本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一個(gè)水稻基因(OsUEP3)的抗病調(diào)控功能分析及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、植物基因克隆技術(shù)

植物基因克隆方法有很多種，隨著基因組序列測定完成的植物物種的增多，基于數(shù)據(jù)庫序列的植物基因克隆方法得到越來越廣泛的應(yīng)用。該方法操作步驟主要包括基于保守序列的引物設(shè)計(jì)，目的植物組織RNA提取，反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，PCR產(chǎn)物與載體的連接，連接產(chǎn)物的細(xì)菌轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒提取，酶切檢驗(yàn)，測序分析等。

2、植物基因表達(dá)控制和基因功能分析技術(shù)

植物基因的功能通過基因表達(dá)和蛋白積累來執(zhí)行。因此，基因功能通常通過比較分析基因的超常規(guī)表達(dá)與正常表達(dá)情況下的表型(Phenotype)或功能發(fā)揮情況來判斷和明確?；虻某Ｒ?guī)表達(dá)包括高于正常水平的表達(dá)和低于正常水平的表達(dá)兩大類。高于正常水平的表達(dá)主要為超表達(dá)/過表達(dá)(Over-expression)，主要通過連接一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)的方式來達(dá)到。低于正常水平的表達(dá)主要通過RNA干擾(RNA interfering,超表達(dá))、基因敲除(Knock-out)等方式來達(dá)到。超表達(dá)通過構(gòu)建和轉(zhuǎn)化一個(gè)含有同一序列片段相反方向插入一個(gè)內(nèi)含子或其它不表達(dá)的序列形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)，結(jié)果是目的基因表達(dá)的降低?；蚯贸?Knock-out)則通過在植物基因組中的目的基因中插入一個(gè)長的非植物序列或切除目的基因等方式來達(dá)到，結(jié)果是目的基因表達(dá)的完全或近乎完全的抑制。構(gòu)建基因超表達(dá)植株和/或超表達(dá)植株、基因敲除突變體，比較這些植株的表型和性狀與野生型/正常植株的差異，就能明確目的基因?qū)υ撔誀畹恼{(diào)節(jié)功能。

3、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)

用于將外源基因?qū)肽康闹参?，從而獲取攜帶外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。包括基因槍法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法包括將目的基因克隆入植物表達(dá)載體，表達(dá)載體對(duì)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化，攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌對(duì)目的植物組織的感染，轉(zhuǎn)基因植株的再生以及植株中基因轉(zhuǎn)化和表達(dá)情況的檢測分析等步驟。

4、植物抗病性檢測分析技術(shù)

植物病原物包括真菌、卵菌、細(xì)菌、菌原體、病毒和線蟲等多種類型。不同類型病原物的接種方法各不相同。對(duì)于真菌，能產(chǎn)生分生孢子的，通常以分生孢子懸浮液噴霧接種植物。不產(chǎn)生分生孢子的，則以菌絲塊等接種植物。對(duì)于卵菌，一般先培養(yǎng)產(chǎn)生大量孢子囊，而后低溫培養(yǎng)使之釋放游動(dòng)孢子，最后以游動(dòng)孢子懸浮液接種植物。對(duì)于細(xì)菌，常以菌體懸浮液剪葉、針刺、注射、噴霧等法接種植物。對(duì)于病毒，常以提純的病毒粒子或人工體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物摩擦、注射、或通過昆蟲等傳播媒介接種植物。對(duì)于菌原體，常通過傳播介體接種或者嫁接接種。對(duì)于線蟲，常以一定數(shù)量的二齡幼蟲接觸植物根部莖基部或根圍土壤中接種植物。多數(shù)情況下，接種后需要保持較高的相對(duì)濕度，合適的溫度和光照條件。接種后按不同時(shí)間點(diǎn)連續(xù)觀察病害發(fā)生癥狀，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和發(fā)病嚴(yán)重度，計(jì)算病情指數(shù)，采用RT-PCR檢測病原物生物量。通過與感病對(duì)照植物發(fā)病情況的對(duì)比分析，明確目標(biāo)植物的抗病性。

