本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體來說涉及細(xì)菌無痕遺傳操作載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：遺傳操作系統(tǒng)是指在分子水平上對細(xì)胞基因組進(jìn)行精確修飾(包括基因敲除、敲入、替換和點(diǎn)突變等)的一種生物工程技術(shù)，不僅是研究生命基礎(chǔ)問題的重要手段，也是人工育種和改良品種的有力工具。目前，多種適用于原核和真核生物的遺傳操作方法已經(jīng)被開發(fā)出來，使得研究者能夠在多種細(xì)胞中進(jìn)行生理功能和代謝工程研究?，F(xiàn)有的遺傳操作系統(tǒng)主要包括兩大類：一類是基于核酸酶的ZFNs、TALENs以及CRISPER/Cas9等技術(shù)；另一類是基于重組酶的Red、Red/ET和Cre/loxP等技術(shù)。前一類技術(shù)主要應(yīng)用于真核生物染色體DNA的修飾，其中應(yīng)用最為廣泛的是最近發(fā)現(xiàn)的利用原核生物II型適應(yīng)性免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的CRISPER/Cas9技術(shù)，能夠應(yīng)用于釀酒酵母、擬南芥、水稻、小麥、線蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠等真核生物中。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道CRISPER/Cas9技術(shù)能夠應(yīng)用于一些細(xì)菌基因組的修飾，但是該技術(shù)的基因編輯效率在不同細(xì)菌中有較大差異，如在肺炎鏈球菌中的基因編輯效率接近100％，而在大腸桿菌中的基因編輯效率則降至60％左右(JiangW.Y.,BikardD.,CoxD.,ZhangF.,MarraffiniL.A.2013.RNA-guidededitingofbacterialgenomesusingCRISPR-Cassystems.NatBiotechnol31:233-239)。此外，包括CRISPER/Cas9技術(shù)在內(nèi)的基于核酸酶的基因編輯技術(shù)均存在一個共同的致命缺陷，即“脫靶效應(yīng)”，顯著降低了基因編輯的特異性和準(zhǔn)確性。因此，基于核酸酶原理的CRISPR/Cas9等技術(shù)難以有效地對原核生物進(jìn)行精確地遺傳修飾和改造。在原核生物研究領(lǐng)域中，主要采用的是基于重組酶的遺傳操作技術(shù)，包括依賴噬菌體重組酶和自身重組酶的遺傳操作技術(shù)。該類技術(shù)需要借助外源DNA的同源序列與染色體的靶序列發(fā)生同源重組，從而定向地改變細(xì)胞的遺傳結(jié)構(gòu)和特性。因此，該類方法均需要構(gòu)建含有同源序列和篩選標(biāo)記的外源DNA片段或非復(fù)制型質(zhì)粒。早期的操作方 法都是在染色體中引入抗性基因，由于可作為抗性篩選標(biāo)記的抗生素基因的數(shù)目有限，難以進(jìn)行染色體多個位點(diǎn)的改造，且抗性片段的插入可能會影響細(xì)胞的生理功能。隨著分子生物學(xué)與基因工程的發(fā)展，通過引入毒性元件作為反篩標(biāo)記發(fā)展成為細(xì)菌有效的無抗性標(biāo)記或無痕敲除策略。例如利用果聚糖蔗糖酶SacB作為反向篩選標(biāo)記已經(jīng)在大腸桿菌(Escherichiacoli)、黃色黏球菌(Myxococcusxanthus)及流感桿菌(Haemophilusinfluenzae)等革蘭氏陰性細(xì)菌中建立了無痕遺傳操作系統(tǒng)(Lalioti,M.D.,Heath,J.K.2001.AnewmethodforgeneratingpointmutationsinbacterialartificialchromosomesbyhomologousrecombinationinEscherichiacoli.NuclAcidsRes29:e14；Wu,S.S.,Kaiser,D.1996.MarkerlessdeletionsofpilgenesinMyxococcusxanthusgeneratedbycounterselectionwiththeBacillussubtilissacBgene.JBacteriol178,5817-5821；Johnston,J.W.2012.AnimprovedcounterselectioncassetteforuseinHaemophilusinfluenzae.Gene492,325-328)。由于革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜，細(xì)胞抗壓、抗輻射以及抵抗毒性能力強(qiáng)。因而，目前常用的反向篩選標(biāo)記無法有效地應(yīng)用于芽胞桿菌(Bacillus)等大多數(shù)的革蘭氏陽性細(xì)菌中。自20世紀(jì)60年代以來，枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)作為革蘭氏陽性細(xì)菌的模式菌種，其遺傳操作系統(tǒng)能夠廣泛應(yīng)用于多種革蘭氏陽性細(xì)菌的代謝機(jī)理和信號調(diào)控等研究中。雖然已有研究者利用一些新的毒蛋白作為反篩標(biāo)記建立了無抗性標(biāo)記的遺傳操作方法，如尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶UPP、β-內(nèi)酰胺酶阻遏蛋白BlaI和雞蛋清溶菌酶Hewl等。但是這些方法需要構(gòu)建毒蛋白編碼基因缺失的突變株，且靶位點(diǎn)附近留下的重復(fù)序列會影響多重突變菌株的穩(wěn)定性。最近有報(bào)道利用誘導(dǎo)表達(dá)的毒素蛋白MazF作為反向篩選標(biāo)記構(gòu)建了敲除/整合載體pDGREF，能夠?qū)莶菅堪麠U菌染色體基因進(jìn)行點(diǎn)突變和無痕敲除，但該系統(tǒng)的反篩效率較低(25％-65％)、篩選困難(HaojieY.,YanX.,ShenW.,ShenY.,ZhangJ.,LiS.2010.EfficientandpreciseconstructionofmarkerlessmanipulationsintheBacillussubtilisgenome.JMicrobiolBiotechnol20:45-53.)。綜合目前研究可知，由于芽胞桿菌等革蘭氏陽性細(xì)菌的抗毒性能力強(qiáng)，且誘導(dǎo)型啟動子難以完全抑制毒素蛋白的滲漏表達(dá)，極易使重組菌對毒素蛋白產(chǎn)生抗毒性，從而導(dǎo)致已有的遺傳操作技術(shù)在芽胞桿菌等革蘭氏陽性細(xì)菌中的特異性不強(qiáng)、系統(tǒng)不穩(wěn)定且篩選困難。因此，亟需建立一套新型、高效的革蘭氏陽性細(xì)菌的無痕遺傳操作系統(tǒng)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種細(xì)菌無痕遺傳操作載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，解決了現(xiàn)有革蘭氏 陽性菌的遺傳操作系統(tǒng)特異性不強(qiáng)、系統(tǒng)不穩(wěn)定且篩選困難的問題。本發(fā)明的一個方面，提供一種細(xì)菌無痕遺傳操作載體，所述載體包括抗毒素開關(guān)控制的毒素反篩元件TCCRAS(ToxinCounter-selectableCassetteRegulatedbyAntitoxinSwitch)和抗生素抗性基因。以上所述載體，所述抗毒素開關(guān)控制的毒素反篩元件包括抗毒素蛋白編碼基因、誘導(dǎo)表達(dá)抗毒素蛋白編碼基因的誘導(dǎo)型啟動子、毒素蛋白編碼基因和持續(xù)表達(dá)毒素蛋白編碼基因的組成型啟動子。以上所述載體，所述毒素蛋白-抗毒素蛋白包括：RelE-RelB、MazF-MazE、ParE-ParD、Doc-Phd、YafQ-DinJ、VapC-VapB、HicA-HicB、CcdB-CcdA、Axe-Txe、YefM-YoeB、RelJ-RelK、HigB-HigA和HipA-HipB；優(yōu)選為RelE-RelB和MazF-MazE；最優(yōu)選為RelE-RelB。以上所述載體，所述誘導(dǎo)型啟動子為PxylA或Ptac啟動子；所述組成型啟動子為Pliag或P45啟動子。以上所述載體，所述毒素蛋白-抗毒素蛋白編碼基因來源于大腸桿菌Escherichiacoli、嗜熱古菌Pyrococcushorikoshii、結(jié)核分枝桿菌Mycobacteriumtuberculosis、詹氏甲烷球菌Methanococcusjannaschii、嗜線蟲致病桿菌Xenorhabdusnematophila、腸道沙門氏菌Salmonellaenterica、嗜甲烷細(xì)菌Methylomicrobiumalcaliphilum、唾液乳桿菌Lactobacillussalivarius或弧菌Vibrionigripulchritudo中的一種細(xì)菌；優(yōu)選地，為大腸桿菌Escherichiacoli或腸道沙門氏菌Salmonellaenterica。以上所述載體，所述細(xì)菌為革蘭氏陽性菌；優(yōu)選地，為芽胞桿菌屬Bacillus、李斯特氏菌屬Listeria、葡萄球菌屬Staphylococcus、鏈球菌屬Streptococcus、腸球菌屬Enterococcus、梭菌屬Clostridium或放線菌Actinomycete中的一種細(xì)菌；最優(yōu)選地，為芽胞桿菌屬Bacillus或棒桿菌屬Corynebacterium中的一種細(xì)菌；所述芽胞桿菌屬的細(xì)菌為枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis、蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus、巨大芽胞桿菌Bacillusmegaterium、解淀粉芽胞桿菌Bacillusamyloliquefaciens、短小芽胞桿菌Bacilluspumilus或地衣芽胞桿菌Bacilluslicheniformis中的一種細(xì)菌；所述棒桿菌屬的細(xì)菌為谷氨酸棒狀桿菌Corynebacteriumglutamicum、北京棒桿菌Corynebacteriumpekinense、鈍齒棒桿菌Corynebacteriumcrenatum或產(chǎn)氨棒桿菌Coryne bacteriumaminogenes中的一種細(xì)菌。