專利名稱：心肌梗死和心力衰竭中的診斷標(biāo)記和藥物設(shè)計(jì)平臺(tái)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及診斷標(biāo)記和用于藥物設(shè)計(jì)的平臺(tái)在心肌梗死和心力衰竭中 的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
充血性心力衰竭(CHF)不是一種特定的疾病，而是一些征兆和癥狀的 集合(compilation)，其全部是由心臟不能隨需要適當(dāng)增加心輸出量所引起 的。患者典型地表現(xiàn)出氣促、水腫和疲勞。CHF己經(jīng)成為一種流行比例疾 病，影響3%的成年人群。CHF的死亡率高于很多類型的癌癥，其五年存 活低于30%。心肌梗死(MI)是引發(fā)CHF的主要原因之一。左心室重建在 很大程度上促進(jìn)CHF。
現(xiàn)在普遍認(rèn)同心肌胞外基質(zhì)(ECM)的改變促進(jìn)進(jìn)行性重建過程。ECM 合成和降解的平衡，也稱作ECM周轉(zhuǎn)，決定組織結(jié)構(gòu)的維持。心臟中ECM 合成的正常速度非常低。在病理學(xué)情況過程中，例如MI中，膠原合成和 沉積加速不僅僅發(fā)生在梗死的心肌，而且發(fā)生在非-梗死的心肌中。生長(zhǎng)證 據(jù)提示纖維膠原網(wǎng)絡(luò)和膠原基質(zhì)解體的變化促進(jìn)LV重建?；|(zhì)解體己經(jīng) 歸因于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)增高的表達(dá)，該酶分解基質(zhì)蛋白并降低金 屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)，即一種蛋白酶抑制劑家族的表達(dá)。多形核 白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是MMPs的豐富來源。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在梗死心肌 中的募集和活化已表明主要促進(jìn)MI后所發(fā)生的過程。
因此，與神經(jīng)激素和促炎細(xì)胞因子例如腫瘤壞死因子-a(TNF-a)類似， 金屬蛋白酶(MMP)似乎代表了可促進(jìn)心力衰竭進(jìn)展的另一種不同類型的生物學(xué)活性分子。不斷增多的證據(jù)提示調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子和MMP水平可能代表一種治療心力衰竭患者的新型治療范例。
在包含至今為止25個(gè)成員的MMP家族中，MMP-9似乎是參與心室重建的的關(guān)鍵蛋白。近期顯示MMP活性在MI后的早期是有害的，而在MI后的晚期有益，這提示這樣的治療機(jī)會(huì)的存在，所述治療機(jī)會(huì)在應(yīng)用治療策略預(yù)防或治療重建時(shí)必須小心采用。許多研究提示了使用特異性MMP-9抑制劑的必要性，因?yàn)镸MP家族的其他成員可以在心室重建中具有有益作用。當(dāng)目的是治療其中涉及基質(zhì)降解的其他病理學(xué)時(shí)，遭遇相同的困難情形，即抑制MMP-9而非其他MMP。若干制藥公司測(cè)試了構(gòu)建所述MMP-9-特異性抑制劑的可能性，但是早期臨床試驗(yàn)帶來混合的結(jié)果。因此，這強(qiáng)調(diào)了對(duì)揭示開發(fā)特異性MMP-9抑制劑的新策略的需要。
MMP-9和TNF-a基因中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)可以起用于急性MI發(fā)展的易感性因子的作用。在初步研究中，我們確定在來自循環(huán)白細(xì)胞的MMP-9和TNF-a基因中存在SNP。 MassARRAY⑧技術(shù)針對(duì)一組98名患有急性MI的患者和92名具有非典型性胸痛和正常冠狀動(dòng)脈的患者進(jìn)行。在研究的147種SNP中，其中9種在兩組中顯示出高度不同的頻率。
在另一方面，我們進(jìn)行臨床研究，其中我們能夠首次顯示血漿MMP-9水平與心力衰竭進(jìn)展有關(guān)。事實(shí)上，MMP-9水平預(yù)示MI后CHF的晚期發(fā)作。在我們的研究中，具有低早期MMP-9水平的患者具有良好的晚期結(jié)果無CHF，正常射血分?jǐn)?shù)和舒張期末體積。然而，具有高早期MMP-9水平的患者具有晚期發(fā)作CHF (讓步比(odds ratio) 6.5, p< 0.006)和左心室重建(減少的射血分?jǐn)?shù)，增大的舒張期末體積)的顯著風(fēng)險(xiǎn)。因?yàn)槲覀冏畛醯墓紡?006年2月開始(Wagner DR, Delagardelle C, Ernens I,Rouy D, Vaillant M, Beissel J. Matrix metalloproteinase-9 is a marker of heartfailure after acute myocardial infarction (基質(zhì)金屬蛋白酶-9是急性心月幾梗死后心力衰竭的標(biāo)記).J Card Fail.(心力衰竭雜志)2006年2月；12(1):66-72)，所以我們的觀察已被多個(gè)其他小組重復(fù)。而且，近期顯示在繼心臟再同步治療后經(jīng)歷反向重建和心力衰竭改善的患者中MMP-9水平降低。因此，普遍認(rèn)同血槳MMP-9水平可以預(yù)示在再灌注MI后的心室重建和CHF。然而，盡管能夠測(cè)定患者中的MMP-9水平，本領(lǐng)域中仍存在對(duì)預(yù)示患者在MI后是否易感于心力衰竭的需要，以便可以準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)闹委熁蜷_始患者訓(xùn)導(dǎo)。
發(fā)明目的
本發(fā)明的目的是雙重的
1. 提供診斷工具
本發(fā)明的目的是提供用于早期診斷充血性心力衰竭發(fā)生的方法，從而改進(jìn)存活并減少惡化的心力衰竭的發(fā)展。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是使用該診斷工具確定處于發(fā)展心室重建和心力衰竭的危險(xiǎn)的易感患者。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是使用該診斷工具調(diào)節(jié)治療，從而更好地預(yù)防心肌梗死后的心室重建和心力衰竭。
2. 提供用于藥物設(shè)計(jì)的平臺(tái)
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于藥物設(shè)計(jì)的平臺(tái)，以提供或確定能夠
特異性抑制MMP-9活性的分子。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是降低患有心肌梗死或心力衰竭的患者中的活性
MMP-9的水平。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是使用該藥物治療心肌梗死后的患者，從而預(yù)防心肌的不適應(yīng)性(maladaptive)重建，包括纖維質(zhì)生成、程序性細(xì)胞死亡和壞死。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是使用該藥物治療心肌梗死后的患者，從而預(yù)防心力衰竭的發(fā)展。此外，本發(fā)明的另一個(gè)目的是施用治療有效量的該藥物，從而治療患有心肌梗死、急性心力衰竭或慢性心力衰竭的患者。
意外地，我們發(fā)現(xiàn)MMP-9基因的編碼序列中存在的單核苷酸多態(tài)性(SNP)在具有對(duì)心肌梗死后的心力衰竭有很好或很差的預(yù)后的患者中以不同頻率存在。特別意外的是，我們顯示出SNP引起轉(zhuǎn)錄的和活性的MMP-9蛋白的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域中的單氨基酸改變，由此導(dǎo)致MMP-9上結(jié)合TIMP-1的位點(diǎn)中的靜電變化。這非常重要，因?yàn)門IMP-1是MMP-9活性的最重要抑制劑。發(fā)明概述
因此，在第一方面，本發(fā)明提供用于確定個(gè)體在心肌梗死后對(duì)心臟病
癥的易感性的方法，所述方法包括檢測(cè)MMP-9 (基質(zhì)金屬蛋白酶9)的血紅
素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域序列中氨基酸改變的存在，所述結(jié)構(gòu)域中氨基酸改變的存在表示心肌梗死后對(duì)所述心臟病癥的易感性。
特別優(yōu)選的是，檢測(cè)到的序列包括或編碼位于與SEQ ID NOS. 6或8的位置148相對(duì)應(yīng)的位置處的精氨酸(Arg)或谷氨酰胺(Gln)氨基酸殘基，或位于與SEQ ID NOS. 2或4的位置668相對(duì)應(yīng)的位置處的殘基。此處，Arg的存在表示個(gè)體在MI后處于患有或發(fā)展心臟病癥的風(fēng)險(xiǎn)。此處，Gin的存在表示保護(hù)作用，即個(gè)體具有較低風(fēng)險(xiǎn)。