5、植物抗病育種技術(shù)

主要可以分為傳統(tǒng)抗病育種和通過基因工程抗病育種兩大類。傳統(tǒng)抗病育種因?yàn)橛刑烊贿z傳隔離現(xiàn)象使抗病資源可用范圍受到顯著限制，只能應(yīng)用遺傳關(guān)系較近的抗病資源，而且需要多次雜交和回交等，因此選育周期長，且需要大量人力物力。而基因工程育種方法是通過將外源的抗病調(diào)控基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法等技術(shù)導(dǎo)入植物，使其獲得原來不具有的抗病性。因此，基因工程育種方法打破了天然遺傳隔離現(xiàn)象的限制，拓寬了抗病資源可用范圍，而且具有操作相對(duì)簡單方便、培育周期短、無需大量人工物力的特點(diǎn)。另外，可通過導(dǎo)入一個(gè)廣譜抗病調(diào)控基因，或者多個(gè)不同抗病譜的基因，創(chuàng)制具有廣譜抗病的品種。因此具有特別適宜培育廣譜、持久抗病品種等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一個(gè)水稻(Oryza sativa)基因OsUEP3，對(duì)水稻細(xì)菌性病害抗性具有調(diào)控作用。本發(fā)明克隆的水稻基因OsUEP3的核苷酸序列如SEQ ID：1所示，該基因的開放閱讀框(ORF)長390bp，編碼一種泛素延伸蛋白(Ubiquitin extension protein)，由129個(gè)氨基酸組成，其序列如SEQ ID：2所示。該蛋白N端為76個(gè)氨基酸的泛素分子，C端則是53個(gè)氨基酸的60S核糖體蛋白L40e。本發(fā)明克隆的序列與水稻品種日本晴的基因組注釋的LOC_Os03g13170.1有很高的相似性，僅有2個(gè)堿基的區(qū)別：LOC_Os03g13170.1序列的A6替換為G；G15替換為C。這些點(diǎn)突變沒有導(dǎo)致氨基酸的變化。在本發(fā)明之前，該基因功能沒有任何公開報(bào)告。本發(fā)明首次通過構(gòu)建該基因的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻及其抗病分析，闡明了該基因?qū)λ炯?xì)菌性病害抗性的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株顯著降低了對(duì)水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)菌株P(guān)XO99和PXO112的抗性，從而揭示了該基因?qū)λ景兹~枯病抗性的正調(diào)控功能(具體見實(shí)施例中的說明)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的水稻OsUEP3基因通過創(chuàng)制基因超表達(dá)水稻來獲取抗細(xì)菌性病害水稻材料的應(yīng)用，是在通過創(chuàng)制超表達(dá)OsUEP3的轉(zhuǎn)基因水稻純合系來獲得針對(duì)水稻白葉枯病菌不同菌株的廣譜抗病材料中的應(yīng)用，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：

(1)OsUEP3基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和獲取

將OsUEP3基因ORF克隆入一個(gè)植物表達(dá)載體，使其受強(qiáng)啟動(dòng)子的驅(qū)使表達(dá)。

(2)轉(zhuǎn)化OsUEP3基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌的獲取

將構(gòu)建好的OsUEP3基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)通過電擊等方法轉(zhuǎn)化對(duì)水稻具有強(qiáng)侵染能力的農(nóng)桿菌菌株。

(3)超表達(dá)OsUEP3的轉(zhuǎn)基因水稻創(chuàng)制和獲取

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將OsUEP3基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入水稻，獲取轉(zhuǎn)OsUEP3基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)的水稻。

(4)超表達(dá)OsUEP3的轉(zhuǎn)基因水稻純合系的獲取

分別以抗生素抗性和OsUEP3基因表達(dá)為檢測指標(biāo)，檢測轉(zhuǎn)基因植株后代的性狀分離情況，獲取后代性狀不再分離的、并能穩(wěn)定遺傳的超表達(dá)OsUEP3的轉(zhuǎn)基因水稻純合系。