本發(fā)明的另一個方面，提供以上任一所述的載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：1)擴(kuò)增毒素蛋白編碼基因、抗毒素蛋白編碼基因和持續(xù)表達(dá)毒素蛋白編碼基因的組成型啟動子，按照持續(xù)表達(dá)毒素蛋白編碼基因的組成型啟動子-毒素蛋白編碼基因-抗毒素蛋白編碼基因的順序融合形成重組基因片段；2)將上述步驟1)中獲得的重組基因片段與載體連接，獲得含有毒素-抗毒素蛋白表達(dá)元件的靶基因無痕遺傳操作通用載體；所述載體帶有誘導(dǎo)表達(dá)抗毒素蛋白編碼基因的誘導(dǎo)型啟動子及抗生素抗性基因。以上所述的載體的構(gòu)建方法，所述步驟1)中擴(kuò)增毒素蛋白編碼基因、抗毒素蛋白編碼基因和持續(xù)表達(dá)毒素蛋白編碼基因的組成型啟動子的融合是通過SOE-PCR方法進(jìn)行。本發(fā)明的再一個方面，提供一種應(yīng)用以上任一所述的載體進(jìn)行細(xì)菌無痕基因敲除的方法，包括如下步驟：1)構(gòu)建待敲除的靶基因的上游同源臂及下游同源臂的融合片段；2)將步驟1)中所述融合片段插入以上任一所述的載體，攜帶有所述待敲除的靶基因的上游同源臂及下游同源臂的融合片段與靶細(xì)菌染色體DNA以單交換的形式發(fā)生同源重組，在抗生素選擇壓力和誘導(dǎo)劑同時存在的條件下篩選有抗生素抗性的重組子，得到將以上任一所述的載體整合到靶細(xì)菌染色體的陽性轉(zhuǎn)化子；3)將步驟2)中獲得的陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于含有誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基中，促使同源臂之間發(fā)生第二次單交換，然后將培養(yǎng)的菌液稀釋涂布不含誘導(dǎo)劑的平板上進(jìn)行反篩，獲得靶基因無痕遺傳改造的重組菌。本發(fā)明的再一個方面，提供一種應(yīng)用以上任一所述的載體進(jìn)行細(xì)菌無痕基因點(diǎn)突變的方法，包括如下步驟：1)構(gòu)建含有突變的基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段；2)將步驟1)中所述融合片段插入以上任一所述的載體，攜帶有所述突變的基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段與靶細(xì)菌染色體DNA以單交換的形式發(fā)生同源重組，在抗生素選擇壓力和誘導(dǎo)劑同時存在的條件下篩選有抗生素抗性的重組子，得到將以上任一所述的載體整合到靶細(xì)菌染色體的陽性轉(zhuǎn)化子；3)將步驟2)中獲得的陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于含有誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基中，促使同源臂之間發(fā)生第二次單交換，然后將培養(yǎng)的菌液稀釋涂布不含誘導(dǎo)劑的平板上進(jìn)行反篩，獲 得靶基因無痕遺傳改造的重組菌。本發(fā)明的再一個方面，提供一種應(yīng)用以上任一所述的載體進(jìn)行細(xì)菌無痕基因插入的方法，包括如下步驟：1)構(gòu)建含有待插入的基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段；2)將步驟1)中所述融合片段插入以上任一所述的載體，攜帶有所述待插入的基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段與靶細(xì)菌染色體DNA以單交換的形式發(fā)生同源重組，在抗生素選擇壓力和誘導(dǎo)劑同時存在的條件下篩選有抗生素抗性的重組子，得到將以上任一所述的載體整合到靶細(xì)菌染色體的陽性轉(zhuǎn)化子；3)將步驟2)中獲得的陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于含有誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基中，促使同源臂之間發(fā)生第二次單交換，然后將培養(yǎng)的菌液稀釋涂布不含誘導(dǎo)劑的平板上進(jìn)行反篩，獲得靶基因無痕遺傳改造的重組菌。本發(fā)明的再一個方面，提供一種應(yīng)用以上任一所述的載體進(jìn)行細(xì)菌無痕基因替換的方法，包括如下步驟：1)構(gòu)建含有替換基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段；2)將步驟1)中所述融合片段插入以上任一所述的載體，攜帶有所述替換基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段與靶細(xì)菌染色體DNA以單交換的形式發(fā)生同源重組，在抗生素選擇壓力和誘導(dǎo)劑同時存在的條件下篩選有抗生素抗性的重組子，得到將以上任一所述的載體整合到靶細(xì)菌染色體的陽性轉(zhuǎn)化子；3)將步驟2)中獲得的陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于含有誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基中，促使同源臂之間發(fā)生第二次單交換，然后將培養(yǎng)的菌液稀釋涂布不含誘導(dǎo)劑的平板上進(jìn)行反篩，獲得靶基因無痕遺傳改造的重組菌。本發(fā)明將抗毒素開關(guān)控制的毒素作為反篩標(biāo)記，建立高效、穩(wěn)定的細(xì)菌無痕遺傳操作載體。該載體利用組成型啟動子持續(xù)表達(dá)毒素蛋白，并利用誘導(dǎo)型啟動子誘導(dǎo)表達(dá)抗毒素蛋白，建立了毒素-抗毒素蛋白的精確表達(dá)元件。在添加誘導(dǎo)劑的條件下，抗毒素蛋白大量表達(dá)，完全抑制毒素蛋白的毒性，細(xì)胞正常生長；在不添加誘導(dǎo)劑的條件下，抗毒素蛋白不表達(dá)或表達(dá)水平低，不能抑制或不能完全抑制毒素蛋白的毒性，細(xì)胞不能生長，可作為無痕遺傳操作的高效反篩標(biāo)記。因而，通過對抗毒素蛋白進(jìn)行精確調(diào)控能夠有效地提高毒素蛋白作為反篩標(biāo)記的作用效果。本發(fā)明的遺傳操作載體能用于芽胞桿菌和棒桿菌(Corynebacterium)等革蘭氏陽性細(xì)菌的無痕基因敲除、敲入、替換、點(diǎn)突變以及大片段DNA插入和刪除(大于194kb)等遺傳操作，其反篩效率高于98％，突變 效率最高能夠達(dá)到100％，具有簡便、快捷、高效和用途廣泛的特征。附圖說明參考以下附圖，將有助于更好地理解本發(fā)明的方案及有益效果。圖1為利用RelB-RelE構(gòu)建抗毒素開關(guān)控制的毒素反篩元件(TCCRAS)的示意圖。圖2為重組質(zhì)粒pWYE448和pWYE585的PliaG-relE-relB和relB-relE-P45基因片段PCR鑒定圖。圖3為重組質(zhì)粒pWYE448圖譜。圖4為重組質(zhì)粒pWYE585圖譜。圖5為TCCRAS在枯草芽胞桿菌中的有效性驗(yàn)證圖。圖6為TCCRAS在谷氨酸棒桿菌中的有效性驗(yàn)證圖。圖7為pWYE469的質(zhì)粒圖譜。圖8為pWYE486的質(zhì)粒圖譜。圖9為pWYE587的質(zhì)粒圖譜。圖10為利用本發(fā)明的載體進(jìn)行無痕敲除過程的示意圖。圖11為利用本發(fā)明的載體進(jìn)行點(diǎn)突變過程的示意圖。圖12為利用本發(fā)明的載體進(jìn)行基因插入過程的示意圖。圖13為利用本發(fā)明的載體進(jìn)行基因替換過程的示意圖。圖14為pWYE469轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌W168后與菌體基因組發(fā)生第一次單交換的PCR驗(yàn)證圖。圖15為pWYE493轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌W168后與菌體基因組發(fā)生第一次單交換的PCR驗(yàn)證圖。圖16為pWYE857轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌W168后與菌體基因組發(fā)生第一次單交換的PCR驗(yàn)證圖。圖17為枯草芽胞桿菌amyE基因的無痕敲除的反篩效率統(tǒng)計(jì)圖。圖18為枯草芽胞桿菌pps操縱子無痕敲除的反篩效率統(tǒng)計(jì)圖。圖19為枯草芽胞桿菌染色體大片段dltA-rocR無痕敲除的反篩效率統(tǒng)計(jì)圖。圖20為pWYE469轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌W168后與菌體基因組發(fā)生第二次單交換刪除了TCCRAS和抗生素抗性基因的PCR驗(yàn)證圖。圖21為pps操縱子上游同源臂和pps部分序列(片段1)、pps操縱子及其上下游同源臂(片段2)和pps操縱子上游同源臂序列(片段3)示意圖。圖22為參照圖21的pps操縱子刪除的PCR驗(yàn)證圖。圖23為pps操縱子及其上下游同源臂(片段1)、pps操縱子上游同源臂和pps操縱子前22kb序列(片段2)以及pps操縱子后16kb序列和pps操縱子下游同源臂序列(片段3)示意圖。圖24為參照圖23的pps操縱子刪除的PCR驗(yàn)證圖。