本發(fā)明涉及電化學發(fā)光材料領(lǐng)域，尤其涉及一種電化學發(fā)光聚合物納米粒的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在小分子電化學發(fā)光(ecl)物質(zhì)中，以三聯(lián)吡啶釕ru(bpy)3²⁺為發(fā)光組分，衍生化上活潑基因進而標記生物分子，以實現(xiàn)ecl生物分析，這是當前臨床醫(yī)學的主要檢測手段。理論上，對于每一個被標記的生物大分子(如抗體)，標記上的ecl小分子越多，檢測信號就越強，檢測靈敏度也越高。但事實上，標記的信號分子過多，生物大分子的反應(yīng)活性會明顯降低，檢測靈敏度反而變差，即“過標記”。

為了實現(xiàn)高靈敏的生物醫(yī)學檢測，人們常常采用間接標記，即ecl小分子不直接標記在生物大分子上，而采用納米粒作為載體，固載大量的ecl小分子，再用納米粒標記生物分子。由于ru(bpy)3²⁺沒有活潑基團，目前主要采用摻雜、包合以及靜電吸附等方式固載于納米粒表面或內(nèi)部，它們大多數(shù)是非化學鍵方式固載ecl小分子。例如，(1)以陰離子配合物或陰離子聚電解質(zhì)與陽離子組分ru(bpy)3²⁺之間的靜電吸附而固載于納米粒內(nèi)部；(2)以陰離子聚電解質(zhì)與陽離子組分ru(bpy)3²⁺之間的靜電吸附而摻雜于硅納米粒內(nèi)部；(3)以反相微乳法摻雜殼聚糖和聯(lián)吡啶釕制備ecl二氧化硅復(fù)合納米粒；(4)以納米粒的微孔吸附和(或)靜電吸附固載ecl小分子；(5)以納米粒作為膜(如nafion膜)載體，在成膜后利用靜電相互作用固載ecl小分子。

上述固載方法依靠弱作用力，所制備的納米粒具有結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、ecl小分子容易泄漏、發(fā)光信號隨保存時間較快衰減等缺點，且會明顯影響ecl信號的強度。通常由于ecl小分子外的包裹殼的影響，固載于納米粒內(nèi)部的ecl小分子組分的發(fā)光信號明顯減弱，然而若采用表面固載ecl小分子的方法，其固載量又較小。以上這些問題對于生物標記特別是檢測試劑是極其不利的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種電化學發(fā)光聚合物納米粒的制備方法及應(yīng)用，采用本發(fā)明的方法，可制備出信號增強且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的電化學發(fā)光納米粒，其具有良好的水溶性，粒徑均一，粒徑約為20nm，由于表面存在大量的活潑基團，有利于生物標記，在實現(xiàn)高靈敏度的生物醫(yī)藥檢測方面將具有廣泛的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種電化學發(fā)光聚合物納米粒的制備方法，包括以下步驟：

將電化學發(fā)光聚合物與非發(fā)光聚合物在溶劑中混合，在攪拌下，發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)后得到電化學發(fā)光聚合物納米粒，非發(fā)光聚合物為導(dǎo)電性聚合物；溶劑為水、n,n-二甲基甲酰胺和二甲亞砜中的一種或幾種。

進一步地，導(dǎo)電性聚合物為離子型導(dǎo)電聚合物和/或非離子型導(dǎo)電聚合物。

進一步地，離子型導(dǎo)電聚合物為離子型有機聚合物或離子型無機聚合物，離子型有機聚合物為聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯磺酸、聚乙烯磷酸、聚谷氨酸、聚(吡咯-羧基吡咯)、聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、聚二烯丙基二甲基季銨鹽、氨基化的聚對苯撐乙炔、聚賴氨酸、殼聚糖或核酸，離子型無機聚合物為聚磷酸鹽或聚硅酸鹽；非離子型導(dǎo)電聚合物為聚吡咯、聚苯胺、聚(3,4-乙烯二氧噻吩)或聚對苯撐乙炔。

