專利名稱：一組控制水稻抽穗期的dth2基因及其單倍型和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一組控制水稻抽穗期的DTH2基因及其單倍型和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抽穗期是一個(gè)重要的農(nóng)藝性狀，并且可能在作物的馴化過程中被選擇(Izawa T. Journal of Experimental Botany 58 :3091-3097 (2007)) 栽培稻目前分布在世界范圍內(nèi)的從北緯53°到南緯40°之間的廣大地區(qū)(Chang T. T. Euphytica 25， 425-441 (1976)) ο然而,亞洲栽培稻的祖先普通野生稻，主要分布在南亞,東南亞和澳大利亞北部，其分布的最北限位于北緯28°的東鄉(xiāng)野生稻。水稻馴化的一個(gè)重要目的是產(chǎn)生適應(yīng)各地區(qū)種植的水稻品種，從而擴(kuò)大栽培面積。影響栽培稻向北擴(kuò)張的主要限制因素就是抽穗期。在高緯度地區(qū)(例如亞洲東北部)，早抽穗和對(duì)光周期不敏感的特性，保證了水稻能在寒冷天氣來臨之前種子發(fā)育成熟。因此，為滿足日益增長的人口對(duì)糧食的需求，尋找能擴(kuò)大栽培稻種植面積的關(guān)鍵基因，并克隆相應(yīng)基因，闡明其遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)理，對(duì)培育廣適性水稻品種具有重要的理論和實(shí)踐意義。水稻品種的抽穗期主要由其感光性、感溫性和基本營養(yǎng)生長性決定(Chang T T, Li C C，Vergara B S. (1969) Euphytica, 18 :79 91 ；Tsai K H. (1985) Rice Genet Newslett, 2 :77 78 ;Tsai K H. (1986)In Rice Genetics. International Rice Research Institute, 339 349)。水稻品種感光性、感溫性和基本營養(yǎng)生長性組合的多樣性，使得抽穗期的遺傳表現(xiàn)異常復(fù)雜，經(jīng)典遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)都證明抽穗期是由少數(shù)質(zhì)量性狀基因和多個(gè)數(shù)量性狀基因(QTL Quantitative Trait Locus)控制的。到目前為止，已經(jīng)有20個(gè)水稻抽穗期基因被克隆，其中有6個(gè)是通過精細(xì)定位圖位克隆的途徑克隆的。如Hdl，Hd6， Hd3a，Ehdl，Ghd7和DTH8(Yano，M. et al. (2000) Plant Cell 12，2473-2483 ;Takahashi，Y.， Shomura,A. ,Sasaki,T. & Yano’M. (2001)Proc Natl Acad Sci USA 98,7922-7927 ；Kojima, S，，Takahashi, Y. & Kobayashi, Y. (2002)Plant Cell Physiol 43，1096-1105 ;Doi，K. et al. (2004)Genes. Dev. 18,926-936 ；Xue, ff. Y. et al. (2007)Nat. Genet. 40，761-767 ；ffei, X.J.et al. (2010)Plant. Physiol. 153,1747-1758)。對(duì)于抽穗期基因來說，由于各地光周期的差異，不同地區(qū)的人可能會(huì)選擇不同類型的光敏感材料以適應(yīng)當(dāng)?shù)氐墓庹諚l件。研究發(fā)現(xiàn)Hdl和Ghd7的等位基因的自然變異和水稻的分布區(qū)有關(guān)，但Hdl和Ghd7的等位變異對(duì)于品種抽穗期的改變過于劇烈，對(duì)其它基因也有很強(qiáng)的上位作用，因此，在品種抽穗期的改良上很難應(yīng)用。而微效基因的改變較易適應(yīng)環(huán)境的緩慢變化，更具有適應(yīng)性，在育種上有重要意義。另外判斷一個(gè)基因是否是馴化基因，主要看該基因在野生稻中的等位基因類型對(duì)人類是無利的，而經(jīng)過馴化以后栽培稻中的等位基因類型對(duì)人類是有利的。即人類馴化選擇了對(duì)人類有利的性狀，但并不是所有的有利性狀都是馴化的。利用源于粳稻品種Asominori和秈稻品種IR24的重組自交系(RILs)群體，我們之前的研究檢測(cè)到多個(gè)抽穗期 QTL(Wei XJ, et al. (2010)Mol Breeding 25 :287-298)，其
