本發(fā)明涉及生物傳感器敏感膜的制備方法，特別是一種聲表面波生物傳感器敏感膜的電化學(xué)原位制備方法。

背景技術(shù)：

聲表面波器件主要有壓電基片和叉指換能器組成，電信號傳輸?shù)讲嬷笓Q能器時，由逆壓電效應(yīng)將電信號轉(zhuǎn)化成機械波，當(dāng)機械波傳輸至另一電極時，由壓電效應(yīng)將機械波轉(zhuǎn)化成電信號。正因為在換能器中傳輸時是以機械波的形式，所以不受電磁干擾。在叉指換能器表面增加一層敏感膜時，敏感膜對特定的物質(zhì)產(chǎn)生響應(yīng)，使敏感膜的重量、粘彈性、電導(dǎo)率、介電常數(shù)等物理特性發(fā)生改變，對基片表面的聲波傳輸產(chǎn)生擾動，聲波的幅度、相位、頻率都發(fā)生相應(yīng)的改變。由于引起多種物理特性的變化，使聲表面波傳感器具有高靈敏度。

通過檢測聲表面波信號參數(shù)的變化，可以實現(xiàn)對待測物的定性和定量分析。目前開發(fā)的聲表面波生物傳感器包括葡萄糖saw(聲表面波)傳感器、dna測定saw傳感器及腫瘤標(biāo)志物saw傳感器等。另外，由于聲表面波無源無線傳感器具有非接觸、快速、無電源、抗干擾，易編碼，保密性好，成本低等優(yōu)點，目前，已廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域。由它構(gòu)成的傳感器陣列，傳感元之間無信號線連接，陣列輸出也無需引線連接，分布更容易，應(yīng)用不受限制，特別適合一些環(huán)境復(fù)雜，不宜接觸的工程結(jié)構(gòu)和環(huán)境的遙測、傳感和目標(biāo)識別領(lǐng)域。

本發(fā)明中生物敏感膜主要是根據(jù)電沉積吸附的原理制成。saw器件連接工作端口，對電極采用惰性金屬鉑絲，使得溶液中的敏感膜成分在電場作用下沉積至saw器件上，原位制備出的敏感膜修飾的saw傳感器。敏感膜成分選擇氨基酸和鎳，利用saw器件的高靈敏特性，氨基酸敏感膜的生物相容性及成膜性，鎳的催化特性，在saw器件的整個區(qū)域覆蓋敏感膜。

這種電化學(xué)機制下原位制備敏感膜的方法，快捷、方便，可以根據(jù)需求的不同及時改變生長條件，在成膜過程中可以通過電化學(xué)工作站進(jìn)行觀察，使生產(chǎn)人員實時了解成膜情況。對于極其微小的saw器件，生成的膜若發(fā)生變化對于高靈敏度的saw器件來說，都有可能是極大的影響，所以，可以直觀了解外部環(huán)境對成膜造成的影響，避免無謂的損失。

將電化學(xué)方法應(yīng)用于制備saw生物傳感器，二者工藝可兼容，生產(chǎn)高效、成本低，而saw傳感器的體積小且便于在各種極端環(huán)境下應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對上述存在問題，提供一種聲表面波生物傳感器敏感膜的電化學(xué)原位制備方法，將電化學(xué)方法應(yīng)用于制備saw生物傳感器，二者工藝可兼容，生產(chǎn)高效、成本低；saw傳感器的體積小、抗干擾能力強，便于在各種極端環(huán)境下應(yīng)用；檢測濃度低，可達(dá)到10^-8mol/l。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種聲表面波生物傳感器敏感膜的電化學(xué)原位制備方法，在聲表面波器件上用電化學(xué)方法原位電沉積一層生物敏感膜，具體步驟如下：

1)制備敏感膜裝置的清洗

saw傳感器敏感膜的制備裝置，由參比電極、對電極、工作電極、電極夾、聲表面波器件、鉑絲、電沉積溶液和密封容器組成，參比電極和對電極分別與鉑絲連接，工作電極通過電極夾與聲表面波器件連接，電沉積溶液裝入密封容器中，鉑絲伸入電沉積溶液中，聲表面波器件的叉指換能器浸入電沉積溶液中；

將直徑為0.5mm的鉑絲放在裝有無水乙醇的容器中，使需要浸入電沉積溶液的部分鉑絲能浸入無水乙醇中，將容器放入超聲清洗機中，超聲清洗鉑絲5-10min，從超聲清洗機中取出容器，再從容器中取出鉑絲，然后放在裝有超純水的容器中，并將容器放在超聲清洗機中，超聲清洗鉑絲5-10min，最后用濾紙吸去鉑絲表面水分；