優(yōu)選地，在與SEQ ID NOS 5或7的位置443相對(duì)應(yīng)的位置處，或在與SEQ ID NOS. 1或3的位置7265相對(duì)應(yīng)的位置處檢測(cè)到SNP (A/G)的身份。此處，鳥嘌呤(Guanidine) (G)核苷酸的存在表示個(gè)體在MI后處于患有或發(fā)展心臟病癥的風(fēng)險(xiǎn)。此處，腺嘌呤(A)核苷酸殘基的存在表示保護(hù)作用，即個(gè)體具有較低風(fēng)險(xiǎn)。
MMP-9 (基質(zhì)金屬蛋白酶9)的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域序列，也稱為PEX9結(jié)構(gòu)域，顯示在(SEQIDNOS. 5-8)中，其中SEQ ID NOS 6和8是氨基酸序列且SEQ ID NOS 5和7是多核苷酸序列。該結(jié)構(gòu)域的序列可以通過評(píng)估蛋白質(zhì)序列本身或編碼該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列來檢測(cè)。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，所述核苷酸序列(優(yōu)選DNA或RNA)可以是編碼SEQID NOS. 6或8的任一核苷酸序列。然而，優(yōu)選地，所述核苷酸序列是按照SEQ ID NO. 5或7的。
優(yōu)選地，檢測(cè)的序列是SEQ ID NO. 7,其是來自處于風(fēng)險(xiǎn)的(易感)組中MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的DNA序列(在位置443處顯示G核苷酸)。
優(yōu)選地，檢測(cè)的序列是SEQIDNO. 8,其是來自處于風(fēng)險(xiǎn)的(易感)組中MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(在氨基酸位置148處顯示Arg)。
還優(yōu)選的是，檢測(cè)的序列是SEQ ID NO. 5,其是來自保護(hù)組中MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的DNA序列(在位置443處顯示腺嘌呤核苷酸)。優(yōu)選地，檢測(cè)的序列是SEQ ID NO. 6,其是來自處于保護(hù)組中MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(在氨基酸位置148處顯示Gln氮基酸殘基)。
優(yōu)選地，檢測(cè)血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域序列中氨基酸改變的存在通過比較來自個(gè)體的MMP-9的核苷酸序列和SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 3進(jìn)行。
特別優(yōu)選的是，該檢測(cè)可以通過評(píng)估與SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 3的位置7265相對(duì)應(yīng)的位置處的至少一個(gè)核苷酸的存在來進(jìn)行。如上所述，該位置處，或與其相對(duì)應(yīng)的位置處存在鳥嘌呤核苷酸表示個(gè)體在心肌梗死后易感于心臟病癥。優(yōu)選地，因此，該個(gè)體具有SEQ ID NO. 3中所示的MMP-9序列，其在所述位置處包含鳥嘌呤。
備選地，該檢測(cè)可以通過觀察腺嘌呤在與SEQ ID NO. 1的位置7265相對(duì)應(yīng)的位置處的存在來進(jìn)行，該位置處,或與其相對(duì)應(yīng)的位置處的腺嘌呤核苷酸針對(duì)心肌梗死后的心臟病癥具有保護(hù)性，換言之，處于該位置處的腺嘌呤核苷酸表示個(gè)體在心肌梗死后不易感于所述心臟病癥。優(yōu)選地，該個(gè)體具有SEQIDNO. 1中所示的MMP-9序列，其在所述位置處包含腺嘌呤。
備選地，或另外地，該檢測(cè)可以通過檢測(cè)從該基因轉(zhuǎn)錄的RNA中所述結(jié)構(gòu)域中氨基酸改變的存在來進(jìn)行。這優(yōu)選是mRNA。
然而，更優(yōu)選地，該檢測(cè)可以通過檢測(cè)活性或功能性蛋白中所述結(jié)構(gòu)域中氨基酸改變的存在來進(jìn)行。優(yōu)選地，該個(gè)體或患者具有按照SEQ IDNO. 2的MMP-9蛋白，其在SEQ ID NO. 2的位置668處，或與其相對(duì)應(yīng)的位置處包含谷氨酰胺(Gln)，其對(duì)心肌梗死后的心力衰竭具有保護(hù)性。備選地，該個(gè)體或患者具有按照SEQIDN0.4的MMP-9蛋白，其在SEQIDN0.2的位置668處，或與其相對(duì)應(yīng)的位置處包含精氨酸(Arg)，這表示對(duì)心肌梗死后心力衰竭的易感性。
所述個(gè)體或患者可以是風(fēng)險(xiǎn)中或保護(hù)性等位基因的純合體，或可以是雜合體。
優(yōu)選地，心臟病癥是心肌梗死，急性冠狀綜合癥，缺血性心肌病、非-缺血性心肌病或充血性心力衰竭。最優(yōu)選地，心臟病癥是充血性心力衰竭。蛋白序列的取樣是除核苷酸分析外優(yōu)選任選的，即評(píng)估了活性或功能性蛋白的基因型和蛋白序列(基因組和蛋白質(zhì)組分析)。
氨基酸序列中的變化優(yōu)選是本文中稱為SNP7265的SNP的結(jié)果。
該SNP包括在與SEQ ID NOS 1或3的7265相對(duì)應(yīng)的位置處從較常見的鳥嘌呤核苷酸到較少見的腺嘌呤核苷酸的變化，如上所述。該包含引起在與SEQ ID NOS 2或4的668相對(duì)應(yīng)的位置處從精氨酸氨基酸殘基到谷氨酰胺氨基酸殘基的變化，也如上所述。
優(yōu)選地，本發(fā)明包括評(píng)估或確定風(fēng)險(xiǎn)中等位基因的存在，即相應(yīng)位置處G的存在。備選地，或另外地，本發(fā)明優(yōu)選包括評(píng)估或確定保護(hù)性等位基因的存在，即所述位置處A的存在。
當(dāng)提及SEQ ID NOS 1禾卩/或3時(shí)，其應(yīng)該理解為包括提及血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域序列(SEQ ID NOS 5和/或7)和其中核苷酸的相應(yīng)編號(hào)方式，除非另外明示。同樣地，當(dāng)提及SEQIDNOS2禾卩/或4時(shí)，其應(yīng)該理解為包括提及血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域序列(SEQ ID NOS 6和/或8)和其中氨基酸的相應(yīng)編號(hào)方式，除非另外明示。
MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域優(yōu)選由SEQ ID NOS 5-8定義，如上所述，其具有或不具有由所述SNP引起的氨基酸變化。該血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域優(yōu)選與TIMP結(jié)合，最優(yōu)選與TIMP-1結(jié)合相關(guān)。
由所述SNP引起的氨基酸變化策略上定位于MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白-樣結(jié)構(gòu)域中(參見圖l-3)并且因此非?？赡懿粌H參與與膠原纖維的結(jié)合，還參與與MMP-9主要抑制劑，即金屬蛋白酶-1的組織抑制劑(TIMP-1)的結(jié)合。因此，該SNP和由此引起的氨基酸變化非常可能在心室重建和發(fā)育或進(jìn)展心臟病癥，尤其是心力衰竭中起關(guān)鍵作用。這是由本實(shí)施例得出的，所述實(shí)施例顯示保護(hù)性等位基因的存在和高EF,低早期MMP-9活性(MI后)，以及正常EF和EDV5，與非常低的發(fā)展心力衰竭、特別是充血性心力衰竭(CHF)或左心室(LV)童建的可能性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)性。
關(guān)于MMP-9的早期活性的機(jī)會(huì)優(yōu)選是MI后1 -2天，且優(yōu)選MI后小于24小時(shí)。因此,為了評(píng)估MMP-9活性水平，優(yōu)選地，在MI后至多24小時(shí)收獲的血漿樣品中測(cè)量MMP-9。評(píng)估的蛋白序列優(yōu)選是在任何翻譯后修飾之后。
優(yōu)選地，患者已經(jīng)經(jīng)歷心肌梗死。然而，還設(shè)想患者可能尚未經(jīng)歷心 肌梗死，在該情形中，所述SNP或由此引起的氨基酸變化應(yīng)該表示心肌梗 死后發(fā)展心臟病癥的可能性，則個(gè)體應(yīng)該患有心肌梗死。這對(duì)評(píng)估例如由 于家族MI病史，可能處于MI風(fēng)險(xiǎn),具有虛弱的心臟或其他風(fēng)險(xiǎn)因素,和/或 在可以引起心肌梗死的手術(shù)前的患者特別有效。
因此，本發(fā)明提供針對(duì)梗死的患者的篩査方法，所述方法包括確定以 上氨基酸變化的存在或缺乏。類似地，本發(fā)明還提供針對(duì)普通人群、梗死 或其他人群的篩查方法。
還提供在患有心肌梗死的患者中確定診斷和/或預(yù)后的方法，其通過使
基質(zhì)-金屬蛋白酶-9 (MMP-9)上的氨基酸變化與較低的MMP-9活性水平相 聯(lián)系來進(jìn)行，這表示心肌梗死后更好的臨床結(jié)果。
