本申請要求于2014年5月27日提交的美國臨時(shí)申請第62/003,205和2014年11月25日提交的美國臨時(shí)申請第62/084,188的優(yōu)先權(quán)，上述申請的主題全文通過引用方式并入本文中。

背景技術(shù)：

典型的一次性電化學(xué)傳感器包括襯底膜，一層導(dǎo)電材料沉積到該襯底膜上且圖案化以形成電極。傳統(tǒng)地，電化學(xué)電池或生物傳感器由三個(gè)電極構(gòu)成，工作電極或傳感電極、基準(zhǔn)電極以及對(duì)電極或輔助電極。工作電極是在相對(duì)于基準(zhǔn)電極的固定施加電位下發(fā)生目標(biāo)反應(yīng)的地方?；鶞?zhǔn)電極起到維持工作電極上的穩(wěn)定的電位的作用。對(duì)電極允許電流在工作電極與對(duì)電極之間流動(dòng)從而不干擾基準(zhǔn)電極功能。在系統(tǒng)電位本質(zhì)上穩(wěn)定或者電位的小的波動(dòng)不是問題的情況下，基準(zhǔn)電極和對(duì)電極可以組合成與工作電極配對(duì)的單個(gè)基準(zhǔn)/對(duì)電極。在一些實(shí)例中，電化學(xué)生物傳感器使用電流滴定法來量化特定的分析物濃度。工作電極提供了與其所暴露的表面積成比例的響應(yīng)。在制作期間，制造嚴(yán)密地控制與工作電極面積相關(guān)聯(lián)的過程變化。

正常地，工作電極由兩個(gè)或更多個(gè)元件形成。一個(gè)元件是形成有源元件的導(dǎo)電層，利于電子傳輸?shù)交蛘邆鬏斪援?dāng)樣本施加到傳感器上時(shí)所產(chǎn)生的電活性粒種。第二元件是介電層，其連同第一元件一起限定了與樣本流體相接觸的工作電極的實(shí)際尺寸。第二元件在導(dǎo)電層的一部分上形成了窗口。任一元件的變化會(huì)導(dǎo)致傳感器響應(yīng)的變化。第二元件或介電層因此會(huì)直接影響讀數(shù)的精度。

在現(xiàn)有技術(shù)的電極中，表面積可由導(dǎo)電層圖案化或介電層圖案化和配準(zhǔn)來限定。對(duì)于更精確地限定傳感器的工作電極從而簡化形成精確生物傳感器的過程的裝置存在需求。

發(fā)明概述

本文所描述的實(shí)施方案涉及能夠利用生物識(shí)別元件來提供各種分析物或生物分子的分析的電化學(xué)生物傳感器。該生物傳感器能夠產(chǎn)生與在諸如生物樣本的樣本中檢測到的分析物的存在或量有關(guān)的信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，生物傳感器可用于檢測存在于生物樣本中的蛋白質(zhì)，多肽，細(xì)胞因子，微生物，多核苷酸(mRNA，DNA，cDNA，mRNA等)，所述生物樣本例如體液(例如血清，血液，唾液，尿，粘液，呼吸等)。

在一些實(shí)施方案中，生物傳感器包括襯底、形成在襯底的表面上的工作電極、形成在襯底的表面上的對(duì)電極以及覆蓋工作電極和對(duì)電極的部分且限定暴露工作電極和對(duì)電極的其它部分的孔口的介電層。工作電極官能化或化學(xué)官能化以包含用于至少一個(gè)目標(biāo)分析物的受體。受體能夠與體樣本中的目標(biāo)分析物中的一種或多種選擇性地結(jié)合。

檢測系統(tǒng)還可以包括測量設(shè)備，該測量設(shè)備用于對(duì)工作電極、對(duì)電極和/或基準(zhǔn)電極施加電壓電位且測量在工作電極與對(duì)電極之間流動(dòng)的電流?？梢允褂秒娀瘜W(xué)分析技術(shù)如循環(huán)伏安法(CV)，差分脈沖伏安法(DPV)來檢測分析物和受體(例如結(jié)合的分析物)的相互作用，以確定生物樣本中分析物的存在。

附圖說明

圖1是依照本申請的方面的生物傳感器的示意圖。

圖2是由絲網(wǎng)印刷工藝制造的以行排列的生物傳感器陣列的俯視平面圖。

發(fā)明詳述

除非本文特別指出，所使用的所有術(shù)語具有與本申請主題領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的相同的含義。以下定義將提供關(guān)于說明書和權(quán)利要求中使用的術(shù)語的清楚性。

