專利名稱：一組與aba合成相關(guān)的提高水稻耐旱性基因的克隆和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與ABA合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，特別是利用基因工程方法操縱來源水稻的 基因的表達，從而調(diào)控植物體內(nèi)ABA的水平，應(yīng)用于培育耐旱性提高的植物。
背景技術(shù)：
植物激素是由植物的部分器官(或組織)合成而轉(zhuǎn)移到另一器官(或組織)，并專一 地影響其生理過程的極微量的非營養(yǎng)性物質(zhì)。植物生長發(fā)育受營養(yǎng)、內(nèi)源激素和生長環(huán)境調(diào)控。
植物激素主要有五類，即生長素、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸和乙烯。植物激素作 為植物體內(nèi)的痕量信號分子幾乎參與了調(diào)控植物生長發(fā)育的每一過程，既包括調(diào)控植物自 身的生長發(fā)育，又通過與植物所生存的外部環(huán)境互相作用調(diào)節(jié)其對環(huán)境的適應(yīng)。植物激素 對于調(diào)節(jié)植物的各種生長發(fā)育過程和對環(huán)境的應(yīng)答具有十分重要的意義(許智宏，李家洋.中 國植物激素研究過去、現(xiàn)在和未來.植物學通報，2006， 23(5):433-442.)。
植物的生長與環(huán)境因素密不可分，植物抗環(huán)境脅迫的研究一直是各國科學家關(guān)注的研 究熱點。常見的外界脅迫主要是自然界所造成的，包括干旱、鹽、極端的溫度、pH值及光 照過強或者過弱等。近年的研究表明環(huán)境脅迫是限制植物生長發(fā)育的重要因素，植物抵抗 逆境的能力受多基因控制(Allen GJ, Kuchitsu K, Chu SP, Murata Y, Schroeder JI.爿raWc/op他 a^7-J and phosphatase mutations reduce abscisic acid induced cytoplasmic calcium rises
in guard cells . Plant Cell, 1999, 11: 1785-1798.)。
在對植物激素調(diào)控作用的研究中，脫落酸(Abscisic acid， ABA)作為一種重要的脅迫 激素受到人們的廣泛關(guān)注，因為ABA與種子休眠，特別是與植物的抗逆生理有著重要的關(guān) 系(Hagenbeek D, Quatrano RS, Rock CD. Trivalent ions activate abscisic acid inducible promoters through an爿朋-dependent pathway in rice protoplasts. Plant Physiol, 2000， 123:1553-1560; Xiong LM, Ishitani M, Lee H， Zhu JK. The爿raWdo戸/s ZOS5/^5v43 locus encodes a molybdenum cofactor sulfurase and modulates cold stress andosmotic stress-responsive gene expression . Plant Cell, 2001a, 13: 2063-2083)。
ABA是20世紀60年代植物學家從棉花落果，馬鈴薯及楓、樺等葉中分離出來的植物激 素。它存在于植物的葉、休眠芽、成熟種子中，通常在衰老的器官或組織中的含量比在幼
嫩部分中的多。它在植物胚胎發(fā)育、種子萌發(fā)、成熟與休眠、果實成熟以及植物對逆境脅 迫的響應(yīng)等許多方面具有廣泛的生理效應(yīng)(Zeevaart JAD. Abscisic acid metabolism and its regulation. Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones, 1999, 189-207)，對植物的 生長發(fā)育起著重要作用。ABA是十五碳化合物， 一般是在葉綠體和其他質(zhì)體中合成，它有 促進離層產(chǎn)生的作用，因而與花、果實和葉的脫落有關(guān)。ABA的另一重要作用是抑制生長。 生物體各種過程常常是促進和抑制兩個過程平衡的結(jié)果。在自然環(huán)境嚴酷的情況下只有停 止生長，進入休眠，再加上一些有保護功能的形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用，植物才能渡過不良的環(huán)境。 ABA不僅可以作為胞間信號物質(zhì)介導植株整體的抗逆反應(yīng)(Sauter A， Davies WJ， Hartung W. The long-distance abscisic acid signal in the draughted plant:the fate of the hormone on its way from root to shoot. J Ex p Bot., 2001， 52(363):1991-60)，而且作為細胞逆境信號物 質(zhì)直接介導許多抗逆基因表達(Leung J，Giraudat J,Abscisic acid signal transduction. Ann. Rev.Plant Physiol. Plant Mol. Biol.， 1998,49:199-222)。逆境下植物啟動ABA合成系統(tǒng)，合成 大量的ABA，促進氣孔關(guān)閉，抑制氣孔開放(Tardieu F, Simonneau T. Variability among speices of stomatal controlunder fluctuating soil water status and evaporative demand: modeling isohydric and anisohydric behaviours. J Exp Bot， 1998,49:419-432.);促進水分吸收，并減少 水分運輸?shù)馁|(zhì)外體途徑，增加共質(zhì)體途徑水流(Steudle E. Water uptake by roots:effects of water deficit J Ex pBot, 2000， 51(350):1531-1542)，增強植株抵抗逆境的能力(Morillon R, Chrispeels MJ. The role of ABA and the transpiration stream in the regulation of the osmotic water permeability of leaf cells . Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(24):14138-14143 )，因而在 基因工程與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有潛在的應(yīng)用價值。
高等植物ABA生物合成一般有兩條途徑d5直接途徑和C4。間接途徑。ds直接途徑是
以甲瓦龍酸(MVA)為前體，經(jīng)C,s的法呢焦磷酸(FPP)直接形成dsABA; (:40間接途徑是經(jīng) 由類胡蘿卜素的氧化裂解間接形成ABA。近十多年來，大量ABA缺失突變體的發(fā)現(xiàn)以及同 {立素示&宗技術(shù)(Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Gene expression and signal transduction in water-stress response . Plant Physiology, 1997， 115: 327-334.)的研究證明，C幼的間接途徑 是高等植物ABA生物合成的主要途徑，即是由類胡蘿卜素(C4o)裂解生成ABA (Milborrow BV. The pathway of biosynthesis of abscisic acid in vascular plant:a review of the present state of knowledge of ABA biosynthesis . J Exp Bot, 2001, 52:1145-1164)。 (1)異戊烯基焦磷酸(IPP)的生物合成
IPP的生物合成有兩個途徑，分別在細胞質(zhì)和質(zhì)體中進行。細胞質(zhì)內(nèi)以甲瓦龍酸(MVA) 為前體。已知MVA在植物中作為類胡蘿卜素及其它一些四萜的前體，但后來發(fā)現(xiàn)阻礙MVA
合成的甲瓦龍酸素(MevinoUn)并不影響類胡蘿卜素的合成。C02在光下很快進入到葉四 萜中，但卻極慢地進入到胞質(zhì)合成的類固醇中(McCaskill D， Croteau R. Monoterpene and sesquiterpene biosynthesis inglandular trichomes of peppermint (Mew決a X/7z》erata) relyexclusivelyon plastid derived isopentenyl diphosphate. Planta， 1995， 197:1135-1146; Lereto F, Ciccioli V, Cecinato A, Branaleoni E， Frattoni M, Fabozzi C,Tricoli D. Evidence of photosynthetic origin of monoterpenes emitted by Quercus idex L. leaves by 13C labeling . Plant Physiol., 1996， 110:1371-1322.)。因而IPP生物合成可能與MVA途徑無關(guān)。Rohmer等 (1999)認為IPP生物合成是在葉綠體中以甲基赤蘚糖磷酸(MEP)途徑合成的。首先以丙酮 酸及硫胺素焦磷酸(TPP)為前體，在3-磷酸甘油醛(GAP)參與下合成5-磷酸脫氧木酮糖， 進向在胞苷三磷酸(CTP)參與下形成IPP (Rohmer M. The discover of a mevalonate independent pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria algae and higher plants. Nat Pro Rep.， 1999, 16:565-574; Rohdich F， Wungsintaweekul J， Fellermieier M， Sagner S， Herz S，Kis K,Eisenreich W, Bacher A, Zenk M. 5，-triphosphate-dependent biosynthesis of isoprenoids YgbP protein of Esc/ze"'c/w co/Z catalyses the formation of 4-diphosphocytidyl-2-Cmethylerthritol. Pro Natl Acad Sci USA, 1999, 16:11758-11763)。以MVA為前體生成的IPP要借助載體作用通過 質(zhì)體膜滲入到質(zhì)體內(nèi)(Soler E， Clastre M, Bantiquies B, Marigo G, Ambid C. Uptake of isopentenyl diphosphate by plasited from Vitis vinifera L. cell suspensions. Planta, 1993， 191:324-329)。
(2) 黃質(zhì)醛(XAN)的生物合成
無論是細胞質(zhì)中由MVA合成后進入到質(zhì)體中的IPP,還是由質(zhì)體自身合成的IPP都可 轉(zhuǎn)化形成XAN。IPP經(jīng)法呢焦磷酸(FPP)合成玉米黃質(zhì)(Zeaxanthin)。在玉米突變體yp入vp5、 vp7、 yp9中已發(fā)現(xiàn)其突變是與玉米黃質(zhì)形成相關(guān)的(楊洪強、接玉玲，高等植物脫落酸的 生物合成及其調(diào)控.植物生理學通訊，2001， 37(5):457-462.)。由玉米黃質(zhì)環(huán)化形成環(huán)氧玉 米黃質(zhì)由環(huán)氧玉米黃質(zhì)環(huán)化酶(ZE)催化，紫黃質(zhì)及新黃質(zhì)可在9-順環(huán)氧類胡蘿卜素雙加 氧酶(NCED)作用下氧化裂解形成黃質(zhì)醛(Xanthoxin)。
(3) ABA的合成
當由NCED催化產(chǎn)生黃質(zhì)醛之后，黃質(zhì)醛便轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中，經(jīng)過兩步催化反應(yīng)形成 ABA。在植物中存在三種可能的ABA合成途徑(Seo M, Koshiba T. Complex regulation of ABA biosynthesis in plants. 7>emis Wa"f 5We"ce, 2002， 7(l):41-48)。三種途徑的主要區(qū)別 是從視黃醛到ABA的合成過程，其中途徑(l)被證明在ABA的生物合成中起主要作用。
在途徑(l)中，黃質(zhì)醛首先被短鏈脫氫,'還原酶(short chain dehydrogenase/reductase,