(5)抗細(xì)菌病害的超表達(dá)OsUEP3的轉(zhuǎn)基因水稻純合系篩選鑒定和獲取

以超表達(dá)OsUEP3的轉(zhuǎn)基因水稻純合系為材料，檢測分析對(duì)各類水稻細(xì)菌病害的抗性，獲取抗細(xì)菌病害的轉(zhuǎn)OsUEP3基因水稻。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明提供的OsUEP3基因是優(yōu)質(zhì)抗細(xì)菌病害調(diào)控基因資源，利用該基因獲取的抗病材料具有抗性強(qiáng)烈、抗病譜廣等優(yōu)點(diǎn)。水稻白葉枯病菌(Xoo)有明顯的致病性分化，可以分為很多個(gè)小種。水稻對(duì)不同Xoo小種的抗性機(jī)制有顯著差異，因此，獲取同時(shí)兼抗不同Xoo小種的水稻基因資源對(duì)于水稻白葉枯病的防控具有重要價(jià)值。本發(fā)明提供的OsUEP3基因此前功能完全未知，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)該基因兼具對(duì)Xoo菌株P(guān)XO99和PXO112的正調(diào)控作用，可通過構(gòu)建OsUEP3-超表達(dá)水稻創(chuàng)制和獲取兼具對(duì)Xoo不同菌株廣譜抗性的新材料。因此，OsUEP3基因是一種適用于創(chuàng)制和選育廣譜抗白葉枯病和其它細(xì)菌病害的水稻新材料和新品種的全新基因資源。(2)獲取抗病材料周期短。獲取抗病植物材料和品種的方法主要有常規(guī)的傳統(tǒng)育種方法和利用抗病調(diào)控基因的基因工程育種方法。傳統(tǒng)育種方法具有可用抗病資源范圍受天然遺傳隔離限制，選育周期長，需要大量人工物力等缺點(diǎn)。而基因工程育種方法則具有可用抗病資源范圍廣、操作相對(duì)簡單方便、培育周期短、無需大量人工物力、特別適宜培育廣譜、持久、高抗病性品種等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明利用抗病調(diào)控基因OsUEP3，采用基因工程方法，創(chuàng)制培育強(qiáng)烈抗細(xì)菌病害的水稻材料，具有周期短，選育快速等特點(diǎn)。

附圖說明

圖1為OsUEP3超表達(dá)水稻純合系及其親本水稻葉片接種水稻白葉枯病菌不同菌株后的癥狀和菌量檢測分析結(jié)果比較圖。OsUEP3超表達(dá)水稻純合系169-6及其親本水稻葉片采用剪葉法接種水稻白葉枯病菌(Xoo)菌株P(guān)XO99和PXO112。上：接種Xoo菌株14天后的癥狀；下：接種后葉片內(nèi)的Xoo菌量檢測結(jié)果。結(jié)果表明，與親本相比，OsUEP3超表達(dá)水稻純合系169-6形成的枯死病斑明顯更短，菌量也顯著降低。表明OsUEP3基因的超表達(dá)顯著增強(qiáng)了對(duì)水稻白葉枯病不同菌株的抗性，揭示OsUEP3對(duì)水稻白葉枯病抗性起廣譜正調(diào)控作用。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1

本發(fā)明克隆了一個(gè)水稻基因OsUEP3，首次通過構(gòu)建超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻，闡明了該基因的廣譜抗白葉枯病不同菌株的調(diào)控功能。同時(shí)，本發(fā)明構(gòu)建的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻具有增強(qiáng)的抗病性，因此，本發(fā)明提供了一套通過構(gòu)建該基因的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻、采用基因工程技術(shù)創(chuàng)制和獲取廣譜抗水稻細(xì)菌病害水稻新材料的技術(shù)體系。主要步驟包括：