3中我們關(guān)注位于第二染色體長臂末端RM318和RM240之間的微效抽穗期QTL (該QTL在本發(fā)明中被命名為DTH2)，在自然長日照條件下，包含Asominori等位基因的植株比包含IR24 等位基因的植株提前抽穗。到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)通過QTL克隆的基因?qū)儆谠陂L日照條件下促進(jìn)開花的類型(Tsuji H, Taoka KI and Shimamoto K (2010) Current Opinion in Plant Biology 14:1-8)。精細(xì)定位水稻抽穗期QTL最好的辦法就是構(gòu)建染色體片段置換系(CSSL)或近等基因系(NIL)，使目標(biāo)QTL位點(diǎn)之外的絕大部分背景保持一致，使該位點(diǎn)表現(xiàn)為典型的孟德爾遺傳，即數(shù)量性狀質(zhì)量化。但是對(duì)于微效QTL來說，在F2群體里，由于雜合型單株和隱性純合型單株的表型差異較小，在構(gòu)建NIL的基礎(chǔ)上，還需要把F2群體繁衍成F2:3家系群體，使表型易于鑒定。之后把QTL分解為單個(gè)基因并進(jìn)行圖位克隆，即通過分析突變位點(diǎn)與已知分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系來確定目的基因在染色體上的物理位置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供了一組控制水稻抽穗期的DTH2 基因及其單倍型和應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一個(gè)控制水稻抽穗期基因DTH2，它來自水稻，長度為7867bp，相應(yīng)編碼CCT/B-box 鋅指蛋白的407個(gè)氨基酸，顯性等位基因DTH2-a(DTH2等位基因來自一個(gè)日本的粳稻品種 Asominori)全序列為SEQ ID NO. 1，其CDS序列如SEQ ID NO. 2所示，屬于DTH2基因的單倍型 5 (Haplotype5, Hap5)。所述的控制水稻抽穗期基因DTH2在水稻品種改良中的應(yīng)用。所述的基因DTH2的隱性等位基因DTH2_i (DTH2等位基因來自一個(gè)國際水稻所的秈稻品種IR24)，核苷酸全序列如SEQ ID NO. 3所示，其CDS序列如SEQ ID NO. 4所示，屬于 DTH2 基因的單倍型 I (Haplotypel，Hapl)。所述的基因DTH2的隱性等位基因DTH2_i在水稻品種改良中的應(yīng)用。所述的基因DTH2的單倍型2 (Hap2)，其⑶S序列如序列表SEQ ID NO. 5所示。所述的基因DTH2的單倍型2在水稻品種改良中的應(yīng)用。所述的基因DTH2的單倍型3 (Hap3)，其⑶S序列如序列表SEQ ID NO. 6所示。所述的基因DTH2的單倍型3在水稻品種改良中的應(yīng)用。所述的基因DTH2的單倍型4 (Hap4)，其⑶S序列如序列表SEQ ID NO. 7所示。所述的基因DTH2的單倍型4在水稻品種改良中的應(yīng)用。根據(jù)圖I的技術(shù)路線，本發(fā)明為精細(xì)定位QTL DTH2，利用以Asominori為背景親本，IR24為供體親本的染色體片段置換系(CSSLs)群體(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所保存)，鑒定出晚抽穗的攜帶DTH2-i插入片段的家系CSSL18。從CSSL18與Asominori雜交構(gòu)建的次級(jí)F2群體中，再次檢測(cè)到DTH2(L0D值24. 70，貢獻(xiàn)率26. 22% )0進(jìn)一步利用分子標(biāo)記輔助選擇的方法(MAS)，構(gòu)建了僅攜帶DTH2的近等基因系一NIL(DTH2)并利用 NIL(DTH2) XAsominori的次級(jí)F2、F2l3以及F3:4群體，最終將DTH2限定在標(biāo)記dCAPS3與 dCAPS5之間約37. 6kb的區(qū)間范圍內(nèi)，共有9個(gè)候選基因。序列分析發(fā)現(xiàn)第5個(gè)基因，編碼 CCT/B-box鋅指蛋白，且與擬南芥C0L9同源，暗示著該基因可能是目的基因。通過構(gòu)建一個(gè)包含該基因的7867bp基因組區(qū)段的轉(zhuǎn)基因組全長互補(bǔ)載體，轉(zhuǎn)入NIL(DTH2)中，發(fā)現(xiàn)T2R轉(zhuǎn)基因家系抽穗提前。通過Real-time RT PCR發(fā)現(xiàn)，DTH2在水稻抽穗期途徑中位于Hd3a 和RFTl的上游。隨后通過對(duì)79份栽培稻和48份野生稻的測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在DTH2編碼區(qū)存在 5個(gè)堿基差異，導(dǎo)致3個(gè)氨基酸變化，產(chǎn)生5種單倍型。并證明DTH2在馴化中被選擇，且起源于中國。有益效果I.