SDR)還原成脫落醛(abscisic aldehyde, ABAId)， ABAId然后被ABA-醛氧化酶(AAO)氧 化為ABA，這種醛氧化酶需要鉬因子的激活?，F(xiàn)已鑒定該途徑失活的多種突變體，如擬南 芥o6a2 (Schwartz SH， Le'on-Kloosterziel KM, Koornneef M, Zeevaart JAD. Biochemical characterization of the aZw2 and a6a3 mutants in JrainVfo/wk Aa//"wa. Plant Physiol, 1997a, 114:161-166.)禾口gz'w/ (Leydecker MT， Moureaux T, Kraepiel Y. Molybdenum cofactor mutants, specially impaired in xanthoxin dehydrogenase activity and abscisic acid biosynthesis, simultaneously overexpress nitrate redutase. Plant Physiol.， 1995， 107:1427-1431.)，這些突變體 不能催化黃質(zhì)醛生成ABAId,但是可以將ABAId轉(zhuǎn)換成ABA，這說明突變體缺失了短鏈脫 氫/還原酶(SDR)，經(jīng)克隆鑒定發(fā)現(xiàn)，這些突變體對應(yīng)的基因都是與短鏈脫氫/還原酶相關(guān) 的基因。番茄W"era突變體是醛氧化酶(AO)缺失(Taylor IB. The wilty tomato mutants^acra and礎(chǔ)e似are impaired in the oxidation of ABA-aldehyde to ABA. Plant Cell Environ, 1988,11:739-745.),它不能將ABAId氧化成ABA 。擬南芥( Schwartz SH, Le'on-Kloosterziel KM, Koornneef M, Zeevaart JAD. Biochemical characterization of the a&(X and a/ra3 mutants in ^4ra6油戸^Plant Physiol, 1997a, 114:161-166.)、煙草flZw/以及 番茄y/"cca突變體(Taylor IB. The wilty tomato mutantsy/acca andare impaired in the oxidationof ABA-aldehyde to ABA. Plant Cell Environ, 1988,11:739-745.)均呈現(xiàn)番茄Wfe"《 的表型，研究發(fā)砂W"A43編碼鉬輔因子硫化酶(molybdenum cofactor sulfUrase)(Xiong LM, Ishitani M, Lee H, Zhu JK. ^The /4ra編o戸k iOS15//15」3 locus encodes a molybdenum cofactor sulfurase and modulates cold stress andosmotic stress-responsive gene expression. Plant Cell， 2001a, 13: 2063-2083; Bittner F, Oreb M， Mendel RR. is a molybdenum cofactor
sulfurase required for activation of aldehyde oxidase and xanthine dehydrogenase in爿ra6/cfo;75^ JBoil Chem.， 2001, 276:40381-40384.)，說明醛氧化酶是依賴于鉬輔因子的氧化酶。
在途徑(2)中，黃質(zhì)醛通過黃質(zhì)酸轉(zhuǎn)變成ABA。從化學結(jié)構(gòu)上看，黃質(zhì)酸是容易轉(zhuǎn)化成 ABA的化合物，但是參與該途徑的基因還未被克隆(SeoM，KoshibaT. Complex regulation of ABA biosynthesis in plants. 7Vewfe /w /Vcr加5t/ewce, 2002, 7(1):41陽48.)。番茄_/7acra突變 體雖然缺失醛氧化酶的活性，但仍能檢測到少量"C標記的黃質(zhì)醛轉(zhuǎn)變成ABA，說明可能存 在另外的途徑形成ABA。
在途徑(3)中，黃質(zhì)醛首先被短鏈脫氫/還原酶(SDR)還原成脫落醛，脫落醛被還原成 脫落醇，脫落醇再氧化成ABA。
(4)ABA的降解途徑
植物體內(nèi)ABA含量的升高會誘使ABA的分解代謝加速。如在煙草中過量表達/
基因?qū)е翧BA降解產(chǎn)物紅花菜豆酸的累積(Qin X, Zeevaart JAD. Overexpression of a 9-ds-epoxycarotenoid dioxygenase gene in M.co".cma p/臓6agi'raybZia increases abscisic acid and phaseic acid levels and enhances drought tolerance. Plant Physiol, 2002, 128:544-551 )。 目 前，ABA在植物體內(nèi)主要有3條分解代謝途徑8'-位甲基的羥基化代謝途徑，9'-位甲基的 羥基化代謝途徑和ABA的酯化降解途徑(Cutler AJ, Krochko JE. Formation and breakdown of ABA. Trends Plant Sci， 1999, 4:472-478; Zhou R, Cutler AJ, Ambrose SJ. Anew abscisic acid catabolic pathway. Plant physiol., 2004， 134:361-369)。
在ABA生物合成中，除外界環(huán)境條件起誘導外，植物體內(nèi)的一些因素如酶及輔酶因 子也起著更為重要的調(diào)節(jié)作用。對ABA生物合成起關(guān)鍵作用的反應(yīng)存在于由八氫番茄紅 素以后的步驟。其次， 一些與異戊烯基焦磷酸(IPP)合成有關(guān)的酶，某些異構(gòu)酶和特定的 輔因子如鉬輔因子(MoCo)及鉬輔因子硫化酶(MCSU)等以及細胞膜類固醇都可能調(diào)節(jié) ABA的生物合成(Xiong LM, Ishitani M, Lee H， Zhu JK. The v4ra6icfo戸^丄OS5/Aa43 locus encodes a molybdenum cofactor sulfurase and modulates cold stress andosmotic stress-responsive gene expression. Plant Cell, 2001a, 13: 2063-2083)。
在酶調(diào)節(jié)生物合成方面，參與中期反應(yīng)的玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(ZEP)、 9-順環(huán)氧類胡蘿 卜素雙加氧酶(NCED)和后期反應(yīng)的醛氧化酶(AO)可能是關(guān)鍵的調(diào)控酶，在ABA的生 物合成中起著主要的調(diào)控作用(Seo M, KoshibaT. Complex regulation of ABA biosynthesis in plants . r簡A 尸/aW 5We"ce, 2002, 7(1 ):41-48; Sagi M, Fluhr R, Lips SH. Aldehyde oxidase and xanthine dehydrogenasein a flacca tomato mutant with deficient abscisic and wilty phe啤pe. Plant Physiol., 1999, 120:571-577)。
NCED的作用是轉(zhuǎn)運到質(zhì)體中催化C4。的9-順新黃質(zhì)和9-順紫黃質(zhì)發(fā)生裂解形成ABA的 前體物質(zhì)黃質(zhì)醛(C15)和一個C25化合物，NCED催化底物11和12位C間的雙鍵發(fā)生氧化裂 解 (Schwartz SH, Le'on陽Kloosterziel KM， Koornneef M, Zeevaart JAD. Biochemical characterization of theand fl6a3 mutants in Jm6油/w7j Plant Physiol, 1997a,
114:161-166)。大量的實驗結(jié)果證實，該步反應(yīng)是催化ABA生物合成的關(guān)鍵步驟，反應(yīng)發(fā) 生在質(zhì)體中。
Iuchi等(2000)從與豇豆脫水反應(yīng)有關(guān)的cDNA中分離得到了一個9-順環(huán)氧類胡蘿卜 素雙加氧酶的同源cDNA片段(Iuchi S, KobayasW M， YamagucW-Shinozaki K, Shinozaki K. A stress- inducible gene for 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase involved in abscisic acid biosynthesis under water stress in drought-tolerant cowpea . Plant Physiol" 2000, 123:553-562)。 其編碼的蛋白(vuNCED)用GST融合顯示其能催化9-順環(huán)氧類胡蘿卜素裂解。用sGFP(合
成的綠色熒光蛋白)融合實驗發(fā)現(xiàn)vuNCED蛋白N-末端序列可起到轉(zhuǎn)運肽的作用，能將 vuNCED轉(zhuǎn)運至質(zhì)體內(nèi)。在鱷梨中，Tacqueline等己分離得到了三個NCED同源cDNA，并 發(fā)現(xiàn)其中的PaNCED 1及PaNCED3與果實成熟中ABA的合成有關(guān)。PaNCED 1及PaNCED3 都在其N-末端具有轉(zhuǎn)運肽，類似于玉米、豇豆中的NCED，能從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運進入質(zhì)體中起作 用(Chernys JT， Zeevaart JAD. Characterization of the 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene family and the regulation of abscisic acid biosynthesis in avocado. Plant Physiol, 2000, 124:343-353)。目前的研究表明，NCED是在胞質(zhì)內(nèi)合成后在轉(zhuǎn)運肽引導下進入質(zhì)體后再 進行催化葉綠醇的氧化裂解的。
隨后在擬南芥(Neill SJ, Burnett EC, Desikan R, Hancock JT. Cloning of a wilt responsive cDNA from an ^ra辦^fo戸j suspension culture cDNA library that encodes a putative
9-"、-epoxycarotenoid dioxygenase. J.Exp. Bot" 1998, 49:1893-1894)、大豆(QinX, Zeevaart JAD. The 9-c/5"-epoxycarotenoid cleavage reaction is the key regulatory step of abscisic acid biosynthesis in water-stressed bean. Proc Natl Acad Sci USA, 1999， 96:15354-15361)、番茄
(Burbidge A, Grieve TM, Jackson A, Thompson A, McCarty DR, Taylor IB. Characterization of the ABA-deficient tomato mutant wotoM/s and its relationship with maize印M. Plant J, 1999, 17(4):427-431)和葡萄(Soar CJ, Speirs J, Maffei SM, Loveys BR. Gradients in stomatal conductance, xylem sap ABA and bulk leaf ABA along canes of Wfc v/m》racv 57i!>az: biochemical and molecular biological evidence indicating their source. Functional Plant Biology, 2004, 31:659-669)中均克隆了NCED基因。Tan等(2003)系統(tǒng)分析了擬南芥基因組中iVC五Z) 基因家族的表達模式，發(fā)5jL4^VCEDs基因的表達有組織和發(fā)育特異性，且不同的AtNCEDs 蛋白與葉綠體膜有著不同的結(jié)合能力，表明植物體內(nèi)ABA的生物合成在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻 譯后等各水平上受WC五D基因表達的時空特異性調(diào)控(Tan BC, Joseph LM, Deng WT， Liu L， Li QB， Cline K, McCarty DR. Molecular characterization of the Arabidopsis 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene family. The Plant Journal, 2003, 35:44-56)。
