專利名稱：膽紅素測定方法以及用于膽紅素測定的分析用具的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及膽紅素測定方法以及用于膽紅素測定的分析用具。
背景技術：
膽紅素是在生物體的膽汁中存在最多的色素，主要是由衰老紅細胞在 骨髓、胸腺、肝臟等中被分解和代謝時作為紅細胞主要成分的血紅蛋白生 成的。由血紅蛋白生成的膽紅素在血液中與白蛋白結合，被稱為非結合(間 接)型膽紅素。該非結合型膽紅素被攝入肝臟中，與葡萄糖醛酸結合而形 成結合(直接)型膽紅素，并被排泄到膽道中。將所述非結合(間接)型 膽紅素和結合(直接)型膽紅素合稱為總膽紅素。 一般間接型膽紅素占總 膽紅素的大部分。
測定生物試樣中的膽紅素的臨床學意義如以往公知的那樣。例如，可 以根據(jù)直接型膽紅素的增加來預測肝細胞障礙、肝內膽汁淤積、肝外膽汁 淤積等，可以根據(jù)間接型膽紅素的增加來預測膽紅素生成量的增加、肝處 理功能異常等。如上所述，總膽紅素量為直接型膽紅素量與間接型膽紅素 量合計得到的量，因此，例如如果知道總膽紅素量和直接型膽紅素量，則 可以求出間接型膽紅素量。
作為膽紅素的測定方法，已知以往有重氮法、釩酸法、酶法、HPLC
法等。所述酶法是指下述的方法使膽紅素氧化酶等酶作用于含膽紅素的
試樣，從而使膽紅素氧化成膽綠素，使膽紅素引起的吸光(最大吸收波長
在450nm附近)消失，根據(jù)該吸光度的減少量來對膽紅素的濃度進行定量。 在通過酶法測定總膽紅素的情況下，由于間接型膽紅素與白蛋白結合，
因此存在著與膽紅素氧化酶的反應耗費時間的問題或反應不充分的問題。
為此，公開了添加表面活性劑或其它物質來作為反應促進劑的技術方案(參
照專利文獻1~3)。
專利文獻1公開了一種液體體系的膽紅素測定方法，其中，首先將含有膽紅素的待測物與含有作為直接化劑的膽酸鈉或十二烷基硫酸鈉(SDS) 等的緩沖液混合，然后在該混合物中添加含有膽紅素氧化酶的酶試劑。專 利文獻2公開了一種液體體系的膽紅素測定方法，其中，在含有作為反應 促進劑的膽酸鈉或SDS等的膽紅素氧化酶溶液中添加含有膽紅素的待測 物。專利文獻3公開了一種液體體系的膽紅素測定方法，其中，為了促進 反應，在羥基吡啶衍生物或巰基吡啶衍生物的存在下使膽紅素氧化酶與含 有膽紅素的待測物發(fā)生反應。
專利文獻l:日本特開昭59-130198
專利文獻2:日本特開昭62-282598
專利文獻3:日本特開2006-34178

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供在使用干燥試劑的膽紅素測定中可促進膽紅素 氧化酶的反應的膽紅素測定方法以及用于膽紅素測定的分析用具。
為了達到上述目的，本發(fā)明的膽紅素測定方法的特征在于，其包含 將生物試樣、含有膽紅素氧化酶的干燥試劑和含有表面活性劑的干燥試劑 進行混合；以及對由該混合產生的變化進行光學測定，其中，所述生物試
樣與所述含有膽紅素氧化酶的干燥試劑的混合在與所述含有表面活性劑的 干燥試劑的混合之前進行。
而且，為了達到上述目的，本發(fā)明的用于膽紅素測定的分析用具的特
征在于，其具備生物試樣的試樣供給部、檢測部、以及與所述試樣供給 部和所述檢測部連接的流路，其中，膽紅素氧化酶和表面活性劑按照下述 方式配置在所述試樣供給部、所述流路、所述檢測部的任意一個中使所 述膽紅素氧化酶位于比所述表面活性劑更靠近所述試樣供給部的位置。
本發(fā)明的發(fā)明人對使用酶(膽紅素氧化酶)的膽紅素測定方法進行了 反復深入的研究，并著眼于下述情況在使用干燥試劑的膽紅素測定中， 間接型膽紅素與膽紅素氧化酶的反應需要時間，如果間接型膽紅素的濃度 增高，則有時反應不會在規(guī)定時間內結束。而且發(fā)現(xiàn)，如果在將作為干燥 試劑的膽紅素氧化酶與測定試樣混合后再混合作為干燥試劑的表面活性 劑，則能夠提高間接型膽紅素與膽紅素氧化酶的反應效率，能夠在短時間內測定膽紅素，從而完成了本發(fā)明。另外，以往在液體體系的膽紅素測定 方法中，如上所述，通常是將表面活性劑等膽紅素氧化酶反應的促進劑在 與膽紅素氧化酶的混合之前或同時地與試樣混合的方法(參照上述專利文
