以下步驟而產(chǎn)生a)向載體中插入該經(jīng)連接核酸序列；b)向宿主細胞中引入該載體；c)在適于表達的條件下培養(yǎng)該宿主細胞；及d)獲得由插入該宿主細胞中的載體表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。優(yōu)選地，引入宿主細胞中的載體編碼可變區(qū)的序列的個別關(guān)聯(lián)對進行編碼。本發(fā)明的應用本發(fā)明的一個主要應用為藉由產(chǎn)生關(guān)聯(lián)對文庫的高產(chǎn)量方法連接編碼可變區(qū)的序列(尤其編碼免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區(qū)的序列或編碼TcRa及卩鏈或y及5鏈可變區(qū)的序列)的關(guān)聯(lián)對。除了產(chǎn)生關(guān)聯(lián)對文庫的外，多重RT-PCR隨后藉由接合或重組連接或本發(fā)明的多重重疊延伸RT-PCR技術(shù)可用于藉由對基因多樣化細胞群、來自該細胞群的細胞溶解產(chǎn)物或自該細自此等文庫中的一者的文庫、子文庫或單獨克隆促進多克隆或單克隆蛋白的表達。尤其可自本發(fā)明的文庫獲得單克隆或多克隆抗體。重組單克隆抗體在診斷、治療及預防中的用途為熟知的。由本發(fā)明所產(chǎn)生的重組單克隆及多克隆抗體將與由現(xiàn)存技術(shù)所產(chǎn)生的抗體產(chǎn)物具有相同應用。詳言的，可藉由本發(fā)明制造與至少一種醫(yī)藥學上可接受的賦形劑組合的包含多克隆重組免疫球蛋白作為活性成份的醫(yī)藥組合物。更優(yōu)選為多克隆重組免疫球蛋白是由編碼可變區(qū)的序列的關(guān)聯(lián)對構(gòu)成的醫(yī)藥組合物。該多克隆重組免疫球蛋白的醫(yī)藥組合物可用作藥物。組合物的多克隆重組免疫球蛋白對預定疾病靶可為特異性的或具活性的，且組合物因此可用于治療、改善或預防在諸如人類、家庭動物或?qū)櫸锏牟溉閯游镆韵录膊?，諸如癌癥、感染、發(fā)炎疾病、過敏癥、哮喘及其它呼吸道疾病、自體免疫疾病、免疫功能障礙、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝及內(nèi)分泌疾病、移植排斥或非所希望妊娠。實施例實施例1:將Balb/c小鼠以傅氏完全佐劑(completeFreund'sadjuvant)中的50|ig破傷風類毒素(Tetanustoxoid,TT)皮下免疫。在第14天將小鼠以傅氏不完全佐劑(Freund'sincompleteadjuvant)中50嗎TT促升(boost)。又30天后，將小鼠以傅氏不完全佐劑中50嗎TT促升。最終促升3天后，犧牲小鼠且在4。C下將脾臟取出且轉(zhuǎn)移至含有30mlRPMI1640w/10%FCS的試管中。將組織轉(zhuǎn)移至10cm盤中的74細胞濾器(Corning,136350-3479)中。隨著針筒活塞的抽回，脾臟經(jīng)過濾器浸軟。將濾液以10mlRPMI1640、10%FCS溶液沖洗。移除濾液且將盤以20ml冷RPMI1640、10%FCS填充。將細胞轉(zhuǎn)移至50ml試管中且以300xg在2-8°C下離心5分鐘。將細胞再懸浮于5-10ml4°CRPMI1640w/1%FCS中且經(jīng)50針筒過濾器(BectonDickinson,340603)過濾。將細胞粒化且再懸浮于FCS;10。/。DMSO中以獲得每安瓶2x107個細胞的細胞密度且冷凍。將具有來自經(jīng)破傷風類毒素免疫的Balb/c小鼠的脾細胞單細胞懸浮液的冷凍小瓶在37。C下解凍且在仍存在水塊的狀況下轉(zhuǎn)移至15ml試管中。在渦流下將10ml水冷的RPMI、10%FCS逐滴添加至試管中。以10mlFACSPBS、5mlPBS洗滌一次后，添加2%FCS隨后將細胞經(jīng)50pmFilcon(BectonDickinson目錄號340603)過濾。將細胞?；以賾腋∮?mlPBS、2%FCS(最終體積)中且隨后以在1mlPBS、2%FCS中1:100倍稀釋的抗CD43FITC(BD目錄號553270)及1:40倍稀釋的抗CD138PE(BD目錄號553714)或以1:40倍稀釋的抗B220APC(BD目錄號553092)及以1:200倍稀釋的抗MHCIIFITC(BD目錄號553547)染色。將細胞在4。C下在暗處培養(yǎng)20min。最終，將細胞以2mlPBS、2%FCS洗滌兩次且添加至15mlPBS、2。/。FCS(胎牛血清)。在即將分選之前，以1:100倍添加PI且將細胞以每秒約1000-2000個細胞的事件計數(shù)分選。兩染色的門控描繪于圖3中。圖3A:在底部左圖中排除PI陽性(死)細胞(Pl)。漿細胞在底部右圖中門控為CD43高、CD138高(P2)。最后，在SSC-H、SSC-W曲線頂部右圖中排除成對物(doublet)(P3)。根據(jù)表l,將對所有三個閘門呈陽性的細胞分選入ELISPOT培養(yǎng)盤中。酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT):將底部涂有硝化纖維素的96孔培養(yǎng)盤(HA培養(yǎng)盤，Millipore，Bedford,MA)以PBS預濕潤(亦阻斷孔)，隨后以PBS中的100pi25pg/ml破傷風類毒素(TT)或綿羊抗鼠科動物IgG(JacksonImmunoResearch,目錄號515-005-062)涂布。對照孔中存在相同體積的PBS。將培養(yǎng)盤保持在4°C下。第二天，將各孔在PBS中洗滌三次，隨后以200^RPMI+2%脫脂奶粉阻斷且保持在4。C下。在添加細胞前1小時將培養(yǎng)盤移至培養(yǎng)器中(37。C,5%C02，100%濕度)。向TT-、抗-IgG涂布的孔及僅阻斷的孔中添加完全RPMI中的100pl細胞。包括無細胞的培養(yǎng)基作為對照。將培養(yǎng)盤移至培養(yǎng)器中(37°C，5%C02，100°/。濕度)。第二天，將培養(yǎng)盤洗滌6次以移除細胞，其中以緩沖液PBS+0.01%Tween20洗滌3次且以PBS洗滌3次。隨后，向各孔中添加1:3000倍稀釋于RPMI+2%脫脂奶粉中的與HRP結(jié)合的山羊抗小鼠IgG(CaltagM30007)(每孔100pi)。在37。C下培養(yǎng)2小時后，將各孔以PBS+0.01%tween20洗滌3次，隨后以僅PBS洗滌3次。隨后以由0.015%H2O2及0.1M乙酸鈉中的0.3mg/ml3-胺基-9-乙基葉唑，pH5.1組成的100pi生色底物使斑點顯現(xiàn)。藉由在5分鐘后以自來水洗滌使顯色停止。