圖25為dltA-rocR上游同源臂和dltA-rocR部分序列(片段1)、dltA-rocR及其上下游同源臂(片段2)和dltA-rocR上下游同源臂序列(片段3)示意圖。圖26為參照圖25的dltA-rocR刪除的PCR驗(yàn)證圖。圖27為枯草芽胞桿菌amyE基因無痕敲除的功能驗(yàn)證圖。圖28為pWYE491轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌W168后與菌體基因組發(fā)生第一步單交換菌株P(guān)CR驗(yàn)證圖。圖29為枯草芽胞桿菌recU基因定點(diǎn)突變的反篩效率統(tǒng)計(jì)圖。圖30為枯草芽胞桿菌recU基因定點(diǎn)突變的測序驗(yàn)證圖。圖31為枯草芽胞桿菌recU基因定點(diǎn)突變的功能驗(yàn)證圖。圖32為pWYE549轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌BS097后與菌體基因組發(fā)生第一次單交換后的的PCR驗(yàn)證圖。圖33為枯草芽胞桿菌pps位點(diǎn)無痕插入12.3-kbtrp-thrABC操縱子的反篩效率統(tǒng)計(jì)圖。圖34為枯草芽胞桿菌pps位點(diǎn)無痕插入trp-thrABC操縱子的PCR驗(yàn)證圖。圖35為pWYE595轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC13032后與菌體基因組發(fā)生了第一次單交換的PCR驗(yàn)證圖。圖36為谷氨酸棒桿菌upp基因無痕敲除的反篩效率統(tǒng)計(jì)圖。圖37為谷氨酸棒桿菌無痕敲除upp基因的重組菌的PCR驗(yàn)證圖。圖38為谷氨酸棒桿菌upp基因無痕敲除的功能驗(yàn)證圖。圖39為pWYE590轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC13032后與菌體基因組發(fā)生第一次單交換的PCR驗(yàn)證圖。圖40為谷氨酸棒桿菌lysE基因無痕替換為大腸桿菌cadA基因的反篩效率統(tǒng)計(jì)圖。圖41為谷氨酸棒桿菌lysE基因無痕替換為大腸桿菌cadA基因的PCR驗(yàn)證圖。圖42為谷氨酸棒桿菌lysE基因無痕替換為大腸桿菌cadA基因的功能驗(yàn)證圖。圖43為pWYE848的質(zhì)粒圖譜。圖44為利用MazF-MazE表達(dá)元件作為反篩標(biāo)記無痕敲除枯草芽胞桿菌amyE基因的反篩效率統(tǒng)計(jì)圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行更加詳細(xì)地說明，以便能夠更好地理解本發(fā)明的方案以及其各個方面的優(yōu)點(diǎn)。然而，以下描述的具體實(shí)施方式和實(shí)施例僅是說明的目的，而不是對本發(fā)明的限制。具體來說，以下描述均以(野生型)枯草芽胞桿菌W168和谷氨酸棒桿菌ATCC13032為例。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明對枯草芽胞桿菌和谷氨酸棒桿菌的遺傳操作系統(tǒng)可用于其他合適的菌株。以下通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。如未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(科學(xué)出版社)、《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第4版)》(高等教育出版社)以及相應(yīng)儀器和試劑的廠商說明書等。實(shí)施例中所用儀器設(shè)備和試劑為市售的常用儀器、試劑。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例1抗毒素開關(guān)控制的毒素反篩元件(TCCRAS)的構(gòu)建(1)基因擴(kuò)增以枯草芽胞桿菌W168(購自美國BacillusGeneticStockCenter，貨號1A308)基因組DNA為模板，P1/P2為引物PCR擴(kuò)增PliaG啟動子基因(片段1，圖1，SEQIDNO：3)；以大腸桿菌W3110(購自美國ColiGeneticStockCenter，貨號4474)基因組DNA為模板，P3/P4為引物擴(kuò)增毒素蛋白relE基因(片段2，圖1，SEQIDNO：1)；以大腸桿菌W3110基因組DNA為模板，P5/P6為引物擴(kuò)增抗毒素蛋白relB基因(片段3，圖1，SEQIDNO：2)；以谷氨酸棒桿菌ATCC13032(購自美國典型微生物保藏中心ATCC，貨號534)基因組DNA為模板，P9/P10為引物擴(kuò)增P45啟動子基因(片段4，圖1，SEQIDNO：4)；PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將四個PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后，作為模板進(jìn)行SOE-PCR反應(yīng):以片段1、片段2、片段3作為模板，P1/P6為引物進(jìn)行重疊延伸聚合酶鏈(SOE-PCR)反應(yīng)，擴(kuò)增得到PliaG-relE-relB(片段5，見圖1，SEQIDNO：5)；以片段2和片段3作為模板，P7/P8為引物，擴(kuò)增得到片段6；最后，以片段4 和片段6為模板、以P7/P10為引物，擴(kuò)增得到relB-relE-P45(片段7，圖1，SEQIDNO：6)。(2)酶切、連接與轉(zhuǎn)化PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將步驟(1)所得的PCR片段5進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后，用限制性內(nèi)切酶BamHI/SacII進(jìn)行酶切，與同樣酶切的整合載體pAX01(含有紅霉素和林可霉素抗性基因，購自美國BacillusGeneticStockCenter，貨號ECE137)進(jìn)行連接，得到圖1A所示的RelB-RelE毒素-抗毒素系統(tǒng)在枯草芽胞桿菌中的共表達(dá)元件。將步驟(1)所得的片段7進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后，用限制性內(nèi)切酶HindIII和SalI進(jìn)行酶切，與同樣酶切的載體pXMJ19(含有氯霉素抗性基因)進(jìn)行連接，得到圖1B所示的RelB-RelE毒素-抗毒素系統(tǒng)在谷氨酸棒桿菌中的共表達(dá)元件。采用CaCl2法制備大腸桿菌EC135感受態(tài)細(xì)胞，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌EC135感受態(tài)細(xì)胞中，分別在加有氨芐青霉素(100μg/ml)或氯霉素(20μg/ml)的LB平板上篩選能夠在含有TCCRAS的枯草芽胞桿菌或谷氨酸棒桿菌中表達(dá)TCCRAS的轉(zhuǎn)化子。(3)PCR與測序驗(yàn)證以步驟(2)獲得的轉(zhuǎn)化子菌落為模板，分別以P3/P6或P7/P10為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定轉(zhuǎn)化子攜帶的PliaG-relE-relB或relB-relE-P45基因片段。用引物P3/P6對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大約668bp大小的目的條帶(圖2,泳道2)，經(jīng)質(zhì)粒提取獲得含有TCCRAS的重組質(zhì)粒pWYE448(圖3)。重組質(zhì)粒pWYE448攜帶的PliaG-relE-relB基因片段經(jīng)測序得到SEQIDNO：5所述的核苷酸序列，為668bp。大腸桿菌RelB-RelE毒素-抗毒素系統(tǒng)在芽胞桿菌中共表達(dá)的核苷酸序列為SEQIDNO：5。利用引物P7/P10對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大約733bp(圖2，泳道3)目的產(chǎn)物，經(jīng)質(zhì)粒提取獲得含有TCCRAS的重組質(zhì)粒pWYE585(圖4)。重組質(zhì)粒pWYE585攜帶的relB-relE-P45基因片段經(jīng)測序得到SEQIDNO：6所述的核苷酸序列，為733bp。大腸桿菌RelB-RelE毒素-抗毒素系統(tǒng)在谷氨酸棒桿菌中共表達(dá)的核苷酸序列為SEQIDNO：6。上述所用的引物序列(5’-3’)如下：P1：TCCCCGCGGCAAAAATCAGACCAGACAAAAG(SacII)P2：AAGAGCATTCACCACCTTTTCATTCATTCTATTATAAAGGAAAAP3：AAAGGTGGTGAATGCTCTTATGGCGTATTTTCTGGATTTTGACGP4：TGAACTCTGATCAGAGAATGCGTTTGACCGCCTCGP5：CATTCTCTGATCAGAGTTCATCCAGCGTCACACGTP6：GGAGGATCCATGGGTAGCATTAACCTGCGTAT(BamHI)P7：TCGCAAGCTTAAAGGAGGAACCGAATGGGTAGCATTAAC(HindIII)P8：TTAAAAGCAAAGGAGGACAACCATGGCGTATTTTCTGGATP9：GGTTGTCCTCCTTTGCTTTTAAAACCATGCATTP10：CTAGGTCGACGTGTTTTTCTGTGATCCTCATTCGC(SalI)實(shí)施例2抗毒素開關(guān)控制的毒素反篩元件TCCRAS作為反篩標(biāo)記的有效性驗(yàn)證(1)TCCRAS在枯草芽胞桿菌中的有效性驗(yàn)證將質(zhì)粒pAX01和上述重組質(zhì)粒pWYE448分別轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌W168自然感受態(tài)細(xì)胞，得到的重組菌株BS048(W168ΔlacA::PxylA-erm)和BS084(W168ΔlacA::PliaG-relE-PxylA-relB-erm)。