獻1~3)。
根據(jù)本發(fā)明，例如能夠充分有效地進行測定對象試樣中的膽紅素與膽 紅素氧化酶的反應，因此優(yōu)選地能縮短膽紅素測定的時間、和/或能提高膽 紅素測定的準確性以及重現(xiàn)性。


圖1是表示本發(fā)明的分析用具的一個例子的圖，圖1A是1 1B是在圖1A的I-I方向觀察的剖面圖。
圖2是本發(fā)明的分析用具的另一例子的俯視圖。 圖3是表示膽紅素測定結果的一個例子的曲線圖。 圖4是表示膽紅素測定結果的另一例子的曲線圖。 圖5是表示膽紅素測定結果的又一例子的曲線圖。 圖6是表示膽紅素測定結果的再一例子的曲線圖。
,圖，圖
符號說明
1、 2分析用具
12試樣供給用流路
14試劑配置部連結用流路
16第1試劑配置部用排氣孔
18磁性粒子
20第2試劑配置部用排氣孔 22含有表面活性劑的干燥試劑 112蓋子
11試樣供給部
13第1試劑配置部
15檢測部/第2試劑配置部
17含有膽紅素氧化酶的干燥試劑
19第2試劑配置部用排氣流路
21第1試劑配置部用排氣流路
111基板
具體實施例方式
如上所述，本發(fā)明基于下述見解在至少使用了含有膽紅素氧化酶的 干燥試劑和含有表面活性劑的干燥試劑的干燥體系的膽紅素測定方法中， 若將使測定對象試樣與上述2種干燥試劑接觸的順序設定為與含有膽紅素氧化酶的干燥試劑的接觸先于與含有表面活性劑的干燥試劑的接觸，則能 夠提高膽紅素、優(yōu)選間接型膽紅素與膽紅素氧化酶的反應效率，能夠縮短 測定時間。通過將與試樣的接觸順序設定為酶在先而表面活性劑在后，從 而能夠縮短間接型膽紅素與酶的反應時間，該機理的詳細情況并不清楚， 但可以認為，如果使測定對象試樣先與含有表面活性劑的干燥試劑接觸， 則表面活性劑與間接型膽紅素即膽紅素-白蛋白復合體結合，從而會阻礙膽 紅素與酶的反應。而且可以認為，通過使測定對象試樣先與含有膽紅素氧 化酶的干燥試劑接觸，酶與膽紅素-白蛋白復合體結合，然后，通過所添加 的表面活性劑使膽紅素與白蛋白解離，其結果是，膽紅素與酶變得容易反 應。但是，本發(fā)明并不限定于這些機理。
在本發(fā)明的膽紅素測定方法中，上述表面活性劑優(yōu)選為陰離子表面活
性劑。而且，上述陰離子表面活性劑優(yōu)選為選自十二垸基硫酸鈉(SDS)、 十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、聚氧乙烯月桂基醚硫酸鈉、脫氧膽酸鈉以及 膽酸鈉中的一種以上的表面活性劑。
本發(fā)明的分析用具優(yōu)選的是具備與同一個上述試樣供給部連接的2 個以上的上述流路，上述流路各自具備上述檢測部，上述膽紅素氧化酶和 上述表面活性劑按照下述方式配置在至少1條上述流路以及該流路的檢測
部的任意一個中使上述膽紅素氧化酶位于比上述表面活性劑更靠近上述
試樣供給部的位置。
在本發(fā)明的分析用具中，上述表面活性劑優(yōu)選為陰離子表面活性劑。
而且，上述陰離子表面活性劑優(yōu)選為選自十二垸基硫酸鈉(SDS)、十二垸 基苯磺酸鈉(SDBS)、聚氧乙烯月桂基醚硫酸鈉、脫氧膽酸鈉以及膽酸鈉 中的一種以上的表面活性劑。
在另一實施方式中，本發(fā)明為一種膽紅素測定用試驗片，其是用于膽 紅素測定的試驗片，其中，從試樣供給面開始依次層疊有含有膽紅素氧化 酶的層和含有表面活性劑的層。