自表1的結(jié)果判斷，對TT具有特異性的漿細胞(PC;圖3中的CD43高、CD138高、門控P3)是以約2%存在，而TT特異性成漿細胞(PB;圖3B中的B220及MHCII陽性，門控P4)是以約4%。存在。此說明在TT免疫后制造特異性抗體時PC相對于PB的優(yōu)勢。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>實施例2:如實施例1中所述，將脾細胞的冷凍小瓶染色。四種不同表型四路分選。分選閥門描繪于圖4中。首先，在底部左圖中排除PI陽性或死細胞(PI)。P2為CD138中等，CD43高。P3為CD138高，CD43高。P4為CD138高，Cd43負。P5為CD138中等，CD43低。將對P1及四個閥門中的每一者呈陽性的IO，OOO個細胞分選于測試試管中且冷凍以供小鼠Symplex評估。將溶離份P2、P3、P4及P5主體分選于各自含有IO，OOO個細胞的試管中。將試管離心且以每微升250個細胞，每試管10pl的濃度再懸浮于含有2U/plRNase抑制劑的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco'smodifiedEagle'smedium)中(RNasin，Promoga目錄號N2511)且在-80。C下冷凍。對4組經(jīng)分選淋巴細胞的每一者的稀釋系列進行小鼠Symplex擴增以比較IgG-K抗體mRNA的含量。反應的基本原則為首先進行RT反應，其中重鏈及輕鏈是由特異性恒定區(qū)引物引發(fā)。其次使用覆蓋所有可變區(qū)且裝有促進重疊帶(overlapband)形成的互補突出物(complementaryoverhang)的VH和VK5'區(qū)引物進4亍多重反應。3'引物定位于重鏈及輕鏈的恒定區(qū)。最后進行使用JH及JK引物僅擴增經(jīng)結(jié)合Vh和VK的嵌套式反應。最終反應產(chǎn)物由結(jié)合5'端至5'端且與接頭相連的Vh和VK組成。大小應為約700bp。經(jīng)組合多重RT-PCR反應使用表2中所示的引物組且基本上根據(jù)制造商說明采用QiagenOneStepRT-PCR試劑盒。將冷凍細胞在水上解凍，再懸浮且離心。在各稀釋系列中使用對應于100、32、10、3.2、1、0.32、0.1及0個細胞的細胞溶解產(chǎn)物?？偡磻w積為20nl。循環(huán)條件為55。C,30min95。C,15min94°C，30sec172°C，5min72。C，10min。基本上根據(jù)制造商說明使用FastStart聚合酶(Roche)及所供應的試劑以表3所示的引物組進行嵌套式反應。每個嵌套式反應使用liilRT-PCR反應產(chǎn)物，總體積為20jul。反應條件為95°C，30sec，60°C,30sec丄35次循環(huán)72°C,卯sec72°C，10min。在1%瓊脂糖凝膠上最終分析10nl各最終反應產(chǎn)物。從關(guān)于經(jīng)滴定細胞溶解產(chǎn)物的Symplex結(jié)果來看(圖5)，顯然可將重鏈及輕鏈可變區(qū)與來自P3的細胞(低至約0.1個細胞)及來自P2的細胞(約3.2個細胞)連接。其它閘門對連接效率較低，僅可能連接約32個細胞或更多。總的，CD43高CD138高(P3)在單細胞層次上最適用于SymplexTM，同時可使用CD43高CD138中等但其效率較低。表2:用于組合的RT及多重反應的小鼠Symplex引物組_序濃度》引物序列列UM)號mHCrevl0.2GACSGATGGGCCCTTGGTGG1mKappar10.2GCTGTAGGTGCTGTCTTTGC2mVH組mVHA0.04TATTCCCATGGCGCGCCSAGGTCCARCTGCARCAGYCTGmVHB0.04TATTCCCATGGCGCGCCGARGTGMAGCTKGTKGAGTC4mVHC0.04TATTCCCATGGCGCGCCSAGGTGCAGCTKMAGGAGTC5mVH80.04TATTCCCATGGCGCGCCCAGGTTACTCTGAAAGAGTC6mVH90.04TATTCCCATGGCGCGCCCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTG7mVK組mVKDmVKEmVKFmVK1-20.04GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGAYATCCAGATGACHCARWC8T0.04GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCRACATTGTGMTGACHCAGTC90.04GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCSAMATTGTKCTSACCCARTCT10C0.04GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGATRTTGTGATGACBCARRCT11『=v4/r,i^4/G，5^G/C，F(xiàn)=GT，AX7/T，M=j/C，7/=^Cr，5=GC7V》,-<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>實施例3.抗-EGFR抗體的克隆免疫將雌性BALB/c、A抹系或C57B16小鼠(8-10周大)用于藉由除EGFR過表達細胞的外注射不同經(jīng)純化蛋白質(zhì)來進行免疫。將市售EGFR蛋白(R&D系統(tǒng)cat弁1095-ER或Sigma#E3641)用于其中的一些免疫。對于其它免疫而言，使用以融合蛋白形式所產(chǎn)生的重組人類EGFR及EGFRvIII,其是由EGFR或EGFRvIII的ECD及人類生長激素(hGH)組成，除His-tag的外亦包括煙草蝕刻病毒(TEV)-裂解位點。在一些狀況下，EGFR的ECD是藉由TEV-蛋白酶裂解而分離且隨后在鎳管柱上純化。將表達約每個細胞107個受體的人類頭頸癌細胞系，HN5(EastyDM,EastyGC,CarterRL,MonaghanP,ButlerLJ.BrJCancer.1981Jun;43(6):772-85.10個來源于頭頸鱗狀癌的人類癌瘤細胞系(Tenhumancarcinomacelllinesderivedfromsquamouscarcinomasoftheheadandneck))用于基于細胞的免疫。將細胞在補充有10%FBS(胎牛血清)、3mM甘油、5mM丙酮酸鈉及1°/。盤尼西林鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在各免疫之前，將細胞在PBS中洗滌，以TrypLE胰蛋白酶化且再懸浮于生長培養(yǎng)基中。