如本文所使用的，術(shù)語“監(jiān)測”是指使用從數(shù)據(jù)集產(chǎn)生的結(jié)果來提供關(guān)于個(gè)體或個(gè)體的健康或疾病狀態(tài)的有用信息?！氨O(jiān)測”可以包括例如預(yù)后，風(fēng)險(xiǎn)分層，藥物治療的選擇，正在進(jìn)行的藥物治療的評(píng)估，治療有效性的確定，結(jié)果的預(yù)測，對(duì)治療的反應(yīng)的確定，疾病或隨著疾病的進(jìn)展疾病并發(fā)癥的診斷，或提供與患者的健康狀態(tài)隨時(shí)間的任何信息，選擇最可能受益于具有已知分子作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)性治療的患者，選擇最可能從具有已知分子機(jī)制的批準(zhǔn)藥物中獲益的患者(其中該機(jī)制對(duì)于藥物可能不具有標(biāo)簽的疾病的小子集可能是重要的)，篩選患者群體以幫助決定更侵入/昂貴的測試，例如，從非侵入性的血液測試到更例如活檢的具侵入性的選擇的測試級(jí)聯(lián)，或測試以評(píng)估用于治療另一種適應(yīng)癥的藥物的副作用。

如本文所用，術(shù)語“定量數(shù)據(jù)”或“定量水平”或“定量量”是指與可以分配數(shù)值的任何數(shù)據(jù)集組分(例如，標(biāo)志物，臨床標(biāo)志)相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)、水平或量。

如本文所用，術(shù)語“受試者”是指人或另一種哺乳動(dòng)物。通常，術(shù)語“受試者”和“患者”在本文中可互換地用于指人類個(gè)體。

如本文所使用的，術(shù)語“體樣本”是指可以從受試者(例如人類)或從受試者的組分(例如組織)獲得的樣本。樣本可以是任何生物組織或流體，其中利用生物組織或流體可以測定本文所述的分析物。通常，樣本將是“臨床樣本”，即源自患者的樣本。這樣的樣本包括但不限于體液，例如唾液、呼吸、尿、血液、血漿或血清；和具有已知診斷、治療和/或結(jié)果歷史的檔案樣本。術(shù)語生物樣本還包括通過處理體樣本得到的任何材料。體樣本的處理可涉及過濾、蒸餾、萃取、濃縮、干擾組分的失活、試劑的添加等中的一種或多種。

如本文所用，術(shù)語“正?！焙汀敖】怠笨苫Q使用。它們是指未顯示待檢測的疾病、病癥或病狀的任何癥狀，并且未被診斷患有疾病、病癥或病狀的個(gè)體或個(gè)體組。優(yōu)選地，正常個(gè)體(或個(gè)體組)不服用藥物。在某些實(shí)施方案中，正常個(gè)體與獲得待測試樣本的個(gè)體相比具有相似的性別、年齡、體重指數(shù)。術(shù)語“正?！痹诒疚闹幸灿糜谙薅◤慕】祩€(gè)體分離的樣本。

如本文所用，術(shù)語“對(duì)照”或“對(duì)照樣本”是指從正常(即健康)個(gè)體或個(gè)體組分離的一個(gè)或多個(gè)生物樣本。術(shù)語“對(duì)照”、“對(duì)照值”或“對(duì)照樣本”還可以指從歸類為正常的一個(gè)或多個(gè)個(gè)體的樣本得到的數(shù)據(jù)的匯編。

本文所述的實(shí)施方案涉及能夠使用生物識(shí)別元件提供對(duì)各種分析物或生物分子的分析的電化學(xué)生物傳感器。該生物傳感器可以產(chǎn)生與樣本(例如生物樣本)中檢測到的分析物的存在或量相關(guān)的信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，生物傳感器可用于檢測存在于生物樣本中的蛋白質(zhì)、多肽、細(xì)胞因子、微生物、多核苷酸(mRNA，DNA，cDNA，mRNA等)，生物樣本例如體液(例如血清、血液、血漿、唾液、尿液、粘液、呼吸等)。本文所述的生物傳感器可以提供用于生物樣本(例如通過非侵入性或微創(chuàng)手段獲得的體液)中的分析物的簡單的即時(shí)檢驗(yàn)、實(shí)時(shí)評(píng)估的單次使用，一次性和成本有效的手段。

圖1示出了依照本申請的實(shí)施方案的生物傳感器10。傳感器10是三電極傳感器，包括對(duì)電極12、工作電極14和基準(zhǔn)電極16，它們形成在襯底的表面上。介電層40覆蓋工作電極12、對(duì)電極14和基準(zhǔn)電極16的一部分。介電層40包括限定工作電極12、對(duì)電極14和基準(zhǔn)電極16的、暴露于包含待檢測的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)分析物的樣本的檢測區(qū)域的孔口20。用于至少一個(gè)目標(biāo)分析物的受體能夠官能化或化學(xué)官能化到工作電極。該受體能夠?qū)⑴c生物樣本中的目標(biāo)分析物中的一個(gè)或多個(gè)選擇性地結(jié)合。

生物傳感器還可以包括：電壓源22，用于對(duì)工作電極、對(duì)電極和/或基準(zhǔn)電極施加電壓定位，以及測量設(shè)備或電流監(jiān)測器24，用于測量工作電極和對(duì)電極之間流動(dòng)的電流。分析物和受體的相互作用可利用可以使用電化學(xué)分析技術(shù)如循環(huán)伏安法(CV)，差分脈沖伏安法(DPV)檢測，以確定樣本中分析物的存在。