因此，優(yōu)選地，MMP-9的可測(cè)活性降低，最優(yōu)選通過降低MMP-9蛋 白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。這可以通過下調(diào)基因的表達(dá)或這可以通過競(jìng)爭(zhēng)或抑制(諸 如來自在活性位點(diǎn)或其他位置結(jié)合的抑制劑的空間(stearic)作用)。至今 為止的證據(jù)是存在由SNP引起的MMP-9表達(dá)的減少，由此降低的可測(cè)活 性。 '
所述活性可以通過許多本領(lǐng)域已知的關(guān)于蛋白酶的方法測(cè)量，例如， 其可以測(cè)定熒光標(biāo)記的裂解。酶譜法(zymogmphy)禾口/或ELISA是特別 優(yōu)選的。
如本文中所示，當(dāng)改變血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域，最優(yōu)選通過改變結(jié)構(gòu) 域的序列，特別是由所述SNP引起變化時(shí)，MMP-9的活性降低。這特別 是在MI后早期機(jī)會(huì)的情形，如上定義。
在我們以前的研究后，我研究了 MMP-9的遺傳多態(tài)性及其對(duì)心力衰 竭的重要性。為了該目的，我們開始測(cè)序?qū)嶒?yàn)，目的在于確定在MMP-9 基因完整序列中SNP的存在或不存在。選擇了 2組22名具有極端表型的 患者 一組在MI后具有良好臨床結(jié)果并且沒有左心室重建和心力衰竭的 征兆(特征在于左心室的射血分?jǐn)?shù)高于55%)，且一組在MI后具有差的臨 床結(jié)果并且存在左心室重建和心力衰竭的征兆(特征在于左心室的射血分 數(shù)低于40%)。在這些患者中鑒定了若干SNP。其中， 一種SNP，位于
iiMMP-9基因的編碼序列的位置7265處，表現(xiàn)出特別令人感興趣。事實(shí)上， SNP7265的頻率在兩組患者中不同。這提示SNP7265可能與MI后心力衰 竭的發(fā)生有關(guān)，且可以作為預(yù)后工具使用。
我們?nèi)缓笤噲D確定在患有MI的患者的小樣本(44名患者)中觀察到 的SNP7265和心力衰竭之間的相關(guān)性是否可以在較大群體中得到驗(yàn)證。我 們使用保存在我們實(shí)驗(yàn)室中的盧森堡急性心肌梗死(LUCKY:)登記簿進(jìn)行 基因型分型實(shí)驗(yàn)，從而檢測(cè)229名患者中SNP7265的存在。首先，這些實(shí) 驗(yàn)容許我們顯示SNP7265以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著方式與血漿MMP-9水平相關(guān)。其 次，我們能夠顯示SNP7265的確與MI后射血分?jǐn)?shù)和心力衰竭的發(fā)展顯著 相關(guān)。
這些實(shí)驗(yàn)揭示SNP7265作為診斷工具預(yù)測(cè)MI后心力衰竭發(fā)生的潛在 有效性。而且，我們假定SNP7265可以是開發(fā)以降低MI患者心臟中有害 MMP-9活性為目標(biāo)的治療策略的起始點(diǎn)。
按照本發(fā)明的另一方面，提供在患有心肌梗死的患者中確立診斷和預(yù) 后的方法，其通過使基質(zhì)-金屬蛋白酶-9 (MMP-9)的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域 中的氨基酸變化與較低的MMP-9水平相關(guān)聯(lián)實(shí)現(xiàn)，所述較低的MMP-9 水平顯示心肌梗死后更好的臨床結(jié)果。
氨基酸變化可以是MMP-9中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，優(yōu)選位于 MMP-9的編碼序列的位置7265處。SNP可以是鳥嘌呤到腺嘌呤核苷酸的 改變。SNP誘導(dǎo)精氨酸到谷氨酰胺氨基酸的改變。
優(yōu)選地，心臟病癥是心肌梗死，急性冠狀綜合癥，缺血性心肌病，非-缺血性心肌病或充血性心力衰竭。最優(yōu)選地，心臟病癥是充血性心力衰竭。
按照本發(fā)明的另一方面，提供用于抑制心室重建和治療和預(yù)防心力衰 竭的治療方法，其通過使基質(zhì)-金屬蛋白酶-9 (MMP-9)的血紅素結(jié)合蛋白結(jié) 構(gòu)域中的氨基酸變化與較低的MMP-9水平相關(guān)聯(lián)實(shí)現(xiàn)，所述較低的 MMP-9水平顯示心肌梗死后較好的臨床結(jié)果。
按照本發(fā)明的另一方面，提供預(yù)測(cè)患者在心肌梗死后發(fā)生心室重建的 方法，其通過使基質(zhì)-金屬蛋白酶-9 (MMP-9)的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域中的 氨基酸變化與較低的MMP-9水平相關(guān)聯(lián)實(shí)現(xiàn)，所述較低的MMP-9水平顯 示心肌梗死后較好的臨床結(jié)果。按照本發(fā)明的另一方面，提供改進(jìn)患者心肌梗死后治療策略的方法， 所述方法基于與基質(zhì)-金屬蛋白酶-9 (MMP-9)的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域中
的氨基酸變化相聯(lián)系，其又與顯示較好的臨床結(jié)果的較低的MMP-9水平 相關(guān)聯(lián)。
按照本發(fā)明的另一方面，提供用于治療心室重建的藥物設(shè)計(jì)平臺(tái)，所 述平臺(tái)基于使基質(zhì)-金屬蛋白酶-9 (MMP-9)的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域中的 氨基酸變化與較低的MMP-9水平相關(guān)聯(lián)實(shí)現(xiàn)，所述較低的MMP-9水平顯 示心肌梗死后較好的臨床結(jié)果。
按照本發(fā)明的另一方面，提供用于特異性抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (MMP-9)活性的藥物開發(fā)平臺(tái)，其中基質(zhì)-金屬蛋白酶-9 (MMP-9)上的氨 基酸變化與較低MMP-9水平相關(guān)并顯示心肌梗死后較好的臨床結(jié)果。
優(yōu)選地，這涉及在MMP-9蛋白二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)中使用由SNP氨基酸 變化引起構(gòu)象和靜電改變，從而提供關(guān)于MMP-9的新的激動(dòng)劑或拮抗劑/ 抑制劑，特別是能夠模擬或結(jié)合"改變的"TIMP-結(jié)合位點(diǎn)的那些。
備選地，本發(fā)明可以用于開發(fā)用于阻斷MMP-9活性或加強(qiáng)其與TIMP -1的相互作用的策略。
因此，本發(fā)明提供鑒定關(guān)于MMP-9的激動(dòng)劑或拮抗劑/抑制劑，或能 夠阻斷MMP-9活性、或加強(qiáng)其與TIMP -1的相互作用或減小MMP-9的可 檢測(cè)活性或表達(dá)的分子的方法。
本發(fā)明還提供鑒定關(guān)于MMP-9的激動(dòng)劑或拮抗劑/抑制劑，或能夠阻 斷MMP-9活性、或加強(qiáng)其與TIMP -1的相互作用或減小MMP-9的可檢測(cè) 活性或表達(dá)的分子的方法，其包括設(shè)計(jì)將與基質(zhì)-金屬蛋白酶-9 (MMP-9) 的改變的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用的分子或配體。
按照本發(fā)明的另一方面，提供用于改進(jìn)MMP-9與其天然抑制劑即 MMP-1的組織抑制劑(TIMP-1)的結(jié)合的方法，所述方法是通過使基質(zhì)-金屬蛋白酶-9 (MMP-9)的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域中的氨基酸變化與較低 MMP-9水平相關(guān)聯(lián)實(shí)現(xiàn)，并顯示心肌梗死后較好的臨床結(jié)果。
按照本發(fā)明的另一方面，提供防止與末期心臟病有關(guān)的心肌組織退化 的方法，其包括施用治療有效量的藥物，其中基質(zhì)-金屬蛋白酶-9(MMP-9) 的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域中的氨基酸變化與較低MMP-9水平相關(guān)，并顯示心肌梗死后較好的臨床結(jié)果。
在本發(fā)明的另一方面中，提供治療表現(xiàn)出充血性心力衰竭癥狀的患者 的方法，其包括施用降低心肌組織中MMP-9活性的試劑，其中基質(zhì)-金
屬蛋白酶-9 (MMP-9)的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域中的氨基酸變化與較低 MMP-9水平相關(guān)，并顯示心肌梗死后較好的臨床結(jié)果。
所述癥狀可以指示慢性或急性心力衰竭，且減少心肌組織中MMP-9 生成的試劑可以包括治療有效藥物。
為了避免疑惑，氨基酸變化，在本發(fā)明任一方面中，可以是MMP-9 中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，優(yōu)選位于MMP-9的編碼序列的位置7265 處。SNP可以是鳥嘌呤到腺嘌呤核苷酸的改變。SNP誘導(dǎo)精氨酸到谷氨酰 胺氨基酸的改變，如上文進(jìn)一步定義。優(yōu)選地，所述心臟病癥是心肌梗死, 急性冠狀綜合癥，缺血性心肌病，非-缺血性心肌病或充血性心力衰竭。最 優(yōu)選地，所述心臟病癥是充血性心力衰竭。藥物或試劑可以通過口服、靜 脈內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)皮或在合適載體中表達(dá)來施用。