隨后，將細胞懸浮液藉由以250xg離心5min在PBS中洗滌兩次，移去且再懸浮于15ml無菌PBS中。將細胞或抗原稀釋于PBS中且接著與傅氏佐劑以1:1混合。佐劑是用于增強及調(diào)節(jié)免疫反應。對于第一免疫而言使用傅氏完全佐劑(CompleteFreund，sAdjuvant,CFA),而將j專氏不完全佐劑(IncompleteFreund，sAdjuvant,IFA)用于隨后的免疫。IFA為由礦物油構(gòu)成的水中油乳液，且CFA為添加有熱殺傷、干燥分枝桿菌種的IFA。兩佐劑皆具有儲存效應(depoteffect)。CFA引起長期持續(xù)的免疫反應且用于第一免疫以促升免疫反應，且將IFA用于隨后的免疫。藉由在玻璃表面添加一滴水來測試乳液。若液滴保持為一滴，則乳液為穩(wěn)定的且可進行注射。僅向小鼠投予穩(wěn)定乳液。視時程(參見表4)而定，將25-100ng抗原或107個細胞用于各注射。小鼠總計接受4次注射。所有小鼠經(jīng)300pl或200W乳液注射。視時程而定，皮下(s.c.)、腹膜內(nèi)(i.p.)或靜脈內(nèi)(i.v.)進行注射。最后，將小鼠藉由頸推脫臼(cervicaldislocation)犧牲，且移除脾臟且轉(zhuǎn)移至74pm細胞濾器(Coming#136350-3479)中。細胞經(jīng)過濾器浸軟，再懸浮于具有10%FBS的冷RPMI1640中且以300xg離心5min。將細胞沉淀再懸浮于具有1%FBS的RPMI1640中，經(jīng)50pm針筒過濾器(BD#340603)過濾且藉由離心收集。將細胞沉淀在再懸浮于具有10%DMSO的FCS中的后低溫儲藏且將冷凍細胞儲存于-80。C下直至FACS分選。鼠科動物漿細胞的FACS分選將具有冷凍脾細胞的小瓶在37。C下解凍且在水仍存在的狀況下轉(zhuǎn)移至15ml試管中。在渦流下將10ml冰冷的RPMI、10%FBS(胎牛血清)逐滴添加至試管中。在10mlFACSPBS中洗滌一次后，添加5mlFCSPBS隨后使細胞經(jīng)50pmFilcon過濾。接著使細胞?；以賾腋∮诰哂?%FBS的1mlPBS(最終體積)中，且根據(jù)特定稀釋至約5|ig/ml的最終濃度以抗-0043〗1丁(及抗-€0138"￡染色。將細胞在4。C下在暗處培養(yǎng)20min。隨后，將細胞以2mlFACS緩沖液洗滌2次。添加至多15mlFACSPBS。以1:100倍添加碘化丙咬(PropidiumIodide,PI)且隨后將細胞分選于含有PCR反應緩沖液(見下文)的96孔PCR培養(yǎng)盤中，且離心分離2min400xg,隨后將培養(yǎng)盤在-80。C下冷凍。漿細胞是門控為CD43-陽性/CD-138卩日性。同源Vh與VL對的連接對門控為漿細胞的單細胞進行編碼Vh和Vi^的序列的連接，促進編碼Vh和Vl的序列的關(guān)聯(lián)對。該程序利用基于單步多重重疊延伸RT-PCR隨后嵌套式PCR的兩步PCR程序。本實例所用的引物混合物僅擴增k輕鏈。然而，若需要可將能夠擴增人輕鏈的引物添加至多重引物混合物及嵌套式PCR引物混合物中。若添加X引物，則分選程序應經(jīng)調(diào)適使得不排除？i陽性細胞。圖1中說明關(guān)聯(lián)對Vh和V^序列的連接原理。將所制得的96孔PCR培養(yǎng)盤解凍且將經(jīng)分選細胞用作多重重疊延伸RT-PCR的模板。在單細胞分選之前添加至各孔中的分選緩沖液含有反應緩沖液(單步RT-PCR緩沖液；Qiagen)、RT-PCR的引物(參見上文的表2)及RNase抑制劑(RNasin,Promega)。此補充有單步RT-PCR酶混合物(25x稀釋液；Qiagen)及dNTP混合物(各200piM)以獲得20pi反應體積中的給定最終濃度。將培養(yǎng)盤在55。C下培養(yǎng)30min以使得各細胞的RNA逆轉(zhuǎn)錄。在RT之后，使培養(yǎng)盤經(jīng)受以下PCR循環(huán)94。C下10min，35x(94。C下40s,60。C下40s，72。C下5min),72。C下10min。在具有PeelSealBasket的H20BIT熱循環(huán)器中進行2496孔培養(yǎng)盤(ABgene)的PCR反應以促進高產(chǎn)量。在循環(huán)后將PCR培養(yǎng)盤儲存于-20。C下。對于嵌套式PCR步驟而言，在各孔中使用以下混合物(20pl反應物)來制備96孑LPCR培養(yǎng)盤，從而獲得給定最終濃度lxFastStart緩沖液(Roche)、dNTP混合物(各200|iM)、嵌套式引物混合物(參見表5)、PhusionDNA聚合酶(0.08U;Finnzymes)及FastStartHighFidelity酶摻合物(0.8U;Roche)。作為嵌套式PCR的模板，自多重重疊延伸PCR反應轉(zhuǎn)移1(al。使嵌套式PCR培養(yǎng)盤經(jīng)受以下熱循環(huán)35x(95。C下30s，60。C下30s，72°C下90s),72°。下lOmin。的重疊延o;片段"存:。'，'、'..、.土-將培養(yǎng)盤儲存于-20。C下直至進一步處理PCR片段。將來自嵌套式PCR的連接的Vh和VL的編碼對的集合匯集而沒有混合來自不同供體的對，且藉由制備型1%瓊脂糖凝膠電泳純化。藉由重疊延伸將編碼人類k恒定輕鏈的序列與連接的VH和VL的編碼對的經(jīng)匯集PCR產(chǎn)物的VL編碼區(qū)剪接(圖2)。在總體積為50iil含有以下各物的反應物中自含有具有k輕鏈的人類抗體的編碼序列的質(zhì)粒擴增編碼人類k恒定輕鏈的序列Phusion酶(2U;Finnzymes)、lxPhusion緩沖液、dNTP混合物(各200)、hKCforw-v2引物及Kappa3'引物(表6)及質(zhì)粒模板pLL138(10ngl)。使反應經(jīng)受以下熱循環(huán)25x(95。C下30s,55。C下30s，72。C下45s)，72'C下10min。將所得PCR片段藉由制備型1%瓊脂糖凝膠電泳純化。藉由以下含有以下各物的重疊延伸PCR(50pi總體積)進行剪接將各集合的經(jīng)純化匯集PCR片段與經(jīng)擴增且純化的人類k恒定編碼區(qū)的PCR片段(Appendix1)剪接人類k恒定編碼區(qū)片段(1.4ng/pl)、經(jīng)純化匯集PCR片段(1.4ng小l)、PhusionDNA聚合酶(0.5U;Finnzymes)及FastStartHighFidelity酶摻合物(0.2U;Roche)、lxFastStart緩沖液(Roche)、dNTP混合物(各200)、mhKCrev引物及mJH組引物(參見表6)。