本發(fā)明涉及生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種光電化學生物傳感器及其制備方法。

背景技術(shù)：

光電化學（PEC）生物傳感技術(shù)是在電化學分析方法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種生物傳感技術(shù)，由于其靈敏度高、價格低廉及設備簡單等優(yōu)點，已被廣泛應用于酶生物傳感、DNA傳感、免疫傳感、及細胞傳感等各種生物傳感。PEC的檢測原理是基于在光照下識別元件和目標分子之間的生物識別作用而產(chǎn)生相應電信號的改變。目前，對于PEC生物傳感器中信號的檢測主要通過電化學工作站，建立一個由工作電極、參比電極、及對電極組成的三電極測試系統(tǒng)來檢測光電流的大小。該系統(tǒng)雖然結(jié)構(gòu)簡單，但不利于器件化，也為該傳感器的微型化帶來不便。

因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進和發(fā)展。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種光電化學生物傳感器及其制備方法，從而進一步提高光電化學生物傳感器的靈敏度及解決現(xiàn)有的光電化學生物傳感器不易微型化的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種光電化學生物傳感器，包括：電解池，設置在所述電解池內(nèi)的電解液，設置在所述電解池內(nèi)的有機電化學晶體管，及設置在所述電解池內(nèi)的柵電極；所述有機電化學晶體管包括：襯底，設置在所述襯底之上的源電極和漏電極，及涂覆在襯底之上連接源電極和漏電極的有機半導體薄膜層；所述柵電極上修飾有光電活性半導體材料作為傳感器的敏感功能層。

所述的光電化學生物傳感器，其中，所述光電活性半導體材料為有機半導體材料、無機半導體材料或二者的組合。

所述的光電化學生物傳感器，其中，所述襯底是由玻璃、聚合物柔性材料或硅片制成。

所述的光電化學生物傳感器，其中，所述源電極、漏電極及柵電極是由金屬材料、金屬氧化物半導體材料、合金材料構(gòu)成。

所述的光電化學生物傳感器，其中，所述有機半導體薄膜層由聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸、聚吡咯、聚噻吩、聚苯胺、聚咔唑或者聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸、聚吡咯、聚噻吩、聚苯胺、聚咔唑的兩種或兩種以上的共聚物中的至少一種構(gòu)成。

所述的光電化學生物傳感器，其中，所述源電極和漏電極的厚度為50-500nm。

所述的光電化學生物傳感器，其中，所述有機半導體薄膜層的厚度為10-300nm。

一種如以上任一項所述的光電化學生物傳感器的制備方法，包括步驟：

A、徹底清洗襯底并干燥，在襯底上制備源電極和漏電極，在源電極和漏電極之間制備有機半導體薄膜層，得到有機電化學晶體管；

B、徹底清洗柵電極并干燥，在柵電極上修飾光電活性半導體材料作為傳感器的敏感功能層，得到修飾后的柵電極；

C、將有機電化學晶體管和修飾后的柵電極放置于裝有電解液的電解池中，制得所述光電化學生物傳感器。

所述的光電化學生物傳感器的制備方法，其中，所述步驟A中，所述的源電極和漏電極是通過真空熱蒸鍍、磁控濺射或氣相沉積中的一種方法制備。

所述的光電化學生物傳感器的制備方法，其中，所述步驟A中，制備有機半導體薄膜層的方法為旋涂或噴墨印刷；退火溫度為100-250℃，退火氛圍為氮氣，時間為20-60min。

有益效果：本發(fā)明首次將光電化學生物傳感技術(shù)與有機電化學晶體管相結(jié)合，由于有機電化學晶體管兼具傳感和信號放大的作用，可對柵電極上微弱的電流信號變化進行放大，因此該傳感器具有極高的靈敏度。本發(fā)明結(jié)構(gòu)簡單、器件尺寸小，所有部件都可以集成到一個微小襯底上，解決了現(xiàn)有的光電化學生物傳感器不易微型化的問題。本發(fā)明在生物檢測領(lǐng)域具有普適性，除可以應用于DNA傳感器和免疫傳感器外，在酶生物傳感、細胞傳感等各種生物傳感方面也都可以廣泛適用。

附圖說明

圖1是本發(fā)明光電化學生物傳感器的整體結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是本發(fā)明所述有機電化學晶體管的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3為光照“關(guān)-開”下柵電極修飾有CdS QDs的器件的I_ds-T曲線。

圖4為DNA雜化前后（目標DNA濃度為10^-13 M）所測的I_ds-T曲線（a為CdS QDs修飾的柵電極的I_ds-T曲線，b為探針ssDNA在CdS QDs修飾的柵電極的I_ds-T曲線，c為目標ssDNA和探針ssDNA雜化后的I_ds-T曲線）。