將菌株BS048和BS084分別在含有和不含有木糖的MLS(0.5μg/mL紅霉素+12.5μg/mL林可霉素)平板上劃線培養(yǎng)，檢測毒素蛋白RelE芽胞桿菌的毒性。結(jié)果顯示，BS084菌株在添加1％木糖的MLS平板上能夠生長，在不含有木糖的平板上不能生長(圖5)。因此，在枯草芽胞桿菌中單獨(dú)表達(dá)毒素蛋白編碼基因relE能夠抑制菌株的生長，TCCRAS能夠作為枯草芽胞桿菌無痕遺傳操作的有效反篩標(biāo)記。(2)TCCRAS在谷氨酸棒桿菌中的有效性驗(yàn)證將質(zhì)粒pXMJ19(購自于BiovectorScienceLab,Inc,貨號SMD1168H)和上述重組質(zhì)粒pWYE585分別轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC13032，得到的重組菌株13032/pXMJ19和13032/pWYE585。分別將重組菌株在含有與不含有IPTG的氯霉素平板上劃線培養(yǎng)，檢測毒素蛋白RelE谷氨酸棒桿菌的毒性。結(jié)果顯示，13032/pWYE585菌株在添加1mMIPTG的氯霉素平板上能夠生長，在不添加IPTG的氯霉素平板上不能生長(圖6)。因此，在谷氨酸棒桿菌中單獨(dú)表達(dá)毒素蛋白編碼基因relE能夠抑制菌株的生長，TCCRAS能夠作為谷氨酸棒桿菌無痕遺傳操作的有效反篩標(biāo)記。實(shí)施例3利用TCCRAS構(gòu)建枯草芽胞桿菌的無痕遺傳操作載體(1)基因的擴(kuò)增以枯草芽胞桿菌W168基因組DNA為模板，以P11/P12為引物擴(kuò)增淀粉酶基因amyE的上游同源臂，大小為516bp；以P13/P14為引物擴(kuò)增淀粉酶基因amyE的下游同源 臂，大小為766bp。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將上述兩個PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收，并以回收的DNA產(chǎn)物作為模板進(jìn)行SOE-PCR反應(yīng)，將所得的PCR片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收，并利用普通PCRTaq酶對其末端進(jìn)行加A。(2)連接、轉(zhuǎn)化與PCR驗(yàn)證純化步驟(1)中的加A反應(yīng)結(jié)束的DNA片段，并與pMD19T-simplevector(購自于中國的寶生物工程(大連)有限公司,貨號6013)連接。采用CaCl2法制備大腸桿菌EC135(菌種保藏號CGMCCNO.5925，專利號CN201210080124.6)感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌EC135感受態(tài)細(xì)胞中，并在加有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。以轉(zhuǎn)化子菌落為模板，以P11/P14為引物PCR擴(kuò)增淀粉酶基因amyE的同源臂，篩選能夠擴(kuò)增得到大小為1282bp的含有amyE基因同源臂的陽性轉(zhuǎn)化子。(3)淀粉酶基因無痕敲除載體構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶ClaI對質(zhì)粒pWYE448進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠回收獲得大小約為3900bp的TCCRAS的基因片段。進(jìn)一步提取上述步驟(2)中的陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，用ClaI進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物純化與同樣酶切處理的TCCRAS的基因片段進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，得到含有TCCRAS的amyE基因無痕敲除質(zhì)粒，命名為pWYE469(圖7)。(4)芽胞桿菌無痕遺傳操作質(zhì)粒構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶KpnI對pWYE469用進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠回收獲得大小約為6600bp的載體片段。將酶切獲得的載體片段進(jìn)行自連，得到可用于枯草芽胞桿菌無痕遺傳操作的通用型載體pWYE486(SEQIDNO：7)，該載體含有多克隆位點(diǎn)(ApaI、NcoI、KpnI、NheI和SphI等)、TCCRAS和紅霉素抗性編碼基因(圖8)。上述所用的引物序列(5’-3’)如下：P11：GGGCCCACGCGTCCATGGGGTACCCGGCATTATGTTTGAATTTCC(ApaI-MluI-NcoI-KpnI)P12：TTTGTCTGATTCAAACCGATGTGAAGACTGGAGAATP13：ACATCGGTTTGAATCAGACAAAACTTTTCTCTTGCP14：ATCGATGCATGCGCTAGCGGTACCCATCTACAATTTGGTCCAGCTCCT(ClaI-SphI-NheI-KpnI)實(shí)施例4利用TCCRAS構(gòu)建谷氨酸棒桿菌無痕遺傳操作載體(1)基因擴(kuò)增以質(zhì)粒pWYE585為模板，以P10/P15為引物PCR擴(kuò)增得到大小為2976bp的目的片段，該片段含有氯霉素抗性編碼基因cat、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白編碼基因lacIq、Ptac啟動子、TCCRAS和P45啟動子。(2)酶切、連接與驗(yàn)證PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將步驟(1)所得的PCR片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后，用限制性內(nèi)切酶SalI和PstI進(jìn)行酶切，并與同樣酶切的pUC19載體(購自于中國的寶生物工程(大連)有限公司,貨號3219)進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌EC135感受態(tài)細(xì)胞，并在含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。以轉(zhuǎn)化子菌落為模板，以P10/P15為引物PCR擴(kuò)增。篩選的陽性轉(zhuǎn)化子能夠擴(kuò)增得到大小約為3000bp的目的條帶。提取陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，進(jìn)一步經(jīng)測序鑒定得到序列正確的含有TCCRAS的質(zhì)粒pWYE587(SEQIDNO：8)，該質(zhì)粒為谷氨酸棒桿菌無痕遺傳操作的通用型載體(見圖9)。上述所用的引物序列(5’-3’)如下：P10：CTAGGTCGACGTGTTTTTCTGTGATCCTCATTCGC(SalI)P15：TCGCCTGCAGGAAGGGCACCAATAACTGCCTTA(PstI)實(shí)施例5枯草芽胞桿菌淀粉酶編碼基因amyE的無痕敲除、制磷脂菌素合成操縱子(ppsEDCBA)和染色體大片段dltA-rocR的無痕刪除參照圖10所示的利用RelB-RelE作為反篩標(biāo)記進(jìn)行基因替換的過程原理，構(gòu)建amyE、ppsEDCBA和dltA-rocR無痕敲除突變株，具體步驟如下：(1)載體構(gòu)建以枯草芽胞桿菌W168染色體DNA為模板、以P16/P17為引物PCR擴(kuò)增含有pps操縱子上游同源臂的片段，獲得大小為738bp的擴(kuò)增片段；以枯草芽胞桿菌W168染色體DNA為模板，以P18/P19為引物PCR擴(kuò)增含有pps操縱子下游同源臂的片段，獲得大小為962bp的擴(kuò)增片段。以P16/P19為引物，以上述兩個PCR純化回收片段作為模板進(jìn)行SOE-PCR。進(jìn)一步用限制性內(nèi)切酶NheI對純化的重疊延伸PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并與相同酶切并去磷酸化處理的pWYE486載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到用于pps基因無痕敲除突變的質(zhì)粒pWYE493(pWYE486-Δpps)。以枯草芽胞桿菌W168染色體DNA為模板、以P23/P24為引物PCR擴(kuò)增dltA-rocR上游同源臂，獲得大小為690bp的擴(kuò)增片段；以枯草芽胞桿菌W168染色體DNA為模板，以P24/P26為引物PCR擴(kuò)增dltA-rocR操縱子下游同源臂，獲得大小為658bp的擴(kuò)增片段。以P23/P26為引物，以上述兩個PCR純化回收片段作為模板進(jìn)行SOE-PCR。進(jìn)一步用限制性內(nèi)切酶NheI對純化的重疊延伸PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并與相同酶切并去磷酸化處理的pWYE486載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到用于dltA-rocR基因片段無痕敲除突變的質(zhì)粒pWYE857(pWYE486-ΔdltA-rocR)。(2)轉(zhuǎn)化和PCR驗(yàn)證將實(shí)施例3的步驟(3)中所構(gòu)建amyE基因無痕敲除載體pWYE469、pps操縱子無痕敲除載體pWYE493和dltA-rocR無痕敲除載體pWYE857分別轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌W168感受態(tài)細(xì)胞，并在含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL紅霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上篩選發(fā)生第一次單交換的轉(zhuǎn)化子(圖10，步驟2)。