NCED的基因是一多基因家族。VP14、 PaNCEDl禾卩PaNCED2等都是9-順環(huán)氧類胡蘿
卜素雙加氧酶家族中的成員(Chernys JT， Zeevaart JAD. Characterization of the 9-cis-epoxycarote加id dioxygenase gene family and the regulation of abscisic acid biosynthesis in avocado. Plant Physiol, 2000, 124:343-353)。在玉米、大豆、擬南芥、番燕及鍔梨中NCED 的氨基酸序列60。/。同源(Burbidge A, Grieve TM， Jackson A， Thompson A， McCarty DR, Taylor IB. Characterization of the ABA-deficient tomato mutant and its relationship with
maize印".Plant J， 1999, 17(4):427-431 )。
最早從玉米突變體中發(fā)現(xiàn)的玉米F尸W基因(即iVC五D)的誘導表達與ABA水平的增加 成平行關(guān)系，認為干早誘導的ABA合成受WC￡Z)活性的調(diào)控(Schwartz SH, Le'on-Kloosterziel KM, Koornneef M， Zeevaart JAD. Biochemical characterization of the oZ>"2 and a6<ad mutants in^4ra6油戸'sPlant Physiol, 1997a， 114:161-166)。 Cheng等(2002) 報道在Landsberg遺傳背景下的擬南芥中，ABA可誘導AM:五ZW基因表達，除此以外，干旱 和鹽脅迫處理后，ABA缺乏型突變體/oW，和/o^中AJVC五A 轉(zhuǎn)錄水平與野生型幼苗相比 明顯降低，表明在滲透脅迫中JWC五ZW的完全激活需要ABA (Xiong LM, Lee H, Ishitani M, Zhu JK. Regulation of osmotic stress responsive gene expression by the iOS6/45乂/ locus in Jra6W0;7w:y. J Biol Chem, 2002, 277:8588-8596)。這些結(jié)果表明ABA生物合成的正反饋調(diào)節(jié) 作用存在，但干早誘導的NCED基因表達的反饋調(diào)節(jié)機制有待進一步研究。
NCED在果實成熟、萎蔫、缺水等過程或條件下對植物中ABA的合成起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié) 作用。萎蔫過程中VP14的表達與ABA水平的升高成平行關(guān)系。鱷梨中NCED組織特異性表 達，劉其蛋白活性研究發(fā)現(xiàn)果實成熟過程中ABA的變化與NCED的表達也是一致的。豇豆 在干旱環(huán)境中編碼ZEP的VuABA2基因并不表達，但VuNCEDl基因卻高度表達。在海棠根 系中脂氧化酶(LOX)活性與ABA的積累一致，用LOX的專一抑制劑去甲愈創(chuàng)木酸(MDGA) 抑制LOX活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脅迫誘導的ABA被阻斷(楊洪強、賈文鎖、張大鵬，水分脅迫下 湖北海棠根系脂養(yǎng)合酶活性與ABA積累的關(guān)系.植物學報，2000年03期)。NCED為LOX的 同工酶或同類酶，同樣可裂解C4o類胡蘿卜素。因此，NCED是ABA生物合成中最關(guān)鍵的酶。
綜上所述，脫落酸(ABA)作為一種調(diào)控生長發(fā)育的激素，對植物胚胎發(fā)育、種子休 眠、果實成熟和抗逆性等多種生理過程起著重要的調(diào)控作用。干旱條件下，ABA的累積是 以ABA合成酶基因的調(diào)控為基礎(chǔ)的。ABA在植物響應(yīng)水分脅迫中的作用，ABA參與了氣孔 活動的調(diào)控。在干旱條件下，植物體內(nèi)的ABA含量增高，ABA促進了開放的氣孔關(guān)閉和 抑制了關(guān)閉的氣孔開放，最終結(jié)果是關(guān)閉氣孔，從而降低了植物水分的蒸發(fā)(Mishra G, Zhang W, Deng F， Zhao J, Wang X. A bifurcating pathway directs abscisic acid effects on stomatal closure and opening in爿rafoVfo;M7、. Science, 2006, 312:264-266)。 9陽順式環(huán)氧類胡蘿 卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoiddioxygenase， NCED)是高等植物ABA生物合成途徑 中的關(guān)鍵酶。ACED基因受逆境脅迫誘導，導致逆境ABA的積累。研究iVC五D基因的克隆、 表達、調(diào)控ABA的生物合成是提高植物抗逆性的重要途徑。
生物節(jié)水是抗旱節(jié)水的一個重要途徑，只有提高作物自身的水分利用效率才有可能取 得節(jié)水農(nóng)業(yè)的新突破。利用現(xiàn)代的分子遺傳轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以將不同物種間的抗旱節(jié)水基
因進行轉(zhuǎn)移，培育出新的抗旱節(jié)水、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的生物新品種，這就是生物節(jié)水研究的重要 方向。目前我國在作物的水分利用效率生理遺傳育種及分子生物學等方面的研究還很薄 弱，因此，在作物抗旱節(jié)水基因工程的很多方面還有待大力加強，這對我國節(jié)水農(nóng)業(yè)和可 持續(xù)農(nóng)業(yè)的深入發(fā)展有著重要意義。
干旱(水分脅迫)是影響植物生長發(fā)育的主要逆境因子，能誘導許多參與逆境響應(yīng)基 囚的表達。目前，水分脅迫及其信號轉(zhuǎn)導機制雖然在擬南芥中已有廣泛研究(ShmozakiK, Yamaguchi-Shinozaki K. Gene expression and signal transduction in water-stress response. Plant Physiology, 1997, 115:327-334)，但相關(guān)工作在單子葉植物中的系統(tǒng)研究還很有限，尤其對 農(nóng)作物開展的研究相對較少，特別是農(nóng)作物響應(yīng)干早信號與其WCED基因表達和ABA水平 之間的關(guān)系及其機制仍有待闡明。
此外，環(huán)境中的非生物脅迫嚴重影響植物的生長和發(fā)育，造成農(nóng)作物的減產(chǎn)，是限制 農(nóng)作物和其他經(jīng)濟作物產(chǎn)量的重要因素之一，因而培育耐逆的作物品種是農(nóng)業(yè)的主要目標 之一。水稻是世界上最重要的糧食作物，也是單子葉植物的模式植物，它為全球近一半的 人口提供食物。然而，干旱、高鹽和低溫等逆境脅迫，每年都會在全世界范圍內(nèi)造成水稻 大面積的減產(chǎn)，全球約有40%的水稻種植區(qū)受到不同程度的環(huán)境脅迫。隨著全球人口的不 斷增加和可耕種面積的逐年減少，提高水稻產(chǎn)量成為全球所共同面臨的一個緊迫的挑戰(zhàn)， 而減少逆境脅迫所造成的產(chǎn)量損失，就能夠在很大程度上緩解糧食危機。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一組水稻中與耐旱相關(guān)的CWVCEZ^基因。 本發(fā)明所提供的與耐旱性相關(guān)的OyTVC五i^基因，來源于稻屬水稻(L.)， 編碼的蛋白質(zhì)具有下述氨基酸序列之一
1) 序列表中的SEQIDNO: 1;
2) 序列表中的SEQIDNO: 3;
3) 序列表中的SEQIDNO: 5;
4) 將序列表中SEQIDNO: 1、 3或5的氨基酸序列經(jīng)過- -至十個氨基酸殘基的取代、 缺失或添加，且所衍生的蛋白質(zhì)具有調(diào)控植物耐旱性的功能。
序列表中的SEQIDNO: 1由608個氨基酸殘基組成，其中，自氨基端第108-601位 氨基酸殘基為RPE65保守區(qū)，將具有該氨基酸殘基序列的蛋白命名為OsNCED3;序列表 中的SEQIDNO: 3由582個氨基酸殘基組成，其中，自氨基端第76-575位氨基酸殘基為 RPE65保守區(qū)，將具有該氨基酸殘基序列的蛋白命名為OsNCED4;序列表中的SEQ ID NO:
5由613個氨基酸殘基組成，其中，自氨基端第110-606位氨基酸殘基為RPE65保守區(qū)， 將具有該氨基酸殘基序列的蛋白命名為OsNCED5;所述取代、缺失或添加的一至十個氨 基酸殘基可以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產(chǎn)生影響。
本發(fā)明來源于水稻的與耐旱性相關(guān)的CWVC五Z^基因，可以具有下述核苷酸序列之一
1) 序列表中SEQ ID NO: 2的DNA序列；
2) 序列表中SEQ ID NO: 4的DNA序列；
3) 序列表中SEQ ID NO: 6的DNA序列；
4) 與序列表中SEQ ID NO: 2、 4或6限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼 具有調(diào)控植物耐旱性功能的蛋白質(zhì)；
5) 在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID NO: 2、 4或6限定的DNA序列雜交的核
苷酸序列。
所述高嚴謹條件為在0.1xSSC (或0.1xSSPE)、 0.1。/。SDS的溶液中，65。C條件下雜交 并洗膜。其中，O.lxSSC為20xSSC的稀釋液，20xSSC的配方為3mol/LNaCl (175g/L), 0.3mol/L檸檬酸三鈉.2H20 (88g/L)，用lmol/LHCl調(diào)至pH 7.0。
序列表中的SEQ ID NO: 2由1827個堿基組成，其開放閱讀框架為自5'端第1-1827 位堿基，編碼具有序列表中SEQIDNO:l的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中，自'5'端第322-1803 位堿基編碼RPE65保守區(qū)，將具有該核苷酸序列的基因命名為0^VC五I)3;序列表中的SEQ ID NO: 4由1749個堿基組成，其開放閱讀框架為自5'端第1-1749位堿基，編碼具有序列 表中SEQIDNO: 3的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中，自5'端第226-1725位堿基編碼RPE65 保守區(qū)，將具有該核苷酸序列的基因命名為OsWC￡Z>/;序列表中的SEQ ID NO: 6由1842 個堿基組成，其開放閱讀框架為自5'端第1-1842位堿基，編碼具有序列表中SEQIDNO: 5 的氨基酸序列的蛋白質(zhì)， 其屮，6 5'端第328-1818位堿基編碼RPE65保守區(qū)，將具有 該核苷酸序列的基因命名為C^VC5D5。
含有本發(fā)明基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
擴增CWVC五ZW、 OsTVC五ZW、 OyW五i)五5中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種提高植物耐旱性的方法。
本發(fā)明所提供的提高植物耐旱性的方法，是將本發(fā)明與耐旱性功能相關(guān)的基因(例如: 6^VC五DJ、 ayM7五ZM、 OyA^Z)五5或與這些基因具有90X以上同源性且編碼相同功能蛋白 的DNA序列)導入植物組織、細胞或器官，使植物耐旱性獲得提高。
在上述提高植物耐旱性的方法中，本發(fā)明水稻與耐旱性相關(guān)基因(CWVC五ZW、 CWVC￡￡M、 CWV￡I>￡5)既可為所述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組基因序列； 與所述基因具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列，是將所述基因的cDNA 或基因組基因序列用已知的方法進行分離和/或修飾和/或設(shè)計得到的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員 應(yīng)該理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改變可能會導致該基因效能的降低或 者加強，而且在一些應(yīng)用(例如，反義或共抑制技術(shù))中，部分序列經(jīng)常會和全長序列同 樣有效地發(fā)揮作用?；蛐蛄凶兓蚩s短的方法，以及測試這些發(fā)生變化的基因的有效性 的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
編碼本發(fā)明7k稻與耐旱性相關(guān)基因(0 M^ZW、 OjM:5ZM、 QsiV￡:￡)￡5)或其同源序列 可通過植物表達載體導入植物組織、細胞或器官；用于構(gòu)建所述植物表達載體的出發(fā)載體 可為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟 擊的載體等，如Gateway 系列載體(如pH2GW7等)、pBin系列載體(如pBinl9等)、 pBI系列載體(如pBI101等)、pCAMBIA系列載體(如pCAMBIA 1301等)、per8、 pX6 或其它衍生植物表達載體，所述出發(fā)載體還可為可在原核生物中復(fù)制的載體，如 pENTER-TOPO、 pUC系列載體或pBluescript系列載體等。