1)水稻OsUEP3基因的克隆和保存

本發(fā)明提供的水稻OsUEP3基因通過以下步驟克隆獲得。先根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫中OsUEP3序列設(shè)計(jì)了引物OsUEP3-F3(5’-caggcgcgcc atg cag atc ttc gtc aag acc-3’，斜體部分為Asc I酶切位點(diǎn))(序列如SEQ ID：3所示)，以及OsUEP3-R2(5’-caggtacc gtt ctt gat ctt ctt ctt ggg-3’，斜體部分為Kpn I酶切位點(diǎn))(序列如SEQ ID：4所示)。采用TRIZOL試劑提取水稻葉片總RNA，采用RT-PCR方法擴(kuò)增獲取OsUEP3cDNA，通過1％瓊脂糖凝膠電泳后割膠純化回收PCR產(chǎn)物，連接pMD19-mT載體，熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在LB培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，采用AscI/KpnI酶切的方法和以O(shè)sUEP3-F3/OsUEP3-R2為引物對(duì)的PCR方法分別檢驗(yàn)所提取的質(zhì)粒是否包含OsUEP3基因，最后送公司測序驗(yàn)證，從而成功克隆和獲取OsUEP3基因cDNA全長序列。

克隆獲得的OsUEP3核苷酸序列如SEQ ID：1所示，該基因的開放閱讀框(ORF)長390bp，編碼一種泛素延伸蛋白(Ubiquitin extension protein)，由129個(gè)氨基酸組成，其序列如SEQ ID：2所示。該蛋白N端為76個(gè)氨基酸的泛素分子，C端則是53個(gè)氨基酸的60S核糖體蛋白L40e。本發(fā)明克隆的序列與水稻品種日本晴的基因組注釋的LOC_Os03g13170.1有很高的相似性，僅有2個(gè)堿基的區(qū)別：LOC_Os03g13170.1序列的A6替換為G；G15替換為C。這些點(diǎn)突變沒有導(dǎo)致氨基酸的變化。在本發(fā)明之前，該基因功能沒有任何公開報(bào)告。

轉(zhuǎn)化了攜帶有OsUEP3基因序列的載體的大腸桿菌，保存于－80℃冰箱。因此，可隨時(shí)通過活化菌株，提取質(zhì)粒，通過PCR擴(kuò)增和酶切，將OsUEP3基因亞克隆至目的載體中，用于轉(zhuǎn)基因等研究。

2)OsUEP3基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和獲取

對(duì)上述1)中獲取的pMD19-OsUEP3質(zhì)粒以及植物超表達(dá)載體pCZD分別先進(jìn)行Kpn I酶切、隨后進(jìn)行Asc I酶切(因?yàn)閮煞N酶的buffer差異大，因此不能同時(shí)進(jìn)行雙酶切)，將酶切后的目的基因與同樣酶切后的pCZD載體進(jìn)行連接、連接產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化、氨芐抗生素培養(yǎng)基平板篩選、酶切和PCR鑒定等步驟獲取OsUEP3基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsUEP3。超表達(dá)載體pCZD以玉米Ubq啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因的表達(dá)，同時(shí)攜帶HA標(biāo)簽，便于分子鑒定和基因功能研究。

3)轉(zhuǎn)化OsUEP3基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsUEP3的農(nóng)桿菌的獲取

將OsUEP3基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsUEP3通過電擊等方法轉(zhuǎn)化對(duì)水稻具有強(qiáng)侵染力的農(nóng)桿菌菌株，如EHAl05，在含鏈霉素和卡那霉素的YEP培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，再通過Asc I+Kpn I酶切和PCR鑒定，獲取攜帶OsUEP3基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsUEP3的農(nóng)桿菌。用于下一步水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。

4)轉(zhuǎn)OsUEP3基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsUEP3水稻的創(chuàng)制和獲取