進一步地，電化學發(fā)光聚合物由小分子電化學發(fā)光化合物與聚合物偶聯(lián)得到。

進一步地，小分子電化學發(fā)光化合物為釕絡(luò)合物或鋨絡(luò)合物。

進一步地，釕絡(luò)合物為二(2,2'-聯(lián)吡啶)(2,2'-聯(lián)吡啶-羧酸)釕、二(2,2'-聯(lián)吡啶)(氨基-2,2'-聯(lián)吡啶)釕、二(2,2'-聯(lián)吡啶)(氨基-1,10-菲咯啉)釕、二(2,2'-聯(lián)吡啶)(羧基-1,10-菲咯啉)釕或二(2,2'-聯(lián)吡啶)(5,6-環(huán)氧-5,6-二氫-[1,10]菲咯啉)釕；鋨絡(luò)合物為二(2,2'-聯(lián)吡啶)(2,2'-聯(lián)吡啶-羧酸)鋨、二(2,2'-聯(lián)吡啶)(氨基-2,2'-聯(lián)吡啶)鋨、二(2,2'-聯(lián)吡啶)(氨基-1,10-菲咯啉)鋨、二(2,2'-聯(lián)吡啶)(羧基-1,10-菲咯啉)鋨、二(2,2'-聯(lián)吡啶)(5,6-環(huán)氧-5,6-二氫-[1,10]菲咯啉)鋨、(羧基-1,10-菲咯啉)(1,10-菲咯啉)(1,2-雙(二苯基膦)乙烯)鋨、(氨基-1,10-菲咯啉)(1,10-菲咯啉)(1,2-雙(二苯基膦)乙烯)鋨、(氨基-1,10-菲咯啉)(碳酰氯)(1,2-雙(二苯基膦)乙烯)鋨或(羧基-1,10-菲咯啉)(碳酰氯)(1,2-雙(二苯基膦)乙烯)鋨。

進一步地，聚合物為聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚谷氨酸、聚(吡咯-羧基吡咯)、聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、聚賴氨酸或殼聚糖。

進一步地，交聯(lián)反應(yīng)是在交聯(lián)劑或活化劑的作用下進行；也可以直接進行交聯(lián)反應(yīng)，既沒有交聯(lián)劑也沒有活化劑。

進一步地，交聯(lián)劑為三羥甲基丙烷-三(3-氮丙啶基)丙酸酯、戊二醛、丙二酸、丁二酸、乙二胺、丙二胺或丁二胺；活化劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(edc)和n-羥基丁二酰亞胺(nhs)的組合物、n,n′-二環(huán)己基碳二亞胺和n-羥基丁二酰亞胺的組合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺或n,n′-二環(huán)己基碳二亞胺。

進一步的，導(dǎo)電性聚合物的分子量為1800-300000g/mol。

進一步地，電化學發(fā)光聚合物與非發(fā)光聚合物的質(zhì)量比為20:1-1:1。優(yōu)選地，電化學發(fā)光聚合物與非發(fā)光聚合物的質(zhì)量比為4:3。

進一步地，交聯(lián)反應(yīng)可以發(fā)生在發(fā)光聚合物之間、發(fā)光聚合物與非發(fā)光聚合物之間，或者非發(fā)光聚合物之間。交聯(lián)反應(yīng)時間為0.5-48h。

進一步地，交聯(lián)反應(yīng)的溫度為10-140℃。優(yōu)選地，交聯(lián)反應(yīng)的溫度為20-60℃。

進一步地，電化學發(fā)光聚合物的制備方法包括以下步驟：

將小分子電化學發(fā)光化合物和聚合物分別溶于堿的水溶液，混勻后，在保護氣氛下，于20-140℃下避光反應(yīng)0.5-48h，透析6-48h后得到電化學發(fā)光聚合物。