使用編碼本發(fā)明水稻與耐旱性相關(guān)基因(o m:五z)5、 as7vc五a/、 ay^vfi^"或其同
源序列構(gòu)建植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組 織特異型或誘導型(ABA、干旱、鹽堿或化學誘導等)啟動子所述組成性表達啟動子可 為花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子，玉米Ubiquitin啟動子或水稻actinl啟動子等；所 述組織特異性表達啟動子可為根特異性表達啟動子、葉片特異性表達啟動子、維管特異性 表達啟動子、種子特異性表達啟動子、花特異性表達啟動子或花粉特異性表達啟動子，如 2S1啟動子(GenBank號NM—118848.2， GI:30687489)和NapinA (GenBank號M64633.1， GL349405)啟動子等；所述誘導型啟動子可為受低溫、干旱、ABA、乙烯、鹽堿或化學等 誘導的啟動子。上述啟動子可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用。此外，使用本發(fā) 明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增 強子區(qū)域可以包含ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框 相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可 以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加 工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、 GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、
潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycinphosphotransferase)基因、慶大霉素標記物或卡那霉素標 記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII) 基因的宿主植物細胞、組織或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等進行篩選，含 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycinphosphotransferase)基因的宿主植物細胞、組織或器官可 由潮霉素進行篩選。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆 境篩選轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)上述方法進行篩選后還可采用Southern、 PCR或點雜交等分子檢測手 段對轉(zhuǎn)基因植株進行檢測，以確定其是否轉(zhuǎn)化有目的基因。
其中，以pH2GW7 (購自inVitrogen公司)為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有本發(fā)明水稻與耐 旱性相關(guān)的a AC'EZ^基因的植物表達載體為pH2GW7 Vector-as7VC五Z)3、 pH2GW7 Vector-QyAC五ZM、 pH2GW7 Vector-歸C五D5。
攜帶有編碼本發(fā)明zK稻與耐旱性相關(guān)的基因(awvc五"j、 ayivc￡i>( qva^d五5)或其
同源序列的植物表達載體可通過使用原生質(zhì)體-化學介導法(Ca^、 PEG)、 Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、 植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管導入、微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌介導等常規(guī) 生物學方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的植物 細胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果莢、愈傷組織、莖尖、 葉片和種子等。
此外，通過將轉(zhuǎn)化有編碼本發(fā)明水稻與耐旱性相關(guān)基因(CWVCfiD3、 CWVCED4、 <9^VED￡"或與所述基因具有90%以上同源性且編碼功能相同蛋白的DNA序列的轉(zhuǎn)基因 植株進行繼代培養(yǎng)后，可從中進一步篩選出基因純合的轉(zhuǎn)基因植株。此外，還可對該轉(zhuǎn)基 因植株進行擴繁，可使轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性進一步改善和提高。所述轉(zhuǎn)基因植物的擴繁包 括無性繁殖和/或種子繁殖。
本發(fā)明的方法對雙子葉植物和單子葉植物均適用，因此，所述被轉(zhuǎn)化的植物細胞、組 織或器官既可來源于煙草、油菜、棉花、大豆、楊樹、桉樹、馬鈴薯或牧草等雙子葉植物， 也可來源于水稻、玉米、小麥、大麥、高梁、谷子或草坪草等單子葉植物。
本發(fā)明提供了一組來源于水稻與ABA合成相關(guān)的可提高耐旱性的CWVC五i^家族基 因。實驗證明，將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化水稻可顯著提高水稻對干旱脅迫的耐受性，且對水稻 的正常生長和經(jīng)濟性狀沒有明顯的影響。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锬婢衬褪苄?機制的研究，以及提高植物的耐逆性及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實際意義，將在 植物(特別是禾谷類作物)的抗逆基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖1為來自水稻的與耐旱性相關(guān)o^vc五z^基因的結(jié)構(gòu)域的同源性比對結(jié)果。
圖2為來自水稻的與耐旱性相關(guān)的C^VC五Z^基因與已知的擬南芥的AtNCED3的進化 樹(以RPE65結(jié)構(gòu)域的保守性為依據(jù))。
圖 3 為 Os7^C五Z)3-pH2GW7 、 OsiVC五D3-pHORD 、 OyMl'fZW-pH2GW7 和 QyM^n5-pHORDTl代轉(zhuǎn)基因水稻不同株系耐旱苗比例圖。
圖4為經(jīng)干旱脅迫的OyTVC五DJ-pH2GW7、 Os^C五A3-pHORD、 OWVC五ZM-pH2GW7 和6^VC￡A5-pHORD T代轉(zhuǎn)基因耐旱植株與野生型植株的對比照。
圖 5 為 Os'iVCEZ)3-pH2GW7 、 Os'M7五D3-pHORD 、 OyTVC五ZM-pH2GW7 和 CtoVC五Z)5-pHORD T2代轉(zhuǎn)基因水稻不同株系耐旱苗比例圖。
圖6為經(jīng)千旱脅迫的a^C五D3-pH2GW7、 CWVC五D3-pHORD、 OWVC五Z)4-pH2GW7 和C^M7五mpHORD T2代轉(zhuǎn)基因耐旱植株與野生型植株的對比照。
圖7為Q^VCEZX3-pH2GW7、 O^C￡￡^-pH2GW7轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻種子萌 發(fā)的時間關(guān)系圖。
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》(Sambrook， J., Russell， David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001， NY, Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均 由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。
實施例1、耐旱基因OsiVC^Zfe的獲得
1、 基因序列的獲得
我們以擬南芥^/iVC五D3的cDNA序列為基礎(chǔ)在水稻基因組數(shù)據(jù)庫中做blast分析。發(fā) 現(xiàn)了與v^VC五D3序列高度同源的3個CWVC五Ds基因，分別命名為C^A^五D3(AY838899)、 Q^iVC五D《AY838900)、 CWVC五D5(AY838卯1)。
2、 QsWCEZW、 C^VCfiZW禾n CWVC五Z)5的PCR擴增及序列分析 以水稻中花ll號(Ory加,raf/ra "ZhonghuaNO.il")的總DNA為模板，采用PCR方法
擴增OsACED3、 OrMH)么(9^VC￡￡>5，引物序列如下 (1)按OsvVC五ZW的CDS序列設(shè)計引物 OsiVC朋-F 5，- CACCACAAAATGGCGACGATCACGACG- 3'歸C五D3-R 5'-GGCCTGGGTGGTGAGCTC- 3，
(2) 按CteVC￡Z^的CDS序列設(shè)計引物
O^VC￡XKF 5'-CACCACAAAATGGCGTCCTCCGCGCCTT- 3' O^VC￡X 4-R 5, - AGCTTGTCGCTGCAGCTCGTT- 3'
(3) 按CWVCEZX5的CDS序列設(shè)計引物
Ov,m5-F 5'-CACCACAAAATGCCGACCACCTTCACGCC- 3， QsM:咖-R 5 ， - GGCCTGCGTGGCGAGCT- 3'
25plPCR反應(yīng)體系為上、下游引物各lpl， DNA模板ljil， Taq酶0.5pl， lOxdNTPs 1 Hi' 10 xbuffer (Mg2+) 2.5 pi ， H20 18(J 。
PCR反應(yīng)條件為預(yù)熱94°C預(yù)變性2min、然后94°C變性30 s、 60°C退火40 s、 72°C 延伸90s，共進行30個循環(huán)；最后72'C延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進 行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)擴增獲得了大小分別為1827bp， 1749bp， 1842bp的DNA 片段，與預(yù)期結(jié)果相符。
回收并純化上述片段，將其分別連接入載體pENTER-TOPO (Invitrogen公司)中，再 將連接產(chǎn)物分別用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(￡. CO//) DH5ct感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，挑 選陽性單菌落加入到5mL含50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、 200rpm下培 養(yǎng)12-16小時，提質(zhì)粒，得到含有目的片段的重組質(zhì)粒，分別命名為pENTER-TOPO Vector-CWVCEDJ、 pENTER-TOPO Vector-a^CED4禾卩pENTER-TOPO Vector-(9sM:￡D5 對上述質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果表明獲得了序列正確的QyM:五仍、CWVC五D4和CfeVC￡D5。 其中，a JVC五ZW具有序列表中SEQIDNO: 2的核苷酸序列，由1827個堿基組成，其開 放閱讀框架為自5'端第1-1827位堿基，編碼具有序列表中SEQIDNO: 1的氨基酸序列的 蛋白質(zhì)，其中，自5'端第322-1803位堿基編碼RPE65保守區(qū)，與AtNCED3 (GenBank號 NPJ88062)的氨基酸序列具有79W的一致性，與玉米的ZraVP14分別有卯％的同源性； aWVCEZW具有序列表中SEQIDNO: 4的核苷酸序列，由1749個堿基組成，其開放閱讀 框架為自5'端第1-1749位堿基，編碼具有序列表中SEQIDNO: 3的氨基酸序列的蛋白質(zhì)， 其中，自5'端第226-1725位堿基編碼RPE65保守區(qū)，與AtNCED3(GenBank號NP—188062) 的氨基酸序列具有80%的一致性，與玉米的ZmVP14分別有80%的同源性；OsAC五D5 具有序列表中SEQIDNO: 6的核苷酸序列，由1842個堿基組成，其開放閱讀框架為自5' 端第1-1842位堿基，編碼具有序列表中SEQIDNO: 5的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中，自 5'端第328-1818位堿基編碼RPE65保守區(qū)，與AtNCED3 (GenBank號NP—188062)的
氨基酸序列具有80%的一致性，與玉米的ZmVP14分別有83%的同源性；對OyiVCEZ)3、 C^WC五D4和C^VC五i)5編碼的氨基酸序列進行序列比對分析，結(jié)果如圖l所示，比對結(jié)果 表明上述各基因編碼氨基酸序列具有79.3%的一致性，歸為同一類NCEDs基因。同時， 根據(jù)序列比對結(jié)果建立了 OsNCEDs (GenBank號AAW21319,AAW21320, AAW21321)與 己知的擬南芥的AtNCED基因的進化樹，如圖2所示，表明本發(fā)明來源于水稻的與抗旱性 相關(guān)的NCED基因與已知的擬南芥的AtNCED基因具有較高的同源性，氨基酸一致性可達 79%以上。