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將OsUEP3基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsUEP3導(dǎo)入水稻。分為水稻愈傷組織的誘導(dǎo)、攜帶pANDA-OsUEP3的農(nóng)桿菌感染水稻愈傷組織、潮霉素抗性植株的再生和鑒定等幾大步驟，最后獲取再生的轉(zhuǎn)pCZD-OsUEP3的水稻T₀代。具體操作步驟如下：

(i)水稻愈傷組織的誘導(dǎo)

種胚表面的消毒和清洗：取成熟完好的日本晴水稻種子，剝?nèi)シN皮，留下完整的種胚。用70％乙醇溶液浸泡種胚1min，倒掉乙醇后用50％次氯酸鈉溶液浸泡種胚，放在搖床上28℃，180rpm消毒40min。倒掉次氯酸鈉溶液，用滅菌的ddH₂O洗滌種胚至少10次，直至液體干凈透明為止。用滅菌的濾紙風(fēng)干種胚后，用鑷子小心把種胚放入NB1固體培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿約30粒種子。之后用保鮮膜密封，置于培養(yǎng)箱中28℃暗培養(yǎng)。

愈傷組織的誘導(dǎo)：將種胚放在NB1上培養(yǎng)15天后，將分化出的愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮的NB2培養(yǎng)基上，在28℃黑暗條件下再培養(yǎng)10天。將健康亮黃的愈傷組織轉(zhuǎn)移到NB3上培養(yǎng)大約10天。注意，為了提供充足營養(yǎng)，一個(gè)NB2板轉(zhuǎn)成2個(gè)NB3板進(jìn)行培養(yǎng)。

愈傷組織的繼代培養(yǎng)：將健康的愈傷組織從NB3換至NB4上，在28℃黑暗條件下培養(yǎng)9天，此時(shí)的愈傷組織最適合農(nóng)桿菌感染。

(ii)水稻愈傷組織的農(nóng)桿菌感染

農(nóng)桿菌的培養(yǎng)：將攜帶有OsUEP3基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pANDA-OsUEP3的根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株從-80℃中取出，在含鏈霉素和卡那霉素的LB平板上劃線，置于28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)(約2d)，長出菌落后挑取單菌落，分別接種于含相應(yīng)抗生素的50mL YEP培養(yǎng)液中，27℃恒溫?fù)u床(180rpm)培養(yǎng)約48h至OD₆₀₀為0.5-0.8，轉(zhuǎn)入無菌離心管中，室溫條件下5000×g離心10min，去掉上清液，菌體用25mL AAM-AS培養(yǎng)液重新懸浮清洗后，再在相同的條件下離心一次，最后用約50mL AAM-AS培養(yǎng)液重新懸浮菌體到OD₆₀₀為0.05-0.1(約10⁹個(gè)細(xì)胞/mL)，置于冰上即可用于水稻的轉(zhuǎn)化。

農(nóng)桿菌侵染：選擇生長健康帶亮黃色的愈傷組織，用勺子小心地刮進(jìn)無菌的的小培養(yǎng)皿中，然后將重懸好的農(nóng)桿菌液倒入培養(yǎng)皿中，盡量使菌液浸沒所有愈傷組織，保持浸泡約30min，期間不時(shí)地輕輕搖晃。之后用滅菌的膠頭滴管將菌液盡可能多地吸出。

共培養(yǎng)：將侵染過的愈傷組織放入NB-AS培養(yǎng)基上22℃黑暗培養(yǎng)3d。

帶菌愈傷組織在抗性篩選前的清洗：共培養(yǎng)3d后，將帶菌的愈傷組織集中放到500mL無菌瓶中，用滅菌的蒸餾水清洗愈傷組織8～10次直到液體透明，然后加入200mL含Amp(200mg/mL)和Cef(300mg/mL)的ddH₂O，將其放到搖床，180rpm、27℃恒溫下?lián)u動(dòng)30min，然后用滅菌的膠頭滴管將洗出液吸出，最后將清洗干凈的愈傷轉(zhuǎn)入NB-CHA培養(yǎng)基，在28℃黑暗下培養(yǎng)14d后用于抗性篩選。