本發(fā)明還提供確定個(gè)體對(duì)心臟疾病的易感性的方法，其包括檢測(cè)SNP 的風(fēng)險(xiǎn)中等位基因，其中所述SNP位于編碼活性MMP-9蛋白的血紅素結(jié) 合蛋白結(jié)構(gòu)域的序列中。
本發(fā)明還提供測(cè)定樣品中具有與心臟病癥易感性有關(guān)的SNP的第一 多核苷酸的存在的方法，其包括使所述樣品與第二多核苷酸相接觸，其 中所述第二多核苷酸包含選自由SEQ. ID. NOS.: 1，3, 5, 7， 9和/或IO和所述 序列的互補(bǔ)序列組成的組中的核苷酸序列，其中所述第二多核苷酸在嚴(yán)格 條件下與所述第一多核苷酸雜交。所述嚴(yán)格條件優(yōu)選是高度嚴(yán)格的，優(yōu)選 是6xSSC。
還提供包括分離的多核苷酸的載體，所述多核苷酸包含與心臟病癥易 感性有關(guān)的SNP，其中所述分離的多核苷酸可操作地連接于調(diào)節(jié)序列，優(yōu) 選是合適的啟動(dòng)子。還提供包含所述載體的宿主細(xì)胞。
在所有方面中，與心臟病癥易感性有關(guān)的SNP引起轉(zhuǎn)錄的活性MMP-9 蛋白的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域中的所述氨基酸變化，且最優(yōu)選的是，如本 文中所述的SNP7265，即G到A核苷酸的改變導(dǎo)致所述結(jié)構(gòu)域中Arg到 Gin氨基酸的改變。本發(fā)明還提供用于生成由具有與心臟病癥易感性有關(guān)的SNP的分離的多核苷酸編碼的多肽的方法，其包括在適合于表達(dá)所述多 核苷酸的條件下培養(yǎng)上述重組宿主細(xì)胞。
還提供測(cè)定樣品中由具有與心臟病癥易感性有關(guān)的SNP的分離的多 核苷酸編碼的多肽的存在的方法，所述方法包括使所述樣品與特異性結(jié)合 所述編碼的多肽的抗體相接觸。
本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其包含具有與心臟病癥易感性有關(guān)的SNP
的多核苷酸。
還提供確定改變包含與心臟病癥易感性有關(guān)的SNP的多核苷酸表達(dá)
的試劑的方法，所述方法包括
(a) 使多核苷酸與待測(cè)試的試劑在用于表達(dá)的條件下相接觸，其中所 述多核苷酸包括(1)與心臟病癥易感性有關(guān)的SNP和(2)與報(bào)告基因可 操作連接的啟動(dòng)子區(qū)；
(b) 在存在所述試劑的條件下，評(píng)估所述報(bào)告基因的表達(dá)水平；
(c) 在缺乏所述試劑的條件下，評(píng)估所述報(bào)告基因的表達(dá)水平；和
(d) 比較步驟(b)中的表達(dá)水平和步驟(c)中的表達(dá)水平，以確定 差別，所述差別表示表達(dá)受到所述試劑的改變。
本發(fā)明還提供測(cè)定樣品以確定第一多核苷酸的存在的方法，所述第一 多核苷酸與第二多核苷酸的一部分至少部分互補(bǔ)，其中所述第二多核苷酸 包括選自由SEQ. ID.NOS. 1，3,5,7,9和/或10確定的序列及其互補(bǔ)序列組 成的組中的序列，所述方法包括
a) 使所述樣品與所述第二多核苷酸在適合于雜交的條件下相接觸，和
b) 評(píng)估在所述第一和所述第二多核苷酸之間是否發(fā)生雜交， 其中如果發(fā)生雜交，則所述第一多核苷酸存在于所述樣品中。 雜交的合適標(biāo)記是本領(lǐng)域中已知的。
還提供用于測(cè)定樣品以確定包含與心臟病癥易感性有關(guān)的SNP的第 一多核苷酸的存在的試劑，所述試劑包括包含連續(xù)核苷酸序列的第二多核 苷酸，其與所述第一多核苷酸的一部分至少部分互補(bǔ)。
本發(fā)明還提供用于測(cè)定樣品以確定包含與心臟病癥易感性有關(guān)的SNP 的第一多核苷酸的存在的試劑盒，其包括處于單獨(dú)容器中的下列各項(xiàng)
a)—種或多種標(biāo)記的第二多核苷酸，其包含選自由SEQ.ID. NOS.: 1,3,5，7，9和/或IO確定的序列及其互補(bǔ)序列組成的組中的序列；和 b)用于檢測(cè)所述標(biāo)記的試劑。
還提供診斷個(gè)體中對(duì)心臟病癥的易感性的方法，其包括檢測(cè)與所述病
癥有關(guān)的單元型，所述單元型包括所述SNP和至少一個(gè)其他單元型。優(yōu)選 所述至少一個(gè)其他單元型也與MI-后的疾病狀態(tài)，特別是心臟病癥有關(guān)。
優(yōu)選地，檢測(cè)單元型的存在包括酶促擴(kuò)增來自個(gè)體的核酸。優(yōu)選地， 檢測(cè)單元型的存在還包括電泳分析。檢測(cè)單元型的存在還可以包括限制片 段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。檢測(cè)單元型的存在還可以包括序列分析。
還提供診斷個(gè)體中對(duì)心臟病癥的易感性的方法，所述方法包括
a) 從所述個(gè)體獲得多核苷酸樣品；和
b) 分析所述多核苷酸樣品以確定單元型的存在或不存在， 其中單元型的存在對(duì)應(yīng)于對(duì)所述心臟病癥的易感性。 還提供鑒定與心臟病癥的易感性有關(guān)的基因的方法，包括(a)鑒定
包含SNP的基因，所述SNP位于選自由SEQ. ID. NOS.: 1,3, 5, 7， 9禾卩/或 10確定的序列及其互補(bǔ)序列組成的組中的序列中；和(b)比較所述基因 在具有風(fēng)險(xiǎn)中等位基因的個(gè)體中的表達(dá)和所述基因在不具有風(fēng)險(xiǎn)中等位 基因的個(gè)體中的表達(dá)，以確定差別，所述差別表示該基因與所述心臟病癥 的易感性有關(guān)。
本發(fā)明還提供確定適合于治療心臟病癥的試劑的方法，其包括(a) 使多核苷酸與待測(cè)試的試劑相接觸，其中所述多核苷酸包含SNP，所述 SNP位于選自由SEQ. ID. NOS.: 1,3, 5， 7, 9和/或IO確定的序列及其互補(bǔ)序 列組成的組中的序列中；和(b)確定所述試劑是否以對(duì)治療所述病癥有 效的方式結(jié)合、改變、或影響所述多核苷酸。
還提供確定適合于治療心臟病癥的試劑的方法，其包括 (a)使多肽與待測(cè)試的試劑相接觸，其中所述多肽是SEQ ID NO 2 或4或由包含SNP的多核苷酸編碼，所述SNP位于選自由SEQ. ID. NOS. 1,3,5，7,9和/或IO確定的序列及其互補(bǔ)序列組成的組中的序列中;和(b) 確定所述試劑是否以對(duì)治療所述病癥有效的方式結(jié)合、改變、或影響所述 多肽。
還提供由所述方法確定的藥物或試劑，包含治療有效量的所述試劑的
16藥物組合物。 附圖簡(jiǎn)述


圖1是MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的3D結(jié)構(gòu)圖，其標(biāo)出了精氨
酸的位置。
圖2顯示人MMP-2血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的3D結(jié)構(gòu)，其在相同(即
相對(duì)應(yīng)的)位置處包含谷氨酰胺。
圖3A圖示無突變的MMP-9結(jié)構(gòu)的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。
圖3B圖示具有突變的MMP-9結(jié)構(gòu)的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。
圖4A顯示SNP7275和急性MI后患者中血漿MMP-9水平之間的統(tǒng)計(jì)
學(xué)顯著關(guān)系。
圖4B顯示SNP7275和MI后4個(gè)月時(shí)患者的射血分?jǐn)?shù)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué) 顯著關(guān)系。
圖5提供人MMP-9的全基因組DNA序列和氨基酸序列。標(biāo)出了位于 核苷酸序列位置7265處的SNP (外顯子12)，其誘導(dǎo)——當(dāng)鳥嘌吟(符號(hào) "G")轉(zhuǎn)化為腺嘌呤(符號(hào)"A")時(shí)——氨基酸精氨酸(符號(hào)"R")改 變?yōu)楣劝滨０?符號(hào)"Q")，其還通過在氨基酸序列中用粗體和帶下劃線 的字母標(biāo)出(氨基酸668)。
詳述
基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是非常重要的化合物，其是心肌胞外基質(zhì)降 解背后的驅(qū)動(dòng)力。近來的研究已清楚地證明在心臟中，MMPs促進(jìn)心室重 建和心力衰竭。在臨床水平，來自我們小組的研究近期得到其他人的驗(yàn)證， 即表明升高的血液MMPs水平與MI后心力衰竭的發(fā)展有關(guān)。因此，測(cè)定 患有MI或CHF的患者的MMPs，且特別是MMP-9，提供了與TNF-a、 血管緊張素1I或去甲腎上腺素類似的預(yù)后測(cè)量。嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞 在導(dǎo)致心肌損傷和纖維化的炎性應(yīng)答中起重要作用，其至少部分通過生成 大量MMP-9實(shí)現(xiàn)。
我們研究在重建過程中負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)MMP-9活性的機(jī)制，且我們檢驗(yàn) MMP-9基因的遺傳多態(tài)性可以改變MMP活性的假說。為了該目的，我們首先選擇44名患有心肌梗死的患者，其中22名具