在容器中放入無水乙醇并使使無水乙醇超過容器的1/3，將容器置于超聲清洗機中，超聲清洗燒杯5-10min，在燒杯超聲的過程中，順著燒杯口用洗瓶將無水乙醇沿?zé)诹飨?，至整個燒杯壁都有無水乙醇流過；

將電極夾放在上述裝有無水乙醇的容器中浸泡5min，用洗瓶中的超純水將電極夾沖洗1-2min，再用濾紙將電極夾擦拭干凈，完成制備敏感膜裝置的清洗工作；

2)電沉積溶液的配置

配制好的ph值為5-8的緩沖溶液作為底液，在配置好的底液中加入鎳鹽，底液與鎳鹽的用量比為10ml：1mmol，溶液放置在超聲清洗機中超聲3-5min，到溶液完全溶解鎳鹽顆粒為止；取出裝有溶液的容器，在容器中再次加入相應(yīng)量的強電解質(zhì)，底液與強電解質(zhì)的用量比為10ml：1mmol，再次將溶液放置在超聲清洗機中超聲3-5min，到溶液完全溶解強電解質(zhì)顆粒為止；取出裝有溶液的容器，在容器中再次加入相應(yīng)量的氨基酸，底液與氨基酸的用量比為1000ml：1mmol，用玻璃棒攪拌溶液1min，倒入容量瓶；把配制好的緩沖溶液沿玻璃棒倒入容器中，沖洗容器和玻璃棒，沖洗過的緩沖溶液倒入容量瓶，反復(fù)此沖洗過程3～5次，最后用緩沖溶液定容，并將容量瓶中的溶液前后搖晃均勻，制得所需的電沉積溶液；

3)saw器件的清洗、烘干

用鑷子夾住saw器件的端口，使saw器件的叉指部分浸入無水乙醇中涮洗1-3min，取出saw器件，用濾紙吸干叉指表面的無水乙醇，再浸入超純水中涮洗1-3min，取出saw器件，用濾紙吸干叉指表面的水分，再用紅外燈在60-100℃的溫度下烘烤1-2min；

4)表面波生物傳感器敏感膜的電化學(xué)原位制備

容器中倒入步驟2中配制的電沉積溶液，溶液體積為容器的2/3，將鉑絲彎折使其與saw器件的叉指部分平行，并用電極夾夾住saw器件的接地端，使saw器件的叉指部分浸入溶液，調(diào)節(jié)鉑絲與saw器件之間的距離保持在1cm，每次電沉積時saw器件和鉑絲間的距離保持一定；

夾住saw器件的電極夾連接到設(shè)備的工作端口，對電極和參比電極的端口與鉑絲相連，構(gòu)成兩電極體系，采用電化學(xué)的循環(huán)伏安法、多電位階躍法或者恒電位法把敏感成分沉積到saw器件上；

把沉積上敏感膜的saw器件連電極夾整個取下，將saw器件的叉指部分浸入超純水中涮洗1-3min，后用濾紙吸干叉指表面的水分，反復(fù)此涮洗過程3-5次，用紅外燈在60-100℃的溫度條件下烘烤1-2min，制得表面波生物傳感器敏感膜。

所述步驟2)中配置的緩沖溶液為磷酸緩沖溶液、伯瑞坦-羅比森緩沖溶液或磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，其中：磷酸緩沖溶液中包含了0.1-0.2mol/l的磷酸氫二鈉和0.1-0.2mol/l的磷酸二氫鈉配制，用0.1-0.2mol/l的磷酸調(diào)節(jié)ph值；伯瑞坦-羅比森緩沖溶液在三種酸的濃度均為0.04mol/l的磷酸、乙酸和硼酸混合液中，加入0.2mol/l的naoh調(diào)節(jié)ph值；磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中為0.2mol/l的磷酸氫二鈉并用0.1mol/l的檸檬酸來調(diào)節(jié)ph值。

所述步驟2)中氨基酸為賴氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、色氨酸或絡(luò)氨酸；鎳鹽為硫酸鎳或硝酸鎳；強電解質(zhì)為氯化鉀或硫酸鈉。

所述步驟3)中的saw器件為頻率不高于435mhz的不同頻率的saw單端口諧振器、saw雙端口諧振器或延遲線。

所述步驟4)中循環(huán)伏安法工藝為：電化學(xué)工作站作為電沉積設(shè)備，設(shè)置電沉積參數(shù)，電極之間的初始電壓設(shè)置在-1～-0.4v，終止電壓設(shè)置為0.9～1.2v，掃速范圍設(shè)置為20～100mv/s，循環(huán)次數(shù)設(shè)置為10～30圈；