在本說明書中，僅記為"膽紅素"的情況下，可以包括總膽紅素、直接 型膽紅素、間接型膽紅素。這里，所謂的"直接型膽紅素"是指與葡萄糖醛 酸結合的結合型膽紅素，所謂的"間接型膽紅素"是指未與葡萄糖醛酸結合 的非結合型膽紅素。將直接型膽紅素與間接型膽紅素合稱為總膽紅素。在本發(fā)明中，"膽紅素氧化酶"沒有特別的限定，可以使用能夠將膽紅 素氧化成膽綠素的酶。作為膽紅素氧化酶，優(yōu)選對直接型膽紅素和間接型 膽紅素雙方均有活性的膽紅素氧化酶。作為膽紅素氧化酶的來源，沒有特別的限定，例如可以舉出作為微生物的漆斑菌屬(Myrothecium)、粗皮靈 芝亞屬(Trachyderma)等。膽紅素氧化酶也可以使用市售品，例如可以使 用商品名(BILIRUBIN OXIDASE Amano3， Amano Enzyme公司制)、商品 名(BILIRUBIN OXIDASE TAKARA，寶酒造公司帝D等。此外，在本發(fā) 明中，關于膽紅素氧化酶的酶單位(U)，如果為市售品，是指制造商所標 示的值，或者是指在37°C、 pH7.0的條件下能夠用1分鐘將l,ol的底物 (白蛋白結合型膽紅素)氧化的膽紅素氧化酶的酶量。在本發(fā)明中，"表面活性靴'可以是以往公知的表面活性劑，例如可以 包括陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑、陽離 子表面活性劑等。這些表面活性劑可以使用一種，也可以將多種組合使用。作為所述陰離子表面活性劑，可以使用以往公知的陰離子表面活性劑， 例如可以舉出十二垸基硫酸鈉(SDS)等烷基硫酸酯鈉、十二垸基苯磺酸 鈉(SDBS)等直鏈烷基苯磺酸鈉、聚氧乙烯月桂基醚硫酸鈉等烷基醚硫酸 酯鈉、脫氧膽酸鈉、以及膽酸鈉等。作為本發(fā)明中使用的陰離子表面活性 劑，優(yōu)選SDS或膽酸鈉，還優(yōu)選組合使用SDS和膽酸鈉。作為上述非離子 表面活性劑，可以使用以往公知的非離子表面活性劑，例如可以舉出聚氧 乙烯烷基醚、聚氧化烯浣基醚、聚氧化烯羧酸酯、聚氧化烯羧酸二酯、聚 氧乙烯聚氧丙烯共聚物(例如Pluronic (注冊商標，BASF公司)F-88等)、 聚氧乙烯聚氧化烯共聚物、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙 烯烷基苯基醚等。作為上述兩性離子表面活性劑，可以使用以往公知的兩 性離子表面活性劑，例如可以舉出烷基氨基脂肪酸鈉、垸基甜菜堿、烷基 胺氧化物等。作為上述陽離子表面活性劑，可以使用以往公知的陽離子表 面活性劑，例如可以舉出十六垸基三甲基溴化銨等垸基三甲基銨鹽、氯化 十六烷基吡啶鐺、氯化月桂基吡啶鑰等垸基吡啶錄鹽等。在本發(fā)明中，"生物試樣"是指來自于含有膽紅素的生物體的試樣，優(yōu) 選為液體狀，更優(yōu)選含有間接型膽紅素。作為這樣的生物試樣，沒有特別 的限定，例如可以舉出全血、血清、血漿、尿等體液試樣。此外，本發(fā)明中的生物試樣也可以是根據(jù)需要經過了稀釋、前處理等的試樣。本發(fā)明的膽紅素測定方法當然也可以將上述"生物試樣"以外的試樣作 為測定對象。例如可以將膽紅素的標準試樣等作為測定對象。因此，在另 一實施方式中，本發(fā)明為一種膽紅素測定方法，其特征在于，該方法包含 將測定對象試樣與含有膽紅素氧化酶的干燥試劑和含有表面活性劑的干燥 試劑接觸；以及對由該接觸產生的變化進行光學測定，其中，測定對象試 樣與含有膽紅素氧化酶的干燥試劑的接觸比測定對象試樣與含有表面活性 劑的干燥試劑的接觸先進行。在該實施方式的本發(fā)明中，測定對象試樣可 以含有上述"生物試樣"，優(yōu)選為液體狀，更優(yōu)選含有間接型膽紅素。 接著，對本發(fā)明的膽紅素測定方法進行說明。首先，準備含有膽紅素氧化酶的干燥試劑和含有表面活性劑的干燥試 劑。在本發(fā)明的膽紅素測定方法中，"含有膽紅素氧化酶的干燥試劑"是指 將含有膽紅素氧化酶的試劑溶液進行干燥處理而得到的試劑。作為上述干 燥處理，只要是不損害膽紅素氧化酶的酶活性的方法即可，沒有特別的限 定，可以是冷凍干燥、加熱干燥、風干、減壓干燥等以往的干燥處理。從 維持酶活性的觀點出發(fā)，優(yōu)選冷凍干燥處理。干燥處理前的含有膽紅素氧 化酶的試劑溶液除了膽紅素氧化酶之外，也可以含有緩沖劑、pH調節(jié)劑、 穩(wěn)定劑、螯合劑等。在含有膽紅素氧化酶的干燥試劑中優(yōu)選不含表面活性 劑。