有有利的結(jié)果(EF 〉 55%)且22名具有不利的結(jié)果(EF < 40%)。基因組DNA 從分離自這些患者靜脈血的外周血單核細(xì)胞中提取。對(duì)全MMP-9基因 (9kB)進(jìn)行測(cè)序。平行地，MMP-9血漿濃度利用明膠酶譜法確定。
我們確定了在兩組患者之間顯著變化的5個(gè)SNP。其中，位于MMP-9 基因的編碼序列的位置7265處的一個(gè)SNP (稱為SNP7265)與MMP-9 的結(jié)構(gòu)和活性的變化密切相關(guān)。該SNP誘導(dǎo)MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié) 構(gòu)域，即其中TIMP-1與MMP-9相互作用的相同結(jié)構(gòu)域的氨基酸組成的 變化。TIMP-1是MMP-9最重要的天然制動(dòng)器。僅已知該SNP的存在。 然而，其臨床和治療重要性完全未得到承認(rèn)。
我們?nèi)缓髾z驗(yàn)SNP7265在更大的患急性MI的患者群體(229名患者) 中的顯著性。我們能夠揭示SNP7265、血漿MMP-9水平和射血分?jǐn)?shù)之間 的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)系。突變的存在改善MI患者的臨床結(jié)果，因?yàn)槠渑c較低 的血漿MMP-9水平和較高的射血分?jǐn)?shù)相關(guān)。突變因此是保護(hù)性的，且減 少在MI后發(fā)展心力衰竭的機(jī)會(huì)。
因此，我們提議一種以兩種互補(bǔ)方式使用該SNP的新方法第一，作 為診斷和預(yù)后方法確定處于心肌梗死后發(fā)展心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)中的患者，和第 二，作為用于藥物設(shè)計(jì)的平臺(tái)，其目的是特異性抑制MMP-9的活性。
我們關(guān)于MMP-9最初公開發(fā)表于2006年2月(Wagner等，見上)并顯 示基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (MMP-9)是急性心肌梗死后心力衰竭的標(biāo)志。然而， 該文獻(xiàn)完全沒有記載可能是保護(hù)以避免或表示針對(duì)MI后心臟病癥易感性 的SNP或核苷酸或氨基酸改變。
盡管僅已知該SNP的存在(本文中指SNP7265)，但是尚未將其與功 能相聯(lián)系。這是因?yàn)樗鯯NP (并提供參考SNP ID rs2274756)，以及許 多其他SNP，是通過若干研究小組對(duì)來自不同群體的數(shù)百人的基因組進(jìn)行 測(cè)序確定的。這些個(gè)體沒有與疾病狀態(tài)相聯(lián)系，因此在兩組或更多組患者 之間從未進(jìn)行SNP頻率的任何比較(即，正常對(duì)照患病的；或有病的對(duì)照 無病的)。換言之，SNP被確定為基因組測(cè)序工程的一部分，且從未與MI 后心臟病癥的發(fā)生率相聯(lián)系。
還提供用于改善MMP-9與其天然抑制劑，即MMP-1的組織抑制劑(TIMP-1)結(jié)合的方法，預(yù)防與末期心臟病相關(guān)的心肌組織退化的方法， 其包括施用治療有效量的藥物，和治療表現(xiàn)出充血性心力衰竭癥狀的患者
的方法，其包括施用降低心肌組織中MMP-9活性的試劑。
當(dāng)提到SNP時(shí)，應(yīng)該理解其包括核苷酸變化和由此產(chǎn)生的氨基酸變
化，除非另外明示。
單核苷酸多態(tài)性，或SNP，通常公認(rèn)為是當(dāng)基因組中的單核苷酸----A, T, C,或G -在物種成員之間(或在個(gè)體中配對(duì)染色體之間)不一致時(shí)發(fā) 生的DNA序列變化。例如，兩個(gè)來自不同個(gè)體的測(cè)序DNA片段，即 AAGCCTA到AAGCTTA，在單核苷酸中包含區(qū)別。在該實(shí)例中，認(rèn)為是 兩個(gè)等位基因C和T。
在本發(fā)明中，還存在兩個(gè)等位基因保護(hù)性等位基因(包括腺嘌呤和 編碼的Gln)和風(fēng)險(xiǎn)/易感性等位基因(包括鳥嘌呤和編碼的Arg)。
還應(yīng)該理解，可以檢測(cè)編碼Gln的全部密碼子(CAA或CAG)。備選地， 或另外地，可以檢測(cè)編碼Arg的全部密碼子(CGA或CGG)。任選地，還 可以檢測(cè)添加旁側(cè)核苷酸，優(yōu)選至少2個(gè)，更優(yōu)選至少5個(gè)，更優(yōu)選至少 10個(gè)，更優(yōu)選至少15個(gè)，更優(yōu)選至少20個(gè)和，更優(yōu)選至少25個(gè)。SNP核 苷酸或密碼子各側(cè)的數(shù)量可以相同或不同。
SNP經(jīng)常發(fā)現(xiàn)是許多人類疾病的病因，并在藥理遺傳學(xué)中受到特別的 關(guān)注。因此，針對(duì)各個(gè)個(gè)體的治療和藥物的藥理遺傳學(xué)分析和調(diào)整也包括 在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
所述SNP還可以提供遺傳指紋，以用在身份測(cè)試中。
檢測(cè)步驟可以包括分離蛋白或多核苷酸序列和確定相關(guān)的一種或多種 核苷酸或一種或多種氨基酸殘基的身份。
用于檢測(cè)SNP的合適方法，對(duì)本領(lǐng)域中技術(shù)人員也應(yīng)該是已知的，但 是可以包括下文中所述的那些中的任一種。本發(fā)明不受任意這類方法的限 制。
合適的方法可以包括基于雜交的方法，包括動(dòng)力學(xué)等位基因一特異性 雜交(DASH)，其利用DNA中由錯(cuò)配堿基對(duì)的不穩(wěn)定性引起的解鏈溫度 的差別。該過程可以是高度自動(dòng)化的，且包括少量簡(jiǎn)單原理。在第一步中， 基因組片斷通過使用生物素化的引物的PCR反應(yīng)擴(kuò)增并附著于珠。在第二步中，將擴(kuò)增的產(chǎn)物附著于鏈霉抗生物素蛋白柱，并用NaOH洗滌，以 除去未生物素化的鏈。然后，在存在當(dāng)與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)發(fā)熒光的分子 的條件下，加入等位基因特異性寡核苷酸。然后，隨著溫度的升高測(cè)量該 強(qiáng)度，直到可以確定Tm。 SNP會(huì)引起低于預(yù)期的Tm。
通過分子信標(biāo)(Molecular beacon)的SNP檢測(cè)利用特殊改造的單鏈寡 核苷酸探針。設(shè)計(jì)該寡核苷酸，以使得在各個(gè)末端存在互補(bǔ)區(qū)，且探針序 列位于其間。該設(shè)計(jì)容許該探針在其天然、分離的狀態(tài)中采用發(fā)夾、或莖 -環(huán)結(jié)構(gòu)。附著在該探針一個(gè)末端的是熒光團(tuán)，且附著在另一個(gè)末端的是熒 光猝滅劑。由于探針的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，所以所述熒光團(tuán)非?？拷鲡鐒?由此防止該分子發(fā)射任何熒光。還改造該分子，以使得只有該探針序列與 該測(cè)定中將使用的基因組DNA互補(bǔ)。
如果分子信標(biāo)的探針序列在測(cè)定過程中遭遇其靶基因組DNA，則應(yīng)該 退火和雜交。由于探針序列的長(zhǎng)度，所以探針的發(fā)夾片斷應(yīng)該變性，有利 于形成更長(zhǎng)的更穩(wěn)定的探針-耙標(biāo)雜交物。該構(gòu)象變化允許熒光團(tuán)和猝滅劑 避免由于發(fā)夾聯(lián)系而非?？拷?，從而容許該分子發(fā)熒光。如果在另一方面， 探針序列遭遇具有少至1個(gè)非-互補(bǔ)核苷酸的靶序列，則分子信標(biāo)應(yīng)該優(yōu)選 位于其天然發(fā)夾狀態(tài)中，并不應(yīng)該觀察到熒光，因?yàn)闊晒鈭F(tuán)保持猝滅。
這些分子信標(biāo)的獨(dú)特設(shè)計(jì)容許簡(jiǎn)單診斷測(cè)定確定給定位置處的SNP。 如果將一個(gè)分子信標(biāo)設(shè)計(jì)為匹配野生型等位基因，且另一個(gè)匹配該等位基 因的突變體，則可以使用這兩個(gè)確定個(gè)體的基因型。如果在測(cè)定過程中僅 檢測(cè)到第一探針熒光團(tuán)波長(zhǎng)，則該個(gè)體對(duì)野生型是純合的。如果僅檢測(cè)到 第二探針波長(zhǎng)，則該個(gè)體對(duì)突變等位基因是純合的。最后，如果檢測(cè)到這 兩種波長(zhǎng)，則兩個(gè)分子信標(biāo)必然與它們的互補(bǔ)序列雜交，并且因此該個(gè)體 必然包含這兩種等位基因且是雜合的。
還使用SNP微陣列。在高密度寡核苷酸SNP陣列中，數(shù)十萬探針排 列在一個(gè)小芯片上，從而容許同時(shí)訊問大量SNP，由此容許除本發(fā)明外還 檢測(cè)其他風(fēng)險(xiǎn)因子。
還可以使用基于酶的方法，包括DNA連接酶，DNA聚合酶和核酸酶， 因?yàn)檫@些被認(rèn)為是高保真SNP基因型分型法。
認(rèn)為限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)是最簡(jiǎn)單和最早期的檢測(cè)SNP的
20方法之一。SNP-RFLP利用許多不同的限制性核酸內(nèi)切酶及其對(duì)唯一的特