實施例2、水稻中耐旱相關(guān)O^VCEZ)*基因的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得 用農(nóng)桿菌介導法將實施例1獲得的與耐旱性相關(guān)的基因CtoVCEZ)3、 CWVC5ZW和 "WCEZ^分別轉(zhuǎn)化水稻，具體方法如下
1) pHORD載體的構(gòu)建
將pH2GW7載體(Invi加gen公司的Gateway vector載體，含CaMV 35S組成型啟 動子)中的CaMV 35S組成型啟動子換成擬南芥W2A4誘導型啟動子(Narusaka Y. Nakashima K, Shinwari ZtC, Sakuma Y, Furihata T, Abe H, Narusaka M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Interaction between two cis-acting elements, ABRE and DRE, in ABA-dependent expression of Arabidopsis rd29A gene in response to dehydration and high-salinity stresses. Plant Journal， 2003， 34(2): 137-48.)。具體方法以擬南芥基因組DNA 為模板，用rd29A-Fl (5，-CACCGAGCTCATTTTCGTTCTTGACATCATTCA-3，，含&cl 酶切位點)和rd29A-Rl (5，-GGACTAGTGATTGTTTTCTAGTTTGCATATTTG- 3，，含S， I 酶切位點)引物擴增rd29A啟動子片段(Prd29A)獲得488bp片段，并克隆至pGEM-T 載體(購自Promega公司)，獲得質(zhì)粒pGEM-T Easy-Prd29A (3503bp);用限制性內(nèi)切酶 &c I和I雙酶切pGEM-T Easy-Prd29A，通過瓊脂糖凝膠電泳回收474bp的片段，并 將該片段連接到Sac I和Spe I雙酶切后的pH2GW7載體上，獲得誘導型植物表達載體 pHORD (薦87bp)。
2) 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
通過LR反應(yīng)將實施例1中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pENTER-TOPO Vector-O^C五ZW 、 pENTER-TOPO Vector-CWVC￡D4和pENTER-TOPO Vector-O^C￡:D5分別重組到表達載體 pH2GW7和表達載體pHORD上，LR反應(yīng)體系為2pl緩沖液，2 [il (150-300 ng)線性化 的pH2GW7 (或pHORD)質(zhì)粒DNA， 2 pi (100-300 ng) pENTER-TOPO Vector-OvM^m pENTER-TOPO Vector-O^C五D4或pENTER-TOPO Vector-O^VC￡D5質(zhì)粒DNA， 2 pi H20，再加入2 nl LR Clonase, LR反應(yīng)條件為25。C水浴保溫1-3 h，加入1 pl 2 U/pl蛋 白酶K， 37°C水浴10 min。然后，通過熱激法將上述重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(￡. co/DDH5a 感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，挑選陽性單菌落加入到5mL含50mg/L的壯觀霉素的LB液 體培養(yǎng)基中，在37'C、 200rpm下培養(yǎng)12-16小時，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRI進 行酶切鑒定，經(jīng)酶切獲得了大小分別為1827bp、 1749bp和1842bp的酶切產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié) 果相符，再在實施例1中引物的引導下進行PCR鑒定，鑒定結(jié)果表明獲得了分別含有 OsiVC￡:Z)3、CWVC￡/>/和<%WC￡D5的重組植物表達載體，分別命名為a^C五ZW-pH2GW7、 OyA^五Z)3-pHORD、 a^VC五D^pH2GW7和(95WC五Z)5-pHORD，隨后將上述重組載體分別 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL0菌株(中國科學院遺傳所贈送)。 3)侵染水稻愈傷組織
挑取歩驟2)獲得的陽性重組農(nóng)桿菌的單菌落接種于含壯觀霉素50mg/L和利福平 50mg/L的20mL YEB液體培養(yǎng)基中，在28°C、 150rpm下振蕩培養(yǎng)2-3天，再于4°C 、5000rpm 離心3分鐘，去上清，將菌體沉淀重懸于含0.1mmol/L乙酰丁香酮的AA培養(yǎng)基 (Co(N03)2-6H2O0.15mg/L， CaCl2 110mg/L， MgS04 122mg/L， KI3.75mg/L， NaH2P04'H20 150mg/L， Na2-EDTA0.01mM， FeS04'7H20 139mg/L， KC12.95g/L， MnS04'4H20 84.5mg/L， ZnS04.7H20 6.25mg/L， H3B03 5mg/L， Gly 37.5mg/L， CuS04 0.005mg/L， Na2Mo04'2H20 1.25mg/L，鹽酸硫胺素VB, 5mg/L，煙酸5mg/L，鹽酸吡哆醇VB6 5mg/L，肌酸0.1g/L， 酪蛋白水解物0.3g/L， L-Gln 87.6mg/L， L-Asp 26.6mg/L，蔗糖20g/L)中，在28'C下避光 振蕩培養(yǎng)1-2小時至OD6W) = 0.6-0.9。挑選按常規(guī)植物組織培養(yǎng)方法獲得的水稻中花11的 生長狀態(tài)良好、顆粒狀愈傷組織浸入上述分別轉(zhuǎn)化有CtoVC五ZW-pH2GW7 、 (9sM:五Z^-pH0RD、 QsM^X)4-pH2GW7禾B asWC￡D5-pHORD的重組農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中搖 動20分鐘后，靜置30分鐘，取出，用無菌濾紙吸干多余菌液，將愈傷組織接種于N6共培 養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基+ 10g/L葡萄糖+ lmg/L乙酰丁香酮+2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 2mg/L) 上培養(yǎng)，其中N6基本培養(yǎng)基的配方為(NH4)2S04 0.46g/L， KN03 2.83g/L， CaCl2 0.2g/L， MgSO40.092g/L， KH2PO40.4g/L， Na2-EDTA0.15g/L， FeS04'7H20 0.11g/L， MnS04.4H20 0.44g/L， ZnS04.7H20 0.17g/L， H3B03 0.14g/L, CoCl2'6H20 0.0005g/L ， CuS04'5H20 0.0005g/L， Na2Mo04'2H20 0.005g/L,鹽酸硫胺素VB, 0.01g/L，煙酸0.001g/L，鹽酸吡咳 醇VB6 0.001 g/L，肌酸0.1g/L,酪蛋白水解物0.3g/L，L-Pro0.5g/L，蔗糖30g/L，瓊脂10g/L, pH5.S。 2-3大后，將愈傷組織放入廣口瓶中，用無菌水沖洗3-5次，每次搖動數(shù)次，然后 在含500mg/L頭孢霉素的無菌水中浸泡30-60分鐘，最后再用無菌水沖洗l遍，置于無菌 濾紙上晾干，最后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(N6基本培養(yǎng)基+ 2,4-D2mg/L+頭孢霉素250mg/L)篩 選。
4)陽性轉(zhuǎn)基因水稻的獲得
將侵染后的水稻愈傷組織于N6共培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3-5天后，轉(zhuǎn)至含30mg/L潮霉素和 400mg/L頭飽霉素的N6固體培養(yǎng)基(N6大量元素+B5微量元素+Bs有機成分+300mg/L 水解酪蛋白+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+7-8g/L瓊脂，pH5.8)上篩選3周，再轉(zhuǎn)入含 50mg/L潮霉素和200mg/L頭飽霉素的N6固體培養(yǎng)基上篩選4周，隨后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn) 入預(yù)分化培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基+ lmg/L奈乙酸+2mg/L6-芐基氨基嘌呤+5mg/L脫落酸)，光 照培養(yǎng)3周，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基+ lmg/L奈乙酸+2mg/L6-芐基氨基嘌呤)上 進行分化，將生長出的再生植株在壯苗培養(yǎng)基(1/2 MS無機鹽+ 0.5mg/L奈乙酸+ 0.25mg/L 多效唑)上進行生根培養(yǎng)后移至溫室中，在28°C、 15小時/天的光照下培養(yǎng)1個月后取植 株葉片，按常規(guī)方法提取總DNA，在正向引物5'-ACTCACCGCGACGTCTGT-3'和反向 弓1物5'-TTCCTTTGCCCTCGGACG-3'的弓I導下，PCR擴增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，經(jīng)擴 增獲得1009bpDNA片段的為陽性轉(zhuǎn)基因植株，檢測結(jié)果表明用上述方法獲得了分別轉(zhuǎn)化 有OsWC五D3-pH2GW7， CWVC五D3-pH0RD， CWVCEi^層pH2GW7禾fl O^C￡Z>5-pH0RD 的轉(zhuǎn)基因水稻。
實施例3、轉(zhuǎn)基因Tl代水稻植株的遺傳分析和分子鑒定
取實施例2收獲的6!^VC5ZW-pH2GW7、 6WVC五Z^-pH0RD、 Os'iVC五i^-pH2GW7禾口 C^iVC五A5-pHORD Tl代轉(zhuǎn)基因水稻的種子，用水浸種培養(yǎng)3天使其萌發(fā)，然后用50mg/L 潮霉素進行抗性篩選，同時以未轉(zhuǎn)基因水稻中花ll作對照，篩選5天后，對照植株全部死 亡，統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗性分離比，選擇抗性苗與無 抗性苗的分離比約為3 : l的株系，結(jié)果表明獲得了具有單位點插入的O^VCEi^-pH2GW7、 OsiVC五i)3-pHORD、 CWVCED^pH2GW7和CWVC五DJ-pHORD轉(zhuǎn)基因株系。
選取生長期為15天的單位點插入的轉(zhuǎn)基因株系的植株，用Trizol試劑提取各植株總 RNA，使用申能博彩公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒并參照試劑盒說明以總RNA (lpg)為模板反轉(zhuǎn) 錄合成其cDNA，再以合成的cDNA為模板，以水稻actinl基因(GenBank號P13362) 為內(nèi)源參照，利用相應(yīng)的基因特異性引物，對轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源表達的OsJVC五D3、 OsiVC五IM 和OsiVC五i)5的表達水平進行半定量RT-PCR分析，檢測目標基因是否過表達，以野生型 水稻為對照(CK)，引物序列如下 OsNCED3畫RT-F: 5'- CGCCAGGATATGCTCACA-3' OsNCED3陽RT-R: 5'匿AGGACATTCGCCACAAAC-3';OsNCED4陽RT-F: 5'- ATCGTGGTCATCGGCTCCT-3' OsNCED4-RT-R: 5'-AACTTCTCCGCCGTGCC-3'; OsNCED5-RT-F: 5'- AGAAGAAGGATGGGCTGA-3' OsNCED5-RT-R: 5'- GCAGTCTCGGTGAAGCG-3';
檢測水稻actinl基因的引物
ACTIN-F: 5'陽TCCGTGACATCAAGGAAAAG-3';
ACTIN-R: 5'- GATATCAACATCGCACTTCATG-3'。
25nlRT-PCR反應(yīng)體系為上、下游引物各0.5pl， cDNAlpl， Taq酶0.3pl， dNTPs 0.5^1， 10xPCR緩沖液2.5|il， H2O20.2pl。 RT-PCR反應(yīng)條件為95。C 5min預(yù)熱，然后94°C lmin, 55°C 40s， 72°C lmin， 30個循環(huán)，最后72'C 10min。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果表明(9^VC五D3、 CWVC五ZW和C^VC五"5在各自的轉(zhuǎn)基因 植株內(nèi)均獲得高水平表達。
實施例4、轉(zhuǎn)基因Tl代植株耐旱性鑒定