使反應經(jīng)受以下熱循環(huán)95。C下2min，25x(95。C下30s，55。C下30s，72。C下1min)，72°CT10min。將所得PCR片段(約1070bp)藉由制備型1°/。瓊脂糖凝膠電泳純4匕。同源(cognate)VH和VL編碼對插入篩選載體中為了鑒別對EGFR具有結(jié)合親和力的抗體，將所獲得的Vh和VL編碼序列表達為全長抗體。此涉和Vh和V!^編碼對的集合插入表達載體中及向宿主細胞中的轉(zhuǎn)染。采用兩步克隆程序來產(chǎn)生含有經(jīng)連接Vh和V^編碼對的表達載體的集合。統(tǒng)計學上而言，若表達載體的集合含有IO倍于用于產(chǎn)生篩選集合的關(guān)聯(lián)對Vh和VLPCR產(chǎn)物數(shù)的重組質(zhì)粒，則有99%可能呈現(xiàn)所有唯一基因?qū)?。因此，若獲得400個重疊延伸V基因片段，則產(chǎn)生至少4000個克隆集合用于篩選。簡言的，與人類k恒定編碼區(qū)剪接的連接Vh和V^編碼對的集合的經(jīng)純化PCR產(chǎn)物在引入PCR產(chǎn)物終端的識別位點處以Xhol及NotlDNA核酸內(nèi)切酶裂解。經(jīng)裂解且純化的片段是藉由標準接合程序接合至XhoI/Notl消化哺乳動物IgG表達載體OO-VP-002(圖6)。將接合混合物電穿孔至大腸桿菌中且添加至含有適當抗生素的2xYT培養(yǎng)盤中，且在37。C下培養(yǎng)隔夜。使用標準DNA純化法(Qiagen)自培養(yǎng)盤所回收的細胞純化載體的經(jīng)擴增集合。藉由使用Ascl及Nhel核酸內(nèi)切酶裂解來制備質(zhì)粒用于插入啟動子-前導序列片段。此等酶的限制位點于Vh和VL編碼基因?qū)χg。在載體純化的后，藉由標準接合程序?qū)scl-Nhel消化的雙向哺乳動物啟動子-前導序列片段插入Ascl及Nhel限制位點中。將經(jīng)接合載體在大腸桿菌中擴增且使用標準方法純化質(zhì)粒。藉由常規(guī)程序?qū)⑺a(chǎn)生的篩選載體集合轉(zhuǎn)型于大腸桿菌中。將所獲得的菌落合并于384孔母體培養(yǎng)盤且儲存。經(jīng)排列菌落的數(shù)目超過輸入PCR產(chǎn)物數(shù)至少3倍，因此產(chǎn)生所獲得的所有唯一V基因?qū)Φ拇嬖诘?5%可能性。自上文選擇的克隆制備DNA質(zhì)粒且將FreeStyleCHO-S細胞(Invitrogen)以2ml規(guī)才莫轉(zhuǎn)染以供表達抗體(根據(jù)制造商說明)。轉(zhuǎn)染96小時后采集上清液。篩選以與EGFR胞外域結(jié)合一般而言，篩選是以兩步程序進行。在ELISA中篩選抗體文庫對重組EGFR蛋白的活性，隨后將FMAT(FLISA)用作使用NR6wtEGFR細胞系的基于細胞的方法(Batra等人，1995,CellGrowthDiffer,6(10):1251-9)以檢測與細胞表面表達的EGFR結(jié)合的EGFR抗體。對于101及108/109文庫而言(表4),以呈現(xiàn)EGFR胞外域的重組EGFR進行ELISA。簡單地對于ELISA而言，將Nuncmaxisorb培養(yǎng)盤(目錄號464718)涂以1嗎/ml蛋白質(zhì)(inhouseproduced)，在4。C下稀釋于PBS中隔夜。在阻斷于50pl2。/o-牛乳-PBS-T之前，將培養(yǎng)盤以PBS+0.05%tween20(PBS-T)洗滌一次。將培養(yǎng)盤以PBS-T洗滌一次，添加20pl2。/。-牛乳-PBS-T及5pl來自FreeStyleCHO-S轉(zhuǎn)染物(見上文)的上清液，且在室溫下培養(yǎng)1.5小時，隨后將培養(yǎng)盤以PBS-T(每孔20pl)洗滌一次。添加以1:10000倍稀釋于2%牛乳-PBS-T中的次級抗體(HRP-山羊-抗人類IgQJackson,目錄號109-035-097)以檢測與孔結(jié)合的抗體且在室溫下培養(yǎng)1小時。將培養(yǎng)盤在PBS-T中洗滌一次，隨后添加培養(yǎng)5min的25pl底物(Kem-en-tecDiagnostics,目錄號4390)。在培養(yǎng)后添加25pl1M硫酸以使反應停止。在ELISA讀取器上在450nm下檢測特定信號。對于抗EGFR抗體的基于細胞的FMAT檢測而言，將SKBR-3(ATCC#HTB-30)或NR6wtEGFR細胞保持于生長培養(yǎng)基中。將細胞計數(shù)且以1:40,000倍稀釋的Alexa-647結(jié)合的山羊-抗-人類IgG(H-L)抗體(分子探針No.A21445,批號34686A)稀釋至每毫升125,000個細胞。將總共20pi此懸浮液轉(zhuǎn)移至384孔透明底Nunc培養(yǎng)盤中。隨后，向各孔中添加10pi轉(zhuǎn)染上清液。在培養(yǎng)6-10小時后，測量來自反應的FMAT信號。來自篩選的資料指示ELISA中總克隆中有221(4.8%)為陽性。此等克隆中有93(2.0%)在FMAT中亦為陽性。此等克隆中總共220(4.8%)在FMAT中為陽性且其中有127(220-93)僅對于細胞表面抗原呈陽性。以類似方式篩選111文庫，但是因為進行免疫程序以產(chǎn)生對缺失突變EGFR受體EGFRvIII具有特異性的抗體，ELISA篩選包括檢測野生型EGFR與EGFRvIII的鑒定。在ELISA中有7個克隆經(jīng)鑒別對EGFRvIII具有特異性，且有趣地，在FMAT中此等克隆對wtEGFR表達細胞的染色呈陰性。在FMAT及ELISA中有13個克隆經(jīng)鑒別對wtEGFR呈陽性但對EGFRvIII不呈陽性，相較于101及108/109文庫，其對此文庫為唯一的。選擇所有ELISA陽性克隆用于進一步分析。序列分析及克隆選擇自初始主體培養(yǎng)盤(384孔格式)重新獲得在ELISA中鑒別為對EGFR具有特異性的克隆且合并于新培養(yǎng)盤中。將DNA自克隆分離且使其經(jīng)受V基因的DNA測序。比對序列且選擇所有唯一克隆。所獲得的序列多序列比對(Multiplealignment)顯示各特定克隆的唯一性且使得可鑒別唯一抗體。對220個克隆進行序列分析后，鑒別出有70個遺傳上獨特的抗體序列群集。有關(guān)序列的各群集可能已由常見前驅(qū)體克隆的體細胞超突變產(chǎn)生?？傃缘?，選擇來自各群集的1至2個克隆以驗證序列及特異性。序列及特異性驗證為了驗證抗體編碼克隆，制備DNA質(zhì)粒且以2ml規(guī)模進行FreeStyleCHO-S細胞(Invitrogen)的轉(zhuǎn)染以供表達。轉(zhuǎn)染96小時后采集上清液。