這是因為，如后所述，表面活性劑另外地以含有表面活性劑的干燥試 劑的形式與上述生物試樣混合。作為在干燥處理前的含有膽紅素氧化酶的試劑溶液中所含的緩沖劑， 例如可以使用在pH為6.0~8.0的范圍內發(fā)揮緩沖作用的以往公知的緩沖 劑。作為上述緩沖劑，例如可以舉出磷酸緩沖劑、Tris(三羥甲基氨基甲烷) 緩沖劑、硼酸緩沖劑、Good's緩沖劑、TES (N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙 磺酸)、BES (N,N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸)、MOPSO (2-羥基-3-嗎啉 基丙磺酸)、MOPS(3-(N-嗎啉基)丙磺酸)、PIPES(哌嗪-N,N，-雙(2-乙磺酸))、 ADA (N-(2-乙酰胺基)亞氨基二乙酸)、ACES (N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺 酸)、MES (2-嗎啉基乙磺酸)等，其中，優(yōu)選膽紅素氧化酶BES、 MOPSO、 MOPS、 ACES。干燥處理前的含有膽紅素氧化酶的試劑溶液也可以根據(jù)需 要調節(jié)pH。作為上述試劑溶液的pH，例如為pH5.5~8.0，優(yōu)選為pH6.0~7.5。在上述含有膽紅素氧化酶的干燥試劑中，優(yōu)選含有在溶解于生物試樣 中時足以與生物試樣中的膽紅素反應的量的膽紅素氧化酶。上述酶的含量 對于本領域技術人員來說能夠容易地設定。例如，生物試樣為血液時，作為溶解于生物試樣中后的膽紅素氧化酶的最終濃度，例如為l~100U/ml， 優(yōu)選為3~10U/ml。在上述含有膽紅素氧化酶的干燥試劑中含有緩沖劑的情 況下，上述緩沖劑優(yōu)選為下述的濃度在以該濃度溶解于生物試樣中時， 發(fā)揮足以維持膽紅素氧化酶的活性的緩沖作用。在本發(fā)明的膽紅素測定方法中，"含有表面活性劑的干燥試劑"是指將 含有表面活性劑的試劑溶液進行干燥處理后得到的試劑。作為上述干燥處 理，沒有特別的限定，可以是冷凍干燥、加熱干燥、風干、減壓干燥等以 往的干燥處理。上述試劑溶液中所含的表面活性劑的種類如上所述。試劑 溶液也可以根據(jù)需要含有膽紅素氧化酶、緩沖劑、pH調節(jié)劑、穩(wěn)定劑等。 作為緩沖劑，可以使用與含有膽紅素氧化酶的干燥試劑中所含的緩沖劑相 同的緩沖劑。在上述含有表面活性劑的干燥試劑中，優(yōu)選含有在溶解于生物試樣中 時足以促進膽紅素氧化酶的反應的量的表面活性劑。作為溶解于生物試樣 中后的表面活性劑的最終濃度，例如為0.3~2質量％，優(yōu)選為0.5~2質量％， 更優(yōu)選為1.0-1.5質量％。如上所述，在上述含有表面活性劑的干燥試劑中， 也可以兩種以上的表面活性劑以各自為上述最終濃度的量來含有。然后，進行上述生物試樣與上述含有膽紅素氧化酶的干燥試劑的混合 (第1混合)，接著，進行上述第1混合物與上述含有表面活性劑的干燥試 劑的混合(第2混合)?；旌系姆椒]有特別的限定，例如可以通過配置磁 性攪拌棒或磁性粒子并從外部施加適當?shù)拇艌鰜磉M行混合。第1混合可以 在上述含有膽紅素氧化酶的干燥試劑溶解完的時間點結束。第2混合可以 與第1混合的結束相連續(xù)地進行，也可以有間隔地進行。從縮短膽紅素測 定時間的觀點出發(fā)，優(yōu)選上述第1混合與第2混合之間的間隔短。在本發(fā)明的膽綠素測定方法中，通過上述第1混合和第2混合"所產生 的變化"是指膽紅素氧化成膽綠素的變化。對上述變化進行"光學測定"是指 對在450nm附近顯示最大吸收的膽紅素消失的情況進行光學測定。例如包 括對上述第1混合前的生物試樣在450nm處的吸光度和上述第2混合后在450nrn處的吸光度進行測定?？梢詮倪@些吸光度的差對膽紅素濃度進行定 量。此外，本發(fā)明的膽綠素測定方法中的光學測定方法可以舉出利用了透 射光的吸光度測定，但并不限定于此，例如也可以利用反射光或散射光。 