一種調(diào)控水稻葉形的鋅指蛋白基因OsRLZP及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種調(diào)控水稻葉形的鋅指蛋白基因OsRLZP及其應(yīng)用，該基因核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO：1所示；所述基因編碼的蛋白其氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO：2所示。本發(fā)明將SEQ?ID?NO：1所述基因全長編碼序列插入到真核載體中，獲得OsRLZP基因過量表達的真核重組質(zhì)粒，將上述真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻，獲得OsRLZP過表達轉(zhuǎn)基因植株。實驗表明：本發(fā)明所述SEQ?ID?NO：1基因能夠控制水稻葉片發(fā)育；與野生型植株相比，OsRLZP上調(diào)轉(zhuǎn)基因植株葉片中脈變粗、葉片變窄，整個植株葉片內(nèi)卷直立，葉片表皮毛減少。因此，本發(fā)明所述基因?qū)λ救~片發(fā)育具有調(diào)控作用，并可在水稻株型改良遺傳育種中應(yīng)用。
【專利說明】—種調(diào)控水稻葉形的鋅指蛋白基因OsRLZP及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種水稻葉形控制基因及其在作物株型改良遺傳育種中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻葉片作為進行光合作用的主要器官是水稻產(chǎn)量形成的決定性因素。較大的葉面積才能構(gòu)成較大的光合群體，但葉片過長、過寬時容易批垂，反而會降低群體的總受光面積，并影響種植群體的通風(fēng)狀況，易于病原微生物滋生繁衍。因而，水稻葉片形態(tài)改良一直是株型改良的重要目標(biāo)。
[0003]水稻葉片形態(tài)主要指標(biāo)包括:葉片卷曲度、傾角、披散程度以及葉片寬度等。分子遺傳學(xué)研究進展顯示，水稻葉片卷曲度主要由卷葉基因調(diào)控葉片近/遠軸間發(fā)育、泡狀細胞的發(fā)育、厚壁組織的形成以及葉片角質(zhì)層的發(fā)育等其中某一環(huán)節(jié)來實現(xiàn)；葉傾角主要經(jīng)由葉角基因調(diào)控油菜素內(nèi)酯信號傳導(dǎo)而影響葉枕細胞的生長發(fā)育；葉片披垂度可能是通過披葉基因DLl等控制葉片中脈的發(fā)育；窄葉基因則主要調(diào)控生長素的合成與極性運輸、維管組織的發(fā)育和分布 ，影響葉片維管束數(shù)目及寬度。但迄今為止，已克隆葉形調(diào)控基因并不多且基因間相互關(guān)系的研究也還不夠深入，還不能完整清晰地勾勒水稻葉形建成和發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(徐靜等，作物學(xué)報，2013)。
[0004]由于葉片適度卷曲的群體可以明顯提高葉片直立性，既能增加葉長寬又可避免葉片批垂，改善群體通風(fēng)與光照條件，促進后期干物質(zhì)增長，有利于提高經(jīng)濟系數(shù)。所以，在水稻育種家提出的理想株型中均認為直立葉是水稻理想株型的重要組成部分。如，周開達的“重穗型”株型模式認為“葉片內(nèi)卷直立”較宜(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995);袁隆平的超高產(chǎn)雜交稻的理想株型中上三葉應(yīng)“長、直、窄、凹、厚”(雜交水稻，1997)。
[0005]水稻卷葉性狀可以由外界環(huán)境脅迫如干旱、蟲害等引起，但受基因控制的卷葉性狀則是能夠遺傳、具有重要價值的育種目標(biāo)。目前已定位了近20個卷葉基因，如rll、rl2、rl3、rl4、rl5、rl6、rl7、rl9、rllO、rill、rll2、rl (t)、urll、nal3、RL-A2、SLLU NRLU0sAG07,(潘存紅等，中國水稻科學(xué)，2011 ;zhang等，Plant Cell，2009)，其中多數(shù)基因為隱性遺傳。但精細定位的卷葉基因并不多，被克隆的卷葉基因就更少。在已克隆的卷葉基因中，SHALL0T-LIKE1 (SLLl)編碼一個SHAQKYF類MYB轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控水稻葉片遠軸面厚壁組織細胞的程序化死亡來控制水稻葉片卷曲性狀(zhang等Plant Cell, 2009)。Shi等(Planta，2007)通過T-DNA標(biāo)簽法克隆水稻0sAG07基因，其過量表達使葉片卷曲。