以標準抗-IgGELISA評估表達含量，且藉由EGFR及EGFRvIII特異性ELISA測定特異性。85%的克隆經(jīng)展示具有正確特異性及序列。篩選抗增殖作用細胞損壞將不可避免地導致細胞喪失維持代謝細胞功能及生長及提供代謝細胞功能及生長的能量的能力。代謝活性鑒定是基于此前提。通常測量粒線體活性(mitochondrialactivity)。細胞增殖試劑WST-1(Roche目錄號11644807001)為測量活細胞代謝活性的即用型基質(zhì)。接著假定與活細胞數(shù)目有關(guān)的代謝活性。在此實例中，將WST-1鑒定用于測量在以含有不同抗EGFR抗體的細胞培養(yǎng)上清液處理后的代謝活性細胞數(shù)目。在進行WST-1鑒定之前，將不同體積的2ml上清液(0、10、25、50及150pl)轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)盤的適當孔中。接著將HN5細胞以lxPBS洗滌且藉由以3ml胰蛋白酶溶液胰蛋白酶化來分離。接著添加17ml完全培養(yǎng)基且將細胞以300xg(1200rcf)離心分離5min。移除上清液且將細胞再懸浮于DMEM+0.5%FBS中。對細胞計數(shù)且調(diào)整其濃度，且向具有上清液的各孔中添加1500個細胞使得各孔總計含有200jil培養(yǎng)基。在37。C下將培養(yǎng)盤在潮濕培養(yǎng)器中培養(yǎng)4天。接著每孔添加20piWST-1試劑且將培養(yǎng)盤在37。C下培養(yǎng)1小時。接著將培養(yǎng)盤轉(zhuǎn)移至軌道培養(yǎng)盤振搖器(orbitalplateshaker)且再保持1小時。在450及620nm(參考波長)下在ELISA讀取器上測量吸光率。將代謝活性細胞(metabolicallyactivecells,MAC)含量的差異如下計算為對照上清液的百分比(OD實驗-gp培養(yǎng)基)—(OZ)未處理-(9Z)培養(yǎng)基/乂x訓接著將此等值用作使用免費軟件群集(freesoftwareCluster)及TreeView進行的監(jiān)督階層群集分析(基于ELISA中的活性群集)的基礎(chǔ)。優(yōu)選能夠在抗體選擇過程早期篩選功能抗體。將來自832-ml轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)上清液用于篩選在使用0.5%FBS中的HN5細胞進行的增殖鑒定中的生長抑制劑功能。藉由簡單階層群集分析目測結(jié)果。如群集分析(圖7)中可見，發(fā)現(xiàn)許多上清液以濃度依賴性方式減少代謝活性HN5細胞(深灰)的數(shù)目(群集2)。類似地，一些上清液以濃度依賴性方式增加代謝活性HN5細胞(淺灰)(群集1、3及4)的數(shù)目。有趣的觀測為，減少代謝活性HN5細胞數(shù)目的上清液具有活性2(黑色箭頭)，而增加代謝活性HN5細胞數(shù)目的上清液具有活性1(灰色箭頭)。具有活性2的上清液在wtEGFR及EGFRvIIIELISA中皆為陽性，而具有活性1的上清液僅對wtEGFR具有活性。因此，該分析可提供ELISA中抗體活性與細胞鑒定中功能性之間的關(guān)克隆修復當使用多重PCR法時，由于引物筒并(degeneracy)及高同源程度而預期V基因家族內(nèi)和V基因家族間特定程度的交叉引發(fā)。交叉引發(fā)將引起并非自然存在于免疫球蛋白構(gòu)架中的氨基酸若干潛在結(jié)果，例如結(jié)構(gòu)變化及增加的免疫原性，其均導致降低的治療活性。為了消除此等缺點且確保所選擇克隆反映自然體液免疫反應，將該交叉引發(fā)的突變以稱為克隆修復的方法校正。在克隆修復程序的第一步中，將VH序列以含有對應于Vh基因(源自其的感興趣的克隆)的序列的引物組進行PCR擴增，藉此校正任何由交叉引發(fā)引起的突變。PCR片段經(jīng)Xhol及Ascl消化且使用常規(guī)接合程序接合回到XhoI/AscI消化的哺乳動物表達載體中(圖6)。將經(jīng)接合載體擴增于大腸桿菌中且藉由標準方法純化質(zhì)粒。將VH序列測序以驗證校正且載體經(jīng)Nhel/Notl消化以使其準備好插入輕鏈。在第二步中，將完全輕鏈以含有對應于產(chǎn)生感興趣的克隆的Vl基因的序列的引物組PCR擴增，藉此校正任何由交叉引發(fā)引起的突變。PCR片段經(jīng)Nhel/Notl消化且接合至上文制備的含有Vh的栽體中。將接合產(chǎn)物擴增于大腸桿菌中且藉由標準方法純化質(zhì)粒。隨后，將輕鏈測序以驗證校正。在所選擇克隆的k恒定區(qū)含有基因擴增期間引入的突變的狀況下，將其以未突變恒定區(qū)置換。此是在重疊PCR中完成，其中使經(jīng)修復Vl基因(未經(jīng)恒定區(qū)擴增)與具有校正序列(在獨立PCR中獲得)的恒定區(qū)融合。全長序列經(jīng)擴增且克隆于如上文所述的含有Vh的栽體中，且將經(jīng)修復輕鏈測序以驗證校正。<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>ACCGCCTCCACCGGCGGCCGCTTATTAACACTCTCCCCTGTTG24mhKCrevmJH組mJHlm服mJH3mJH40,20.20.20,20.2ACCGCCTCCACCGGCGGCCGCTTATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCT25TGGAGGCGCTCGAGACGGTGACCGTGGTCCCGGAGGCGCTCGAGACTGTGAGAGTGGTGCCGGAGGCGCTCGAGACAGTGACCAGAGTCCCGGAGGCGCTCGAGACGGTGACTGAGGTTCC12131415附錄l，抗體恒定區(qū)序列〉人類IGKC區(qū)(序列號tcaacaggggagagtgttaataagcggccgccggtggaggcggt〉人類IGKC區(qū)(序列號27)TVAAPSVF工FPPSDEQLKSGTASwcriljNNFYPREAKVQWKVDNAIjQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTIjSKADYEKHKVYACEVTHQGIjSSPVTKSFNRGEC外顯子11..298介入子299,.689外顯子2690..734介入子735..852外顯子3853..1182介入子1183..1279外顯子41280..1602〉人類IGHG1恒定域基因組序列(序列號28)'IGHG1(Seg.no.29)IjDSDGSFFIjYSKLjTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALjHISIHYTQKSLSIjSPGKtyt9ctc3tc3tcgtcctyctccccccct9cc333facctycca,3ctccccqga.11t901cfa3ccc3ccgc3cca.cncfaqgc3ccttcccrclycgc3tctccccttcgac3gc3facqtc9t9acntgalctcaccaacaagcaalegatcgtyaacc9gatygga9tcggcacgenacctaatcatciytct9g9cGntaccccCacggcr-C9901cC9caaCtca9caag9tgacctttacccccggtyct9CcctccctnlygcatcacacgatU19tga9ctccu-acctytgtatget9gttattcccteytttaatr-9cnnscctnctgaaaatttcccgccagcDcccacttccactntcIytaccccycfT5aac9tytnttcaCTJ9alca1c9gacGnglytcttctttcttaacgaccatacccaatj-gccctcalctgaacttgcng仁actcC01ctpacgacao>ctatcccccc9tto-clytaac9cacctCCC9仁Ctnalya9tgccgetacag9ccatctccatcaC9talyaacntcgcgGncccctccctn9cctyagatctaCtyn3tyccnsccctttn9ccnctcnolaaatgiygccgccgcccact9caccctctcncctyacttaca,Eacololtnaatjllyatjlttctytj-ccatatgacccctc9tcataGnlygtagcalgtccat9Caaccalalyctccatacataalclyca9cclyclylycgtcccatgetlytctnlytttccraclyclyca9Ctyacgentactaccattytcgcncactatcaalccatt9ccgtccan3g9acct01c9ac9cattnccgcccaattyttcnacntaaacctngcoccntageculgccactgcn仁gaclyaacciycttgtcaalycctljlttsLGsQApTGTLAGspYcG濕GGppFpGKsscYYNEEKpGQDEHEJDRGYKN^>QLEsEVpsnsK幻KMAENEEpVpGJDTwoFEKR:>pEopGDKVIDTV工cpEJ權(quán)利要求1.一種產(chǎn)生關(guān)聯(lián)對的文庫的方法，所述關(guān)聯(lián)對包含連接的可變區(qū)編碼序列，該方法包括a)提供來自供體的包含淋巴細胞的細胞部分；b)獲得分離的單細胞的群，包含將來自該細胞部分的細胞個別地分配于多個容器中，其中至少細胞的亞群表達CD43和CD138抗原或MHCII和B220抗原；及c)在以多重分子擴增步驟中使用來源于分離的單細胞或同基因細胞群的模板擴增感興趣的核苷酸序列，并實現(xiàn)擴增的感興趣核苷酸序列的連接，從而擴增該分離的單細胞群中所包含的可變區(qū)的編碼序列及實現(xiàn)該分離的單細胞群中所包含的可變區(qū)的編碼序列的連接。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該單細胞的群中個別分離的單細胞擴展為同基因細胞的群，隨后進行擴增及連接(步驟l.c)。3.如前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中該含有淋巴細胞的細胞部分包含脾細胞、全血、骨髓、單核細胞、或白細胞。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該含有淋巴細胞的細胞部分包含脾細胞或骨髓，優(yōu)選為脾細胞。5.如前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中該含有淋巴細胞的細胞部分或B淋巴細胞語系是針對漿細胞或成漿細胞富集。6.如前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中感興趣的核普酸序列包含編碼免疫球蛋白可變區(qū)的序列且該連接產(chǎn)生與編碼重鏈可變區(qū)的序列締合的編碼輕鏈可變區(qū)的序列的關(guān)聯(lián)對。7.—種隨機連接多個感興趣非鄰接核苦酸序列的方法，該方法包含a)以多重分子擴增步驟使用來源于遺傳上多樣的細胞的群的模板擴增感興趣核苷酸序列；b)其中該遺傳上多樣的細胞是來源于來自供體的包含淋巴細胞的細胞部分；抗原；及d)實現(xiàn)步驟a)中擴增的感興趣核苷酸序列的連接。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中該細胞群是已裂解的。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中該感興趣的核苷酸序列包含可變區(qū)10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該感興趣核苷酸序列包含編碼免疫球蛋白可變區(qū)的序列且該連接產(chǎn)生編碼輕鏈可變區(qū)及重鏈可變區(qū)的序列對的組合文庫。11.如前述權(quán)利要求中任一項的方法，其進一步包含在多重分子擴增之前評定包含淋巴細胞的細胞群包含表達CD43和CD138抗原或MHCII和B220抗原，優(yōu)選CD43和CD138抗原的細胞。12.如前述權(quán)利要求中任一項的方法，其進一步包含在多重分子擴增之B220的淋巴細胞群富集。13.如前述權(quán)利要求中任一項的方法，其進一步包含在多重分子擴增之前自該包含淋巴細胞的群分離表達CD43和CD138抗原或MHCII和B220抗原的細胞。14.如前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中該分離的細胞或細胞的亞群相對于該包含淋巴細胞的細胞部分為CD138高/CD43高或CD138中等/CD43高。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中該分離的細胞或細胞的亞群相對于該包含淋巴細胞的細胞部分為CD138高/CD43高。16.如前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中該富集或分離包含自動分選步驟。17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中該自動分選步驟為MACS或FACS。18.