下面，對本發(fā)明的分析用具進行說明。本發(fā)明的分析用具是用于膽紅素測定方法中的分析用具，其具備上述 生物試樣的試樣供給部、檢測部、以及與上述試樣供給部和上述檢測部連 接的流路，其中，膽紅素氧化酶和表面活性劑按照下述方式配置在上述試 樣供給部、上述流路以及上述檢測部的任意一個中使上述膽紅素氧化酶 位于比上述表面活性劑更靠近上述試樣供給部的位置。本發(fā)明的分析用具 的結構和形態(tài)只要是按照上述膽紅素氧化酶位于比上述表面活性劑更靠近 上述試樣供給部的位置的方式來配置的構成即可，沒有特別的限定。此外， 本發(fā)明的分析用具優(yōu)選用于本發(fā)明的膽紅素測定方法中。上述流路優(yōu)選為能夠利用毛細管現(xiàn)象使上述生物試樣移動的流路。所 配置的膽紅素氧化酶和表面活性劑優(yōu)選為各自是上述的含有膽紅素氧化酶 的干燥試劑和含有表面活性劑的干燥試劑的形態(tài)。在上述流路中也可以根據(jù)需要形成試劑配置部。在形成兩個上述試劑 配置部的情況下，可以分別配置膽紅素氧化酶和表面活性劑。或者，形成 一個試劑配置部來配置膽紅素氧化酶，表面活性劑可以配置在上述檢測部 中。試劑的配置方法沒有特別的限定，例如可以舉出如下方法制備上述 的含有膽紅素氧化酶的試劑溶液和含有表面活性劑的試劑溶液，通過噴墨 法等進行涂布并進行干燥處理。作為上述干燥處理，可以舉出冷凍干燥、 加熱干燥、風干、減壓干燥等以往的干燥處理，在酶的情況下，優(yōu)選為冷 凍干燥處理。為了有助于與生物試樣的混合，也可以在上述試劑配置部中 配置磁性攪拌棒或磁性粒子。用圖1對本發(fā)明的分析用具的一個實施方式進行說明。圖1A是本發(fā)明 的分析用具1的俯視圖，圖1B是在圖1A的I-I方向觀察的剖面圖。如圖所示，分析用具1通過在基板111上配置蓋子112而構成。在上 述基板111的內部形成有第1試劑配置部13和兼作檢測部的第2試劑配置 部15 (以下也稱為"檢測部/第2試劑配置部")，上述兩者通過試劑配置部 連結用流路14來連結。此外，蓋子112上形成有開口，上述開口為試劑供給部11，試劑供給部11與第1試劑配置部13通過試樣供給用流路12來連 結。第1試劑配置部13與第1試劑配置部用排氣孔16通過從試劑配置部 連結用流路14分支的第1試劑配置部用排氣流路21來連結。檢測部/第2 試劑配置部15與第2試劑配置部用排氣孔20通過第2試劑配置部用排氣 流路19進行連結。第1試劑配置部用排氣孔16和第2試劑配置部用排氣 孔20最初是閉口的。在第1試劑配置部13中配置有含有膽紅素氧化酶的 干燥試劑17和一個磁性粒子18。在檢測部/第2試劑配置部15中配置有含 有表面活性劑的干燥試劑22。另外，檢測部/第2試劑配置部15中也可以 配置磁性粒子。在本發(fā)明中，構成分析用具的部件的材質沒有特別的限定。上述基板 和蓋子的材質例如有聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧垸、聚 對苯二甲酸乙二醇酯、玻璃等。例如，在檢測部15中，為了能夠進行光學 測定、例如利用透射光測定進行的分光測定等，優(yōu)選使用透光性材料。本 發(fā)明的分析用具的大小沒有特別的限定，本領域技術人員可以適當設定。 此外，本發(fā)明的分析用具的制造方法沒有特別的限定，可以使用以往公知 的技術來制造。使用圖1所示的分析用具的膽紅素測定例如如下進行。即，首先，向 試樣供給部11供給生物試樣。然后，使第1試劑配置部用排氣孔16開口。 通過上述開口產生毛細管現(xiàn)象，由此，上述試樣流經試樣供給用流路12而 被導入到第1試劑配置部13中，將含有膽紅素氧化酶的干燥試劑17溶解。 然后，通過磁性體(未圖示)使上述磁性粒子18移動，對上述生物試樣進 行攪拌，使上述干燥試劑均勻地混合并溶解。接著，使第2試劑配置部用 排氣孔20開口，產生毛細管現(xiàn)象，從而使上述生物試樣流經試劑配置部用 連結流路14而導入到檢測部/第2試劑配置部15中。