異性限制位點(diǎn)的高親和性。通過對(duì)基因組樣品進(jìn)行消化和通過凝膠測(cè)定確 定片段長(zhǎng)度，有可能確定該酶是否切斷預(yù)期的限制性位點(diǎn)。未能切斷基因 組樣品導(dǎo)致明顯大于預(yù)期的片段，這暗示在限制性位點(diǎn)附近存在突變，該 突變致使其受到保護(hù)以避免遭受核酸酶活性。
還設(shè)想了基于PCR的方法。例如，四-引物ARMS-PCR在一個(gè)PCR
反應(yīng)中使用兩對(duì)引物擴(kuò)增兩種等位基因。設(shè)計(jì)該引物，以使得這兩對(duì)引物 對(duì)在SNP的位置重疊，但各自僅與一個(gè)可能的SNP完全匹配。所以，如 果PCR反應(yīng)中存在給定的等位基因，則特異于該等位基因的引物對(duì)應(yīng)該 生成產(chǎn)物，而特異于另一個(gè)具有不同SNP的等位基因的引物對(duì)不應(yīng)該生成 產(chǎn)物。還設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物對(duì)，以使得它們的PCR產(chǎn)物具有顯著不同的長(zhǎng) 度，從而容許產(chǎn)生通過凝膠電泳容易區(qū)分的條帶。
在檢查該結(jié)果中，如果基因組樣品是純合的，則產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物應(yīng)該 來自使SNP位置與外部相反鏈引物匹配的引物，以及來自兩個(gè)相反的外部 引物。如果基因組樣品是雜合的，則產(chǎn)物應(yīng)該由各種等位基因與它們各自 的外部引物負(fù)體的引物，以及由兩個(gè)相反的外部引物產(chǎn)生。
FIap核酸內(nèi)切酶(FEN)是催化結(jié)構(gòu)-特異性裂解的核酸內(nèi)切酶。該裂 解對(duì)錯(cuò)配高度敏感，并可以用于訊問具有高度特異性的SNP。
在基本侵入物(Invader)測(cè)定中，稱為FEN的裂解酶與兩種特異性寡 核苷酸探針組合，其與靶DNA—起，可以形成由該裂解酶識(shí)別的三聯(lián)體 結(jié)構(gòu)。第一探針，稱為侵入物寡核苷酸，與靶DNA的3'末端互補(bǔ)。侵入 物寡核苷酸的最后堿基是非-匹配堿基，其與靶DNA中的SNP核苷酸重疊。 第二探針是等位基因-特異性探針，其與靶DNA的5，末端互補(bǔ)，但還延伸 越過SNP核苷酸的3，側(cè)。等位基因-特異性探針應(yīng)該包含與SNP核苷酸互 補(bǔ)的堿基。如果靶DNA包含理想的等位基因，則侵入物和等位基因-特異 性探針應(yīng)該與靶DNA結(jié)合，形成三聯(lián)體結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)被裂解酶識(shí)別，這 將裂解并釋放等位基因-特異性探針的3'末端。如果靶DNA中的SNP核 苷酸不與等位基因4寺異性探針互補(bǔ)，則不形成正確的三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，且不發(fā) 生裂解。該侵入物測(cè)定通常與熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)系統(tǒng)偶聯(lián)，從而檢 測(cè)裂解事件。在該設(shè)置中，猝滅劑分子附著于等位基因-特異性探針的3'末端且熒光團(tuán)附著于5，末端。如果裂解發(fā)生，則熒光團(tuán)應(yīng)該與猝滅劑分子 分開，由此產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。
使用錯(cuò)配的探針僅發(fā)生最小的裂解使得侵入物測(cè)定高度特異性。然而， 在其原始格式中，只能訊問一個(gè)SNP等位基因/反應(yīng)樣品，且其需要大量
靶DNA在合理期限內(nèi)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。若干發(fā)展擴(kuò)展了原始的侵入物 測(cè)定。通過執(zhí)行第二 FEN裂解反應(yīng)，連續(xù)入侵信號(hào)擴(kuò)增反應(yīng)(Serial Invasive Signal Amplification Reaction) (SISAR)容許在單次反應(yīng)中訊問兩種SNP等 位基因。SISAR侵入物測(cè)定還需要較少的靶DNA，從而提高原始侵入物 測(cè)定的靈敏性。還以若干方式改造該測(cè)定，從而以高通量形式使用。在一 個(gè)平臺(tái)中，將等位基因-特異性探針錨定于微球。當(dāng)由FEN引起的裂解產(chǎn) 生可檢測(cè)的熒光信號(hào)時(shí)，利用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)量該信號(hào)。流式細(xì)胞計(jì)數(shù) 法的靈敏性消除對(duì)PCR擴(kuò)增靶DNA的需要。這些高通量平臺(tái)尚未超越原 理-證據(jù)階段進(jìn)展，且迄今為止，侵入物系統(tǒng)尚未用在任何大規(guī)模SNP基 因型分型工程中。
其他合適的方法包括引物延伸分析，5'-核酸酶測(cè)定(諸如關(guān)于SNP 基因型分型的Taqman⑧測(cè)定)，寡核苷酸連接酶測(cè)定，單鏈構(gòu)象多態(tài)性測(cè) 定，溫度梯度凝膠電泳(TGGE)，變性高效液相層析法(DHPLC)，完整擴(kuò) 增子的高分辨率解鏈，SNPlex (應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)銷售 的專利基因型分型平臺(tái))或甚至通過測(cè)序(特別是通過熱測(cè)序)。
術(shù)語"SNP"指人基因組中特定位置處的單核苷酸多態(tài)性，其在個(gè)體 群中 變化。用于本文中時(shí)，SNP可能通過其名稱或通過在特定序列中的位 置確定。
用于本文中時(shí)，由本發(fā)明的SEQ. ID. NOS. 1,3,5,7,9和10公開的核苷 酸序列包括所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列。另外，用于本文中時(shí)，術(shù)語"SNP" 包括一組等位基因中的任一等位基因。
術(shù)語"等位基因"指選擇定義SNP的核苷酸中的特定核苷酸。術(shù)語"次 要等位基因"指SNP的等位基因，其在個(gè)體群中以低于主要等位基因的頻 率出現(xiàn)，例如本發(fā)明的保護(hù)性等位基因(包括A)。術(shù)語"主要等位基因" 指SNP的等位基因，其在個(gè)體群中以高于次要等位基因的頻率出現(xiàn)，例如 本發(fā)明的風(fēng)險(xiǎn)中等位基因(包括G)。術(shù)語"風(fēng)險(xiǎn)中等位基因"指與對(duì)MI后心臟病癥的易感性有關(guān)的等位 基因。術(shù)語"單元型"指來自兩種或更多SNP的特殊等位基因的組合。
術(shù)語"多核苷酸"指任意長(zhǎng)度的核苷酸多聚體形式。多核苷酸可以包 含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、和/或它們的類似物。多核苷酸可以具有 任意三維結(jié)構(gòu)，包括單鏈、雙鏈和三螺旋分子結(jié)構(gòu)，且可以執(zhí)行任意已知 或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性實(shí)施方案基因或基因片段、
外顯子、內(nèi)含子、mRNA、 tRNA、 rRNA、短干擾核酸分子(siRNA)、核 糖核酸酶、cDNA、重組多核苷酸、分支的多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任意 序列的分離的DNA、任意序列的分離的RNA、核酸探針、和引物。多核 苷酸還可以包括修飾的核酸分子，諸如甲基化的核酸分子和核酸分子類似
"基本分離的"或"分離的"多核苷酸是基本不含自然界中與其結(jié)合 的序列的那些。基本不含意指至少50%，至少70%，至少80%,或至少90%
地不含自然界中與其結(jié)合的物質(zhì)。"分離的多核苷酸"還包括重組多核苷 酸，其，依靠來源或操作(1)不與在自然界中與其結(jié)合的所有或一部分 多核苷酸結(jié)合，(2)與除在自然界中與其連接的多核苷酸相連接，或(3) 在自然界中不發(fā)生。
術(shù)語"在嚴(yán)格條件下雜交"意欲描述雜交和洗滌的條件，在該條件下 彼此至少60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,卯％， 95%,或98%相同的核苷酸 序列典型地保持彼此間的雜交。所述嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知 的，且參見Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)流程)， John Wiley & Sons,紐約(簡(jiǎn)),6.3.1- 6.3.6。嚴(yán)格雜交條件的非限制性實(shí)例 是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，在約45。C雜交，隨后在0.2. x SSC， 0.1% SDS中，在50-65'C，進(jìn)行一次或多次洗滌。
當(dāng)提到特定的序列、氨基酸或核苷酸時(shí)，應(yīng)該理解其包括優(yōu)選與所述 參考序列至少70%序列同源性和更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%,更 優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%,更優(yōu)選至少99%, 更優(yōu)選至少99.5%,和甚至更優(yōu)選至少99.9%同源性，除非另外明示。用 于確定此的合適方法包括BLAST程序。