(iii)潮霉素抗性植株的再生

抗性篩選培養(yǎng)：將愈傷組織分系轉(zhuǎn)入含抗生素(Cef，300mg/mL；Hyg，50mg/mL)的NB-CH1篩選培養(yǎng)基上，在28℃黑暗下培養(yǎng)，進(jìn)行抗生素抗性篩選；

繼代培養(yǎng)：將NB-CH1上經(jīng)抗性篩選再生的潮霉素抗性愈傷組織，以系的方式轉(zhuǎn)入含抗生素(Cef，300mg/mL；Hyg，50mg/mL)的NB-CH2篩選培養(yǎng)基上，在28℃黑暗下繼代培養(yǎng)一次，培養(yǎng)時(shí)間大約1周。

抗性愈傷組織的預(yù)分化培養(yǎng)：將具有抗潮霉素的愈傷組織以系的方式轉(zhuǎn)入含抗生素(Hyg，50mg/mL)預(yù)分化培養(yǎng)基Pre-H上，在28℃黑暗下培養(yǎng)15d。

抗性愈傷組織的再分化培養(yǎng)：將預(yù)分化充分的抗性愈傷以系的方式轉(zhuǎn)入含抗生素(Hyg，50mg/mL)再分化培養(yǎng)基R-50上，在27℃光條件下培養(yǎng)大約3周。

生根培養(yǎng)：待潮霉素抗性愈傷組織分化出小根和綠色小芽，且小根長到1cm以上進(jìn)行生根培養(yǎng)。用鑷子將變綠的抗性芽從分化培養(yǎng)基上挑出，轉(zhuǎn)入到含有抗生素(Hyg，50mg/mL)的1/2MS生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。

土壤種植：等潮霉素抗性苗長到根系完全后，將T₀代無菌小苗在27℃下開蓋培養(yǎng)鍛煉2d，然后移栽到水田取回的熟土中，置于溫室中進(jìn)行常規(guī)管理，最后收獲得到T₀種子。

5)轉(zhuǎn)OsUEP3基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsUEP3的水稻純合系的篩選鑒定和獲取

分別以潮霉素抗性和OsUEP3基因表達(dá)為檢測指標(biāo)，檢測轉(zhuǎn)基因植株后代的性狀分離情況。潮霉素抗性篩選在含潮霉素的平板上針對(duì)水稻種子開展進(jìn)行，觀察能否在潮霉素抗性平板上正常生長成健康小苗?；虮磉_(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法進(jìn)行檢測。獲取后代性狀不再分離的、并能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)OsUEP3基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsUEP3的水稻純合系。這些水稻純合系在潮霉素抗性平板上全部能正常生長成健康小苗、且OsUEP3基因表達(dá)水平顯著高于轉(zhuǎn)空載體的對(duì)照。

6)OsUEP3基因超表達(dá)水稻純合系的抗病性檢測分析

以5)中獲取的OsUEP3基因超表達(dá)水稻純合系為材料，檢測分析其對(duì)水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)菌株P(guān)XO99和PXO112的抗性。采用剪葉法接種。先搖菌制成濃度為OD₆₀₀＝1.0的Xoo細(xì)菌懸浮液，再以無菌剪刀蘸取菌液，在離葉尖3cm處剪葉，置于大塑料筐中覆膜保濕48h。