進一步地，堿為碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、氫氧化鈉或氫氧化鉀。

進一步地，保護氣氛為氮氣或氦氣。

本發(fā)明還提供了一種采用上述方法所制備的電化學發(fā)光聚合物納米粒在生物標記中的應(yīng)用。

本發(fā)明的原理如下：

本發(fā)明首先將小分子的ecl絡(luò)合物偶聯(lián)到聚合物而合成ecl聚合物。若僅僅由ecl聚合物交聯(lián)制備ecl納米粒時，固載于納米粒中的ecl絡(luò)合物將存在兩種情況，即內(nèi)部固載和表面固載，且發(fā)生前者的概率較大。納米粒的發(fā)光需要電激發(fā)才能進行，固載于內(nèi)部的ecl絡(luò)合物由于有機材料納米粒的導(dǎo)電性極弱甚至不導(dǎo)電，從而導(dǎo)致了這些ecl絡(luò)合物不能或不能有效地被外部的電極激發(fā)而發(fā)光。而固載于表面的ecl絡(luò)合物是能夠有效發(fā)光的。因此，僅僅由ecl聚合物交聯(lián)制備的納米粒的發(fā)光效率是極其低下的。當ecl聚合物與導(dǎo)電性聚合物混合后，再交聯(lián)制備ecl納米粒時，導(dǎo)電性聚合物將交聯(lián)和/或摻雜于納米粒中，此時，上述的固載于內(nèi)部的ecl絡(luò)合物的電激發(fā)問題即獲得了解決，使固載于內(nèi)部的大量的ecl絡(luò)合物也就能夠有效地產(chǎn)生ecl信號，從而實現(xiàn)了ecl信號的增強。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點：

所制備的電化學發(fā)光聚合物納米粒電化學發(fā)光信號明顯增強，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠在水溶液中良好分散，粒徑為20nm左右；相對于現(xiàn)有技術(shù)中不存在非發(fā)光聚合物的納米粒，電化學發(fā)光信號明顯增強；將本發(fā)明制備的電化學發(fā)光聚合物納米粒在溶液中保存至少一個月時，粒子大小和分布、電化學發(fā)光強度、溶液懸浮均一性均能夠穩(wěn)定保留。

上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實施，以下以本發(fā)明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。

附圖說明

圖1是本發(fā)明所制備的電化學發(fā)光聚合物納米粒的sem圖；

圖2是相關(guān)各物質(zhì)的電化學發(fā)光強度對比結(jié)果；

圖3是本發(fā)明制備的電化學發(fā)光聚合物納米粒在放置3天后的粒徑分布測試結(jié)果；

圖4是本發(fā)明制備的電化學發(fā)光聚合物納米粒在放置19天后的粒徑分布測試結(jié)果；

圖5是本發(fā)明制備的電化學發(fā)光聚合物納米粒在放置31天后的粒徑分布測試結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

將二(2,2'-聯(lián)吡啶)(5,6-環(huán)氧-5,6-二氫-[1,10]菲咯啉)釕與聚丙烯酸(paa)的羧基化學連接，獲得釕絡(luò)合物接枝聚丙烯酸，即電化學發(fā)光聚合物(ecl聚合物)。具體方案如下：

稱取108mg二(2,2'-聯(lián)吡啶)(5,6-環(huán)氧-5,6-二氫-[1,10]菲咯啉)釕溶解于20ml的nahco3水溶液(1mmol/l)中，得到ecl絡(luò)合物儲備液。稱取2gpaa(分子量為30000g/mol)溶解于10ml的nahco3水溶液(1mmol/l)中，得paa儲備液。取3ml上述ecl絡(luò)合物儲備液置于10ml單頸圓底燒瓶中，并加入1ml的paa儲備液。抽真空，充氮氣，反復(fù)三次。在110℃油浴中避光、氮氣保護下，磁力攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，用去離子水透析48h，每12h換一次液，最后將透析液定容到20ml，得電化學發(fā)光聚合物溶液。