工作電極14平衡在適當(dāng)?shù)碾娀瘜W(xué)電位使得當(dāng)受體與樣本中的分析物結(jié)合時(shí)流經(jīng)電極的電流變化。對(duì)電極12的作用是完成電路，允許電荷流經(jīng)傳感器10。工作電極14和對(duì)電極12優(yōu)選地由相同的材料形成，但是這不是要求?？捎糜诠ぷ麟姌O14和對(duì)電極12的材料的例子包括但不限于金，鉑、鈀、銀、碳、其合金及其復(fù)合物。

被官能化或化學(xué)官能化到工作電極的受體是選擇性結(jié)合目標(biāo)分析物的分子。與分析物選擇性結(jié)合的分子是優(yōu)先結(jié)合該分析物的分子(即，其對(duì)該分析物的結(jié)合親和力大于其對(duì)任何其它分析物的結(jié)合親和力)。其對(duì)目標(biāo)分析物的結(jié)合親和力可以是其對(duì)任何其它分析物的結(jié)合親和力的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、100倍或更多。除了其相對(duì)結(jié)合親和力之外，受體還必須具有足夠高以有效結(jié)合目標(biāo)分析物的絕對(duì)結(jié)合親和力(即，它必須具有足夠的靈敏度)。具有皮摩爾至微摩爾范圍內(nèi)的結(jié)合親和力的受體是合適的。這種相互作用可以是可逆的。

受體可以是任何性質(zhì)(例如，化學(xué)，核酸，肽，脂質(zhì)，其組合等)。分析物也可以是任何性質(zhì)的，只要存在選擇性與其結(jié)合并且在一些情況下特異性與其結(jié)合的受體即可。在一些實(shí)施方案中，分析物可以是帶電物質(zhì)或分子。

本文所用的術(shù)語“官能化”或“化學(xué)官能化”是指通過化學(xué)反應(yīng)將官能基團(tuán)加成到材料的表面上。如本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的，官能化可以用于材料的表面改性，以實(shí)現(xiàn)所需的表面性質(zhì)，例如生物相容性，潤濕性等。類似地，本文所用的術(shù)語“生物官能化”，“生物官能化”等意指對(duì)材料表面的改性，使得其具有所需的生物學(xué)功能，這將是如生物工程的相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解的。

受體可以共價(jià)或非共價(jià)地官能化到工作電極。受體與工作電極的共價(jià)附著可以是直接或間接的(例如通過連接子)。受體可以使用連接子固定在工作電極上。連接子可以是能夠用于連接多種實(shí)體的連接子。

在一些實(shí)施方案中，連接子可以是同雙功能連接子或異雙功能連接子，這取決于待綴合的分子的性質(zhì)。同雙功能連接子具有兩個(gè)相同的反應(yīng)基團(tuán)。異雙功能連接子具有兩個(gè)不同的反應(yīng)基團(tuán)。各種類型的市售連接子與一個(gè)或多個(gè)以下基團(tuán)反應(yīng)：伯胺，仲胺，巰基，羧基，羰基和碳水化合物。胺特異性連接子的實(shí)例是雙(磺基琥珀酰亞胺基)辛二酸酯，雙[2-(琥珀酰亞氨基氧基羰基氧基)乙基]砜，辛二酸二琥珀酰亞胺酯，酒石酸二琥珀酰亞胺酯，己二酸二甲酯2HCl，二甲基庚二亞胺2HCl，二甲基辛二酰亞胺HCl，乙二醇雙-[琥珀酰亞胺基-[琥珀酸]]，二硫代雙(丙酸琥珀酰亞胺酯)和3,3'-二硫代雙(磺基琥珀酰亞胺基丙酸酯)。與巰基反應(yīng)的連接子包括雙馬來酰亞胺己烷，1,4-二-[3'-(2'-吡啶基二硫代)-丙酰胺基)]丁烷，1-[對(duì)疊氮基水楊酰胺基]-4-[碘乙酰氨基]丁烷和N-[4-(對(duì)疊氮基水楊酰胺基)丁基]-3'-[2'-吡啶基二硫代]丙酰胺。優(yōu)先與碳水化合物反應(yīng)的連接子包括疊氮苯甲酰肼。優(yōu)先與羧基反應(yīng)的連接子包括4-[對(duì)疊氮基水楊酰胺基]丁胺。

與胺和巰基反應(yīng)的異雙功能連接子包括N-琥珀酰亞胺基-3-[2-吡啶基二硫代]丙酸酯，琥珀酰亞胺基[4-碘乙?；鵠氨基苯甲酸酯，琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯，m-馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯，磺基琥珀酰亞胺基6-[3-[2-吡啶基二硫代]丙酰胺基]己酸酯，和磺基琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯。與羧基和胺基反應(yīng)的異雙能夠連接子包括1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]-碳二亞胺鹽酸鹽。與碳水化合物和巰基反應(yīng)的異雙功能連接子包括4-[N-馬來酰亞胺甲基]-環(huán)己烷-1-羧基酰肼HCl，4-(4-N-馬來酰亞胺基苯基)-丁酸酰肼2HCl，和3-[2-吡啶基二硫代]丙酰肼。