本發(fā)明通過構(gòu)建近等基因系NIL(DTH2)，并利用NIL(DTH2) XAsominori的次級(jí) f2、f2:3以及f3:4群體，通過圖位克隆的方法，最終克隆了一個(gè)擴(kuò)大栽培稻向北分布區(qū)及控制水稻抽穗期的微效基因DTH2，此基因是第一個(gè)通過圖位克隆的方法克隆的在長日條件下促進(jìn)水稻抽穗的基因，為擴(kuò)大栽培稻向北分布區(qū)提供新的基因資源，也為其他作物利用電子克隆法克隆相關(guān)基因提供了基因序列，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該基因是一個(gè)馴化基因，為水稻的進(jìn)化研究提供新的思路。2.將DTH2_a導(dǎo)入包含DTH2_i的育種材料中，可以使該材料的抽穗期提前，種植范圍由其原產(chǎn)地向北遷移，擴(kuò)大栽培稻的向北分布區(qū)。3.本發(fā)明克隆的基因與馴化相關(guān)，其馴化模式可為水稻、玉米和大豆等農(nóng)作物的光周期反應(yīng)和分子進(jìn)化研究提供參照。


圖I.本發(fā)明的總體技術(shù)流程2. DTH2的精細(xì)定位和轉(zhuǎn)基因全長互補(bǔ)T2代和干擾T2代的結(jié)果。A圖是DTH2精細(xì)定位圖；B圖表示DTH2的基因結(jié)構(gòu)；C_D圖表示轉(zhuǎn)基因全長互補(bǔ) T2代和干擾T2代及兩親本Asominori和NIL(DTH2)的表型(C)和抽穗期數(shù)據(jù)(D)，P1和P2 分別指全長互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株和NIL(DTH2)及干擾植株和Asominori之間的P值，采用威爾科克森符號(hào)秩檢驗(yàn)，P3指兩親本之間的P值，采用雙尾t檢測(cè)，η指實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的植株數(shù)，平均值 ± s. e. nio圖3.本發(fā)明中用到的雙元載體PCAMBIA1305. I的載體圖。圖4. DTH2編碼區(qū)的自然變異和地理分布分析。圖A是對(duì)79個(gè)栽培稻和48個(gè)野生稻的DTH2編碼區(qū)測(cè)序的結(jié)果，顯示了 5個(gè)SNP 和5種單倍型；圖B顯示了 5種單倍型的地理分布；圖C顯示了 5種單倍型的轉(zhuǎn)基因結(jié)果， 平均值土s. e. m, P值采用雙尾t檢測(cè)得出；圖D顯示了 5種單倍型在不同亞種之間的分布和它們之間的進(jìn)化關(guān)系。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I DTH2近等基因系的構(gòu)建I. DTH2的QTL檢測(cè)，回交與選擇利用Asominori和IR24的RILs群體，我們之前的研究檢測(cè)到多個(gè)控制抽穗期的基因位點(diǎn)，其中的一個(gè)位點(diǎn)DTH2,在自然長日照(natural long-day, NLD)條件下,包含 DTH2-a的植株比包含DTH2-i的植株提前抽穗。利用以Asominori為背景親本，IR24為供體親本的CSSLs群體，我們發(fā)現(xiàn)CSSL18比背景親本Asominori具有極顯著遲熟且表達(dá)穩(wěn)定，由于CSSL18與背景親本Asominori相比，僅在某些片段上插入了 IR24片段，因此插入的秈稻片段IR24是導(dǎo)致CSSL18具有極顯著遲熟的根本原因。我們將CSSL18與Asominori 雜交一次，連續(xù)回交4次，然后自交構(gòu)建一個(gè)包含374個(gè)單株的CSSL18/ASominori BC4F2群體，采用IciMapping v2. I軟件，從中再次檢測(cè)到DTH2。目標(biāo)區(qū)段確定在兩個(gè)SSR(Simple Sequence Repeat)標(biāo)記RM318和RM240之間(RM系列引物公知公用，見網(wǎng)站www. gramene. org)，遺傳距離9. 6cM(厘摩)。從表I可以看出在這個(gè)區(qū)間存在一個(gè)控制抽穗期的QTL，貢獻(xiàn)率26. 22 %，運(yùn)用MAS技術(shù)，選擇在DTH2區(qū)段為純合IR24基因型，而在其他區(qū)段為純合 Asominori背景的單株即為NIL(DTH2)。表I.位于RM318和RM240之間控制抽穗期的QTL