術(shù)語"載體"指能夠攜帶插入的DNA并在宿主細(xì)胞中永續(xù)的DNA分子。載體還稱為克隆載體，克隆媒介物或媒介物。術(shù)語"載體"包括主要 起將核酸分子插入細(xì)胞中的作用的載體、主要起復(fù)制核酸作用的復(fù)制載
體、和起轉(zhuǎn)錄和/或翻譯DNA或RNA作用的表達(dá)載體。還包括提供多于
一種以上功能的載體。
"宿主細(xì)胞"包括單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，其可以是或已經(jīng)是載體或 引入核酸分子和/或蛋白的受體。宿主細(xì)胞包括單宿主細(xì)胞的后代，且所述 后代由于天然的、意外的、或蓄意的突變，不必然與原始親本完全相同(在
形態(tài)學(xué)或總DNA互補(bǔ)序列方面)。宿主細(xì)胞包括用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞。"分離的宿主細(xì)胞"是從其來源的生物體中物理解離的細(xì)胞。
術(shù)語"個(gè)體"、"宿主"、和"受試者"在本文中可以互換使用，以指脊 椎動(dòng)物，優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地，人。
術(shù)語"轉(zhuǎn)化"、"轉(zhuǎn)染"、和"遺傳轉(zhuǎn)化"在本文中可以互換使用，以指 將外源多核苷酸插入或引入宿主細(xì)胞，其與用于插入的方法，例如，脂轉(zhuǎn) 染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、電穿孔、CaPU4沉淀、DEAE-葡聚糖、粒子轟擊等無關(guān)。 外源多核苷酸可以保持為非-整合的載體，例如，質(zhì)粒，或備選地，可以整 合到宿主細(xì)胞基因組中。遺傳轉(zhuǎn)化可以是瞬時(shí)的或穩(wěn)定的。
本發(fā)明使用，除非另外指出，常規(guī)分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生 物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)，其屬于本領(lǐng)域中的一般技術(shù)。
用于本文中時(shí)，任何術(shù)語的單數(shù)形式可以備選地包括復(fù)數(shù)形式，且反 之亦然。將本文中引用的所有出版物和參考文獻(xiàn)作為整體引入本文作為參 考，以實(shí)現(xiàn)任何目的。
現(xiàn)關(guān)于以下非限制性實(shí)施例描述本發(fā)明。
實(shí)施例 患者和方法
為了增加我們?cè)谛氖抑亟ㄇ樾蜗聶z測(cè)相關(guān)SNP的機(jī)會(huì)，我們選擇兩組 心肌梗死后具有"極端"表型的患者，即梗死后發(fā)展非常順利的患者(EF〉 55%,平均值60。/。)和發(fā)展不順利的患者(EF〈40。/c),平均值29%)。每組包 含22名患者。
基因組DNA在Ficoll分離后由外周血單核細(xì)胞提取。提取利用FlexiGeneDNA試劑盒(Qiagen)，按照制造商的說明進(jìn)行。DNA的數(shù)量和 質(zhì)量利用Nanodrop分光光度計(jì)評(píng)估。DNA完整性通過瓊脂糖凝膠電泳評(píng) 估。
在不知道患者表型的條件下，在所有患者中對(duì)全MMP-9基因測(cè)序， 包括啟動(dòng)子、編碼序列和不翻譯區(qū)(總共9kb)。 血漿MMP-9水平通過明膠酶譜法確定。
現(xiàn)參考圖l，具有標(biāo)出的精氨酸位置的MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu) 域(由虛線圍繞)。其凈正電荷應(yīng)該參與MMP-9/TIMP-1的相互作用。如 果精氨酸被谷氨酰胺，即帶負(fù)極性的氨基酸替換，可以預(yù)期推定的變化。
如圖2所示，人MMP-2血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域在相同位置處包含谷 氨酰胺。3D結(jié)構(gòu)顯示該氨基酸(由虛線圍繞)可能參與與抑制劑的相互 作用。
用MAGOS軟件對(duì)MMP-9結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)顯示在圖3A和3B中。標(biāo)出的 (通過亮色點(diǎn))是帶正電的氨基酸。
我們清楚地顯示當(dāng)SNP改變氨基酸谷氨酰胺(圖3B)為精氨酸(圖 3A)時(shí)，蛋白質(zhì)極性改變。
用于檢測(cè)SNP7265的存在的另外的基因型分型試驗(yàn)針對(duì)來自盧森堡 急性心肌梗死(LUCKY)登記簿的較大群體進(jìn)行。該登記簿得到當(dāng)?shù)貍惱砦?員會(huì)和數(shù)據(jù)保護(hù)委員會(huì)的認(rèn)同。229名患者利用Taqman⑧技術(shù)和下述探針 進(jìn)行基因型分型
GCTGAGGAGGATCCCTT. (SEQ ID NOS 9 (包括位置26處的A和SEQ ID NO. 10，其包括位置26處的G))
所有患者記錄了血漿MMP-9水平(通過酶聯(lián)免疫吸收測(cè)定，ELISA 測(cè)量)，且125患者記錄了 MI后4個(gè)月時(shí)的射血分?jǐn)?shù)(通過超聲波心動(dòng)描
結(jié)果
1.血漿MMP-9水平在低EF組中是660 pixels2,在高EF組中是437 pkels、這與以前的工作一致，顯示MMP-9是心肌梗死后EF的預(yù)測(cè)因子。
252. 在這兩組中鑒定了 5個(gè)具有不同頻率的SNP。其中，位于編碼序列
的位置7265處的一個(gè)SNP顯示出已知的SNP(rs2274756)，其具有由鳥嘌 呤到腺嘌呤核苷酸的變化，從而造成由精氨酸到谷氨酰胺氨基酸的變化。 該變化出現(xiàn)在低EF組中的2名患者中和高EF組中的6名患者中。A/G雜 合患者中的平均MMP-9水平是215 pixels2,如與純合G/G患者中的675 pixeW相比較(p = 0.004)。該氨基酸變化因此與較低的MMP-9水平和MI 后較好的臨床結(jié)果有關(guān)(6名具有60%的EF的患者對(duì)比2名具有35%的 EF的患者)。
3. 關(guān)于患有急性MI的患者的基因型分型實(shí)驗(yàn)揭示一方面在SNP7265 的存在和MMP-9血漿水平之間和另一方面在SNP7265和射血分?jǐn)?shù)之間的 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著聯(lián)系。血漿MMP-9的平均值在非突變患者(11=176)中是562.41 ng/mL，對(duì)比在突變患者(11=53)中是404.55 ng/mL(P = 0.03)。參見圖4A。 這說明SNP7265的存在與較低的血漿MMP-9水平有關(guān)。
射血分?jǐn)?shù)的平均值在非突變患者0=93)中是48.65 %，對(duì)比在突變患者 (n二32)中是52.23 %(P= 0.04)。參見圖4B。這說明SNP7265的存在與較高 的射血分?jǐn)?shù)和因此較好的MI后臨床結(jié)果有關(guān)。
由于其在MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白-樣結(jié)構(gòu)域中的策略位置(見以下 附圖)不僅參與與膠原纖維的結(jié)合而且參與與MMP-9主要抑制劑，即金 屬蛋白酶-1 (TIMP-1)的組織抑制劑的結(jié)合，所以該SNP非?？赡茉谛氖?重建和心力衰竭的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。
序列簡(jiǎn)述
SEQ ID NO. 1 :來自保護(hù)性組的MMP-9的DNA序列…-位置7265處 是腺嘌呤(A)。
SEQ ID NO. 2 :來自保護(hù)性組的MMP-9的氨基酸序列…-位置668處 是Gln (Q)。
SEQ ID NO. 3:來自處于風(fēng)險(xiǎn)(易感的)的組的MMP-9的DNA序列 ----位置7265處是鳥嘌呤(G)。
SEQ ID NO. 4 :來自處于風(fēng)險(xiǎn)(易感的)的組的MMP-9的氨基酸序列--—位置668處是Arg(R)。
SEQ ID N0.5 :來自保護(hù)性組的MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的 DNA序列---位置443處是腺嘌呤(A)。
SEQ ID NO. 6 :來自保護(hù)性組的MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的 氨基酸序列----位置148處是Gin (Q)。
SEQ ID NO. 7:來自處于風(fēng)險(xiǎn)(易感的)的組的MMP-9的血紅素結(jié) 合蛋白結(jié)構(gòu)域的DNA序列----位置443處是鳥嘌呤(G)。
SEQ ED NO. 8來自處于風(fēng)險(xiǎn)(易感的)的組的MMP-9的血紅素結(jié)合 蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列----位置148處是精氨酸(R)).