可替代地，受體可以非共價(jià)地涂敷到工作電極上。受體到工作電極的非共價(jià)沉積會(huì)涉及到聚合物基質(zhì)的使用。聚合物可以是天然存在的或非天然存在的，并且可以是任何類型的，包括但不限于核酸(例如DNA，RNA，PNA，LNA等或其模擬物、衍生物或組合)，氨基酸(例如肽，蛋白質(zhì)(天然或變性的)等)或其模擬物、衍生物或組合，脂質(zhì)，多糖和官能化嵌段共聚物。受體可吸附到和/或包埋在聚合物基質(zhì)內(nèi)。

可替代地，受體可以與聚合物共價(jià)綴合或交聯(lián)(例如，其可以“接枝”到官能化聚合物上)。

合適的肽聚合物的實(shí)例是聚賴氨酸(例如聚-L-賴氨酸)。其它聚合物的實(shí)例包括包含聚乙二醇(PEG)，聚酰胺，聚碳酸酯，聚烷撐，聚亞烷基二醇，聚環(huán)氧烷，聚對(duì)苯二甲酸亞烷基酯，聚乙烯醇，聚乙烯醚，聚乙烯酯，聚乙烯基鹵化物，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙交酯，聚硅氧烷，聚氨酯，烷基纖維素，羥烷基纖維素，纖維素醚，纖維素酯，硝基纖維素，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，甲基纖維素，乙基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羥丁基甲基纖維素，乙酸纖維素，丙酸纖維素，纖維素乙酸丁酸酯，醋酸纖維素鄰苯二甲酸酯，羧乙基纖維素，三乙酸纖維素，硫酸纖維素鈉鹽，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(甲基丙烯酸乙酯)，聚(甲基丙烯酸丁酯)，聚(甲基丙烯酸異丁酯)，聚(甲基丙烯酸己酯)，聚(甲基丙烯酸異癸酯)，聚(甲基丙烯酸月桂酯)，聚(甲基丙烯酸苯酯)，聚(丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸異丙酯)，聚(丙烯酸異丁酯)，聚(丙烯酸十八烷基酯)，聚乙烯，聚丙烯，聚(乙二醇)，聚(環(huán)氧乙烷)，聚(對(duì)苯二甲酸乙二醇酯)，聚(乙烯醇)，聚乙酸乙烯酯，聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚透明質(zhì)酸，酪蛋白，明膠，谷蛋白，聚酸酐，聚丙烯酸，藻酸鹽，殼聚糖，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(甲基丙烯酸乙酯)，聚(甲基丙烯酸丁酯)，聚(甲基丙烯酸異丁酯)，聚(甲基丙烯酸己酯)，聚(甲基丙烯酸異癸酯)，聚(甲基丙烯酸月桂酯)，聚(甲基丙烯酸苯酯)，聚(丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸異丙酯)，聚(丙烯酸異丁酯)，和聚(丙烯酸十八烷基酯)，聚(丙交酯-乙交酯)，共聚草酸酯，聚己內(nèi)酯，聚酯酰胺，聚原酸酯，聚羥基丁酸，聚酐，聚(苯乙烯-b-異丁烯-b-苯乙烯)(SIBS)嵌段共聚物，乙烯乙酸乙烯酯，聚(甲基)丙烯酸，乳酸和乙醇酸的聚合物，聚酸酐，聚(鄰)酯，聚氨酯，聚(丁酸)，聚(戊酸)和聚(丙交酯-共聚己內(nèi)酯)，以及例如藻酸鹽和其它多糖的天然聚合物(包括葡聚糖和纖維素，膠原，白蛋白和其他親水蛋白，玉米醇溶蛋白和其它醇溶谷蛋白和疏水蛋白)、其共聚物和混合物及其化學(xué)衍生物的嵌段共聚物，包括取代和/或添加化學(xué)基團(tuán)，例如烷基，亞烷基，羥基化，氧化和本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)進(jìn)行的其它改性。

在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，工作電極可以包括化學(xué)交聯(lián)或生物素化的金工作電極，以允許連接抗體或含生物素的分子。金工作電極可以例如用二硫醇雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)(DSP)交聯(lián)，其含有可與蛋白質(zhì)和抗體的胺基團(tuán)反應(yīng)的胺反應(yīng)性N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯。生物素化也可用于連接含生物素的分子，包括含有生物素的適體、蛋白質(zhì)、核酸或其它分子。