[0006]鋅指蛋白(zinc-finger protein)是轉(zhuǎn)錄因子中研究得比較深入的一個類型，因其具有可以結(jié)合鋅離子的指狀結(jié)構(gòu)域-鋅指結(jié)構(gòu)域(zinc-finger domain)而命名。鋅指蛋白中有單個或成簇出現(xiàn)的鋅指結(jié)構(gòu)域，依賴在長期進化過程中形成的鋅指結(jié)構(gòu)域的多變組合，使其能夠結(jié)合DNA、RNA等分子而具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)重構(gòu)等多種生理功能(Gamsjaeger等，Trends Biochem Sci, 2007)。植物中普遍存在鋅指蛋白，有些鋅指蛋白是植物所特有，并廣泛參與植物各個時期的生長發(fā)育調(diào)控、脅迫應(yīng)答等。水稻鋅指蛋白基因在葉片發(fā)育調(diào)控中作用還未闡明，而這對于克隆新的水稻葉形控制基因資源，應(yīng)用于株型改良遺傳育種具有重要價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是在于提供一個控制水稻葉片發(fā)育的基因，所述基因的上調(diào)可以影響水稻葉片形態(tài)。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0009]本發(fā)明所述控制水稻葉形的基因，命名為0sRLZP(0ryza sativa Rolling LeafZinc-finger Protein)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:I所示。
[0010]所述基因編碼蛋白的氣基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所不。其編碼序列在第68-88位氨基酸、第94-117位氨基酸各有一個鋅指(zinc-finger)結(jié)構(gòu)域。
[0011]該基因的克隆:根據(jù)GenBank中水稻mRNA序列(登錄號:AK063705)，利用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0設(shè)計PCR特異引物。從水稻葉片中提取總RNA,通過反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)從水稻中分離到OsRLZP基因編碼序列。
[0012]本發(fā)明所述OsRLZP基因過表達真核重組質(zhì)粒，是將SEQ ID NO:1所述基因全長編碼序列插入到真核表達載體PHB中獲得。
[0013]將上述過表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻，獲得轉(zhuǎn)基因植株。實驗結(jié)果表明:本發(fā)明所述SEQ ID NO:1基因能夠控制水稻葉片發(fā)育；與野生型植株相比，OsRLZP上調(diào)轉(zhuǎn)基因植株葉片中脈變粗、葉片變窄、 內(nèi)卷直立，葉面表皮毛減少。因此，本發(fā)明所述基因?qū)λ救~片發(fā)育具有調(diào)控作用，并可在水稻株型改良遺傳育種中應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0015]1、本發(fā)明為水稻等單子葉禾本科作物的葉形調(diào)控和遺傳育種提供了一種新的基因資源。
[0016]2、本發(fā)明所用基因為水稻本身自有基因，所以轉(zhuǎn)基因水稻的安全性能高。
[0017]3、本發(fā)明所述基因的克隆和植物轉(zhuǎn)基因均為常規(guī)方法，所需材料易于獲取。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是OsRLZP過表達轉(zhuǎn)基因株系的實時定量PCR檢測。A =OsRLZP過表達真核重組質(zhì)粒(pHB-OsRLZP)的示意圖。B:過表達轉(zhuǎn)基因株系實時定量PCR檢測結(jié)果。從左至右依次為:野生型(WT)、3個獨立過表達株系(0X-1~0X-3)中OsRLZP基因的表達水平。
[0019]圖2是OsRLZP過表達轉(zhuǎn)基因植株葉片掃描電子顯微鏡檢測結(jié)果。A:野生型(WT)、過表達植株(0X-1)葉片上表面掃描電子顯微鏡檢測結(jié)果；B:野生型、過表達植株葉片下表面掃描電子顯微鏡檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步說明。下述實施例中，凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如SambrookRussell的分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。[0021]實施例1:水稻OsRLZP基因的克隆
[0022]1、試劑
[0023]RNA 提取試劑 Trizol 購于 Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄酶 ReverTraAce 購于 Toyobo公司；高保真DNA聚合酶PrimeStar購于TaKaRa公司；克隆載體pEASY?_Blunt SimpleCloning Vector購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，其余試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。