多電位階躍工藝為，電化學(xué)工作站作為電沉積設(shè)備，階躍1的電位設(shè)置為-0.4v，保持0.2s，階躍2的電位設(shè)置為1v，保持0.2s，循環(huán)次數(shù)設(shè)置為1000～5000；

恒電位法工藝為，直流電源作為電沉積的電源，設(shè)置直流電源的電壓為0.9～1.2v，時間為3～8min。

本發(fā)明的特點是：

將電化學(xué)方法應(yīng)用于制備saw生物傳感器，二者工藝可兼容，生產(chǎn)高效、成本低；saw傳感器的體積小、抗干擾能力強，便于在各種極端環(huán)境下應(yīng)用；檢測濃度低，可達(dá)到10^-8mol/l。

附圖說明

圖1為本發(fā)明saw傳感器敏感膜的裝置結(jié)構(gòu)示意圖，其中，1為參比電極，2為對電極，3為工作電極，4為電極夾，5為聲表面波器件，6為鉑絲，7為叉指換能器，8為密封容器。

圖2為本發(fā)明提供的saw叉指換能器結(jié)構(gòu)的示意圖，其中，9為叉指換能器的指條，10為叉指換能器的壓電基體，11為敏感膜上的鎳顆粒，12為叉指換能器上附有賴氨酸敏感膜。

圖3為本發(fā)明提供的在saw器件電沉積前后的頻率響應(yīng)，其中，實線為電沉積前聲表器件的頻率響應(yīng)，虛線為電沉積后聲表器件的頻率響應(yīng)。

圖4為本發(fā)明提供的在saw器件電沉積前后的相位圖，其中，實線為電沉積前聲表器件的相位，虛線為電沉積后的相位圖。

圖5為本發(fā)明提供的在saw器件電沉積賴氨酸和鎳的復(fù)合敏感膜后的mapping掃描圖。

圖6為本發(fā)明提供的在已沉積鎳-賴氨酸混合敏感膜后的saw單端口諧振器檢測不同濃度多巴胺(da)的頻率偏移圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，并參照附圖，對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。

本發(fā)明提供的制作聲表面波生物傳感器敏感膜的方法，是在聲表面波單端口諧振器的叉指上電沉積一層敏感膜，該混合溶液是以ph值為5的緩沖溶液作為底液，使賴氨酸更易溶于溶液中。在混合溶液中加入氯化鉀，使聲表面波器件在電沉積過程中更易吸附上賴氨酸，形成聚賴氨酸膜。

聲表面波器件具有高靈敏特性，氨基酸敏感膜具有生物相容性，生物檢測中易于吸附生物分子，而鎳有催化的特性，這三個特性相疊加，超靈敏檢測生物分子。從傳感器件構(gòu)筑的方法來講，采用電化學(xué)沉積技術(shù)在saw叉指電極及石英晶體表面全覆蓋敏感膜，做到了增大有效響應(yīng)面積。saw器件中心頻率達(dá)到433.97mhz±0.05mhz，屬于高頻器件，這又有利于提高靈敏度。從原理上講，其它類型都是屬于改變敏感區(qū)域的電導(dǎo)率來實現(xiàn)響應(yīng)，蓋該方法制成的敏感膜屬于形成了附加電容。從應(yīng)用角度來講，可作為無線傳感網(wǎng)絡(luò)的傳感器節(jié)點。

一種聲表面波生物傳感器敏感膜的電化學(xué)原位制備方法，在聲表面波器件上用電化學(xué)方法原位電沉積一層生物敏感膜，具體步驟如下：

1)制備敏感膜裝置的清洗

saw傳感器敏感膜的制備裝置，如圖1所示，由參比電極1、對電極2、工作電極3、電極夾4、聲表面波器件5、鉑絲6、電沉積溶液7和密封容器8組成，參比電極1和對電極2分別與鉑絲6連接，工作電極3通過電極夾4與聲表面波器件5連接，電沉積溶液7裝入密封容器8中，鉑絲6伸入電沉積溶液7中，聲表面波器件5的叉指換能器浸入電沉積溶液7中；

將直徑為0.5mm的鉑絲放在裝有無水乙醇的燒杯中，使需要浸入電沉積溶液的部分鉑絲能浸入無水乙醇中，將燒杯放入超聲清洗機中，超聲清洗鉑絲5min，從超聲清洗機中取出燒杯，再從燒杯中取出鉑絲，然后放在裝有超純水的燒杯中，并將燒杯放在超聲清洗機中，超聲清洗鉑絲5min，最后用濾紙吸去鉑絲表面水分。