收獲 a^CED3-pH2GW7 、 OsMT五mpHORD 、 OiWC五D4-pH2GW7 和 OyiVC^Z 5-pHORDTl代轉(zhuǎn)基因水稻種子。用水浸種培養(yǎng)3天使其萌發(fā)，然后用50mg/L潮 霉素進行抗性篩選，同時以未轉(zhuǎn)基因水稻中花11作對照，篩選5天后，對照植株全部死亡， 統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗性分離比，獲得具有單位點插入 的OyAC五D3-pH2GW7、 Oy7VC五D3-pHORD、 OsTVC五Z^-pH2GW7禾卩OyiVC五D5-pHORD轉(zhuǎn) 基因株系，并進行Southern印記分析，進一步鑒定外源插入基因的拷貝數(shù)。每個基因選擇 5個不同的單拷貝轉(zhuǎn)基因株系，繼續(xù)培養(yǎng)10天后對其轉(zhuǎn)基因陽性苗進行干早處理，同時設(shè) 未轉(zhuǎn)基因的水稻中花11植株作對照。將水稻幼苗種入裝箱的土壤中，采用蛭石營養(yǎng)土比 例為3 : 1的混合土， 土壤的含水量限定為55-65%之間(采用烘干法測量土壤含水量，根 據(jù)土壤烘干前后土壤重量的差值計算土壤的含水量)。從處理即日起不再澆水，采用重復(fù) 干旱法，即當同一培養(yǎng)箱中約50%的幼苗表現(xiàn)出萎蔫時結(jié)束第一次干旱，復(fù)水約7天，使 苗恢復(fù)生長，再進行第二次干旱處理，直至絕大多數(shù)的未轉(zhuǎn)基因水稻苗的葉片干枯、莖桿 脫水彎曲、死亡，而各轉(zhuǎn)基因株系的生長狀態(tài)良好，葉片稍下垂，莖桿直立，停止篩選， 復(fù)水培養(yǎng)。此過程大約需要20-30天。在正常的復(fù)水培養(yǎng)條件下恢復(fù)生長2周后統(tǒng)計各轉(zhuǎn) 基因株系的成活苗數(shù)，計算耐旱苗比例，結(jié)果如圖3所示(橫坐標為不同的轉(zhuǎn)基因株系編
號，縱坐標為耐旱苗百分比)，與野生型(WT)對照植株相比，CWVC五D3-pH2GW7、 OyjVCED3-pHORD、 C^WC￡X^-pH2GW7和OsM^D5-pHORD轉(zhuǎn)基因水稻Tl代植株對干 旱脅迫的耐受性均明顯提高。6WVC五D3-pH2GW7、OyJVC五D3-pHORD、OsiVC五ZM-pH2GW7 和CWVC￡D5-pHORD轉(zhuǎn)基因水稻Tl代經(jīng)耐早處理后的植株與經(jīng)耐旱處理后的未轉(zhuǎn)基因?qū)?照植株如圖4所示，每張照片中WT為未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辏疫叺娜铻椴煌幪柕霓D(zhuǎn)基 因株系。篩選出的轉(zhuǎn)基因耐旱苗在大田屮繼續(xù)生長獲得T2代種子。
實施例5、轉(zhuǎn)基因T2代植株耐旱性鑒定
選取在Tl代的耐旱性篩選中有抗旱功能的轉(zhuǎn)基因水稻株系，收獲種子(T2代種子)， 對其T2代轉(zhuǎn)基因苗進行進一步耐旱性實驗鑒定。每個轉(zhuǎn)基因株系選擇3個T2代編號(要 求轉(zhuǎn)入基因為純合體)，每個T2代編號至少培養(yǎng)100株苗，培養(yǎng)至15天時丌始進行干旱 處理。將水稻幼苗植入裝箱的土壤中，采用蛭石營養(yǎng)土比例為3 : 1的混合土， 土壤的 含水量限定為55-65%之間(采用烘干法測量土壤含水量，根據(jù)土壤烘干前后土壤重量的 差值計算土壤的含水量)。從處理即日起不再澆水，采用重復(fù)干早法，即當同一培養(yǎng)箱中 50%的幼苗表現(xiàn)出蔞蔫時停止第一次干旱，復(fù)水約7天，使苗恢復(fù)生長，再進行第二次干 旱處理，直至絕大多數(shù)的未轉(zhuǎn)基因水稻苗的葉片干枯、莖桿脫水彎曲、死亡，而各轉(zhuǎn)基因 株系的生長狀態(tài)良好，葉片稍下垂，莖桿直立，停止篩選，復(fù)水培養(yǎng)。此過程大約需要20-30 天。在正常的復(fù)水培養(yǎng)條件下恢復(fù)生長2周后統(tǒng)計各轉(zhuǎn)基因株系的成活苗數(shù)，計算耐旱苗 比例(結(jié)果如圖5所示)，非轉(zhuǎn)基因的中花11作為對照(WT)基本上全部萎蔫，而轉(zhuǎn)基 因植株則表現(xiàn)出較強的抵抗干旱的能力。6WVC五D3-pH2GW7 、 6WVC五D3-pHORD 、 0 AC'￡i>/-pH2GW7和Qs'iVC￡A5-pHORD轉(zhuǎn)基因水稻T2代經(jīng)耐旱處理后的植株與經(jīng)耐旱 處理后的未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?WT)如圖6所示，每張照片中左邊的三株苗為未轉(zhuǎn)基因的 對照植株，右邊的三株苗為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因耐旱植株。篩選出的轉(zhuǎn)基因耐旱苗在大田中繼 續(xù)生長。
實施例6、 O^VC￡Z)《轉(zhuǎn)基因水稻的種子萌發(fā)過程發(fā)生延遲
將OwVC五ZW-pH2GW7和OyWCED4-pH2GW7轉(zhuǎn)基因水稻分別選取6個株系的 Tl代轉(zhuǎn)基因水稻種子，每個株系取200粒種子，用無菌水浸泡，使其發(fā)芽，同時設(shè)非轉(zhuǎn) 基因中花11水稻種子400粒作為對照株系，其中200粒和轉(zhuǎn)基因水稻種子一樣用無菌水發(fā) 芽(H20-CK)，另外200粒種子用含ABA濃度為lmg/L的無菌水發(fā)芽(ABA-CK)。記 錄丌始發(fā)苗的時間，并每隔24h分別計數(shù)各個轉(zhuǎn)基因株系和對照已經(jīng)萌發(fā)的種子的數(shù)量。 通過連續(xù)的觀察并計數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時間在48h左右的時候所有的種子均未發(fā)芽；到 72h時H20-CK的種子有接近5%的發(fā)芽率，轉(zhuǎn)基因水稻的種子和ABA-CK的種子均 未發(fā)芽；96h的時候H20-CK有近50°/。的種子發(fā)芽，轉(zhuǎn)基因水稻的種子和ABA-CK的 種子開始有約5%的種子發(fā)芽。因此可以看出，轉(zhuǎn)基因水稻種子的萌發(fā)明顯延遲于非轉(zhuǎn)基 因水稻的萌發(fā)時間，結(jié)果如圖7所示。同時，此表型類似施加了外源ABA時的非轉(zhuǎn)基因 水稻的萌發(fā)時間。
序列表(SEQUENCE LISTING)
<120〉 <130> <160> <170〉
北京未名凱拓農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司
一組與ABA合成相關(guān)的提高水稻耐旱性基因的克隆和應(yīng)用
JSP070225
6
Patentln version 3.1
<210> 1
10 <211> 608
<212〉 PRT
<213〉 水稻中花ll (Oo^/^riraZ.)
<400> 1 15 Met Ma Thr lie
1
Gly Arg Cys Ser 20
Arg Phe Ser Ala 20 35
Ser Ser Ala Pro 50
Ala Pro Ser Pro
65
25 Arg Lys Gly Glu
Ala Met Ala
Glu Arg
30
Ala
Pro 145 35 Asn
Gly 130 Val
Pro 115 Asn
Leu 100 His
Asp Gly Asp
40
Gly 225 45 Cys
Glu Ser Tyr 195 Ala Met 210
His Ser
Arg
Gly 180 Ala
Gly
Gly
Gly Leu Leu
Thr
5 Thr
Thr Pro Gly Tyr
Thr Ala
Arg Ala Val Ala
Ser
Glu 85 Asp
Phe Leu 55
Gly Lys 70
Gly Lys Ala Phe
Gly Leu Pro
Phe A丄a
Ser Gly Arg
Gly Ala Asn
Pro 165 Met
Pro Val 135 lie Pro 150
His Phe Val His
Cys Arg Phe
Arg Pro Met 215
lie Ala Arg
230 Asp Pro Ser 245
Gly Arg
25 Ser Ser 40
Pro Val
Ala 10 Arg
Val
Pro
Ser Al3工le
Axg Leu
Glu Glu 105 Ser Thr 120
Gly Glu
Asn
90
Gly
Ala
Thr
Pro Phe lie
Asp Pro Val 170
Ala Val Arg
185 Thr G上u 200
Phe Pro
Thr
Lys
Leu Ala Leu
His Gly Thr 250
His工le Gin Arg
Gin His 15
Ser Val
Gly Ala Ser Asn 30
Pro His Ala Ala Ala Ala 45
Phe Val Pro Gly Ala Asp
60
Gly Val Pro Lys 75
Phe Phe Gin Arg
Phe Val Ala Asn
110
Asp Pro Ala Val 125
Pro Pro Ala Arg 140
Asn Gly Val Tyr 155 , Ala Gly His His
Ala Pro
80
Ala Ala 95
Val Leu
Gin工le
Ma Leu
Ala Arg 160 Leu Phe 175
Ala Ala
lie Arg Asn Gly 190
Ala Arg Leu Arg Gin Glu 205
Ala工le Gly Glu Leu His 220
Phe Tyr Ala Arg Ala Ala 235 240 Gly Val Ala Asn Ala Gly 255
Leu lie Tyx Pro Tyr
5 Arg
Lys 305 lie
10
Lys
Asp
15 Val
Asp 385 Asp
20
His
Tyr 290 Leu
Lys
Ser
Phe
Phe 370 Lys
Gin 275 Asp
Asp
Lys
Ala
Ala 355 Lys
Phe 260 Val
Phe
Pro
Pro
Asp
工le
Asn Gly Arg Leu
Asp
Ala
Tyr 325 Val
Thr
Gly
Thr 310 Leu
Glu
Glu
Gin 295 Gly
A丄a 280 Leu
Leu Ala
265
Asp Gly Gly Cys
G丄u Leu His
3Lys Tyr lie Pro
Leu Gin Glu
Glu Ala Ser
Leu Trp
工le Gly
25 Asp
Gly 465 Leu
30
Tyr
Ala
35 Glu
Ala 545 His
40
Asp Gly
45
Ser
Arg Eeu 450
Glu Ser
Lys Glu
Asn
420 Cys
Thr
Met 405 Ala
Ser 390 Val
Trp
Asn
Met 375 Arg
Trp
Glu
Met Thr Pro
Glu Ser Val
Thr Arg
Arg 470
Glu Val Gly Met Val 485
Ma Val
Leu 455 Ala
Tyr 36〇 Leu
Phe
Val
Glu
Ala 440 Thr
Phe Tyr 330 Leu Asp 345
Val Val
Arg Gly
Gly Val
Asp Val 410 Ala Asp
425
Asp Ser
Met Ser Glu Asp 270
Asp Leu Glu Thr 285
Ala Met lie Ala 300
Ala Leu Ser Tyr 315
Phe Ala Pro Asp
Gin Pro Thr
Val Pro Asp 365
Gly Ser Pro
380 Leu Pro Lys 395
Pro Asp Cys Thr Asp Glu
Met 350 His
Asp Leu
Val Gly
His Pro
Asp Val 320 Gly Thr 335
工le His Gin Val
Val Val Leu
lie
Glu工le Arg
工le Leu Pro
Ala Tyr
Leu
500
Asp Leu Ala
Ala Glu
Glu
535 Glu
Lys Val 515
Gly Arg Phe Gly Gly 530
Ala Thr Pro Arg Gly 550
Asp G丄u Arg Ala Gly Thr
Met Arg Leu Glu Ala Tta 580
Phe His Gly Thr Phe工le 595
Gly 520 Pro
Asp
Ser
Val
Thr 600
Asn Leu 490 Pro Trp 505 Glu
Pro Leu Pro
Phe Asn 445 Leu Asn 460
Ser Ser Gly Arg Lys Val
His
Phe
Val 430 Glu
Thr
G丄n
Lys
Ser 510 G丄u
Cys
Asp
Glu
Gin 585 Gly
Phe Val
Gly
Tyr 555 Leu
Leu 570
Leu Pro Asp Glu
Lys Phe 525
Pro Met Asp 540
工le Leu Ser
Val Val Asn
Ser Arg Val
Leu Thr Thr 605
Ala Ala 400 Cys Phe 415
Val Val
Ser Asp
Arg Thr
Val Asn 480 Thr Arg 495
Gly Phe
Tyr Gly
Ala Ala
Phe Val
Ala Ala 575
Pro Tyr Gin Ala
<210> 2
<211> 1827 <212〉 DNA
<213> 水稻中花11 (03^arariva丄.)