將意識(shí)到，化學(xué)官能化的靈活性使得生物傳感器可用于基本上附著對(duì)分析物具有親和力的任何受體或配體?？梢赃B接到工作電極的具有親和力的受體或配體的分析物的實(shí)例包括但不限于DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、生物素和鏈霉親和素。官能化或化學(xué)官能化到工作電極的這些分析物的受體可以包括配體，例如抗體或其抗原結(jié)合片段。抗體通常在賴氨酸(K)殘基的側(cè)鏈中具有幾個(gè)可用于交聯(lián)的伯胺，例如NHS-酯交聯(lián)。

化學(xué)官能化方法還使具有氨基的DNA適體的生物綴合成為可能。這些適體可潛在地結(jié)合小分子和蛋白質(zhì)。一旦結(jié)合，工作電極表面上電荷的變化將使生物傳感器能夠檢測靶生物分子或小分子。

在一些實(shí)施方案中，受體可以是特定于目標(biāo)分析物的抗體。用于本文所述的生物傳感器的合適的抗體包括單克隆和多克隆抗體，免疫活性片段(例如Fab或(Fab)2片段)，抗體重鏈，人源化抗體，抗體輕鏈和嵌合抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法制備抗體(包括單克隆和多克隆抗體，片段和嵌合體)(參見例如，R.G.Mage和E.Lamoyi，“Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications”，1987，Marcel Dekker，Inc.:紐約，第79-97頁；G.Kohler和C.Milstein，Nature，1975,256：495-497；D.Kozbor等人，J.Immunol.Methods，1985,81：31-42；和R.J.Cote等人，Proc.Natl.Acad.Sci.1983,80：2026-203；R.A.Lerner，Nature，1982,299：593-596；A.C.Nairn等人，Nature，1982,299：734-736；A.J.Czernik等人，Methods Enzymol.1991,201：264-283；A.J.Czernik等人，Neuromethods：Regulatory Protein Modification：Techniques&Protocols，1997,30：219-250；A.J.Czemik等人，NeuroNeuroprotocols，1995,6：56-61；H.Zhang等人，J.BioI.Chern.2002,277：39379-39387；S.L.Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，1984,81：6851-6855；M.S.Neuberger等人，Nature，1984,312：604-608；S.Takeda等人，Nature，1985,314：452-454)。用于生物傳感器的抗體可以通過本領(lǐng)域公知的方法純化(參見例如S.A.Minden，“Monoclonal Antibody Purification”，1996，IBC Biomedical Library Series：Southbridge，Mass.)。例如，可以通過在其上結(jié)合蛋白質(zhì)標(biāo)記或其片段的柱上通過來親和純化抗體。然后可以使用具有高鹽濃度的緩沖液從柱上洗脫結(jié)合的抗體。

代替制備，用于本文所述方法的抗體可以從科學(xué)或商業(yè)來源獲得。

在一些實(shí)施方案中，受體可以是特異性結(jié)合癌生物標(biāo)記的抗體或其抗原結(jié)合片段。癌癥生物標(biāo)記的實(shí)例包括AMACR(前列腺癌)，碳水化合物抗原125(CA125)(卵巢癌)，人附睪蛋白4(HE4)(卵巢癌)，BRAC1/BRAC2(乳腺癌，卵巢癌)，AFP(肝癌)，BCR-ABL(慢性髓性白血病)，BRAF V600E(黑色素瘤/結(jié)腸直腸癌)，KIT(胃腸道間質(zhì)瘤)，PSA(前列腺癌)，S100(黑素瘤)，KRAS(肺癌)，CIZL(肺癌)和EGFR(結(jié)腸直腸/肺癌)。

應(yīng)當(dāng)理解，受體不限于針對(duì)癌生物標(biāo)記的抗體或抗原結(jié)合片段，并且針對(duì)與可以在體樣本中可檢測的其它疾病，紊亂，病癥或病理相關(guān)的其他生物標(biāo)記的抗體或抗原結(jié)合片段也被官能化或化學(xué)官能化到工作電極。

為了最小化工作電極表面上的任何非特異性結(jié)合并阻斷工作電極的任何開放表面區(qū)域，一旦受體已經(jīng)被官能化或化學(xué)官能化到工作電極，則可以將至少一種阻滯劑施加到工作電極的表面上。阻滯劑可以通過最小化工作電極上的非特異性相互作用來增強(qiáng)生物傳感器的再現(xiàn)性和靈敏度。在一些實(shí)施方案中，阻滯劑可以包括二硫蘇糖醇或酪蛋白。阻滯劑可以以有效使得工作電極表面上的蛋白質(zhì)或其它分子的非特異性結(jié)合最小化的量施加于工作電極的表面。

電壓源22可以根據(jù)傳感器10的設(shè)計(jì)而向工作電極14和基準(zhǔn)電極16和/或?qū)﹄姌O12施加電壓電位。工作電極14和對(duì)電極16之間的電流可以用測量設(shè)備或計(jì)量器24來測得。這種電流取決于分析物與工作電極上的受體的相互作用。