繼續(xù)以篩選得到的將轉(zhuǎn)化子在LB+MLS(0.5μg/mL紅霉素+12.5μg/mL林可霉素)+1％木糖連續(xù)三次傳代培養(yǎng)之后，用轉(zhuǎn)化pWYE469所得轉(zhuǎn)化子的菌體作為模板，以P11/P14為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選能夠擴(kuò)增得到大約1282bp目的條帶的轉(zhuǎn)化子(圖14)，即獲得了通過為發(fā)生了第一次單交換，整合含有RelE-RelB表達(dá)元件、抗生素基因和amyE同源臂的宿主重組菌，命名為BS087(W168ΔamyE::pWYE469)；用轉(zhuǎn)化pWYE493所得轉(zhuǎn)化子的菌體為模板，以P16/P19為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選能夠擴(kuò)增得到大約1700bp目的條帶的轉(zhuǎn)化子(圖15)，即獲得了通過為發(fā)生了第一次單交換，整合含有TCCRAS、抗生素基因和pps同源臂的宿主重組菌，命名為BS095(W168Δpps::pWYE493)；用轉(zhuǎn)化pWYE857所得轉(zhuǎn)化子的菌體為模板，以P23/P26為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選能夠擴(kuò)增得到大約1348bp目的條帶的轉(zhuǎn)化子(圖16)，即獲得了通過為發(fā)生了第一次單交換，整合含有TCCRAS、抗生素基因和dltA-rocR同源臂的宿主重組菌，命名為BS214(W168ΔdltA-rocR::pWYE857)。(3)TCCRAS和抗生素基因的刪除將上述所得的轉(zhuǎn)化子BS087、BS095和BS214在含有1％木糖的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；培養(yǎng)液稀釋10-4-10-8倍后，取200μl涂布在LB平板上過夜培養(yǎng)；培養(yǎng)所得的單菌落為發(fā)生第二次單交換刪除了TCCRAS和抗生素基因的重組菌。(4)TCCRAS作為反篩標(biāo)記的反篩效率檢測將本實(shí)施例步驟(3)獲得的重組菌BS087同時在含有與不含有1％木糖和MLS(0. 5μg/mL紅霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。結(jié)果顯示，所有重組菌都能在LB平板生長，不能在含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL紅霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上生長(圖17)。將本實(shí)施例步驟(3)獲得的重組菌BS095同時在含有與不含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL紅霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。結(jié)果顯示，所有重組菌都能在LB平板生長，99.4％的重組菌不能在含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL紅霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上生長(圖18)。將本實(shí)施例步驟(3)獲得的重組菌BS214同時在含有與不含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL紅霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。結(jié)果顯示，所有重組菌都能在LB平板生長，98.7％的重組菌不能在含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL紅霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上生長(圖19)。以上結(jié)果表明TCCRAS和抗生素基因已成功從BS087,BS095及BS214的染色體上刪除，TCCRAS的反篩效率分別為100％,99.4±1.1％和98.7±1.1％。(5)突變株篩選、amyE突變株功能驗(yàn)證與突變效率檢測以上述步驟(3)中BS087反篩所得的重組子為模板，以P11/P14為引物進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果顯示amyE基因無痕敲除菌株能夠擴(kuò)增到大約1282bp目的條帶，而對照菌株W168用相同引物擴(kuò)增得到大小約為3407bp的片段(圖20)。表明重組菌株的amyE基因已被無痕敲除，并將該重組菌命名為BS089(W168ΔamyE)。以上述步驟(3)中BS095反篩所得的重組子為模板，以P16/P19/P20為引物進(jìn)行PCR檢測，進(jìn)一步以對照菌株W168染色體DNA為模板，分別以P16/P19/P20擴(kuò)增pps操縱子上游同源臂及其ppsE基因428bp片段。W168能夠擴(kuò)增得到1167bp片段(圖21，片段1；圖22，泳道2)，片段2(圖21)太大，無法用當(dāng)前PCR條件獲得；突變株擴(kuò)增得到1700bp片段(圖21，片段3；圖22，泳道3)。為進(jìn)一步驗(yàn)證W168的pps操縱子，以P16/P21PCR擴(kuò)增pps操縱子上游同源臂和pps操縱子前22kb序列(圖23，片段2)，以P19/P22為引物PCR擴(kuò)增pps操縱子后16kb序列和pps操縱子下游同源臂序列(圖23，片段3)。對照菌株P(guān)CR擴(kuò)增時，由于片段1太大，未能成功擴(kuò)增得到40.1kb目的片段(圖23，片段1；圖24，泳道1)，所以將其分為23.5kb的片段2(圖23，片段2；圖24，泳道2)和17.1kb的片段3(圖23，片段3；圖24，泳道3)進(jìn)行擴(kuò)增；突變株用P16/P19擴(kuò)增得到約為1.7kb的片段(圖24，泳道4)。說明刪除pps已被無痕敲除，并將該重組菌命名為BS097(W168ΔppsEΔppsDΔppsCΔppsBΔppsA)或BS097(W168ΔppsEDCBA)。隨機(jī)挑選78個突變子進(jìn)行PCR檢測，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示upp操縱子無痕刪除的突 變效率為70.1±4.5％。以上述步驟(3)中BS214反篩所得的重組子為模板，以P23/P26/P27為引物進(jìn)行PCR檢測，進(jìn)一步以對照菌株W168染色體DNA為模板，分別以P23/P26/P27擴(kuò)增dltA-rocR上游同源臂及dltA-rocR內(nèi)部269bp片段。W168能夠擴(kuò)增得到959bp片段(圖25，片段1；圖26，泳道2)，片段2(圖25)太大，無法用當(dāng)前PCR條件獲得；突變株擴(kuò)增得到1348bp片段(圖25，片段3；圖26，泳道3)，并將該重組菌命名為BS215(W168ΔdltA-rocR)。隨機(jī)挑選78個突變子進(jìn)行PCR檢測，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示194.9kb的dltA-rocR大片段無痕刪除的突變效率為29.5±4.4％。分別將重組菌BS089與野生型菌株W168接種于含有1％可溶性淀粉的LB平板上進(jìn)行過夜培養(yǎng)，第二天加碘液顯色。結(jié)果顯示，野生型菌株W168的菌體周圍含有白色的淀粉水解圈，而重組菌BS089的菌體周圍沒有淀粉水解圈(圖27)。通過功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)說明重組菌BS089上的淀粉酶已經(jīng)失活，不能水解淀粉，從而不能形成淀粉水解圈。隨機(jī)挑選240個突變子進(jìn)行淀粉酶功能檢測，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示amyE基因無痕敲除的突變效率為89.6±9.0％。以上結(jié)果表明利用TCCRAS作為反篩標(biāo)記建立的無痕操作系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了枯草芽胞桿菌染色體基因的無痕敲除和大片段無痕刪除。上述所用的引物序列(5’-3’)如下：P11：GGGCCCACGCGTCCATGGGGTACCCGGCATTATGTTTGAATTTCC(ApaI-MluI-NcoI-KpnI)P14：ATCGATGCATGCGCTAGCGGTACCCATCTACAATTTGGTCCAGCTCCT(ClaI-SphI-NheI-KpnI)P16:CTAGCTAGCACGGAACGGAAATGACAAACG(NheI)P17:CTGGAGGGAAAGCGGATTAGCGGACAGAGGCP18:CTAATCCGCTTTCCCTCCAGTTCTCATAATAAGP19:CTAGCTAGCAAGCACCTAGTTCTTCAGATGTG(NheI)P20：GAAGTGGCACAGGCTATGGAGCP21：AATGTAGCCAAACCTCGTCAAGTCGP22：CAGTGTTTAGTGTCGCACCAGAAGCP23:CTAGCTAGCGTTAACTGCCAAAGGATCTGCC(NheI)P24:CCTGCTCCGGAAGTTATTCTCTCTCCAATTAGP25:AGAGAATAACTTCCGGAGCAGGAAGCCTGATCP26:CTAGCTAGCTTGTGATGGGTGTAGACGCCTT(NheI)P27：CGTTCGGACGGAATAGACAGG實(shí)施例6枯草芽胞桿菌霍利迪連結(jié)體解離酶編碼基因recU的定點(diǎn)突變參照圖11所示的利用RelB-RelE作為反篩標(biāo)記進(jìn)行基因點(diǎn)突變的過程原理，構(gòu)建recUA107C突變株，具體步驟如下：(1)載體構(gòu)建以枯草芽胞桿菌W168染色體DNA為模板、以P28/P29為引物PCR擴(kuò)增含有recU基因上游同源臂和recU基因突變位點(diǎn)的片段，獲得大小為796bp的擴(kuò)增片段；以枯草芽胞桿菌W168染色體DNA為模板，以P30/P31為引物PCR擴(kuò)增含有recU基因下游同源臂和recU基因突變位點(diǎn)的片段，獲得大小為730bp的擴(kuò)增片段。