一種水稻基因組dna的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水稻基因組DNA的提取方法，包括裂解、提取、離心分離、酶解以及沉淀等步驟。通過本發(fā)明的方法，能夠簡易有效的提取水稻大片段基因組DNA，與現(xiàn)有的技術(shù)相比，能簡化操作步驟，減少離心次數(shù)和轉(zhuǎn)速，減少所需試劑的數(shù)量，DNA的質(zhì)量完全可以滿足包括基因組文庫構(gòu)建、基因組序列擴(kuò)增、Southern?blot，TAIL-PCR等在內(nèi)的常見后續(xù)實驗的要求。
【專利說明】一種水稻基因組DNA的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體而言，涉及一種高純度、大片段水稻基因組DNA的簡易提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻不僅是主要的糧食作物，而且是重要的模式生物。隨著水稻基因組研究的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)在水稻研究中得到廣泛地的應(yīng)用。在水稻分子生物學(xué)研究中，提取和制備其DNA是許多研究工作的基礎(chǔ)和前提，例如:構(gòu)建基因組文庫、Southern雜交、RFLP, PCR分離基因以及調(diào)控區(qū)等。在這些基于基因組DNA的操作中，對提取DNA的質(zhì)量要求不僅包括高得率、高純度、完整性好且斷裂降解程度盡可能小，而且要盡量排除其他大分子，如蛋白質(zhì)、多糖等的污染。由于一些植物組織材料中富含多糖和酚類物質(zhì)，如果在DNA提取中未將其有效的去除，將抑制后續(xù)的操作，包括酶切、PCR反應(yīng)，所以在DNA的抽提中，要應(yīng)盡可能將其去除。
[0003]目前常用的水稻基因組DNA的提取方法主要有CTAB法和SDS法，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的實驗需要，還有一些衍生的簡易制備微量DNA方法的報道[3-11]。這些方法的原理是利用基因組DNA分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于細(xì)胞器DNA的特點，在破碎細(xì)胞后，通過有機試劑的多次抽提，將基因組DNA溶解在水相中，最后通過異丙醇或乙醇將其沉淀，達(dá)到分離提取的目的。根據(jù)實驗?zāi)康牡牟煌瑢μ崛NA的質(zhì)量和大小的要求也不同，例如:構(gòu)建基因組文庫，初始DNA長度必須在IOOkb以上，否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段就很少，獲得的基因組文庫的庫容就小，達(dá)不到覆蓋基因組全部遺傳信息的目的；如果是RFLP和PCR分析，DNA長度要達(dá)到50kb才可以滿足實驗需要。
[0004]現(xiàn)有的DNA提取方法，為去除蛋白質(zhì)、多糖等大分子，需要在抽提過程中采用有機試劑多次處理、多次離心，而這樣的多步驟操作，勢必在提取過程中，不可避免的造成染色體DNA機械斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段。因此，平衡好DNA純度和長度兩個因素是建立有效提取方法的關(guān)鍵。目前符合制備基因組文庫要求的、長度至少在IOOkb以上的高純度、大片段水稻基因組DNA的簡易制備方法還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]由于提取高純度、大片段基因組DNA是許多分子生物學(xué)實驗的基礎(chǔ)和前提，現(xiàn)有的方法大多關(guān)注DNA的得率和操作的簡便性，對提取DNA的長度這一主要質(zhì)量指標(biāo)重視不足，導(dǎo)致不能滿足一些后續(xù)實驗，例如構(gòu)建基因組文庫要求。本發(fā)明的目的是建立了一種簡便的、適合從水稻黃化苗中提取大片段基因組DNA的方法，這種既關(guān)注質(zhì)量，也兼顧操作簡便的技術(shù)方法同樣適用于其他的植物材料。
[0006]為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案:
[0007]本發(fā)明一方面涉及一種水稻基因組DNA的提取方法，其特征在于包括如下步驟:
[0008](I)取新鮮水稻黃花苗材料液氮研磨，化凍前將粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)熱至60-70°C的CTAB緩沖液中，輕輕轉(zhuǎn)動離心管，輕柔混勻，水浴保溫l_3h。
[0009](2)將裂解混合物從水浴取出，冷卻至室溫后，加入0.8-1.2倍體積的氯仿/異戊醇,輕輕顛倒混合成乳濁液；
[0010](3)室溫4500-5500rpm離心8-15min，將上層水相轉(zhuǎn)至新容器中，加I / 1000-2 /100體積的RNase A溶液,輕柔顛倒混勻，36-38°C保溫20min-40min ；
[0011](4)加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，待有白色絲狀物產(chǎn)生，收集白色絲狀物；
[0012](5)將收集絲狀DNA用60 % -80 %乙醇洗滌2次；
[0013](6)將洗滌后的DNA在室溫空氣干燥。
[0014]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的CTAB緩沖液的pH值為7.9-8.1之間，包括Tris-HCl緩沖溶液，EDTA, NaCl以及CTAB，使用前加入0.2% B-巰基乙醇。