圖5為沙門氏菌（沙門氏菌濃度為10⁸cells/ml）與抗體結(jié)合前后所測的I_ds-T曲線（a為CdS QDs修飾的柵電極的I_ds-T曲線，b為固定抗體在CdS QDs修飾的柵電極上的I_ds-T曲線，c為沙門氏菌與抗體結(jié)合后的I_ds-T曲線）。

圖6為采用光電化學分析方法測試不同濃度沙門氏菌的結(jié)果。

圖7為基于有機電化學晶體管的光電化學傳感器測試不同濃度沙門氏菌的結(jié)果。

具體實施方式

本發(fā)明提供一種光電化學生物傳感器及其制備方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明提供一種光電化學生物傳感器，用于生物分子的檢測，如圖1、圖2所示，包括：電解池1，設置在所述電解池1內(nèi)的電解液2，設置在所述電解池1內(nèi)的有機電化學晶體管9，及設置在所述電解池內(nèi)的柵電極3；所述有機電化學晶體管9包括：襯底5，設置在所述襯底5之上的源電極7和漏電極8，及涂覆在襯底5之上連接源電極7和漏電極8的有機半導體薄膜層6；所述柵電極3上修飾有光電活性半導體材料4作為傳感器的敏感功能層。

進一步的，本發(fā)明實施例中，所述光電活性半導體材料為有機半導體材料、無機半導體材料或二者的組合；例如CdS、TiO₂。

進一步的，本發(fā)明實施例中，所述襯底是由玻璃、聚合物柔性材料（例如PET）或硅片制成。

進一步的，本發(fā)明實施例中，所述源電極、漏電極及柵電極是由金屬材料、金屬氧化物半導體材料、合金材料構(gòu)成；例如Au、Ag、Pt、Cu、ITO等。

進一步的，本發(fā)明實施例中，所述有機半導體薄膜層由聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸（PEDOT:PSS）、聚吡咯、聚噻吩、聚苯胺、聚咔唑或者聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸、聚吡咯、聚噻吩、聚苯胺、聚咔唑的兩種或兩種以上的共聚物中的至少一種構(gòu)成。

進一步的，本發(fā)明實施例中，所述源電極和漏電極的厚度為50-500nm。

進一步的，本發(fā)明實施例中，所述有機半導體薄膜層的厚度為10-300nm。

進一步的，本發(fā)明實施例中，將源電極、漏電極和柵電極放置于裝有電解液的電解池中進行檢測，所述電解液用于作為電子給體。

本發(fā)明所述有機電化學晶體管（OECT）為有機薄膜晶體管（OTFT）中的其中重要一類，其具有成本低、容易制備、工作電壓低（<1V）、生物兼容性好、易微型化、可制成柔性器件等諸多優(yōu)點。由于OECT同時具有傳感和信號放大的功能，因此在生物分子檢測中具有非常高的靈敏度和低的檢測極限。與此同時，OECT可制備成小尺寸器件，有利于傳感器的微型化和可集成性。

本發(fā)明將OECT和PEC兩種生物檢測技術(shù)完美結(jié)合在一起，開發(fā)出一種基于有機電化學晶體管的光電化學新型生物傳感技術(shù)。由于該技術(shù)結(jié)合了OECT和PEC的各自優(yōu)勢，因此具有更高的靈敏度和更低的檢測極限，且器件可微型化并制作陣列檢測系統(tǒng)，有望在生物傳感領(lǐng)域得到廣泛的應用。

在本發(fā)明所述光電化學生物傳感器的基礎(chǔ)上，可以通過進一步在光電活性半導體材料修飾的柵電極表面上固定探針ssDNA（單鏈DNA）、抗體等，分別對應制得光電化學DNA傳感器和光電化學免疫傳感器，從而達到對應檢測目標ssDNA和沙門氏菌等細菌濃度的目的。