以P28/P31為引物，以上述兩個PCR純化回收片段作為模板進(jìn)行SOE-PCR。進(jìn)一步用限制性內(nèi)切酶NheI對純化的重疊延伸PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并與相同酶切并去磷酸化處理的pWYE486載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到用于recU基因定點(diǎn)突變的質(zhì)粒pWYE491(pWYE486-recUA107C)。(2)轉(zhuǎn)化與PCR驗(yàn)證將質(zhì)粒pWYE491轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌W168感受態(tài)細(xì)胞，并在含有木糖和MLS(0.5μg/mL紅霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。繼續(xù)以轉(zhuǎn)化子的菌體作為模板，以P1/P6為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選能夠擴(kuò)增得到大小約為668bp目的條帶的轉(zhuǎn)化子(圖28)。獲得了通過第一次單交換整合有TCCRAS、抗生素基因和同源臂的重組菌，命名為BS092(W168ΔrecU::pWYE491)。(3)TCCRAS和抗生素基因的刪除將上述所得的BS092在含有木糖的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)液稀釋10-4-10-8倍后，取200μl涂布在LB平板上過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)所得的單菌落即為發(fā)生第二次單交換刪除了TCCRAS和抗生素基因的重組菌。(4)TCCRAS作為反篩標(biāo)記的反篩效率檢測將獲得的重組菌分別在含有與不含有木糖和MLS(0.5μg/mL紅霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。結(jié)果顯示，所有菌落都能在LB平板生長，不能在含有木糖和MLS(0.5μg/mL紅霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上生長(圖29)， 表明TCCRAS和抗生素基因已經(jīng)從BS092的染色體上刪除，TCCRAS的反篩效率為100％。(5)recU點(diǎn)突變菌株篩選、功能驗(yàn)證與突變效率檢測以上述步驟(3)反篩所得到的重組子的染色體DNA為模板,以P28/P31為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示重組子的recU基因發(fā)生點(diǎn)突變，即第107位核苷酸由腺嘌呤A突變?yōu)榘奏，對應(yīng)第36位谷氨酰胺E突變?yōu)楸滨，與預(yù)期的突變位點(diǎn)一致(圖30)。獲得recU基因突變的重組菌株，命名為BS093(W168RecUE36A)。由于甲磺酸甲酯(methylmethanesulfonate，MMS)是一種DNA損傷試劑，能夠?qū)ⅧB嘌呤烷化為7-甲基鳥嘌呤，將腺嘌呤烷化為3-甲基腺嘌呤，從而導(dǎo)致堿基錯配和DNA復(fù)制終止。recU基因編碼的霍利迪連結(jié)體解離酶參與DNA損傷修復(fù)同源重組,RecUE36A突變導(dǎo)致基因失活，使DNA同源重組和損傷修復(fù)不能正常進(jìn)行，細(xì)胞不能在含有MMS的平板上生長。分別將野生型菌株W168與重組菌株BS092培養(yǎng)于含有100μg/ml甲磺酸甲酯的LB平板上，結(jié)果顯示野生型菌株W168能夠在添加MMS的培養(yǎng)基上生長,而點(diǎn)突變菌株BS093(W168RecUE36A)不能生長(圖31)。表明重組菌BS093的recU基因已經(jīng)發(fā)生突變，與預(yù)期的突變效果相一致。隨機(jī)挑選156個突變子進(jìn)行突變功能檢測，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示recU基因點(diǎn)突變的突變效率為64.1±4.8％。以上結(jié)果表明利用TCCRAS作為反篩標(biāo)記建立的無痕操作系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了枯草芽胞桿菌染色體基因的點(diǎn)突變。上述所用的引物序列(5’-3’)如下：P1：TCCCCGCGGCAAAAATCAGACCAGACAAAAG(SacII)P6：GGAGGATCCATGGGTAGCATTAACCTGCGTAT(BamHI)P28：CTAGCTAGCCTTTCCCAGCCTTATCCTTTCC(NheI)P29：TAAGTCATCTGCGAGGGTCATTP30：AATGACCCTCGCAGATGACTTAP31：CTAGCTAGCAGAAACCATGACGGCAAATGTA(NheI)實(shí)施例7在枯草芽胞桿菌pps位點(diǎn)插入融合操縱子trp-thrABC參照圖12所示的利用TCCRAS作為反篩標(biāo)記進(jìn)行基因插入的過程原理，構(gòu)建thrABC-trp無痕插入ppsEDCBA敲除的突變株，具體步驟如下：(1)載體構(gòu)建以大腸桿菌W3110染色體DNA為模板，以P32/P41為引物PCR擴(kuò)增大小為5154bp的thrABC操縱子。以谷氨酸棒桿菌ATCC13032染色體DNA為模板，以P34/P35為引物PCR擴(kuò)增大小為7183bp的trp操縱子。以枯草芽胞桿菌W168染色體DNA為模板，以P36/P37為引物PCR擴(kuò)增大小為1133bp的pps操縱子上游同源臂ppsU。以枯草芽胞桿菌W168染色體DNA為模板，P38/P39為引物擴(kuò)增大小為970bp的pps操縱子下游同源臂ppsD。將擴(kuò)增得到的thrABC片段用KpnI和SphI進(jìn)行雙酶切，并與同樣酶切的pWYE486載體相連接，得到重組質(zhì)粒pWYE-thrABC。然后，將pps下游同源臂用SphI酶切，并與同樣酶切處理的pWYE486-thrABC連接，得到重組質(zhì)粒pWYE486-thrABC-ppsD。然后，用NheI和ApaI酶切trp操縱子，并與同樣酶切處理的pWYE486-thrABC-ppsD載體連接，得到含有重組質(zhì)粒pWYE486-trp-thrABC-ppsD。最后，將pps上游同源臂用ApaI酶切，并與同樣酶切處理的pWYE486-trp-thrABC-ppsD連接，得到重組質(zhì)粒pWYE486-ppsU-trp-thrABC-ppsD命名為pWYE549。(2)轉(zhuǎn)化與PCR驗(yàn)證將質(zhì)粒pWYE549轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌BS097(W168ΔppsEDCBA)中，并在含有木糖和MLS(0.5μg/mL紅霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。進(jìn)一步以轉(zhuǎn)化子的菌體作為模板，以P40/P41為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。篩選能夠擴(kuò)增到大約1000bp目的條帶的轉(zhuǎn)化子(圖32)，即為發(fā)生了第一次單交換，含有TCCRAS、抗生素基因、同源臂和trp-thrABC操縱子的重組菌，命名為BS114(W168ΔppsEDCBA::pWYE549)。(3)TCCRAS和抗生素基因的刪除將上述所得的BS114在含有木糖的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)液稀釋10-4-10-8倍后，取200μl涂布在LB平板上過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)所得的單菌落為發(fā)生第二次單交換刪除了TCCRAS和抗生素基因的重組菌。(4)TCCRAS作為反篩標(biāo)記的反篩效率檢測將獲得的重組菌分別在含有與不含有木糖和MLS(0.5μg/mL紅霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。結(jié)果顯示，所有重組菌都能在LB平板生長，其中97％以上的重組菌不能在含有木糖和MLS(0.5μg/mL紅霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上生長(圖33)。表明TCCRAS和抗生素基因已成功從BS114的染色體上刪除，TCCRAS的反篩效率達(dá)到99.4±1.1％。(5)突變株篩選及PCR驗(yàn)證以步驟(3)所得的重組菌的染色體DNA為模板，以P40/P41為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選能夠擴(kuò)增得到約1000bp目的條帶的重組菌，即為整合了trp-thrABC的突變株，命名為BS115(W168ΔppsEDCBA::trp-thrABC)。