此時，也可以在包含 上述磁性粒子18的狀態(tài)下導入上述生物試樣。然后，在檢測部/第2試劑 配置部15中，根據(jù)需要通過上述磁性粒子18進行攪拌，將含有表面活性 劑的干燥試劑22均勻地混合并溶解，從而促進膽紅素氧化酶的反應。這里， 根據(jù)需要，優(yōu)選將上述磁性粒子18導出到檢測部/第2試劑配置部15外。 然后，在檢測部/第2試劑配置部15中，通過光學手段(例如分光光度計) 來測定反應后的吸光度(450nm)等。在另一實施方式中，本發(fā)明為一種分析用具(以下也稱為"分析用具集合體")，其具備與同一個上述試樣供給部連接的2個以上的上述流路， 上述流路各自具備上述檢測部，上述膽紅素氧化酶和上述表面活性劑按照下述方式配置在至少1條上述流路以及該流路的檢測部的任意一個中使 上述膽紅素氧化酶位于比上述表面活性劑更靠近上述試樣供給部的位置。 即，同一個生物試樣流入多個流路中，通過與各種試劑反應，還可以對一 個生物試樣進行除了膽紅素之外的其它多種項目的測定。另外，在具備2 個以上的流路的本發(fā)明的分析用具集合體中，優(yōu)選在至少一條流路和檢測 部中不配置膽紅素氧化酶，而是提供膽紅素測定中的對照。通過這樣的構 成，可以不必另外使用其它的分析用具對反應前的生物試樣的吸光度等進 行測定，僅通過一個本發(fā)明的分析用具集合體就可以進行膽紅素測定。此外，本發(fā)明的分析用具集合體也可以是圖2所示形態(tài)的分析用具。圖2所示的分析用具集合體是圖1所示的流路為1條的分析用具呈放 射狀集合而成的形態(tài)的分析用具集合體。在圖2中，與圖1相同的部分用 相同的符號表示。如圖所示，分析用具集合體2為形成12個圖1所示的分 析用具并使它們集合而成的集合體。各分析用具具備試樣供給部11、試 樣供給用流路12、第1試劑配置部13、第1試劑配置部用排氣流路21、第 1試劑配置部用排氣孔16、試劑配置部連結用流路14、第2試劑配置部15、 第2試劑配置部用排氣流路19以及第2試劑配置部用排氣孔20。各分析用 具的上述試樣供給部整合為一個試樣供給部ll，此外，各第2試劑配置部 用排氣孔整合為一個第2試劑配置部用排氣孔20。在分析用具集合體2的 至少一個分析用具中配置有含有膽紅素氧化酶的干燥試劑17、上述磁性粒 子18以及含有表面活性劑的干燥試劑22。本發(fā)明的分析用具集合體的材 料、制造方法、以及使用方法與上述圖1的分析用具的情況相同。在另一種實施方式中，本發(fā)明為一種膽紅素測定用試驗片，其是用于 膽紅素測定的試驗片，其中依次層疊有試樣保持層、含有膽紅素氧化酶的 層和含有表面活性劑的層。構成各層的材料沒有特別的限定，例如可以使 用濾紙、玻璃纖維濾紙、編織品、織物、無紡布、膜濾器、多孔質樹脂片、 塑料薄膜等以往公知的材料。此外，上述試樣保持層也可以具備例如血細胞分離膜(層)等。本發(fā)明的試驗片可以優(yōu)選地用于本發(fā)明的膽紅素測定本發(fā)明的試驗片中，也可以省去上述試樣保持層。因此，在另一實施 方式中，本發(fā)明為一種膽紅素測定用試驗片，其包含含有膽紅素氧化酶的 干燥試劑層和含有表面活性劑的干燥試劑層，其中從試樣供給面開始依次 層疊有含有膽紅素氧化酶的干燥試劑層和含有表面活性劑的干燥試劑層。 在上述試樣供給面上也可以具備例如血細胞分離膜(層)等。本發(fā)明的試 驗片可以優(yōu)選地用于本發(fā)明的膽紅素測定方法。下面，用實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明并不限定于這些 實施例。實施例1(對由試劑的混合順序引起的反應速度的變化進行確認) 確認了在使用了膽紅素氧化酶(干燥試劑)和表面活性劑(干燥試劑)的膽紅素測定中，混合測定試樣的順序會對膽紅素氧化酶的反應速度產生影響。<干燥試劑的制備>在微孔板的孔內分別制備干燥試劑Rl和R2。將干燥試劑Rl和R2溶 解于測定試樣中時的各組成的最終濃度如下述表1所示。 (表1) MlOOmM BES pH7.0 5mM EDTA 腦U/ml BOD畫mM BES pH7.0 0.5% SDS干燥試劑R1如下進行制備。首先，將2.1325g的BES (N,N-雙(2-羥乙 基)-2-氨基乙磺酸，同仁化學公司制)和0.0931g的EDTA'2Na'2H20溶解 在蒸餾水中， 一邊用NaOH調節(jié)pH達到7， 一邊使總量達到50ml (以下 稱為"BOD緩沖液")。將0.8163g的膽紅素氧化酶(BOD, Amano Enzyme 公司制)用上述BOD緩沖液溶解，按照使總量達到20ml的方式進行制備。將該膽紅素氧化酶溶液中的70W添加到微孔板的各孔中，在一80。C下凍結 后，進行冷凍干燥處理，從而制成干燥試劑R1。干燥試劑R2如下進行制備。首先，將0.25g的十二烷基硫酸鈉(SDS) 溶解在上述BOD緩沖液中， 一邊用HCl調節(jié)pH達到7， 一邊使總量達到 50ml。將該SDS溶液中的50^11添加到微孔板的各孔中，在一80'C下凍結后， 進行冷凍干燥處理，從而制成干燥試劑R2。<測定試樣的制備〉將50mg的間接型膽紅素(商品名膽紅素，和光純藥公司制)溶解 在2.5ml的DMSO中，并添加5ml的0.1M的Na2C03。將該間接型膽紅素 溶液中的7.5ml添加到150ml的正常血清中，再添加3ml的0.1N的HC1， 從而準備好間接型膽紅素試樣。通過以往公知的液體體系的定量法來測定 該試樣的濃度，結果為27.3mg/dl。<R1—R2的測定>將上述測定試樣70pl添加到制備有干燥試劑Rl的孔中，將干燥試劑 Rl溶解，然后迅速地將該溶解的70pl中的5(Hil添加到制備有干燥試劑R2 的孔中，將干燥試劑R2溶解。利用酶標儀(microplate reader),在主波長 為450nm、副波長為630nm下對反應后的吸光度變化進行測定(Rl—R2 的測定)。測定是從將上述測定試劑添加到干燥試劑Rl中經過120秒后開 始的。R2—Rl測定除了將干燥試劑Rl與R2調換之外其它均同樣地進行。<結果>Rl—R2的測定和R2—Rl的測定的結果的一個例子如圖3的曲線圖所 示。如該圖所示，在Rl—R2測定、也就是使膽紅素氧化酶先起作用、然 后再使表面活性劑起作用的情況下，開始2分鐘后吸光度的曲線圖達到幾 乎平臺，由此可知膽紅素與膽紅素氧化酶的反應迅速完成(該圖左側的曲 線圖)。另一方面，在R2—R1測定、也就是使表面活性劑先起作用、然后 使膽紅素氧化酶起作用的情況下，反應開始8分鐘后仍未達到平臺，由此 可知膽紅素與膽紅素氧化酶的反應還未完成(該圖右側的曲線圖)。因此， 可以確認，在使用了膽紅素氧化酶(干燥試劑)和表面活性劑(干燥試劑) 的膽紅素測定中，將膽紅素氧化酶先與測定試樣混合和將表面活性劑先與 測定試樣混合相比，能夠縮短測定時間。實施例2(對由試劑的混合順序引起的反應速度的變化進行確認)除了實施例1中使用的測定試樣(間接型膽紅素試樣27.3mg/dl)之 夕卜，還制備了濃度為6.0mg/dl、 12.1mg/dl以及24.4mg/dl的直接型膽紅素試 樣、濃度為8.1mg/dl禾B 16.1mg/dl的間接型膽紅素試樣、以及濃度為O.Omg/dl 的膽紅素試樣，與實施例1同樣地操作，進行R1—R2測定和R2—Rl測定。 上述直接型膽紅素試樣使用直接型膽紅素(商品名Ditaurobilirubin， Promega公司制)來作為膽紅素，除此之外，與實施例1的間接型膽紅素 試樣的制備方法同樣地進行制備。此外，各試樣的濃度通過使用正常血清 的稀釋來調節(jié)。其結果的一個例子如圖4所示。在該圖的圖例中，D表示直接型膽紅 素，I表示間接型膽紅素。如圖4所示，可以確認通過按照R1—R2的順 序進行混合而產生的膽紅素氧化酶反應的促進效果在測定試樣中的間接型 膽紅素的濃度高時顯著。實施例3(對能使用膽酸鈉的情況進行確認)除了將干燥試劑Rl中的BOD的最終濃度設為10U/ml和3U/ml、將干 燥試劑R2中的表面活性劑設為膽酸鈉(最終濃度為0.5wt。