所測得的電流的量或水平與生物樣本中的分析物的水平或量成比例。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)樣本是從受試者獲得的體樣本時(shí)，一旦確定了由用傳感器測試的反應(yīng)溶液所產(chǎn)生的電流水平，就可以將該水平與預(yù)定值或?qū)φ罩颠M(jìn)行比較，以提供用于診斷或監(jiān)測受試者中與分析物的存在或不存在相關(guān)的病癥，病理或障礙的信息。

從受試者獲得的樣本所產(chǎn)生的電流水平可以與先前(例如在施用治療劑之前)從受試者獲得的樣本的電流水平比較。因此，本文所述的方法可用于通過比較治療方案之前和之后所獲得的電流水平來度量治療與受試者中分析物的水平相關(guān)的病癥、病理或障礙的治療方案的功效。另外，本文所述的方法可用于通過比較在給定時(shí)間段內(nèi)(例如數(shù)天，數(shù)周，數(shù)月或數(shù)年)獲得的體樣本中的電流水平，來度量與受試者中的目標(biāo)分析物的存在或不存在相關(guān)的病癥、病理或障礙的進(jìn)展。

從受試者獲得的樣本所產(chǎn)生的電流水平也可以與預(yù)定值或?qū)φ罩颠M(jìn)行比較，以提供用于確定與受試者中分析物水平相關(guān)的病癥、病理或障礙的嚴(yán)重性或攻擊性的信息。預(yù)定值或?qū)φ罩悼梢曰趶慕】祷蛘Ｊ茉囌呋蛞话闳后w或從對(duì)照受試者的選頂群體獲得的可比較樣本中的電流水平。

預(yù)定值可以采取各種形式。預(yù)定值可以是單個(gè)截止值，例如中值或平均值。預(yù)定值可以基于比較組來建立，諸如其中一個(gè)定義的組中的電流電平是另一個(gè)定義的組中的電流電平的兩倍。預(yù)定值可以是這樣的范圍，例如，其中一般受試者群體被均等地(或不等地)劃分成組或劃分為象限，最低象限是具有最低電流水平的受試者，最高象限是具有最高電流電平的個(gè)體。在示例性的實(shí)施方案中，選擇兩個(gè)截止值以最小化假陽性和假陰性結(jié)果的比率。

圖1和圖2中所示的生物傳感器可以制造在襯底100上，襯底100由聚酯或其它非導(dǎo)電材料(例如其它聚合物材料、氧化鋁(Al₂O₃)、陶瓷基材料、玻璃或半導(dǎo)電襯底，例如硅、氧化硅和其它覆蓋的襯底。因此，多個(gè)傳感器器件102可以形成在公共襯底100(圖2)上。如將理解的，可以設(shè)想電極的幾何形狀和尺寸的變化。

生物傳感器可以使用薄膜、厚膜和/或噴墨印刷技術(shù)制造，特別是用于在襯底上沉積多個(gè)電極。薄膜工藝可以包括物理或化學(xué)氣相沉積。用于其制造的電化學(xué)傳感器和厚膜技術(shù)在C.C.Liu等人的美國專利4,571,292，C.C.Liu的美國專利No.4,655,880，以及共同未決的美國申請序號(hào)09/466,865中進(jìn)行了論述，這些專利或?qū)＠暾埲績?nèi)容通過引用并入本文。

在一些實(shí)施方案中，工作電極、對(duì)電極和基準(zhǔn)電極可利用激光消融來形成，激光消融是一種能夠產(chǎn)生具有小于千分之一英寸的特征的元件的工藝。激光消融實(shí)現(xiàn)了工作電極、對(duì)電極和基準(zhǔn)電極的精確限定以及電連接引線和其它特征，這是減少變化系數(shù)以及提供精確測量所要求的?？梢允褂眉す鉄g來照射金屬化膜，例如Au，Pd和Pt或具有類似電化學(xué)性質(zhì)的任何金屬，其可以濺射或涂覆在塑料襯底(例如PET或聚碳酸酯)或其它介電材料上，以提供這些特征。

在一個(gè)實(shí)施例中，可以通過濺射技術(shù)沉積厚度為約300A至約2000A的金膜，得到非常均勻的層，其可以被激光燒蝕以形成工作電極和對(duì)電極。對(duì)電極可以使用其它材料。然而，為了制造的簡單性，對(duì)于工作電極和對(duì)電極使用相同的材料將簡化制造工藝，從而提供在單個(gè)處理步驟中生產(chǎn)兩個(gè)電極的可行性。然后可以使用厚膜絲網(wǎng)印刷技術(shù)來印刷Ag/AgCl基準(zhǔn)電極、絕緣層和電連接部件。