接種結(jié)果顯示，在剪葉接種Xoo菌株P(guān)XO99后14天，親本對(duì)照水稻葉片形成長度達(dá)16.4cm的枯死病斑，而OsUEP3基因超表達(dá)水稻純合系169-6葉片則只形成平均長為9.3cm的枯死病斑，長度僅為對(duì)照的56.7％(圖1左上)。菌量檢測分析結(jié)果顯示，親本對(duì)照水稻葉片的菌量達(dá)1.25×10⁹cfu/葉，而OsUEP3超表達(dá)水稻純合系169-6葉片的菌量平均僅有6.50×10⁸cfu/葉，僅為親本對(duì)照的52.0％(圖1左下)。剪葉接種Xoo另一個(gè)菌株P(guān)XO112后14天，親本對(duì)照水稻葉片形成長度達(dá)15.4cm的枯死病斑，而OsUEP3基因超表達(dá)水稻純合系169-6葉片則只形成平均長為8.4cm的枯死病斑，長度僅為對(duì)照的54.5％(圖1右上)。菌量檢測分析結(jié)果顯示，親本對(duì)照水稻葉片的菌量達(dá)3.10×10⁸cfu/葉，而OsUEP3超表達(dá)水稻純合系169-6葉片的菌量平均僅有9.96×10⁷cfu/葉，僅為親本對(duì)照的32.1％(圖1右下)。

這些結(jié)果表明，OsUEP3超表達(dá)水稻純合系169-6對(duì)兩個(gè)Xoo菌株P(guān)XO99和PXO112的抗性均顯著高于親本對(duì)照。OsUEP3基因的超表達(dá)導(dǎo)致水稻對(duì)這些菌株抗性的顯著增高，因此，OsUEP3對(duì)水稻白葉枯病菌不同菌株均起正調(diào)控作用?？梢酝ㄟ^構(gòu)建OsUEP3-超表達(dá)水稻純合系來創(chuàng)建獲取廣譜抗水稻白葉枯病菌不同菌株的水稻新材料和新品種。

7)廣譜抗細(xì)菌病害的超表達(dá)OsUEP3基因水稻純合系的篩選鑒定和獲取

以超表達(dá)OsUEP3基因的水稻純合系為材料，檢測分析對(duì)各類細(xì)菌病原物所致病害的抗性，比如水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)不同菌株、水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)的其它菌株等。通過接種分析和抗病評(píng)價(jià)，篩選和獲取對(duì)Xoc和Xoo多個(gè)菌株均表現(xiàn)出抗性的、廣譜抗細(xì)菌病害的OsUEP3基因超表達(dá)水稻。

<110> 浙江大學(xué)

<120> 水稻基因OsUEP3及抗病調(diào)控功能的應(yīng)用

<160> 4

<210> 1

<211> 390

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> CDS

<222> (1)…(390)

<400> 1

atgcagatct tcgtcaagac cctgactggg aagaccatca ccctcgaggt ggagagcagc 60

gacaccatcg acaatgtcaa ggctaagatc caggacaagg agggaatccc gccggaccag 120

cagcggctga tcttcgccgg gaagcagctg gaggacggac gcaccctggc tgactacaac 180

atccagaagg agtccaccct ccacctcgtc ctcaggctcc gtggcggtat catcgagccg 240

tcgcttcagg cgcttgcccg caagtacaac caggacaaga tgatctgccg caaatgctat 300

gcgcgcctgc accctagggc tgtcaactgc cgcaagaaga agtgtggtca cagcaaccag 360

ctgaggccca agaagaagat caagaactag 390

<210> 2

<211> 129

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 2

Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu

1 5 10 15

Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp

20 25 30

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys

35 40 45

Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ala Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu

50 55 60

Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Ile Ile Glu Pro

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Leu Ala Arg Lys Tyr Asn Gln Asp Lys Met Ile Cys

85 90 95

Arg Lys Cys Tyr Ala Arg Leu His Pro Arg Ala Val Asn Cys Arg Lys

100 105 110

Lys Lys Cys Gly His Ser Asn Gln Leu Arg Pro Lys Lys Lys Ile Lys

115 120 125

Asn

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫提供的水稻基因序列設(shè)計(jì)和人工合成，用作引物

<400> 3

caggcgcgcc atg cag atc ttc gtc aag acc

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫提供的水稻基因序列設(shè)計(jì)和人工合成，用作引物

<400> 4

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