/。和1.5wt%)之 外，與實施例1同樣地制備干燥試劑R1和R2，使用各種濃度的直接型/間 接型膽紅素試樣，按照R1—R2的順序進行混合來測定膽紅素。其結果的一個例子如圖5所示。如該圖所示，可以確認即使使用膽酸 鈉也能夠測定膽紅素。此外，啟示了通過提高表面活性劑的濃度，能夠減 少膽紅素氧化酶的酶使用量。實施例4 (表面活性劑的組合)除了將干燥試劑Rl中的BOD的最終濃度設為1U/ml、將干燥試劑R2 中的表面活性劑設為SDS與膽酸鈉的組合(最終濃度分別為0.5wtM和分別為1.0wt%)之外，與實施例1同樣地制備干燥試劑R1和R2，使用各種濃 度的直接型/間接型膽紅素試樣，按照R1—R2的順序進行混合來測定膽紅 素。其結果的一個例子如圖6所示。如該圖所示，可知通過將表面活性劑 組合，可配置的總量增加，從而即使BOD為1U/ml也能迅速地測定。如上所述，本發(fā)明在干燥體系的膽紅素測定中是有用的，例如在檢査、 診斷等醫(yī)療領域中是有用的。
權利要求
1、一種膽紅素測定方法，其對生物試樣中的膽紅素進行測定，其特征在于，該方法包含將所述生物試樣、含有膽紅素氧化酶的干燥試劑和含有表面活性劑的干燥試劑進行混合；以及對由該混合產生的變化進行光學測定，其中，所述生物試樣與所述含有膽紅素氧化酶的干燥試劑的混合在與所述含有表面活性劑的干燥試劑的混合之前進行。
2、 根據(jù)權利要求1所述的膽紅素測定方法，其中，所述表面活性劑為 陰離子表面活性劑。
3、 根據(jù)權利要求2所述的膽紅素測定方法，其中，所述陰離子表面活 性劑為選自十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二垸基苯磺酸鈉(SDBS)、聚氧乙 烯月桂基醚硫酸鈉、脫氧膽酸鈉以及膽酸鈉中的一種以上的表面活性劑。
4、 一種分析用具，其用于膽紅素測定方法，其特征在于，該分析用具具備所述生物試樣的試樣供給部、檢測部、以及與所述試樣供給部和所述檢測部連接的流路，膽紅素氧化酶和表面活性劑按照下述方式配置在所述試樣供給部、所述流路、所述檢測部的任意一個中使所述膽紅素氧化酶位于比所述表面 活性劑更靠近所述試樣供給部的位置。
5、 根據(jù)權利要求4所述的分析用具，其中，該分析用具具備與同一個 所述試樣供給部連接的2個以上的所述流路，所述流路分別具備所述檢測部，所述膽紅素氧化酶和所述表面活性劑按照下述方式配置在至少1條所 述流路以及該流路的檢測部的任意一個中使所述膽紅素氧化酶位于比所 述表面活性劑更靠近所述試樣供給部的位置。
6、 根據(jù)權利要求4或5所述的分析用具，其中，所述表面活性劑為陰 離子表面活性劑。
7、 根據(jù)權利要求6所述的分析用具，其中，所述陰離子表面活性劑為 選自十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、聚氧乙烯月桂 基醚硫酸鈉、脫氧膽酸鈉以及膽酸鈉中的一種以上的表面活性劑。
8、 一種膽紅素測定用試驗片，其是用于膽紅素測定的試驗片，其中， 從試樣供給面開始依次層疊有含有膽紅素氧化酶的層和含有表面活性劑的 層。
全文摘要
本發(fā)明提供使用可促進膽紅素氧化酶的反應的干燥試劑的膽紅素測定方法以及用于該膽紅素測定方法的分析用具。本發(fā)明的膽紅素測定方法的特征在于，在生物試樣與含有膽紅素氧化酶的干燥試劑的混合之后，將上述混合物與含有表面活性劑的干燥試劑混合。而且，本發(fā)明的用于膽紅素測定的分析用具(1)的特征在于，膽紅素氧化酶以及表面活性劑按照下述方式配置在試樣供給部(11)、上述流路(12、13、14)、檢測部(15)的任意一個中使上述膽紅素氧化酶位于比上述表面活性劑更靠近試樣供給部(11)的位置。
文檔編號C12Q1/26GK101622359SQ20088000668
公開日2010年1月6日 申請日期2008年4月17日 優(yōu)先權日2007年4月27日
發(fā)明者高間利夫 申請人:愛科來株式會社