[0024]2、大腸桿菌菌株和植物材料
[0025]大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5a購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；水稻粳稻品種日本晴(Oryza sative L.ssp.japonica cv.Nipponbare)種子由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院繁育提供。
[0026]3、培養(yǎng)基和溶液
[0027]LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC110g/L。用NaOH調(diào)pH至7.0，高壓滅菌。
[0028]SOB 培養(yǎng)基:胰蛋白胨 20g/L，酵母粉 5g/L，NaCl0.58g/L，KC10.19g/L，IOOXMg2+IOmLo 用 NaOH 調(diào) pH 至 7.0，高壓滅菌。
[0029]SOC培養(yǎng)基:S0B+20%葡萄糖。
[0030]100 XMg2+ 溶 液:20.33g MgCl2.6H20 和 24.65g MgSO4.7H20 定容于 IOOmL H2O,高壓滅菌。
[0031]20%葡萄糖溶液:20g葡萄糖定容于IOOmL H2O,過濾除菌。
[0032]4、方法
[0033]4.1水稻葉片RNA提取
[0034]I)取新鮮水稻葉片，加入液氮研磨成粉狀，迅速轉(zhuǎn)移100-200mg粉末于不含RNase的1.5mL Ep管中，即刻加入ImL Trizol提取液混勻,振蕩IOs,室溫下放置5min ；
[0035]2)加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫下放置2_3min ；
[0036]3)4。。，12000g離心15min,吸取上清約600 μ L至新EP管中，加入0.6mL異丙醇，室溫下放置IOmin ；
[0037]4) 4°C,12000g離心10min，棄上清，沉淀用70 %乙醇沖洗兩次，4°C，7500g離心5min ；
[0038]5)倒掉乙醇，常溫干燥RNA沉淀lOmin，溶于50 μ L RNase-free ddH20中，保存于-80°C中備用。
[0039]4.2 RT-PCR
[0040]4.2.1 RT
[0041]I)取 I μ g 總 RNA 與 I μ L PolyT18(10 μ Μ)引物混合,用 RNase-free ddH20 補足到
12.75 μ L，輕輕混勻；
[0042]2) 65°C保溫5min，立即轉(zhuǎn)移至冰浴中，放置2min ；
[0043]3)加入 5X 反應(yīng)緩沖液 4yL，10mM dNTP2yL，RNA 抑制劑 0.25 μ L(40U/μ L)，ReverTra Ace 反轉(zhuǎn)錄酶 I μ L (100U/ μ L)，42°C Ih,合成第一鏈 cDNA ；
[0044]4) 95°C加熱5min,失活反轉(zhuǎn)錄酶,終止合成反應(yīng)。
[0045]4.2.2 PCR[0046]水稻OsRLZP基因的克隆。將200 μ L EP管放置于冰上，加入以下試劑:
[0047]
【權(quán)利要求】
1.一種調(diào)控水稻葉形的鋅指蛋白基因OsRLZP，其特征在于，所述基因核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種調(diào)控水稻葉形的鋅指蛋白基因OsRLZP，其特征在于，所述基因編碼的蛋白其氣基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所不。
3.一種真核重組質(zhì)粒，其特征在于:將權(quán)利要求1所述OsRLZP的核苷酸序列中基因全長編碼序列插入到真核表達載體中獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種真核重組質(zhì)粒，其特征在于，所述真核表達載體為pHB。
5.權(quán)利要求1所述調(diào)控水稻葉形的鋅指蛋白基因OsRLZP在調(diào)控水稻葉片發(fā)育中的應(yīng)用。
6.一種調(diào)控水稻葉片發(fā)育、改變水稻葉形的方法，其特征在于:將權(quán)利要求3所述的真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻，獲得轉(zhuǎn)基因植株。
【文檔編號】C12N15/82GK103993017SQ201310655783
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】牛向麗, 吳海云, 毛云 申請人:合肥工業(yè)大學(xué)