以paa(分子量為30000g/mol)為非發(fā)光聚合物，利用上述獲得的電化學發(fā)光聚合物溶液，以三羥甲基丙烷-三(3-氮丙啶基)丙酸酯為交聯(lián)劑，制備化學交聯(lián)的電化學發(fā)光聚合物納米粒。具體方案為：

將1.6ml上述制備的電化學發(fā)光聚合物溶液和0.4ml的paa水溶液(1.2mg/ml)分別加入單頸圓底燒瓶中，再加入交聯(lián)劑三羥甲基丙烷-三(3-氮丙啶基)丙酸酯20mg，置于60℃水浴中，攪拌(400轉(zhuǎn)/min)反應(yīng)10h。最后，將反應(yīng)液在水中透析24h以除去多余的交聯(lián)劑，即得電化學發(fā)光聚合物納米粒。

實施例2

取實施例1制備的電化學發(fā)光聚合物溶液1.6ml置于圓底燒瓶中，向其中加入0.2mlpaa(分子量為30000g/mol)水溶液(0.4mg/ml)，混勻，加入0.1mlpei(分子量為1800g/mol)水溶液(0.01mg/ml)，再加入交聯(lián)劑三羥甲基丙烷-三(3-氮丙啶基)丙酸酯20mg，置于60℃水浴中，攪拌(400轉(zhuǎn)/min)反應(yīng)10h。最后，將反應(yīng)液在水中透析24h以除去多余的交聯(lián)劑，即得電化學發(fā)光聚合物納米粒。在此實施例中，電化學發(fā)光聚合物與paa發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，而pei被靜電組裝在ecl聚合物或(和)paa上，之后，再交聯(lián)固定于納米粒的結(jié)構(gòu)中，此時pei是被靜電相互作用摻雜于納米粒內(nèi)部。

實施例3

取實施例1制備的電化學發(fā)光聚合物溶液1.6ml置于圓底燒瓶中，再加入0.2mlpaa(分子量為30000g/mol)水溶液(0.4mg/ml)。在0.1mlpei(分子量為1800g/mol)水溶液(0.01mg/ml)中加入1mgedc，搖勻，再加入上述圓底燒瓶中，edc活化電化學發(fā)光聚合物和paa中的羧基。室溫下攪拌(400轉(zhuǎn)/min)反應(yīng)1h，使活化后的羧基與pei上的氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。最后，將反應(yīng)液在水中透析24h以除去多余的活化劑，即得電化學發(fā)光聚合物納米粒。在此實施例中，電化學發(fā)光聚合物、paa和pei均發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)，而固載于納米粒中。

實施例4

取實施例1制備的電化學發(fā)光聚合物溶液1.6ml置于圓底燒瓶中。然后取0.2mlpaa(分子量為30000g/mol)水溶液(0.4mg/ml)，用edc和nhs活化paa的羧基，將活化后的paa水溶液加入上述圓底燒瓶中，再加入0.1mlpei(分子量為1800g/mol)水溶液(0.01mg/ml)，室溫下攪拌(400轉(zhuǎn)/min)反應(yīng)3h。最后，將反應(yīng)液在水中透析24h以除去多余的活化劑，即得電化學發(fā)光聚合物納米粒。在此實施例中，ecl聚合物被靜電組裝在pei上，之后，組裝的pei再與活化的paa發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，獲得交聯(lián)納米粒，此時ecl聚合物被靜電相互作用摻雜于納米粒內(nèi)部。

實施例5

取實施例1制備的電化學發(fā)光聚合物溶液1.6ml置于圓底燒瓶中，用edc和nhs活化發(fā)光聚合物的羧基。然后加入0.2mlpaa(分子量為2000g/mol)水溶液(0.4mg/ml)，混勻，再加入0.1mlpei(分子量為60000g/mol)水溶液(0.01mg/ml)，室溫下攪拌(400轉(zhuǎn)/min)反應(yīng)3h。最后，將反應(yīng)液在水中透析24h以除去多余的活化劑，即得電化學發(fā)光聚合物納米粒。在此實施例中，paa被靜電組裝在pei上，組裝的pei再與活化的發(fā)光聚合物發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，獲得交聯(lián)納米粒，此時paa被靜電相互作用摻雜于納米粒內(nèi)部。