然后可以將工作電極表面化學(xué)交聯(lián)或生物素化，以允許連接抗體或含生物素的分子。交聯(lián)步驟可以通過產(chǎn)生硫醇鍵來完成。這可以使用例如DSP(二硫醇雙[琥珀酰亞胺丙酸酯])化學(xué)完成以產(chǎn)生硫醇鍵。DSP可以溶于DMSO，(二甲基亞砜)。DSP在其碳間隔臂的每個(gè)末端含有胺反應(yīng)性N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯。NHS可與伯胺(在pH＝7-9)反應(yīng)而形成穩(wěn)定的酰胺鍵。作為實(shí)例，可以使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，在DSP改性的金電極表面上形成半穩(wěn)定的胺反應(yīng)性酯基團(tuán)。類似的化學(xué)方法可以用于產(chǎn)生半穩(wěn)定的胺-酯基團(tuán)以增強(qiáng)抗體和硫醇基團(tuán)之間的交聯(lián)。其它交聯(lián)劑，例如3,3'-二硫代雙[磺基琥珀酰亞胺基丙酸酯](DTSSP)也可以用于該工藝中。

生物素化是快速的、特異性的，并且通常由于生物素的相對(duì)小的尺寸而對(duì)分子的天然功能不受干擾?？梢詫㈡溍褂H和素和類似的化學(xué)品如抗生物素蛋白固定在用于檢測抗體和抗原的相互作用的生物傳感器的工作電極表面上。

生物傳感器的工作電極可以使用上述固定方法與抗體受體或含生物素的蛋白(包括抗體)交聯(lián)或生物素化。

在將抗體或蛋白質(zhì)加入工作電極之后，可以使用阻滯劑阻滯工作電極表面，以最小化電極表面上的任何非特異性分子(例如蛋白質(zhì))結(jié)合。該步驟將增強(qiáng)生物傳感器的再現(xiàn)性和靈敏度。在一些實(shí)施方案中，可以使用DTT(二硫蘇糖醇)、酪蛋白和/或其它阻滯劑來覆蓋工作電極的開放表面積并使任何非特異性蛋白質(zhì)覆蓋最小化。

在其他實(shí)施方案中，可以在襯底的表面上提供多個(gè)生物傳感器以提供生物傳感器陣列。生物傳感器陣列可以被配置為檢測在陣列附近發(fā)生的化學(xué)和/或生物過程(化學(xué)反應(yīng)，細(xì)胞培養(yǎng)，神經(jīng)活性，核酸測序過程等)的宿主中的分析物濃度變化。生物傳感器陣列可以包括布置成多行和多列的多個(gè)生物傳感器。每個(gè)生物傳感器包括工作電極、對(duì)電極和覆蓋工作電極和對(duì)電極的一部分并且限定暴露工作電極和對(duì)電極的其它部分的孔口的介電層。用于至少一種目標(biāo)分析物的受體可以被官能化或化學(xué)官能化到工作電極。對(duì)于陣列的每個(gè)生物傳感器，受體可以是相同的或不同的，并且可以選擇性地結(jié)合一種或多種目標(biāo)分析物。陣列的生物傳感器可以被配置為提供表示接近陣列表面的分析物的存在和/或濃度的至少一個(gè)輸出信號(hào)。對(duì)于所述多個(gè)列中的每一列或所述多個(gè)行中的每一行，所述陣列進(jìn)一步包括經(jīng)配置以向所述列或行中的相應(yīng)生物傳感器提供電壓電位的列或行電路。行或列中的每個(gè)生物傳感器可以潛在地檢測不同的分析物和/或偏置以檢測不同的分析物。

在一個(gè)實(shí)施例中，受體可以包括與α-甲基?；?CoA消旋酶(AMACR)或AMACR的底物或代謝物結(jié)合的抗體和/或其抗原結(jié)合片段。AMACR是涉及膳食支鏈脂肪酸的過氧化物酶體β氧化的酶。AMACR在前列腺癌上皮中一直過表達(dá)，因此它成為前列腺內(nèi)癌細(xì)胞的理想的特異性生物標(biāo)記。AMACR的過表達(dá)可能增加前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)槠浔磉_(dá)在癌前病變(前列腺上皮內(nèi)瘤變)中增加。此外，流行病學(xué)、遺傳和實(shí)驗(yàn)室研究已經(jīng)指出了AMACR在前列腺癌中的重要性。遺傳性前列腺癌家族中基因組范圍的連鎖掃描已經(jīng)證明，AMACR(5p 13)的染色體區(qū)域是前列腺癌易感基因的位置，并且已經(jīng)顯示AMACR基因序列變體(多態(tài)性)在具有遺傳性前列腺癌的家族中與前列腺的癌癥共分離。

在一些實(shí)施方案中，抗體可以是特異性結(jié)合AMACR的單克隆抗體。特異性結(jié)合AMACR的單克隆抗體的實(shí)例是可購自Dako的AMACR Clone13H4，可購自Thermoscientific的AMACR抗體2A10F3和可購自Novus的AMACR抗體2A10F3。

結(jié)合AMACR或AMACR的底物或代謝物的抗體或其抗原結(jié)合片段可以通過例如交聯(lián)或生物素化共價(jià)或非共價(jià)地連接到工作電極上。抗體或其抗原結(jié)合片段與在獲自患有或懷疑患有前列腺癌的受試者的生物樣本中的AMACR或AMACR的底物或AMACR代謝物的相互作用將產(chǎn)生可以電化學(xué)、電學(xué)或光學(xué)方式檢測的信號(hào)，并且該信號(hào)可以用于定量生物樣本中的AMACR。