本發(fā)明實施例還提供了一種如以上所述的光電化學生物傳感器的制備方法，包括步驟：

S100、徹底清洗襯底并干燥，在襯底上制備源電極和漏電極，在源電極和漏電極之間制備有機半導體薄膜層，得到有機電化學晶體管；

S200、徹底清洗柵電極并干燥，在柵電極上修飾光電活性半導體材料作為傳感器的敏感功能層，得到修飾后的柵電極；

S300、將有機電化學晶體管和修飾后的柵電極放置于裝有電解液的電解池中，制得所述光電化學生物傳感器。

優(yōu)選地，所述步驟S100中，所述的源電極和漏電極是通過真空熱蒸鍍、磁控濺射或氣相沉積中的一種方法制備。

優(yōu)選地，所述步驟S100中，制備有機半導體薄膜層的方法為旋涂或噴墨印刷；退火溫度為100-250℃，退火氛圍為氮氣，時間為20-60min。

本發(fā)明將有機電化學晶體管（OECT）和光電化學（PEC）生物分析方法相結(jié)合，以光電活性材料修飾OECT中的柵電極，在光照條件下，當待測物引起柵電極上光電流的變化時，會進一步引起OECT相關(guān)電學參數(shù)（界面電勢、有效柵電壓、溝道電流等）的變化，最終通過測量OECT溝道電流的變化來實現(xiàn)對生物分子的檢測。由于OECT兼具傳感和信號放大的作用，可對柵電極上微弱的電流信號變化進行放大，因此該傳感器具有極高的靈敏度。此外，該傳感器還有結(jié)構(gòu)簡單、易微型化、可制成柔性器件、工作電壓低（<1V）等諸多優(yōu)點。該新型傳感技術(shù)目前已成功應用于DNA檢測和免疫傳感，其在酶生物傳感和細胞傳感等各種傳感領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V泛的應用前景。

下面以具體實施例對本發(fā)明作詳細說明：

實施例1 基于有機電化學晶體管的光電化學DNA傳感器

原理：柵電極選用組裝有硫化鎘量子點（CdS QDs）的ITO電極，在光照條件下，當光的能量大于CdS中電子躍遷所需的能量時，CdS中價帶的電子會躍遷至導帶，形成電子-空穴對。當導帶中的電子注入電極，溶液中電子給體提供電子給價帶中的空穴，會形成光電流，該電流的產(chǎn)生會降低電解質(zhì)/柵電極界面的電位，從而增加施加在OECT器件上的有效柵電壓。OECT的溝道電流如以下方程所示：

其中q代表電子電量，μ代表空穴遷移率，代表有機半導體層中的初始空穴密度，W和L分別代表器件溝道的寬度和長度，t代表有機半導體膜的厚度，C_i代表OECT器件的有效柵電容，V_P代表夾斷電壓，代表有效柵電壓，代表補償電壓，補償電壓與柵極-電解液、電解液-溝道這兩個界面的電壓降有關(guān)系。

由于有機電化學晶體管的溝道電流I_ds受到柵電壓V_G的調(diào)控，由以上方程可以看出，當有效柵電壓增大時溝道電流I_ds會減小。圖3中光照“關(guān)-開”（off-on）形成的臺階大小間接反映了柵電極上產(chǎn)生光電流的大小，并且對該信號進行了放大，因此當柵電極上產(chǎn)生的光電流大小改變時，I_ds-T曲線中光照“關(guān)-開”所形成的臺階大小也會隨之改變，通過比較DNA雜化前后臺階變化的大小可以達到檢測的目的。

在該實例中，本發(fā)明還設計了基于硫化鎘量子點（CdS QDs）和金納米顆粒（Au NPs）之間的激子-等離子體效應的體系來進一步提升傳感器的靈敏度，由于CdS QDs的熒光光譜和Au NPs的紫外吸收光譜重疊，光照條件下CdS QDs的熒光可以激發(fā)Au NPs發(fā)生表面等離子體共振，它們間的相互作用會改變CdS QDs內(nèi)的激子狀態(tài)，引起光電流的降低。因此，在目標ssDNA（單鏈DNA）上修飾Au NPs，在柵電極上連接探針ssDNA，其發(fā)生雜化后會導致光電流的降低，在I_ds-T曲線上表現(xiàn)為光照“關(guān)-開”臺階的減小，根據(jù)不同濃度目標ssDNA引起光電流猝滅的效果不同達到檢測不同濃度DNA的效果，其中圖4為濃度為10^-13M目標ssDNA雜化前后的I_ds-T（溝道電流-時間）曲線，該DNA傳感器具有極高的靈敏度，檢測極限可達10^-13M以下濃度。

基于有機電化學晶體管的光電化學DNA傳感器的制備過程

1. 制作有機電化學晶體管（OECT）的源電極、漏電極及有機半導體薄膜層：將清洗好的玻璃貼緊在設計好圖案的掩模板上，通過熱蒸鍍沉積金屬電極，分別沉積10nm的Cr和100nm的Au以得到Au/Cr/玻璃電極，在該電極上旋涂一層摻有二甲基亞砜（DMSO）的聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸（PEDOT:PSS），將不需要覆蓋PEDOT:PSS膜的地方擦除干凈；在氮氣氛圍180℃退火30min，使PEDOT:PSS膜更加牢固的附著在電極表面并最終得到了OECT器件。