SEQ ED NO. 9 :在位置26處包含A的探針。
SEQ ED NO. 10:在位置26處包含G的探針。
權(quán)利要求
1.一種用于確定個(gè)體在心肌梗死后對(duì)心臟病癥的易感性的方法，所述方法包括檢測(cè)MMP-9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域序列中氨基酸變化的存在，所述結(jié)構(gòu)域中存在氨基酸變化表示在心肌梗死后對(duì)所述心臟病癥的易感性。
2. 按照權(quán)利要求1的方法，其中檢測(cè)到的序列包括或編碼位于與SEQ IDNOS. 6或8的位置148相對(duì)應(yīng)的位置處的谷氮酰胺(Gln)或精氨酸(Arg) 氨基酸殘基，或位于與SEQ ID NOS. 2或4的位置668相對(duì)應(yīng)的位置處的 殘基。
3. 按照權(quán)利要求2的方法，其中所述位置處精氨酸殘基的存在表示個(gè) 體在MI后處于患有或發(fā)展心臟病癥的風(fēng)險(xiǎn)中。
4. 按照權(quán)利要求2的方法，其中所述位置處谷氨酰胺殘基的存在表示 保護(hù)性作用。
5. 按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在與SEQ ID NOS 5或7 的位置443相對(duì)應(yīng)的位置處，或在與SEQ ID NOS. 1或3的位置7265相 對(duì)應(yīng)的位置處檢測(cè)到SNP(A/G)的身份。
6. 按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)到的序列是選自由 SEQ ID NOS 1， 3， 5,和/或7組成的組中的多核苷酸。
7. 按照權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)到的序列是選自由 SEQ ID NOS 2, 4， 6，和/或8組成的組中的氨基酸序列。
8. 按照權(quán)利要求4的方法，其中所述位置處存在谷氨酰胺氨基酸殘基 表示心肌梗死后高射血分?jǐn)?shù)(EF)、低早期MMP-9活性，并且減少發(fā)展心 力衰竭的機(jī)會(huì)。
9. 按照權(quán)利要求8的方法，其中在所述個(gè)體經(jīng)歷心肌梗死后測(cè)量所述 低早期MMP-9至多24小時(shí)。
10. —種針對(duì)梗死患者的篩查方法，所述方法包括確定如前述任一項(xiàng) 權(quán)利要求中所定義的氨基酸變化在MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域序列 中的存在或不存在。
11. 一種針對(duì)非梗死群體的篩查方法，所述方法包括確定如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所定義的氨基酸變化在MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域序列中的存在或不存在。
12. —種在患有心肌梗死的患者中確立診斷和/或預(yù)后的方法，所述方 法通過使如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所定義的MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié) 構(gòu)域序列中的氨基酸變化，與較低的MMP-9活性水平相關(guān)聯(lián)來實(shí)現(xiàn)，所 述較低的MMP-9水平顯示心肌梗死后較好的臨床結(jié)果。
13. —種抑制心室重建和治療和/或預(yù)防心力衰竭的治療方法，所述方 法通過使如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所定義的基質(zhì)-金屬蛋白酶-9(MMP-9)的 血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域中的氨基酸變化，與較低的MMP-9水平相關(guān)聯(lián)來 實(shí)現(xiàn)，所述較低的MMP-9水平顯示心肌梗死后較好的臨床結(jié)果。
14. 一種預(yù)測(cè)患者心肌梗死后發(fā)生心室重建的方法，所述方法通過使 如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所定義的基質(zhì)-金屬蛋白酶-9(MMP-9)的血紅素結(jié) 合蛋白結(jié)構(gòu)域中的氨基酸變化，與較低的MMP-9水平相關(guān)聯(lián)來實(shí)現(xiàn)，所 述較低的MMP-9水平顯示心肌梗死后較好的臨床結(jié)果。
15. —種鑒定MMP-9的激動(dòng)劑或拮抗劑/抑制劑，或能夠阻斷MMP-9 活性、或加強(qiáng)其與TIMP -1的相互作用或減小MMP-9的可檢測(cè)的活性或 表達(dá)的分子的方法，所述方法包括設(shè)計(jì)將與如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所定 義的基質(zhì)-金屬蛋白酶-9 (MMP-9)的改變的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域相互作 用的分子或配體。
16. —種用于測(cè)定樣品中具有與心臟病癥易感性有關(guān)的SNP的第一多 核苷酸的存在的方法，包括使所述樣品與第二多核苷酸相接觸，其中所 述第二核苷酸包括選自由SEQ. ID. NOS.: 1,3, 5， 7, 9禾口/或10以及所述序列 的互補(bǔ)序列組成的組中的核苷酸序列，其中所述第二多核苷酸與所述第一 多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交。
17. —種測(cè)定樣品中由分離的多核苷酸編碼的多肽的存在的方法，所 述分離的多核苷酸具有位于MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域中的、與心 臟病癥易感性有關(guān)的SNP，所述方法包括使所述樣品與特異性結(jié)合所述編 碼的多肽的抗體相接觸。
18. —種鑒定改變包含與心臟病癥易感性有關(guān)的SNP的多核苷酸表達(dá)的試劑的方法，所述方法包括(a) 使多核苷酸與待測(cè)試的試劑在用于表達(dá)的條件下相接觸，其中所述多核苷酸包括(1)位于MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域中的、與心臟 病癥易感性有關(guān)的SNP和(2)與報(bào)告基因可操作連接的啟動(dòng)子區(qū)；(b) 在存在所述試劑的條件下，評(píng)估所述報(bào)告基因的表達(dá)水平；(c) 在不存在所述試劑的條件下，評(píng)估所述報(bào)告基因的表達(dá)水平；和(d) 比較步驟(b)中的表達(dá)水平和步驟(c)中的表達(dá)水平，以確定差別，所述差別表示表達(dá)受到所述試劑的改變。
19. 一種診斷個(gè)體中對(duì)心臟病癥的易感性的方法，所述方法包括a) 從所述個(gè)體獲得多核苷酸樣品；和b) 分析所述多核苷酸樣品，以確定單元型的存在或缺乏，其中所述單元型的存在對(duì)應(yīng)于對(duì)所述心臟病癥的易感性；其中所述單 元型包括由位于MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域中的、與心臟病癥易感 性有關(guān)的SNP產(chǎn)生的等位基因。
20. 按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述心臟病癥是選自由 心肌梗死、急性冠狀綜合征、缺血性心肌病、非-缺血性心肌病和充血性心 力衰竭組成的組中的至少一種。
21. 按照權(quán)利要求20的方法，其中所述心臟病癥是充血性心力衰竭。
22. 包含分離的多核苷酸的載體，所述分離的多核苷酸包含位于 MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域中的、與心臟病癥易感性有關(guān)的SNP， 其中所述分離的多核苷酸與調(diào)節(jié)序列、優(yōu)選合適的啟動(dòng)子可操作地連接。
23. 包含按照權(quán)利要求22的載體的宿主細(xì)胞。
24. 包含多核苷酸的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述多核苷酸具有位于MMP-9的血 紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域中的、與心臟病癥易感性有關(guān)的SNP。
25. 測(cè)定樣品以確定第一多核苷酸的存在的試劑盒，所述第一多核苷 酸包含位于MMP-9的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域中的、與心臟病癥易感性有 關(guān)的SNP，所述試劑盒包括處于單獨(dú)容器中的下列各項(xiàng)a) -一種或多種標(biāo)記的第二多核苷酸，其包含選自由SEQ. ID. NOS.: 1,3， 5，7，9和/或IO確定的序列及其互補(bǔ)序列組成的組中的序列；和b) 用于檢測(cè)所述標(biāo)記的試劑。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于確定個(gè)體在心肌梗死后對(duì)心臟病癥的易感性的方法，其包括檢測(cè)MMP-9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域序列中氨基酸變化的存在，所述結(jié)構(gòu)域中存在氨基酸變化表示在心肌梗死后對(duì)所述心臟病癥的易感性，還描述了藥物設(shè)計(jì)的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101646784SQ200880006709
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2008年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月15日
發(fā)明者丹尼爾·R·瓦格納, 伊萬·德沃, 迪迪埃·魯伊 申請(qǐng)人:公共健康研究中心