如前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中該細胞來源于哺乳動物。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中該哺乳動物為非人類。20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中該非人類哺乳動物為轉(zhuǎn)基因的且表達人類免疫球蛋白。21.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中該供體為嚙齒動物。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中該供體為小鼠。23.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中該供體為靈長類動物。24.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中該供體為兔。25.如前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中該多重分子擴增步驟為多重RT-PCR擴增。26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中該多重RT-PCR擴增為在多重PCR擴增之前包含分開的逆轉(zhuǎn)錄(RT)步驟的兩步法。27.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中該多重RT-PCR擴增是以包含最初將進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)和多重PCR擴增兩者所必需的所有組份添加至單個容器中的單步進行。28.如前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中該感興趣核苷酸序列的連接是在與該多重分子擴增相同的容器中進行。29.根據(jù)權(quán)利要求25至28項中任一項的方法，其中該感興趣核苷酸序列的連接是利用多重重疊延伸引物混合物與該多重PCR擴增聯(lián)合實現(xiàn)。30.如前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中該感興趣核苷酸序列的連接是藉由接合(ligation)實現(xiàn)。31.如前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中進行利用適用于擴增該感興趣連接核酸序列的引物混合物的額外分子擴增。32.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中該多重重疊延伸？I物混合物包含引物組，其中各引物組的至少一個引物組成員包含能夠與第二引物組的引物組成員的重疊延伸尾(overlap-extensiontail)雜交的重疊延伸尾。33.根據(jù)權(quán)利要求29或32的方法，其中該多重重疊延伸引物混合物包含a)至少一個與編碼免疫球蛋白輕鏈區(qū)的序列的有意義鏈互補的mKapparl或hmJK引物；b)至少一個與編碼免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的序列或輕鏈可變區(qū)前導序列的反義鏈互補，且能夠與步驟a)中的該引物形成引物組的mVK引物；c)至少一個與編碼免疫球白重鏈域的序列的有意義鏈互補的mCHrevl、mHCrevl-ext或mJH引物；及d)至少一個與編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的序列或重鏈可變區(qū)前導序列的反義鏈互補，且能夠與步驟c)中的該引物形成引物組的mVH引物。34.如前述權(quán)利要求中任一項的方法，其進一步包含將連接的核芬酸序列或關(guān)聯(lián)對的文庫插入載體中。35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中該載體是選自克隆載體、穿梭載體、展示載體或表達載體。36.根據(jù)權(quán)利要求34或35的方法，其中該連接核苷酸序列或該關(guān)聯(lián)對的文庫的個別成員包含與編碼免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的序列締合的編碼重鏈可變區(qū)的序列且該序列符合讀框地插入已含有編碼一或多個免疫球蛋白恒定域的序列或其片段的載體中。37.根據(jù)權(quán)利要求34至36中任一項的方法，其進一步包含通過選擇具有所需靶特異性的編碼結(jié)合蛋白的連接的可變區(qū)序列的關(guān)聯(lián)對的子組，產(chǎn)38.根據(jù)權(quán)利要求36至37中任一項的方法，其進一步包含將該可變區(qū)的編碼序列的關(guān)聯(lián)對或靶特異性關(guān)聯(lián)對的文庫轉(zhuǎn)移至哺乳動物表達載體中。39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中該哺乳動物表達載體編碼一或多個選自人類免疫球蛋白IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM類、K輕鏈或X輕鏈的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。40.根據(jù)權(quán)利要求34至39中任一項的方法，其進一步包含以下步驟a)將編碼連接的核苷酸序列的區(qū)段之載體引入至宿主細胞中，b)在適于表達的條件下培養(yǎng)該宿主細胞；及c)獲得由插入該宿主細胞中的載體所表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中該蛋白質(zhì)產(chǎn)物為包含與重鏈可變區(qū)締合的輕鏈可變區(qū)之關(guān)聯(lián)對的抗體。42.—種多孔板/培養(yǎng)盤，其中在大多數(shù)孔中包含一個來源于包含淋巴細胞的細胞部分的細胞，該細胞表達CD43和CD138抗原或MHCII和B220抗原，及進行mRNA逆轉(zhuǎn)錄及擴增重鏈及輕鏈可變編碼區(qū)所需的緩沖液和試劑。43.