QTL標(biāo)記區(qū)間染色體LOD%PVEadDTH2RM318-RM240224.7026.225.03-1.17% PVE :解釋表型變異率；a :加性效應(yīng)；d :顯性效應(yīng)。2.微衛(wèi)星標(biāo)記基因型鑒定方法(SSR技術(shù))PCR標(biāo)準(zhǔn)程序參見J.薩姆布魯克等，2002,分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社。PCR采用20 μ I反應(yīng)體系如下DNA模版20-50ng，引物O. 5μΜ， dNTPlOO μ Μ, I Xbuffer (Mg2+ plus)和 IU rTaqDNA 聚合酶(購自日本 Takara 公司)。PCR 擴(kuò)增條件為=98°預(yù)變性3分鐘；94° 30秒，55° 30秒，72° I分鐘，35個(gè)循環(huán)；72°延伸 7分鐘。PCR產(chǎn)物在6%的聚丙烯酰胺凝膠上分離后進(jìn)行銀染(Basam，et al. (1991)Anal. Biochem. 196 :80-83)。實(shí)施例2 DTH2的精細(xì)定位與圖位克隆I.兩親本的抽穗期表型鑒定抽穗期指單株的第一個(gè)穗子抽出的日期；抽穗期天數(shù)指單株自播種到第一個(gè)穗子抽出的天數(shù)；極端晚抽穗單株指抽穗期與親本NIL(DTH2)相同或更晚的單株；極端晚抽穗家系指一個(gè)隨機(jī)家系中大部分單株抽穗都相同或晚于親本NIL(DTH2)的家系。在北京NLD 條件下(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所東門網(wǎng)室)，NIL(DTH2)比Asominori晚抽穗7. 4 天(表I,圖2C)。而在海南自然短日照(natural short-day,NSD)條件下(海南陵水南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南繁基地)，兩親本抽穗沒有顯著差異。經(jīng)過光照培養(yǎng)箱嚴(yán)格的長日照(LD，14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗)與短日照(SD，10小時(shí)光照/14小時(shí)黑暗)處理，結(jié)果分別與在NLD 和NSD條件下的一致(表2)。表2. Asominori和NIL(DTH2)在不同光照條件下的抽穗期表現(xiàn)
權(quán)利要求
1.一個(gè)控制水稻抽穗期基因DTH2，它來自水稻，長度為7867bp，相應(yīng)編碼CCT/B-box 鋅指蛋白的407個(gè)氨基酸，顯性等位基因DTH2-a全序列為SEQ ID NO. 1，其⑶S序列如SEQ ID NO. 2 所示。
2.權(quán)利要求I所述的控制水稻抽穗期基因DTH2在水稻品種改良中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求I所述的基因DTH2的隱性等位基因DTH2-i，核苷酸序列如SEQID NO. 3 所示，其CDS序列如SEQ ID NO. 4所示。
4.權(quán)利要求3所述的基因DTH2的隱性等位基因DTH2-i在水稻品種改良中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求I所述的基因DTH2的單倍型2，其⑶S序列如序列表SEQID NO. 5所示。
6.權(quán)利要求5所述的所述的基因DTH2的單倍型2在水稻品種改良中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求I所述的基因DTH2單倍型3，其⑶S序列如序列表SEQID NO. 6所示。
8.權(quán)利要求7所述的所述的基因DTH2的單倍型3在水稻品種改良中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求I所述的基因DTH2的單倍型4，其⑶S序列如序列表SEQID NO. 7所示。
10.權(quán)利要求9所述的所述的基因DTH2的單倍型4在水稻品種改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一組控制水稻抽穗期的DTH2基因及其單倍型和應(yīng)用。該基因編碼一個(gè)CCT/B-box鋅指蛋白，屬于CONSTANS-Like轉(zhuǎn)錄因子基因家族，顯性等位基因序列如SEQ ID NO.1所示，只在長日照條件下促進(jìn)開花。隱性等位基因的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證明了該基因具有使水稻抽穗期提前的功能。通過對(duì)79份栽培稻和48份野生稻的測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在DTH2編碼區(qū)存在5個(gè)堿基差異，導(dǎo)致3個(gè)氨基酸變化，產(chǎn)生五種單倍型。并證明該基因在馴化中被選擇，且起源于中國。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102586277SQ201210054659
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月5日
發(fā)明者萬建民, 吳瑋勛, 江玲, 鄭曉明, 鐘錚錚, 陸廣文 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)