[0015]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式中，所述的氯仿/異戊醇的體積比是24:1。
[0016]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的RNase A的濃度為8_20mg / mL。
[0017]本發(fā)明建立了一種簡易有效的水稻大片段基因組DNA的提取技術(shù)，與現(xiàn)有的技術(shù)相比，能簡化操作步驟，減少離心次數(shù)和轉(zhuǎn)速，減少所需試劑的數(shù)量，DNA的質(zhì)量完全可以滿足包括基因組文庫構(gòu)建、基因組序列擴(kuò)增、Southern blot, TAIL-PCR等在內(nèi)的常見后續(xù)實驗的要求。
【專利附圖】

【附圖說明】`
[0018]圖1:實施例1所提取的水稻基因組DNA的0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果:其中M =Lambda DNA / Hind III Marker (0.5ug) ;1_3:基因組 DNA(5ul)
【具體實施方式】
[0019]實施例1
[0020](I)取I克新鮮水稻黃花苗材料液氮研磨，化凍前將粉末轉(zhuǎn)移至2ml已預(yù)熱至650C的CTAB緩沖液中(在水浴中)，輕輕轉(zhuǎn)動離心管，輕柔混勻，65°C水浴保溫2h。其中CTAB 緩沖液:100mM Tris-HCl (pH8.0), 20mM EDTA, 1.4M NaCl，2 % CTAB，用前加入 0.2 %β-巰基乙醇；
[0021](2)將裂解混合物從水浴取出，冷卻至室溫后，加入等體積的氯仿/異戊醇(兩者的體積比24:1)，輕輕顛倒混合成乳濁液。
[0022](3)室溫5000rpm離心IOmin,將上層水相轉(zhuǎn)至新管中，加I / 100體積的RNaseA(10mg / ml),輕柔顛倒混勻，37°C保溫30min。
[0023](4)加入0.7倍體積的異丙醇，仔細(xì)混勻，一旦有白色絲狀物產(chǎn)生,立即用玻璃鉤將其鉤出。
[0024](5)將鉤出的絲狀DNA用20ml 70%乙醇洗滌2次。
[0025](6)將DNA挑出到新離心管中，室溫空氣干燥后，溶于盡可能少的TE中，4°C儲存。
[0026]根據(jù)本實施例的方法提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，依據(jù)Lambda DNA /Hind III DNA Marker條帶的指示，本方法提取的DNA長度達(dá)到了 50kb以上，而且是DNA群體的主要組分(圖1)。由于瓊脂糖凝膠電泳分辨率的限制，50kb以上的DNA條帶堆積在凝膠中，顯示為一條亮度較高的條帶。電泳中，RNA條帶由于在提取中已經(jīng)過RNase A消化，所以亮度較弱(未顯示)。采用分光光度法測定樣品在0D260和0D280吸收值，以0D260 /0D280計算DNA純度，結(jié)果顯示，比值一般在2.0左右，稍有波動，說明提取的DNA中所含的RNA和蛋白質(zhì)污染極少，符合后續(xù)實驗對DNA質(zhì)量的要求。
[0027]以上所述，僅為本發(fā)明的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范`圍為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種水稻基因組DNA的提取方法，其特征在于包括如下步驟: (1)取新鮮水稻黃花苗材料液氮研磨，化凍前將粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)熱至60-70°C的CTAB緩沖液中，輕輕轉(zhuǎn)動離心管，輕柔混勻，水浴保溫l_3h。 (2)將裂解混合物從水浴取出，冷卻至室溫后，加入0.8-1.2倍體積的氯仿/異戊醇，氯仿/異戊醇的體積比為20— 30:1，輕輕顛倒混合成乳濁液； (3)室溫4500-5500rpm離心8-15min，將上層水相轉(zhuǎn)至新容器中，加I/ 1000-2 / 100體積的RNase A溶液,輕柔顛倒混勻，36-38°C保溫20min-40min ； (4)加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，待有白色絲狀物產(chǎn)生，收集白色絲狀物； (5)將收集絲狀DNA用60%-80%乙醇洗滌2次； (6)將洗滌后的DNA在室溫空氣干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，所述的CTAB緩沖液的pH值為7.9-8.1之間，包括Tris-HCl緩沖溶液，EDTA, NaCl以及CTAB，使用前加入0.2% β -巰基乙醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，所述的氯仿/異戊醇的體積比是24:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，所述`的RNaseA的濃度為8_20mg / mL。
【文檔編號】C12N15/10GK103555712SQ201310559435
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】梁衛(wèi)紅, 李佳佳, 樓晨, 林群婷, 楊丹丹, 王俊杰, 郝雨帆 申請人:河南師范大學(xué)