2. TGA（巰基乙酸）修飾的CdS QDs的合成：在三口燒瓶中加入50 mL 0.01 M CdCl₂溶液，攪拌，通入氮氣，升溫至40℃后加入250μL TGA，反應30 min；在此期間，使用1 M的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液的pH到11；然后，加入5.0mL 0.1M Na₂S溶液，氮氣氛圍下110℃加熱，回流4 h，用水(體積比1:1)稀釋后，保存于4℃冰箱待用。

3. Au NPs的合成：Au NPs通過常見的NaBH₄還原HAuCl₄的方法來進行；0.6mL 0.1M冰水配制的NaBH₄加入到不停攪拌的20mL 2.5×10⁴ M HAuCl₄溶液中；溶液迅速變?yōu)殚偌t色代表Au NPs的形成，該溶液繼續(xù)在冰水浴中攪拌10 min，隨后在常溫條件下攪拌3h，在此過程中，溶液顏色會逐漸變?yōu)榫萍t色；攪拌結(jié)束后，金膠溶液保存于4 ℃冰箱待用。

4. CdS QDs修飾的柵電極的制備：將洗凈干燥后的ITO電極依次浸入2% PDDA(聚合物電解質(zhì)，0.5 M NaCl溶液配制)和CdS QDs溶液中各10 min，每次浸泡完用水清洗，該過程重復3次，得到所需的多層膜修飾電極，CdS QDs干燥穩(wěn)定后在光照下測量I_ds-T曲線。

5. 探針ssDNA在CdS QDs修飾的柵電極表面的固定：通過探針ssDNA上的NH₂基團和CdS QDs上的COOH基團之間的偶聯(lián)反應進行；將CdS QDs修飾的電極浸入20mg/ml EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）和10mg/ml NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）的溶液中1h，隨后用水小心沖洗，將25 μL探針ssDNA (1 μM)滴在電極表面并4℃孵化過夜后，使用10 mM PBS小心沖洗，以便去除未固定的ssDNA；然后，使用1 mM MEA（乙醇胺）于4℃封閉電極2h，再用10 mM PBS（磷酸鹽緩沖液）小心沖洗后，在光照下，測量I_ds-T曲線。

6. Au NPs對目標ssDNA的標記：首先使用10 mM TCEP活化目標DNA上的巰基，還原雙硫鍵；在50 μL 10 μM的活化過的目標DNA中加入1 ml所制備的Au NPs溶液，搖床震蕩過夜，期間加入0.5M NaCl溶液，離心收集后4℃保存?zhèn)溆?，不同濃度的Au NPs修飾的目標DNA通過加入對應體積的10mM PBS進行稀釋。

7. 目標ssDNA和探針ssDNA之間的雜化：25 μL的不同濃度Au NPs標記的目標DNA滴在探針ssDNA修飾的柵電極表面，在濃度為20mM的MgCl₂條件下37℃孵化1h，之后用10 mM PBS沖洗，去除未雜化的目標ssDNA，然后，在光照下，測量I_ds-T曲線。

在該實例中，CdS QDs修飾、連接探針ssDNA以及和目標ssDNA雜化后的柵電極的I_ds-T曲線在0.1M AA（抗壞血酸）溶液（0.1M PBS溶液配制）中測量，V_G=0V，V_DS=0.1V，激發(fā)波長為420nm。

實施例2 基于有機電化學晶體管的光電化學免疫傳感器

原理：同樣是通過測量器件的I_ds-T曲線來反應柵電極上光電流的變化，在柵電極上連接抗體，當抗體與沙門氏菌發(fā)生特異性結(jié)合時，由于沙門氏菌的位阻效應會使得柵電極光電流下降，并且不同濃度沙門氏菌引起光電流的下降值不同，據(jù)此可以對不同濃度的沙門氏菌進行檢測。

圖5為濃度為10⁸cells/ml沙門氏菌與抗體結(jié)合前后的電學信號變化圖。圖6為采用傳統(tǒng)的光電化學分析方法測試不同濃度沙門氏菌的結(jié)果，檢測極限為10³cells/ml。圖7為基于有機電化學晶體管的光電化學傳感器測試不同濃度沙門氏菌的結(jié)果，檢測極限為10²cells/ml。由此可見，該新型傳感技術(shù)的靈敏度要高于傳統(tǒng)的光電化學傳感技術(shù)。