可以使用生物傳感器測量從懷疑患有前列腺癌或處于前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者獲得的生物樣本中的AMACR的量或數(shù)量，以確定體液中AMACR的水平和量，并因此判定受試者是否患有前列腺癌或患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。

取決于生物傳感器的設(shè)計(jì)，電壓源可以向工作電極和基準(zhǔn)電極和/或?qū)﹄姌O施加電壓電位。工作電極和對(duì)電極之間的電流可以用測量設(shè)備或計(jì)量器來測量。

測得的電流的量或水平可以與生物樣本中AMACR或AMACR的底物或代謝物的量以及受試者中前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)或存在成比例。一旦確定了用生物傳感器測試的生物樣本所產(chǎn)生的電流水平，就可以將該水平與預(yù)定值或?qū)φ罩颠M(jìn)行比較，以提供用于診斷或監(jiān)測受試者中前列腺癌的信息。例如，可以將電流水平與預(yù)定值或?qū)φ罩颠M(jìn)行比較，以判定受試者是否患有前列腺癌或有前列腺癌。與預(yù)定值或?qū)φ罩迪啾仍黾拥碾娏魉娇梢灾甘臼茉囌呋加星傲邢侔?；而與預(yù)定值或?qū)φ罩迪啾认嗨苹蚪档偷碾娏魉娇芍甘臼茉囌咧星傲邢侔┑牟淮嬖凇?/p>

由從受試者獲得的生物樣本所產(chǎn)生的電流水平可以與先前(例如在施用治療劑之前)從受試者獲得的類似生物樣本的電流水平比較。因此，本文所述的方法可用于通過比較治療方案之前和之后獲得的電流水平來度量治療方案用于治療受試者的前列腺癌的功效。另外，本文所述的方法可用于通過比較在給定時(shí)間段(例如數(shù)天，數(shù)周，數(shù)月或數(shù)年)內(nèi)所獲得的生物樣本中的電流水平來測量受試者中前列腺癌的進(jìn)展。

由受試者的生物樣本所產(chǎn)生的電流水平也可以與預(yù)定值或?qū)φ罩当容^，以提供用于確定受試者中前列腺癌的嚴(yán)重性或攻擊性的信息。因此，在一些方面，可以將電流水平與從具有與前列腺癌相關(guān)的組織病理學(xué)的公知臨床分類或階段的受試者獲得的對(duì)照值(例如，前列腺癌或惰性與攻擊性前列腺癌的Gleason評(píng)分)進(jìn)行比較。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，樣本中的電流可提供用于確定受試者中前列腺癌的特定Gleason等級(jí)或分?jǐn)?shù)的信息。

預(yù)定值或?qū)φ罩悼梢曰趶慕】祷蛘Ｊ茉囌呋蛞话闳后w或從對(duì)照受試者的選頂群體獲得的可比較樣本中的電流水平。在一些方面，對(duì)照受試者的選頂群體可包括診斷為前列腺癌的個(gè)體。例如，與對(duì)照值相比具有更大電流水平的受試者可以指示具有更晚期的前列腺癌的受試者。

對(duì)照受試者的選擇群體還可以包括患有前列腺癌的受試者，以便將患有前列腺癌的受試者與具有良性前列腺疾病的受試者區(qū)分開。在一些方面，對(duì)照受試者的選頂群體可以包括患有前列腺癌的一組個(gè)體。

預(yù)定值可以采取各種形式。預(yù)定值可以是單個(gè)截止值，例如中值或平均值。預(yù)定值可以基于比較組來建立，諸如其中一個(gè)定義的組中的電流電平是另一個(gè)定義的組中的電流電平的兩倍。預(yù)定值可以是這樣的范圍，例如，其中一般受試者群體被均等地(或不等地)劃分成組或劃分為象限，最低象限是具有最低電流水平的受試者，最高象限是具有最高電流電平的個(gè)體。在示例性的實(shí)施方案中，選擇兩個(gè)截止值以最小化假陽性和假陰性結(jié)果的比率。

應(yīng)當(dāng)理解，AMACR的檢測可以使用從受試者獲得的任何生物樣本或生理流體來完成。已經(jīng)使用血液樣本，并且也可以使用其他生理流體例如尿、唾液等實(shí)現(xiàn)AMACR的檢測。因此，作為任何類型的生理流體中的前列腺癌的生物標(biāo)志物的AMACR的檢測可以由本文所述的生物傳感器提供。

從本發(fā)明的上述描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到改進(jìn)、變化和修改。本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的這些改進(jìn)、變化和修改旨在由所附權(quán)利要求覆蓋。本申請中引用的所有參考文獻(xiàn)、出版物和專利通過引用整體并入本文。