—種產(chǎn)生編碼具有人類恒定區(qū)及非人類可變區(qū)的嵌合抗體的載體的方法，該方法包含a)提供來自非人類動物的包含淋巴細胞的細胞部分；b)獲得分離的單細胞的群，包含將來自該細胞部分的細胞個別地分配至多個容器中；c)藉由以多重分子擴增步驟使用來源于分離的單細胞或同基因細胞群的模板擴增該核酸；及實現(xiàn)該編碼重鏈及輕鏈可變區(qū)的經(jīng)擴增核酸的連接從而擴增該分離的單細胞群中所包含的編碼可變區(qū)的核酸和實現(xiàn)該分離的單細胞群中所包含的編碼可變區(qū)的核酸的連接；d)實現(xiàn)該經(jīng)擴增可變區(qū)與人類恒定區(qū)的連接；及e)將所獲得的核酸插入載體中。44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中該多重分子擴增步驟為多重RT-PCR擴增。45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中該多重RT-PCR擴增為在多重PCR擴增之前包含分開的逆轉(zhuǎn)錄(RT)步驟的兩步法。46.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中該多重RT-PCR擴增是以包含最初將進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)及多重PCR擴增兩者所必需的所有組份添加至單個容器中的單步進行。47.如前述權(quán)利要求43至46中任一項的方法，其中該感興趣核苷酸序列的連接是在與該多重分子擴增相同的容器中進行。48.根據(jù)權(quán)利要求44至47中任一項的方法，其中該感興趣核苷酸序列的連接是利用多重重疊延伸引物混合物與該多重PCR擴增聯(lián)合實現(xiàn)。49.如前述權(quán)利要求43至48中任一項的方法，其中該感興趣核香酸序列的連接是藉由接合實現(xiàn)。50.如前述權(quán)利要求43至49中任一項的方法，其中進行利用適用于擴增該感興趣經(jīng)連接核酸序列的引物混合物的額外分子擴增。51.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中該多重重疊延伸引物混合物包含引物組，其中各引物組中的至少一個引物組成員包含能夠與第二引物組的引物組成員的重疊延伸尾雜交的重疊延伸尾。52.根據(jù)權(quán)利要求48或51的方法，其中該多重重疊延伸引物混合物包含a)至少一個與編碼免疫球蛋白輕鏈區(qū)的序列的有意義鏈互補的mKapparl或hmJK引物；b)至少一個與編碼免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的序列或輕鏈可變區(qū)前導序列的反義鏈互補，且能夠與步驟a)中的該引物形成引物組的mVK引物；c)至少一個與編碼免疫球蛋白重鏈域的序列的有意義鏈互補的mCHrev1、mHCrev1-ext或mJH引物；及d)至少一個與編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的序列或重鏈可變區(qū)前導序列的反義鏈互補，且能夠與步驟c)中的該引物形成引物組的mVH引物。53.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中將該PCR產(chǎn)物插入表達載體中。54.根據(jù)權(quán)利要求53的方法，其中將雙啟動子盒(dualpromotorcassette)插入表達構(gòu)建體中，該雙啟動子盒能夠引導重鏈及輕鏈同時表達，優(yōu)選地其中該雙啟動子盒為雙向的。55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中該雙啟動子盒進一步包括編碼雙信號肽的核酸序列。56.根據(jù)權(quán)利要求53的方法，其中該表達載體骨架包含編碼人類恒定輕鏈的序列或其片段和/或編碼人類恒定重鏈的序列或其片段。57.根據(jù)權(quán)利要求43至56中任一項的方法，其包含另一擴增步驟，其中將具有能夠提供與可變輕鏈的連接的重疊的編碼人類恒定輕鏈或其片段的多核苷酸與能夠擴增按順序包含鼠科動物VH鏈、接頭、鼠科動物VL鏈、及人類恒定輕鏈的構(gòu)建體的引物組一起添加至PCR混合物中。58.根據(jù)權(quán)利要求43至56中任一項的方法，其包含另一擴增步驟，其中將具有能夠提供與可變重鏈的連接的重疊的編碼人類恒定重鏈或其片段的多核苷酸與能夠擴增按順序包含人類恒定重鏈、鼠科動物VH鏈、接頭、及鼠科動物VL鏈的構(gòu)建體的引物組一起添加至PCR混合物中。59.—種編碼嵌合抗體的載體文庫，各抗體成員由編碼非人類免疫球蛋白可變區(qū)的序列，和人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈恒定區(qū)組成。60.根據(jù)權(quán)利要求59的文庫，其中該載體是藉由根據(jù)權(quán)利要求1至41的方法或根據(jù)權(quán)利要求43至58的方法獲得。61.根據(jù)權(quán)利要求59的文庫，其中該輕鏈恒定區(qū)為k恒定區(qū)。62.根據(jù)權(quán)利要求59的文庫，其中該非人類序列為嚙齒動物序列，優(yōu)選為鼠科動物序列。63.根據(jù)權(quán)利要求59的文庫，其中該非人類序列為兔序列。64.根據(jù)權(quán)利要求59的文庫，其中該載體為表達載體。65.根據(jù)權(quán)利要求59的文庫，其中該可變區(qū)為關(guān)聯(lián)對。66.根據(jù)權(quán)利要求59的文庫，其中該人類免疫球蛋白恒定區(qū)選自人類免疫球蛋白IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4或IgM類。67.根據(jù)權(quán)利要求66的文庫，其中該恒定區(qū)選自IgGl及IgG2。68.—種編碼針對特定靶展現(xiàn)所需結(jié)合特異性的抗體的子文庫，其選自根據(jù)權(quán)利要求59至67中任一的文庫。全文摘要本發(fā)明是關(guān)于一種連接來自富含特殊表面抗原標記的細胞的群的編碼V_H和V_L的序列的關(guān)聯(lián)對的程序。該連接程序涉及能夠隨擴增(尤其為聚合酶鏈反應(多重PCR))連接感興趣核苷酸序列的多重分子擴增程序。該方法尤其有利于產(chǎn)生來自免疫球蛋白的編碼可變區(qū)的序列的關(guān)聯(lián)對文庫以及組合文庫。本發(fā)明亦是關(guān)于產(chǎn)生嵌合人類/非人類抗體的方法及由該等方法產(chǎn)生的表達文庫。文檔編號C12N15/10GK101622346SQ200880006843公開日2010年1月6日申請日期2008年2月27日優(yōu)先權(quán)日2007年3月1日發(fā)明者拉斯·S·尼爾森,杰斯珀·卡斯特拉普,珀-約翰·邁杰申請人:西福根有限公司