5<400> 2
tcscgacgccsggst3tgct
acgacggcgggaaggcgtggggcgtccaat
tccgtgccgcacgcggcggcggcgtcatcg
cctggggccgacgcgccgtcgccgtcgggg
10aggaaggggg
gscgcgttcgaggaggggtttgtggcgaait
scggccgaccccgcggtgcsgstcgccggc
gcgcgcgcgctgccggtgtcggggcgcatc
3scggcgcc3acccgcacttcgsccccgtc
15atggtgcscgccgtcsggstscgc33cggc
gagaccgcgcggctgcggcsggsgcgcgcg
ggggagctcc3tggcc3ctccggc3tcgcg
tgcggcctcctcgscccgtcgcacggcacc
tcctcgcc3tgtcggsggsc
20g3cgscg3cctcgsgsccgtcggccgctac
3tcgcgcacccc33gctcg3cccggccacc
Cgt3CCtC33gtscttct3c
gtcgsgstcccgctcgaccagcccsccstg
gtggtggtgcccg3ccscc3ggtggtgttc
25cccgtggtgc
gscgcgtcgg3g3tggtgtgggtggscgtc
gcgtgggsggsggcggacaccgscgsggtg
gsctccstcttc33cg3gtccgacgaccgc
33C3CCCgC3ccggcg3gccgacgcggtgc
30ctcgsggtgggcatggtca3ccgc33cctc
gccgtggccg3gccgtggccC33ggtgtcg
g3gctcscc3agttcgagtacggcgsgggc
stggscgccgccgccgccscgccccgcggc
gcgccgggscctccgsgctc
35gsggccsccgtgcsgctgccgtcccgcgtg
ggcgscgsgctC3CC3CCC3ggcctgs
ggcagc3cggcaggtgctcg60
tcggtgagattctccgcgcgcgcggttsgc120
gcgccggcgttcctgccggtgccgttcgtg180
ttggcgtcccgsaggcgccg240
ttcttccagcgcgccgcggcgatggcgctc300
gtcctcgsgcgcccgcscgggctgccg己gc360
ascttcgcgccggtcggtgsgscgccgccc420
ccgcccttcstc3acggcgtct3cgcgcgc480
gccgggcsccscctgttcgacggcgstggc540
gccgccgagtcgtacgcgtgccggttcacg600
3tggggcggcccstgttccccaaggccstt660
cgccttgctctgttctacgcgcgcgccgcc720
ggcgtcgcc33cgccggcctcgtctscttc780
gacctcccctsccaggtgtgcgtcaccgcc840
gacttcgacgggcsgctcggctgcgcc3tg900
ggcgagctccscgcgctcsgctscgscgtg960
ttcgcgcccggtcggccgsc1020
3tccscgscttcgccatcaccgsgaac七3c1080
aagctccaggsgstgctccgcggcggctcg1140
cggttcggggtgctccccaagcacgccgcg1200
ccggactgcttctgcttcc3cctctggssc1260
gtggtgatcggctcgtgcatgscccccgcc1320
ctcgsgsgcgtcctcaccgagatccgcctc1380
gccatcctgccgccgtcgsgccaggtcsac1440
ctcggccgcs3gacgcggtscgcctacctc1500
ggcttcgccs3ggtggscctcgccscgggt1560
cggttcggcggcgagccctgcttcgtcccc1620
gctatcaLtcctgtccttcgtc1680
ctcgtcgtcs3tgccgccgacatgcgcctt1740
ccgtscggcttccacggcscgttcstc3cc1, 1827
<210> 3 <211> 582 40 <212> PRT
<213〉 水稻中花11 (O)'加sa〃v" Z.) <400> 3
Met Ala Ser Ser Ala Pro Ser Ala Pro Gly Leu Ala Pro Val Ala Lys 15 10 15
45 Pro Pro Pro Pro Pro Ser Lys Val Lys Val Ala Thr Ala Thr Val Pro 20 25 30
<formula>formula see original document page 26</formula>
Vsl Val工le Gly
Pro Ser Gin Ser 420
5工le Arg Leu Asp
10
20
25
30
35
40
45
Ser 405 Pro
Cys Met Thr
Glu Glu Glu
Arg
Gin 465 Pro
Arg Leu 435 Asp Ala
450
Ijeu Leu
Pro Arg Thr
A丄a Glu Gin
Gly Arg
Trp Pro Arg
Thr Ala Glu
15 Cys
Leu
val 545 Pro
Phe Val 515 Cys Phe 530
Asp Ala
Lys 500 Pro
485 Phe
470 Ser
Val 455 Thr
Gly 440 Asn
Ai:g
Pro Pro Asp 410
Ser Phe Arg 425
Val Ser Arg
Ala Val Phe
Ser Vsl
Arg
Leu Glu Ala Gly 460 Leu
Gly Phe
工le Tyr Gly
Tyr Ala Tyr 475
Ala Lys Val
49〇 Glu Gly
Arg Ala Gly
505 Ala
Val His Asp
Gly Arg Val
Gly Ser Glu 55〇 Tyr
Glu 535 Ala
Ala 520 Glu
Met Glu Glu
Asp Tyr Ala Glu Asp
Arg
Arg Gly Thr Ser 540 Ala
Glu Leu Gin
Arg 580
Pro 565 Gin
Gly Leu His
Gly 570
Val 555 Thr
445 Met
Ma
Leu
Gly
Asp 525 Glu
Ala
:Leu 430 Asp
Asn 415
Glu
Glu
Val Leu
Val Asn Arg 工le Glu
Ala
Gly 510 Gly
Ser Glu
Glu 480 Gly
Pro
His Val
Leu Val Val
Val Phe lie Gly
Ala 575
Leu 560 Asn
Ala
<210〉 4
<211> 1749
<212> DNA
<213> 水稻中花11 (O^yza ran'ra丄.)
<400> 4
3tggcgtcctccgcgccttccgcccccggcctcgcgccggtcgccs3gccgccgccgccg60
ccgtccssggtg33ggtggcg3c3gc33ccgtgcc33cc3csagcagggt120
gcgsggcc33tgcgtgtctcggcgccgccggtggsgccgcggcggcggatgsacccgctc180
cagcggctggcggcggcggcgsttgscgccgcctcgtcgccgggttgctc240
g3gcgggggcacgcgctgccgcgcaccgctgstccggccgtgcagstcgccgggssctsc300
gcgcccgtcggggagcgcccgccggtgagggggctgccggtgtccggccgcctcccggcg360
tgcctcgscggggtgtscgtccgcsscggcgcc33cccgctccscgcgccgcgcgccggg420
C3ccscctgttcgscggcgscgggatgctgcscgccgtgcggctcgccggggggcgcgcc480
gsgtcgtscgcgtgccggttgcgcggctgcggcsggsgcgggagatgggs540
cgccccgtgttccccaaggccstcggcgsgctccscggccactccggcgttgcgcggctt60〇
ctgctgttcggctcgcgcgcgctctgcggcgtgctcgacgcgtcccggggC3tcggcgtc660
gccMcgccggcctcgtctacc3cg3cggccgcctcctcgccstgtccgsggacgacctc720
ccctaccacgtccgtgtcaccc3cgscggcgscctcgsgsccgtcgggaggtacgacttc780
catgggcagctcgscgccgscggcsccstgstcgcgc3cccc33gctcg3cccggtcacc840
ggcgagctcttcgcgctcagct3C33tgtcgtgtcc33gcgt3cttctsc900
ttcsccgccgscggccgca3gtcccgsgscgtcgsc3tccccgtcggcgcgccgscgstg960
tcgccgtC3Ccg3g33ct3tgccgtcgtccccg3CC3gcsgatcgtgttc1020
3agctccsggagatggtgcgcggcggctcgccggtggtst3cgacsgggagaaggcgtcg1080
cggttcggcgtgctcccgs3gcgcgccgccgscgcgtcggagctccggtgggtgg3ggtc1140
cccggctgcttctgcttcc3cctctgg3scgcgtggg3ggscgacgccsccggcgagatc1200
gtggtcstcggctcctgcstgscgccgccggacgccgtgttcaacgagccgtcgcagtcg1260
ccggaggaggsgagcttccgcagcgtgctctccgagstccgcctcgscccgcgcaccggc1320
gtgtcgcggcggcgcgscgtgctgcgcgscgccgccgsgcaggtgsacctcgsggccggc1380
3tggtg33ccggcsgctgctcggccggssgscgcggtscgcctacctcgccatcgccgsg1440
10cc3tggccgsgggtgtcgggcttcgccssggtggscctcg3gsgcggcscggcggagaag15C0
ttc3tctscggcgaggggaggtacggcggcgagccatgcttcgttccgcgcgccggcgcc1560
gcggcggagg3cg3cggccscgtgctgtgcttcgtccscg3cg3gg3gcgcggcacgtcg1620
g3gctggtggtggtggacgccggcggcgagsggtcgcggccgtgssgctg1680
ccggggcgcgtgccgtscgg3ttgcscggc3CCttC3ttggcgccaacgagctgcagcga1740
15casgcttag1749
<210> 5
<211> 613
<212> PRT
20 <213> 水稻巾花ll (07zawdra丄.)