實施例6

將(羧基-1,10-菲咯啉)(1,10-菲咯啉)(1,2-雙(二苯基膦)乙烯)鋨與pei(分子量為60000g/mol)的氨基化學連接，獲得鋨絡(luò)合物接枝pei，即電化學發(fā)光聚合物(ecl聚合物)。具體方案如下：

稱取80mg(羧基-1,10-菲咯啉)(1,10-菲咯啉)(1,2-雙(二苯基膦)乙烯)鋨溶解于20ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，得到ecl絡(luò)合物儲備液。稱取2.5gpei溶解于10ml的dmf中，得pei儲備液。取3ml上述ecl絡(luò)合物儲備液置于10ml單頸圓底燒瓶中，加入1ml的pei儲備液，然后加入1mgedc活化鋨絡(luò)合物的羧基。抽真空，充氮氣，反復(fù)三次。在50℃水浴中避光、磁力攪拌反應(yīng)5h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，用dmf透析24h，每6h換一次液，最后將透析液用dmf定容到20ml，得ecl聚合物溶液。

以非離子型導(dǎo)電聚合物聚吡咯和離子型導(dǎo)電聚合物聚谷氨酸為非發(fā)光聚合物，利用上述獲得的ecl聚合物溶液，在加熱下發(fā)生化學交聯(lián)反應(yīng)，制備電化學發(fā)光聚合物納米粒。具體方案為：

將1mg聚吡咯(分子量為2100g/mol)和2mg聚谷氨酸(分子量為50000g/mol)置于燒杯中，加入30mldmf，振搖，使聚合物溶解，過濾后將濾液置于單頸圓底燒瓶中，加入4ml上述制備的ecl聚合物溶液，振搖均勻。抽真空，充氮氣，反復(fù)三次。置于140℃的油浴中，攪拌(400轉(zhuǎn)/min)，加熱反應(yīng)48h。冷卻至室溫，高速離心(12000rpm)，除去多余的各種聚合物，沉淀復(fù)溶于dmf中，即得電化學發(fā)光聚合物納米粒。帶有大量氨基的ecl聚合物和帶有大量羧基的離子型導(dǎo)電聚合物聚谷氨酸在高溫下形成酰胺鍵而發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，而制備電化學發(fā)光納米粒。非離子型導(dǎo)電聚合物聚吡咯在聚谷氨酸的羧基作用下，部分離子化而靜電吸附于聚谷氨酸上，而在聚谷氨酸交聯(lián)時被包埋于納米粒內(nèi)；同時，在發(fā)生ecl聚合物與聚谷氨酸兩種大分子交聯(lián)過程中，也能夠通過摻雜的方式而將聚吡咯包埋于交聯(lián)納米粒之中。

圖1是本發(fā)明實施例3所制備的電化學發(fā)光聚合物納米粒的sem圖，從圖中可看出，其粒徑在20nm左右，且粒徑較均一。

圖2是本發(fā)明實施例3相關(guān)各物質(zhì)的電化學發(fā)光強度對比結(jié)果。從圖中可看出，在加入具有導(dǎo)電性的非發(fā)光聚合物交聯(lián)后，其納米粒的電化學發(fā)光強度達到1466a.u.左右，明顯高于小分子釕絡(luò)合物(1196a.u.)和未加入具有導(dǎo)電性的非發(fā)光聚合物的ecl納米粒(即發(fā)光聚合物納米粒的1000a.u.)。說明本發(fā)明制備的ecl納米粒具有明顯的信號增強作用。

圖3-5是本發(fā)明實施例3制備的電化學發(fā)光聚合物納米粒在分別放置3天、19天和31天后的粒徑分布測試結(jié)果。從圖中可看出，納米粒的各物理參數(shù)沒有發(fā)生明顯的變化，說明其粒徑大小以及粒徑分布具有良好的納米粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。