進(jìn)一步以BS097染色體DNA為模板，P36/P39PCR擴(kuò)增得到約為2.1kb的pps上下游同源臂(圖34，泳道2)；以BS115染色體DNA為模板，外源基因引物P34/WB1206為引物擴(kuò)增得到約為12.3kb的trp-thrABC片段(圖34，泳道3)；以BS115染色體DNA為模板，W168染色體引物P36/P39擴(kuò)增得到約為14.4kb的pps上下游同源臂和trp-thrABC片段(圖34，泳道4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明pps位點(diǎn)成功插入了大小為12.3kb的trp-thrABC操縱子。隨機(jī)挑選78個突變子進(jìn)行PCR檢測，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示trp-thrABC操縱子無痕插入的突變效率為49.0±3.7％。以上結(jié)果說明利用TCCRAS作為反篩標(biāo)記建立的無痕操作系統(tǒng)能成功實(shí)現(xiàn)枯草芽胞桿菌染色體上大片段DNA插入。上述所用的引物序列(5’-3’)如下：P32：CGGGGTACCCTAGCTAGCTGGGGCTTTTAGAGCAACGAGA(KpnI-NheI)P33：ACATGCATGCATGTGTGCACCAAACCCGGCCTGATTGAGATA(SphI)P34:ATTAGGGCCCTCCCACTATGTGATAAAGTCCC(ApaI)P35:CTAGCTAGCTCCAAAACCCTGAGATTTCCTA(NheI)P36：ATTAGGGCCCTCCATAGGCGGCAACCCAATC(ApaI)P37：ATTAGGGCCCAGCGGATTAGCGGACAGAGGC(ApaI)P38：ACATGCATGCTTCCCTCCAGTTCTCATAATAAG(SphI)P39：ACATGCATGCCACCTAGTTCTTCAGATGTGCTG(SphI)P40：GGTTCCCGCTGGCGCAATTGP41：TTGGCGCGGGCCAGTGCGGC實(shí)施例8谷氨酸棒桿菌尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶編碼基因upp的無痕敲除(1)載體構(gòu)建以谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA為模板，以P42/P43為引物擴(kuò)增upp基因的上游同源臂，獲得大小為704bp的擴(kuò)增片段。進(jìn)一步以P44/P45為引物擴(kuò)增upp基因下游同源臂，獲得大小為681bp的擴(kuò)增片段。最后以P42/P45為引物，以上述兩個P CR純化回收片段作為模板進(jìn)行SOE-PCR反應(yīng)，獲得大小為1385bp的融合片段。利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI對純化的融合片段進(jìn)行酶切，并與相同酶處理的pWYE587載體相連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到用于谷氨酸棒桿菌upp基因無痕敲的質(zhì)粒pWYE595(pWYE587-Δupp)(2)轉(zhuǎn)化和PCR驗(yàn)證將質(zhì)粒pWYE595轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC13032的感受態(tài)細(xì)胞，并在含有IPTG和氯霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。進(jìn)一步以轉(zhuǎn)化子的菌體為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。篩選能夠擴(kuò)增到大約1403bp目的條帶的轉(zhuǎn)化子(圖35)，即為發(fā)生了第一次單交換，含有TCCRAS、抗生素基因和同源臂的重組菌，命名為CG708(13032Δupp::pWYE595)。(3)TCCRAS和抗生素基因的刪除將上述所得的CG708在含有IPTG的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)液稀釋10-4-10-8倍后，取200μl涂布在LB平板上過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)所得的單菌落即為發(fā)生第二次單交換刪除了TCCRAS和抗生素基因的重組菌。(4)TCCRAS作為反篩標(biāo)記的反篩效率檢測將上述步驟(3)中獲得的重組菌分別在含有與不含有IPTG和氯霉素的LB平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。結(jié)果顯示，所有菌落都能在LB平板生長，不能在含有IPTG和氯霉素的LB平板上生長(圖36)。表明TCCRAS和抗生素基因已成功從CG708的染色體上刪除，TCCRAS的反篩效率為100％。(5)upp突變株篩選、功能驗(yàn)證與與突變效率檢測以上述步驟(3)所得的重組菌的染色體DNA為模板，以P42/P45為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，野生型菌株能夠擴(kuò)增到約2157bp條帶，而重組菌能擴(kuò)增得到大約1403bp的目的條帶(圖37)，即為無痕敲除upp基因的重組菌，命名為CG709(13032Δupp)。隨機(jī)挑選78個突變子進(jìn)行PCR檢測，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示upp基因無痕敲除的突變效率為100％。upp基因編碼尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，催化尿嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶核苷酸(UMP)，以便細(xì)胞對外源尿嘧啶加以利用；同時，尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶還能轉(zhuǎn)化有毒的嘧啶類似物5-氟尿嘧啶(5-Fu)生成5-氟尿嘧啶核苷酸(5-Fu-UMP)，后者進(jìn)一步代謝生成對胸苷酸合成酶具有強(qiáng)抑制作用的5-氟脫氧尿嘧啶核苷酸(5-Fu-dUMP)，使胸苷合成受阻，從而抑制細(xì)胞生長。分別將重組菌CG709與野生型菌株ATCC13032培養(yǎng)在含有5-氟尿嘧啶(5-Fu)的CGX培養(yǎng)基(含有20g/L(NH4)2SO4、0.5g/LKH2PO4、0.5/LK2HPO4、4 0g/L葡萄糖、0.25g/LMgSO4·7H2O、10mg/LCaCl2、10mg/LMnSO4·H2O、10mg/LFeSO4·7H2O、1mg/LZnSO4·H2O、0.2mg/LCuSO4、0.02mg/LNiCl2和0.2mg/L生物素，pH7.0)中。結(jié)果顯示，重組菌CG709能夠生長于含有5-Fu的培養(yǎng)基中，而野生型菌株ATCC13032不能生長(圖38)。表明重組菌CG709的upp基因被成功敲除，upp基因編碼的嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)失活。以上結(jié)果說明利用TCCRAS作為反篩標(biāo)記建立的無痕操作系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了谷氨酸棒桿菌基因的無痕敲除。上述所用的引物序列(5’-3’)如下：P42：CGCGGATCCGCTTCGGCAATCATCAGTC(BamHI)P43：CCGCTTTTCCGACCGCCCAGAAGAAGACCP44：TCTTCTGGGCGGTCGGAAAAGCGGTGGTP45：CCGGAATTCTGGGTATTTTGCGTCCTC(EcoRI)實(shí)施例9谷氨酸棒桿菌L-賴氨酸外排蛋白編碼基因lysE無痕替換為大腸桿菌賴氨酸脫羧酶編碼基因cadA參照圖13所示的利用RelB-RelE作為反篩標(biāo)記進(jìn)行基因替換的過程原理，構(gòu)建cadA無痕替換lysE的突變株，具體步驟如下：(1)載體構(gòu)建以谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA為模板，以P46/P47為引物擴(kuò)增lysE基因上游同源臂lysEU，獲得大小為748bp的擴(kuò)增片段；同時，以P50/P51為引物擴(kuò)增lysE基因下游同源臂lysED，獲得大小為775bp的擴(kuò)增片段；然后，以大腸桿菌W3110的染色體DNA為模板，以P48/P49為引物，擴(kuò)增大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶cadA基因，獲得大小為2148bp的擴(kuò)增片段。以純化的PCR擴(kuò)增片段lysEU、lysED和cadA為模板，以P46/P51為引物，進(jìn)行SOE-PCR反應(yīng)。進(jìn)一步利用限制性內(nèi)切酶XmaI和SalI對重疊延伸PCR的純化產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，并與相同酶切處理的pWYE587載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌中，獲得用于谷氨酸棒桿菌lysE基因無痕替換為大腸桿菌cadA基因的遺傳操作質(zhì)粒pWYE590(pWYE587-ΔlysE::cadA)(2)轉(zhuǎn)化和PCR驗(yàn)證將質(zhì)粒pWYE590轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC13032的感受態(tài)細(xì)胞，并在含有IPTG和 氯霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。進(jìn)一步以轉(zhuǎn)化子的菌體為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選能夠擴(kuò)增到大約3682bp目的條帶的轉(zhuǎn)化子(圖39)，即為發(fā)生了第一次單交換，含有TCCRAS、抗生素基因和同源臂的重組菌，命名為CG705(ATCC13032ΔlysE::pWYE595)。