基于有機電化學晶體管的光電化學免疫傳感器的制備過程

1. 制作有機電化學晶體管（OECT）的源電極、漏電極及有機半導體薄膜層：將清洗好的玻璃貼緊在設計好圖案的掩模板上，通過熱蒸鍍沉積金屬電極，分別沉積10nm的Cr和100nm的Au以得到Au/Cr/玻璃電極，在該電極上旋涂一層摻有二甲基亞砜（DMSO）的聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸（PEDOT:PSS），將不需要覆蓋PEDOT:PSS膜的地方擦除干凈；在氮氣氛圍180℃退火1h，使PEDOT:PSS膜更加牢固的附著在電極表面并最終得到了OECT器件。

2. TGA修飾的CdS QDs的合成：在三口燒瓶中加入50 mL 0.01 M CdCl₂溶液，攪拌，通入氮氣，升溫至40℃后加入250μL TGA，反應30 min；在此期間，使用1 M的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液的pH到11；然后，加入5.0mL 0.1M Na₂S溶液，氮氛下110℃加熱，回流4 h，用水(體積比1:1)稀釋后，保存于4℃冰箱待用。

3. CdS QDs修飾的柵電極的制備：將洗凈干燥后的ITO電極依次浸入2% PDDA(0.5 M NaCl溶液配制)和CdS QDs溶液中各10 min，每次浸泡完用水清洗，該過程重復3次，得到所需的多層膜修飾電極，在光照下，測量I_ds-T曲線。

4. 抗體在CdS QDs修飾的柵電極表面的固定：通過抗體上的NH₂基團和CdS QDs上的COOH基團之間的偶聯(lián)反應進行；將CdS QDs修飾的電極浸入20mg/ml EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）和10mg/ml NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）的溶液中1h，隨后用水小心沖洗，將25 μL抗體（2mg/ml）滴在電極表面并4℃孵化過夜后，使用10 mM PBS小心沖洗，以便去除未固定的抗體；然后，使用1 mM MEA于4℃封閉電極2h，再用10 mM PBS小心沖洗后，在光照下，測量I_ds-T曲線。

5. 沙門氏菌與抗體的結(jié)合：修飾有抗體的柵電極在1ml在不同濃度的沙門氏菌溶液中（10mM PBS溶液配制）室溫下浸泡1h以便其充分結(jié)合，然后用10mM PBS小心沖洗，除去未結(jié)合的沙門氏菌，在光照下，測量I_ds-T曲線。

在該實例中， CdS QDs修飾、連接抗體以及和沙門氏菌結(jié)合后的柵電極的I_ds-T曲線在0.1M抗壞血酸（AA）溶液（0.1M PBS溶液配制）中測量，V_G=0V，V_DS=0.1V，激發(fā)波長為420nm。

本發(fā)明首次將光電化學（PEC）生物傳感技術(shù)與有機電化學晶體管（OECT）相結(jié)合，由于OECT兼具傳感和信號放大的作用，可對柵電極上微弱的電流信號變化進行放大，因此該傳感器具有極高的靈敏度。本發(fā)明器件制備方法多樣，結(jié)構(gòu)簡單、器件尺寸小，所有部件都可以集成到一個微小襯底上，易集成化、微型化、陣列化，適合大規(guī)模生產(chǎn)；該傳感器工作電壓低（<1V），有機半導體薄膜層和組裝于柵電極上的半導體材料都可選用生物兼容性好的材料，為傳感器提供良好的穩(wěn)定性； 此外，本發(fā)明在生物檢測領(lǐng)域具有普適性，除可以應用于DNA傳感器和免疫傳感器外，在酶生物傳感、細胞傳感等各種生物傳感方面也都可以廣泛適用。

另外需要說明的是，本發(fā)明有機電化學晶體管中的有機半導體薄膜層也可換成其他無機半導體薄膜材料如石墨烯。本發(fā)明是在OECT柵電極上修飾光電活性材料，光照下引起電解質(zhì)/柵電極界面電位變化來達到生物分子檢測目的，而在有機電化學晶體管中的有機半導體薄膜層上修飾光電活性材料，光照下引起電解質(zhì)/溝道界面電位變化亦可同樣達到傳感檢測目的。

綜上所述，本發(fā)明所述光電化學生物傳感器具有極高的靈敏度，且結(jié)構(gòu)簡單、器件尺寸小，解決了現(xiàn)有的光電化學生物傳感器不易微型化的問題。本發(fā)明光電化學生物傳感器在生物檢測領(lǐng)域具有普適性，除可以應用于DNA傳感器和免疫傳感器外，在酶生物傳感、細胞傳感等生物傳感方面也都可以廣泛適用。

應當理解的是，本發(fā)明的應用不限于上述的舉例，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。