30
40
<400> f
Met Pro
1
Thr Arg
Pro
Thr
65 Ala
35 Ala
Val
Gin
Ser 145 Ala
Ser
50
Lys
Arg
Ala
Leu
lie 130 Leu
Thr Thr
25 His His Arg
Pro
35
Ser
Met
Arg
Ala
Ala 20 Arg
Phe
5 Ser
Thr Pro Asn Ser
Pro Ser Arg
Ala Ala Ala
Val Pro Pro
Phe
Cys
Val 1〇0 Arg
Pro
Gly 85 Ala
Glu 70 Lys
Glu 115
Ala Gly
Pro Val Ser
Arg Asn Gly
45 Leu Phe Asp Gly 180
Ala 165 Asp
Gly 150 Asn
Ala 55 Ma
Lys
Asp
Pro His Ala
Ijeu
Asn Phe
Ala 135 Arg
Ala 40 Tyr
Gly
Lys
Ala
Leu 120 Pro
Gly 25 Ala
Pro
10
Ala
Ala Ser Ser Cys
Arg Asn Ser
Thr Asn Ser
Val Pro Pro
Asp
Asp
Phe 105 Pro
Val
Ala
Gly 90 Glu
Arg
Gly
lie Pro Pro
Pro His Phe
Ala 75 Leu
Glu
Thr
Glu
Phe 155 Pro
Gly Met Val
His 185
Glu 170
Ala Va丄
Pro 60 Ala
Val
45
Pro
Val 30 Leu
Gly Ala
Gin 140
工le Asn
Ser 15
lie
Phe
Ser Ala
Pro Pro Pro
Ala Lys Ala
Asn Phe Phe
Phe
Asp 125 Pro
lie 110 Pro
Gin 95 Thr
Ala 80 Arg
Asn
Ala Val
Pro Val Arg
Gly Thr Ala Gly
Arg lie
Arg 190
Val
His 175 Asn
Tyr 160 His
GlyAla Ala
Gin
5 Leu
225 Gly
Ala
10
Asp
Val
15 His 305 Asp
Gly
20
lie
Gin
25 Val 385 Ala
Cys
30
Val
Ser
35 Arg 465
Val
Thr
40
Gly
Tyr
45 Gly 545
Glu 210 His
Eeu
Gly
Leu
Gly 290 Pro
Val
Thr
His
Va丄 370 Lieu
Glu Ser 195
Arg Ala
Gly His
Cys Gly
Leu Val 260 Pro Tyr 275
Arg Tyr
!Lys Leu
lie Lys
Lys Ser 340 Asp Phe 355
Val Phe
Asp Arg Thr Ser Ser
Phe
Val
Asp 450 Thr
His Leu 420 Val Gly 435
Glu His
Tyr Ala Cys Leu Gly
Ser
Leu 245 Tyr
Gly 230 Val
Arg 215 工le
Asp
Asp
Ijys 325 Pro
Ala
Ijys
Glu
Leu 405 Trp
Ser
Leu
Asn Leu Glu
Arg Tyr Ala 500
Phe Ala !Lys 515
Gly Glu Gly 530
Ala Gly Ma
Phe
Pro 310 Pro
Asp
工le
Leu
Lys 390 Glu
Gly Glu Ser
Val 485 Tyr
Val
Arg
Ma
Glu
Thr 470 Gly
Met Ser
Arg
Asp
Phe
Ala 550
Leu
G上y 535 Ser
Arg 2〇0 Ala
Ala
Asp Pro Phe Asn Gly Gin Val Arg
Asp
295 Val
Val 280 Gly
Ser
Tyr Leu
Val Glu
Thr
G丄y 375 Thr
Glu 360 Glu
Phe Thr Glu
Val Phe Pro
Arg Leu Ala 235
Ser His Gly 250
Arg Leu Leu 265
Thr Ala Asp
Gin Leu Gly
Gly Glu Leu 315
Lys Tyr Phe 330
lie Glu Leu 345
Asn Phe Val
Met Phe Arg Ser A;i:g Phe
Met Val
Asn Ala Trp Cys
Thr 440 Val
Met Val
Leu Ala Val
Ala 520 Gly
Trp Val 410 Glu Glu 425
Pro Ala
Gly 395 Asp
Ala
Asp
Leu Thr Glu
Arg Ala Val
Asn Arg 490 Ala Glu 505
Thr Gly
Leu 475 Ala
Pro
Glu
Glu Pro Cys
Thr Ala 205 Lys Ala 220
Lieu Phe
Arg lie
Leu
Gly Tyr Ala
Thr Gly Val
Ala Met
Gly Asp 285 Cys Ala 300
Phe Ala
Tyr Phe
Glu Gin
Val Val 365 Gly Gly 380
Val Leu Val Pro Glu Ser
Ser 270
Met
Asp
Pro 350 Pro
Ala 255 Glu
Glu
lie
Leu Ser
Ala 335 Thr
Asp
Gly 430 Phe
Cys 415 Glu
Pro Ala Arg
Gly
555
Ser lie 445 lie Arg Leu 460
Pro Pro Ala
Met Leu Gly
Trp Pro Lys 510
Leu Thr Lys
525 Phe Val Pro 540
Glu Asp Asp
Ala
Arg 495 Val
Gly
Glu
Arg 240 Asn
Asp
Thr
Ala
Tyr 320 Asp
Met
Asp His Ser Pro Val Pro Lys
His 400 Phe
Val
Asn Glu
Asn Thr
Gin 480 Lys
Ser
Phe Glu
Met Gly
Gly
Tyr
560
lie Leu Ser Phe Val Arg Asp Glu 565
Val Val Asn Ala Ala Asp Met Arg 580
5Ser Arg Val Pro Tyr Gly Phe His 595 600 Leu Ma Thr Gin Ala
610
Ala Ala Gly Thr Ser Glu Leu Leu
570 575 Leu Glu Ala Thr Val Gin Leu Pro 585 590 Gly Thr Phe lie Asn Ala Gly Glu 605
10 <210> 6
<211> 1842
<212> DNA
<213> 水稻中花11 (0> a rariva )
15 <400> 6
stgccgsccsccttc3cgcccaL5ittcccccgcctcctcgtgttccstacsccaccgcgcc60
tccccgtcgsggggtgcccgcasttcggtgcggttcacgcgcccgcgcgccgccgccgcg12〇
gcgacgssctcggtgctcsgcgcgccgtcgtccgtgccgcccgcgtscgtgccgccgccg180
ccgccgccgcgttcccggsggcgggcgscgcggcggcggccssggctgcg240
20gcgsggsggtctgascttcttccsgcgcgcggcggcggtg300
gcgctcgscgcgttcgsggaagggttcatcacgsstgtgctggagaggccgcacgcgctg360
ccgcggscggccgscccggcggtgcsgstcgccgggascttcgcgccggtgggggagcag420
ccgccggtgcggtcgctcccggtgtccggccgcatcccgcCCttC3tC33tggcgtctac徹
gcccgc33cggcgcc33cccgcscttcgagcccaccgcgggccaccacctgttcgacggc540
25gscggcstggtccscgccgtccgcstccgcsscggcgccgccg3gtcc仁scgcctgccgc600
ttcaccgagactgcgcgcctcggccsggsgcgcgccctcggccgcgccgtcttccccssg660
gccatcggcgsgctccstggccsctccggcattcgcccgcctcgccctcttctscgcgcgg720
gggctctgcggcctcgtcg3cccgtcgcacggcaccggcgtcgccsscgccggcctcgtc780
tscttcaL3cggccgcctcctcgccstgtcctcccgtsccsggtccgcgtc840
30accgccgacggcgacctcgsgacggtggggcgctscgscttcgscggccsgctcggctgc900
gcc3tg3tcggctcgscccggtctccggcgsgctcttcgccctcsgctdc960
CCtg333t3Cttct3cttcgscgccgatggC3cc3agtcs1020
cccg3cgtcg3gatcg3gcttgagcagccgacgatgatccacgscttcgcC3tcsccg3g1080
3scttcgtggtggtscccgsccsccsggtggtgttcssgctcggcgagstgttccgcggc1140
35ggctcgccggtggtgctcgsscgtcgcggttcggcgtgctcccc33gc3c1200
gcgscgsgctcgttggagatggtgtgggtcgscgtccccgactgcttctgcttccacctg1260
tggastgcgtgggaggsggccgagtccggc,gtggtggtggtgggaitcctgc3tg3cg1320
cccgccgsctCC3tcttC33cgaigtcgg3csgsgcgtgct1380
cgcctcs3C3cgcgcaccggcgsgtccscccgccgcgccgtgctgccgccggcggcgcag1440
40gtgaacctcgsggtcggcstggtgssccgcgccatgctcggccggasgacgaggtacgcc1500
tscctcgccgtcgccgsgccgtggcccaaggtgtccggcttcgcc33ggtggacctcgcc1560
sccggcgsgctcaccaagttcg己gt3cggcgagggccggttcggcggcgsgccgtgcttc1620
gtgcccstgggcggcgccggcgccgccgcgtccccggcgcgcggcgsggscgscggctsc1680
atcctctccttcgtccgcgscgsggccgcgggcacatccgagctcctcgtcgtgsacgcc1740
45gccgacatgaggctggsggccsccgtccsgctgccgtcgcgcgtcccctacggcttccac1800
ggcsccttc3tc3acgccggcgsgctcgcc3cgc3ggcctsg184權(quán)利要求
1.與脫落酸合成相關(guān)的OsNCED基因及其編碼的蛋白質(zhì)在培育耐旱性植物中的應(yīng)用，所述OsNCED基因來源于水稻，所編碼的蛋白質(zhì)具有下述氨基酸序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)序列表中的SEQ ID NO3；3)序列表中的SEQ ID NO5；4)將序列表中SEQ ID NO1、3或5的氨基酸序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且所衍生的蛋白質(zhì)具有調(diào)控植物耐旱性的功能。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于將所述O^VCfiZ)基因?qū)胫参锝M織、 細胞或器官，再將被轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或器官培育成植株，得到耐旱性提高 的轉(zhuǎn)基因植物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述OyTVC五Z)基因具有下述核苷酸序列之一1) 序列表中的SEQIDNO: 2;2) 序列表中的SEQIDNO: 4;3) 序列表中的SEQIDNO: 6;4) 與序列表中SEQIDNO: 2、 4或6限定的DNA序列具有90%以上同源性且 編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述OyTVC五D基因通過植物表達載 體導入植物組織、細胞或器官。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于用于構(gòu)建所述植物表達載體的出發(fā)載 體是一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微 彈轟擊的載體，或者是可在原核生物中復(fù)制的載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌 轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體為pBin系列載體、pBI系列 載體、GatewayTW系列載體、pCAMBIA系列載體、per8或pX6;所述可在原核 生物中復(fù)制的載體為pENTER-TOPO、 pUC系列載體或pBluescript系列載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述出發(fā)載體是pH2GW7或pHORD 載體，所述pHORD載體是用擬南芥W2^4誘導型啟動子取代pH2GW7載體中 的CaMV 35S組成型啟動子而得到的載體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于用所述OyiVC五D基因構(gòu)建植物表達 載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上一種增強型、組成型、組織特異型或誘導 型啟動子。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于用所述CWVC5D基因構(gòu)建植物表達載體時添加翻譯增強子和/或轉(zhuǎn)錄增強子。
10. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于在所述植物表達載體中加入選擇性 標記基因，所述選擇性標記基因包括但不限于可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生 顏色變化的酶的基因、發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物和抗化學 試劑標記基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組來源于水稻的與耐旱性相關(guān)的OsNCEDs基因，編碼的蛋白質(zhì)具有下述氨基酸序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1、3或5；2)將序列表中SEQID NO1、3或5的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且所衍生的蛋白質(zhì)具有調(diào)控植物耐旱性的功能。實驗證明，用本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化水稻可顯著提高水稻對干旱脅迫的耐受性。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锬秃禉C制的研究，以及提高植物的耐旱性及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實際意義，將在植物(特別是禾谷類作物)的耐旱基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12N15/29GK101173287SQ20071017591
公開日2008年5月7日 申請日期2007年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月16日
發(fā)明者劉春霞, 勉 夏, 孟秀萍, 王喜萍, 瑩 謝, 莉 辛, 黃曉翠 申請人:北京未名凱拓農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司