檢測大麻醇的電化學納米免疫傳感器及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物免疫檢測技術領域，具體涉及一種檢測大麻醇的電化學納米免疫傳感器及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]大麻醇(Cannabinoid)是大麻(marijuana)中影響精神狀態(tài)的主要成分，它對大腦的作用主要是通過激活一個叫CB1的分子受體來實現(xiàn)的。目前大麻醇主要用于其它藥物療效不佳的某些疾病，如神經系統(tǒng)疾病中的多發(fā)性硬化癥(MS)、運動性神經疾病、慢性頑固性疼痛和藥源性嘔吐。另外，該藥對青光眼、哮喘和心血管疾病也可能有一定作用，雖然尚未進入臨床應用，但已引起研究者的廣泛興趣。對大麻醇的檢測方法目前只能達到定性目的，如采用相應的試紙條/板/盒，靈敏度為50ng/mL。為了便于對大麻醇進行研究和應用，亟需研究發(fā)展檢測靈敏度更高的檢測方法。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對目前無法對大麻醇進行定量檢測、檢測靈敏度很低的缺陷，而提供一種檢測大麻醇的電化學納米免疫傳感器及其制備方法和應用。本發(fā)明的電化學納米免疫傳感器不受樣品的濁度、顏色的影響，無需對樣品進行純化、富集等預處理，操作簡單，檢測靈敏度高、特異性強，能夠用于對大麻醇進行快速定量檢測。
[0004]本發(fā)明提供下述技術方案解決上述技術問題。
[0005]本發(fā)明提供的技術方案之一是:一種檢測大麻醇的電化學納米免疫傳感器，所述傳感器以殼聚糖為橋聯(lián)劑將納米金和辣根過氧化物酶固定于電極表面，所述納米金吸附有抗大麻醇抗體。
[0006]所述抗大麻醇抗體為本領域常規(guī)，其來源和類型均沒有特殊要求，既可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體。
[0007]所述電極可以是本領域常規(guī)所述的各類電極，優(yōu)選玻碳電極。
[0008]本發(fā)明提供的技術方案之二是:前述電化學納米免疫傳感器的制備方法，其包括如下步驟:
[0009](1)對電極進行預處理，然后在電極上包被殼聚糖溶液；
[0010](2)以殼聚糖為橋聯(lián)劑將納米金和辣根過氧化物酶包被在電極上；
[0011](3)繼續(xù)在電極上包被抗大麻醇抗體；
[0012](4)封閉液封閉后即得。
[0013]步驟(1)為對電極進行預處理，然后在電極上包被殼聚糖溶液。
[0014]其中，所述電極可以是本領域常規(guī)所述的各類電極，優(yōu)選玻碳電極。
[0015]所述殼聚糖溶液優(yōu)選以如下方法制得:將殼聚糖溶于醋酸溶液得到殼聚糖溶液，備用。更優(yōu)選地，將2g殼聚糖溶于100mL體積百分比為2 %的醋酸溶液中，攪拌3h得到2 %的殼聚糖溶液，備用。
[0016]步驟⑵為以殼聚糖為橋聯(lián)劑將納米金和辣根過氧化物酶包被在電極上。
[0017]如本領域常規(guī)，所述包被為將電極置于溶液中進行包被。優(yōu)選地，所述包被為將電極置于由納米金溶液和辣根過氧化物酶溶液組成的混合溶液中進行包被。
[0018]所述納米金溶液優(yōu)選以如下方法制得:取0.01g/100mL氯金酸溶液100mL，加入lg/100mL的檸檬酸鈉溶液4mL混勻，置于微波爐中低火保持8_10min，待自然冷卻后用超純水補充至104mL，即得納米金溶膠，置于4°C避光保存?zhèn)溆谩?br>[0019]所述辣根過氧化物酶溶液優(yōu)選以如下方法制得:將辣根過氧化物酶(HRP)溶于磷酸緩沖液(PBS)中，即得辣根過氧化物酶溶液。更優(yōu)選地，將0.02g辣根過氧化物酶(HRP)溶于10mL 0.01M pH值為7.4的磷酸緩沖液(PBS)中，即得2.0g/L辣根過氧化物酶溶液。
[0020]所述封閉液為免疫檢測領域常規(guī)的封閉液，優(yōu)選牛血清白蛋白(BSA)。
[0021]所述抗大麻醇抗體為本領域常規(guī)，其來源和類型均沒有特殊要求，既可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體，更優(yōu)選Balb/c小鼠單克隆抗體，且純化后抗體的濃度不低于0.5mg/mL。
[0022]在所述包被的操作過程中，如本領域常規(guī)，一般都需要經過恒溫孵育和清洗的步驟。
[0023]在所述封閉的操作過程中，如本領域常規(guī)，一般也需要經過恒溫孵育和清洗的步驟。
[0024]所述制備方法較佳地包括如下步驟:
[0025](1)將玻碳電極預處理后，取質量百分比濃度為2%的殼聚糖溶液滴滿處理后的玻碳電極表面，在45°C干燥箱中干燥30min，使玻碳電極表面凝膠化；取出待冷卻至室溫，再浸于濃度為lmol/L的NaOH溶液中5min，用超純水沖洗掉NaOH溶液，之后浸于超純水中30min，徹底清除NaOH離子；取出，在25°C干燥箱干燥lOmin ；
[0026](2)將玻碳電極置于納米金(GNPs) /辣根過氧化物酶(HRP)混合溶液中至少24h，得到GNPs/HRP電極；
[0027](3)滴加5 μ L濃度不低于0.5mg/mL的小鼠抗大麻醇單克隆抗體于制得的GNPs/HRP電極表面，30°C孵育干燥lh ;
[0028](4)超純水沖洗三次，然后將玻碳電極置于1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液中37°C溫育lh，以封閉非特異性位點；
[0029](5)以含0.05% (v/v) Tween-20的PBST溶液清洗未結合的BSA，30°C孵育干燥lh，即得用于大麻醇檢測的電化學納米免疫傳感器，置于4°C PBS緩沖環(huán)境中待用。
[0030]本發(fā)明的電化學納米免疫傳感器利用循環(huán)伏安法、交流阻抗法，原子力顯微鏡等表征電極組裝的各個階段。利用電流時間曲線法等方法可以實現(xiàn)對復雜樣品中大麻醇的定量檢測，實驗結果表明該傳感器靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及使用壽命等技術參數(shù)均良好。
[0031]本發(fā)明提供的技術方案之三是:前述電化學納米免疫傳感器的在大麻醇檢測中的應用。
[0032]在符合本領域常識的基礎上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。
[0033]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0034]本發(fā)明的積極進步效果在于:
[0035]本發(fā)明的電化學納米免疫傳感器不受樣品的濁度、顏色的影響，無需對樣品進行純化、富集等預處理，操作簡單，檢測靈敏度高、特異性強，能夠用于對大麻醇進行快速定量檢測，且靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及使用壽命等技術參數(shù)均良好，具有非常好的應用前景。
【附圖說明】
[0036]圖1為實施例1所制備的電化學納米免疫傳感器的結構圖。
【具體實施方式】
[0037]以下實施例用于說明本發(fā)明，但并不用來限制本發(fā)明的范圍。下述各實施例中，所使用的各類設備、試劑和材料若無特別說明，均為常規(guī)市售可得。
[0038]實施例1電化學納米免疫傳感器的制備
[0039]1、玻碳電極的預處理:
[0040]將玻碳電極依次分別用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μ m粒徑的α _Α1203漿在麂皮上拋光三次，且每次拋光后在超聲水浴中清洗30s，最后依次用ΗΝ0#Ρ Η 20按體積比1: 1配制的混合液、無水乙醇和超純水清洗。在lmol/L H2S04溶液中用掃描范圍為1.0?一 1.0V，掃描速度為100mV/S的循環(huán)伏安法活化電極，重復掃描直至出現(xiàn)穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線。上述穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線滿足下述要求:在實驗室條件下預處理后的電極的循環(huán)伏安曲線的峰電位差應在80mV以下，并盡可能地接近64mV，電極方能使用，最后置于氮氣環(huán)境中干燥待用。
[0041]2、納米金(Nano-Au)溶膠的制備:
[0042]根據(jù)Frens法取0.01g/100mL氯金酸溶液100mL，加入lg/100mL的梓檬酸鈉溶液4mL混勻，置于微波爐中低火保持8-10min，待其自然冷卻后用超純水補充至104mL即得納米金溶膠，置于4°C避光保存?zhèn)溆?。利用分光光度計對所制備的納米金溶膠在可見光范圍內(400_700nm)進行掃描，光吸收性膠體金在可見光范圍內有一單一光吸收峰，且光吸收峰的波長Xmax在518nm，可粗略確定納米金平均粒徑為15nm。用透射電鏡對所制納米金溶膠顆粒的大小、形狀及分散情況進行進一步精確的表征，所合成的納米金形狀規(guī)則，粒度均勻，平均粒徑約為15nm，且沒有聚集現(xiàn)象。
[0043]3、殼聚糖溶液的制備:
[0044]將2g殼聚糖溶于100mL體積百分比為2%的醋酸溶液中攪