(3)TCCRAS和抗生素基因的刪除將重組菌CG705在含有IPTG的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)液稀釋10-4-10-8倍后，取200μl涂布在LB平板上過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)所得的單菌落即為發(fā)生第二次單交換刪除了TCCRAS和抗生素基因的重組菌。(4)TCCRAS作為反篩標(biāo)記的反篩效率檢測將上述步驟(3)獲得的重組菌分別在含有與不含有IPTG和氯霉素的LB平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。結(jié)果顯示，所有菌落都能在LB平板生長，不能在含有IPTG和氯霉素的LB平板上生長(圖40)。表明TCCRAS和抗生素基因已成功從CG705的染色體上刪除，TCCRAS的反篩效率為100％。(5)lysE無痕替換突變株篩選、功能驗(yàn)證與突變效率檢測以上述步驟(3)所得到的重組菌的染色體DNA為模板，以P34/P47為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，野生型菌株13032能夠擴(kuò)增得到大約2224bp的目的條帶，重組菌株能擴(kuò)增得到大約3682bp的目的條帶(圖41)。表明重組菌的lysE基因無痕替換為cadA基因，將該重組菌命名為CG706(ATCC13032ΔlysE::cadA)。隨機(jī)挑選78個突變子進(jìn)行PCR檢測，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示lysE無痕替換為cadA的突變效率為66.7±2.2％。由于lysE基因編碼蘇氨酸外排蛋白，能夠增加胞內(nèi)賴氨酸積累量。而來源于大腸桿菌的cadA基因編碼賴氨酸脫羧酶，催化賴氨酸脫羧反應(yīng)，生成戊二胺。為驗(yàn)證lysE基因無痕替換為cadA基因的作用效果，進(jìn)一步將重組菌CG706培養(yǎng)在含有16g/L蛋白胨和10g/L酵母浸粉的CGX培養(yǎng)基(配方見實(shí)施例8，步驟5)中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測發(fā)酵過程中戊二胺的積累情況(圖42)。結(jié)果顯示，重組菌CG706發(fā)酵16h后開始積累戊二胺，30h時戊二胺的積累量達(dá)到最高，為4.6mM，而對照菌株不能積累戊二胺。表明重組菌CG706的lysE基因已成功無痕替換為大腸桿菌cadA基因，且lysE基因的敲除和大腸桿菌cadA基因的插入能夠?qū)崿F(xiàn)谷氨酸棒桿生物合成戊二胺。以上結(jié)果說明利用TCCRAS作為反篩標(biāo)記建立的無痕操作系統(tǒng)能夠成功實(shí)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌基因的無痕敲除、插入或替換。上述所用的引物序列(5’-3’)如下：P46：TCCCCCCGGGAATTGCCTCACCAAAACCTTC(XmaI)P47：CAATAACGTTCATGATCACCATCGTGACCTATGGAAGP48：CGATGGTGATCATGAACGTTATTGCAATATTGAATCP49：CCCGCGAAAATTATTTTTTGCTTTCTTCTTTCAATACCP50：GAAAGCAAAAAATAATTTTCGCGGGTTTTGGAATCP51：ACGCGTCGACGGATATGTGGCCTGGACCTTATG(SalI)實(shí)施例10利用MazF-MazE構(gòu)建的TCCRAS系統(tǒng)無痕敲除枯草芽胞桿菌淀粉酶基因(1)載體構(gòu)建以大腸桿菌W3110的染色體DNA為模板，以P52/P53為引物擴(kuò)增mazF基因(SEQIDNO：9)，獲得大小為336bp的擴(kuò)增片段；同時，以P54/P55為引物擴(kuò)增mazE基因(SEQIDNO：10)，獲得大小為249bp的擴(kuò)增片段；然后，以PliaG啟動子(實(shí)施例1，片段一)、mazF基因和mazE基因?yàn)槟０?，以P1/P55為引物，SOE-PCR擴(kuò)增PliaG-mazF-mazE融合片段，獲得大小為725bp的擴(kuò)增片段；以pWYE469為模板，P56/P57為引物，擴(kuò)增amyE基因同源臂，獲得大小為1282bp的擴(kuò)增片段。進(jìn)一步利用限制性內(nèi)切酶SalII對SOE-PCR的純化產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并與相同酶切并去磷酸化處理的pAX01載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌中，獲得含有MazF-MazE共表達(dá)載體pAX01-mazEF。然后用ClaI酶切pAX01-mazEF質(zhì)粒，回收大小為4047bp，含有MazF-MazE表達(dá)的TCCRAS元件；用ClaI酶切pWYE486(實(shí)施例3，圖8)，回收大小為2736bp的載體片段，并用堿性磷酸酶進(jìn)行去磷酸化處理；將上述兩個片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到含有MazF-MazE表達(dá)的TCCRAS元件的無痕敲除質(zhì)粒，命名為pWYE848(圖43，SEQIDNO：11)；最后將amyE基因同源臂用NheI進(jìn)行酶切，與同樣酶切并去磷酸化處理的pWYE848連接，得到含有MazF-MazE表達(dá)元件的淀粉酶基因無痕敲除質(zhì)粒，命名為pWYE848-ΔamyE。(2)轉(zhuǎn)化和PCR驗(yàn)證將質(zhì)粒pWYE848-ΔamyE轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌W168感受態(tài)細(xì)胞，并在含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL紅霉素和12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。繼續(xù)以篩選得到的用轉(zhuǎn)化子的菌體作為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。篩選能夠擴(kuò)增得到大約1300bp目的條帶的轉(zhuǎn)化子，即獲得了通過為發(fā)生了第一次單交換，整合含有MazF-MazE表達(dá)的TCCRAS元件、抗生素基因和同源臂的宿主重組菌，命名為BS203(W168ΔamyE::pW YE848-ΔamyE)。(3)MazF-MazE表達(dá)的TCCRAS元件和抗生素基因的刪除將上述所得的轉(zhuǎn)化子在含有1％木糖的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；培養(yǎng)液稀釋10-4-10-8倍后，取200μl涂布在LB平板上過夜培養(yǎng)；培養(yǎng)所得的單菌落為發(fā)生第二次單交換刪除了MazF-MazE表達(dá)的TCCRAS元件和抗生素基因的重組菌。(4)MazF-MazE表達(dá)的TCCRAS元件作為反篩標(biāo)記的反篩效率檢測將獲得的重組菌同時在含有與不含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL紅霉素和12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。結(jié)果顯示，所有重組菌都能在LB平板生長，不能在含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL紅霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上生長(圖44)。表明MazF-MazE表達(dá)的TCCRAS元件和抗生素基因已成功從BS203的染色體上刪除，MazF-MazE表達(dá)的TCCRAS元件的反篩效率為100％。(5)amyE突變株功能驗(yàn)證與突變效率檢測分別將淀粉酶敲除菌與野生型菌株W168接種于含有1％可溶性淀粉的LB平板上進(jìn)行過夜培養(yǎng)，第二天加碘液顯色。結(jié)果顯示，野生型菌株W168的菌體周圍含有白色的淀粉水解圈，而重組菌周圍沒有淀粉水解圈。通過功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)說明重組菌上的淀粉酶已經(jīng)失活，不能水解淀粉，從而不能形成淀粉水解圈。隨機(jī)挑選240個突變子進(jìn)行淀粉酶功能檢測，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示amyE基因無痕敲除的突變效率為89.6±9.0％。以上結(jié)果表明利用MazF-MazE表達(dá)的TCCRAS元件作為反篩標(biāo)記建立的無痕操作系統(tǒng)能夠有效地實(shí)現(xiàn)枯草芽胞桿菌染色體基因的無痕敲除。上述所用的引物序列(5’-3’)如下：P1：TCCCCGCGGCAAAAATCAGACCAGACAAAAG(SacII)P52：AAAGGTGGTGAATGCTCTTATGGTAAGCCGATACGTACCCP53:AGTCTGGTAACTACCCAATCAGTACGTTAATP54:GATTGGGTAGTTACCAGACTTCCTTATCTTTCP55:TCCCCGCGGATGATCCACAGTAGCGTAAAGC(SacII)P56:CTAGCTAGCCGGCATTATGTTTGAATTTCC(NheI)P57:CTAGCTAGCCAATTTGGTCCAGCTCCTCT(NheI)當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3