在25ml燒杯中放入無水乙醇，放入無水乙醇10ml，將燒杯置于超聲清洗機中，超聲清洗燒杯5min，在燒杯超聲的過程中，順著燒杯口用洗瓶將無水乙醇沿?zé)诹飨?，至整個燒杯壁都有無水乙醇流過。

將用到的電極夾放在裝有無水乙醇的燒杯中浸泡5min，用洗瓶中的超純水將電極夾沖洗1min，再用濾紙將電極夾擦拭干凈。完成制備敏感膜裝置的清洗工作。

2)電沉積溶液的配置

先配制ph值為5的磷酸緩沖溶液，其中：磷酸緩沖溶液中包含了0.1mol/l的磷酸氫二鈉和0.1mol/l的磷酸二氫鈉配制，用0.1mol/l的磷酸調(diào)節(jié)ph值；

在15ml的配置好的緩沖溶液中加入0.6572g的硫酸鎳，將裝有溶液的燒杯放置在超聲清洗機中超聲3min，到溶液完全溶解硫酸鎳顆粒為止；取出裝有溶液的燒杯，在燒杯中再次加入0.3551g的硫酸鈉，再次將溶液放置在超聲清洗機中超聲3min，到溶液完全溶解硫酸鈉顆粒為止；取出裝有溶液的容器，在容器中再次加入0.0036g的賴氨酸，用玻璃棒攪拌溶液1min，倒入容量瓶；把配制好的緩沖溶液沿玻璃棒倒入25ml容量瓶中，沖洗燒杯和玻璃棒，沖洗過的緩沖溶液倒入容量瓶，反復(fù)此沖洗過程3次，最后用緩沖溶液定容為25ml，并將容量瓶中的溶液前后搖晃均勻，制得所需的電沉積溶液。

3)saw器件的清洗、烘干

用鑷子夾住saw器件的端口，使saw器件的叉指部分浸入無水乙醇中涮洗1min，取出saw器件，用濾紙吸干叉指表面的無水乙醇，再浸入超純水中涮洗1min，取出saw器件，用濾紙吸干叉指表面的水分，再用紅外燈在60℃的溫度下烘烤2min。

4)表面波生物傳感器敏感膜的電化學(xué)原位制備

25ml燒杯中倒入步驟2中配制的電沉積溶液，溶液體積為20ml，將鉑絲彎折使其與saw器件的叉指部分平行，并用電極夾夾住saw器件的接地端，使saw器件的叉指部分浸入溶液，調(diào)節(jié)鉑絲與saw器件之間的距離保持在1cm，每次電沉積時saw器件和鉑絲間的距離保持一定。

夾住saw器件的電極夾連接到設(shè)備的工作端口，對電極和參比電極的端口與鉑絲相連，構(gòu)成兩電極體系。采用電化學(xué)的循環(huán)伏安法，電化學(xué)工作站作為電沉積設(shè)備，設(shè)置電沉積參數(shù)，電極之間的初始電壓設(shè)置為-0.4v，終止電壓設(shè)置為0.9v，掃速范圍設(shè)置為100mv/s，循環(huán)次數(shù)設(shè)置為30圈，之后開始沉積，把敏感成分沉積到saw器件上。

把上述沉積上敏感膜的saw器件連電極夾整個取下，將saw器件的叉指部分浸入超純水中涮洗1min，后用濾紙吸干叉指表面的水分，反復(fù)此涮洗過程3遍，用紅外燈在60℃的溫度條件下烘烤2min。

制備的saw生物敏感膜如圖2所示，其中，9為叉指換能器的指條，10為叉指換能器的壓電基體，11為敏感膜上的鎳顆粒，12為叉指換能器上附有賴氨酸敏感膜。

圖3為本發(fā)明提供的在saw單端口諧振器電沉積前后的頻率響應(yīng)，其中，實線為電沉積前聲表器件的頻率響應(yīng)，虛線為電沉積后聲表器件的頻率響應(yīng)。從圖中可以直觀的看出電沉積前后saw單端口諧振器的中心頻率發(fā)生偏移，說明在saw單端口諧振器的叉指換能器上生成敏感膜。

圖4為本發(fā)明提供的在saw單端口諧振器電沉積前后的相位圖，其中，實線為電沉積前聲表器件的相位，虛線為電沉積后的相位圖。從圖中可以直觀的看出電沉積前后saw單端口諧振器的中心頻率發(fā)生偏移，說明在saw單端口諧振器的叉指換能器上生成敏感膜。

圖5為本發(fā)明提供的在saw器件電沉積賴氨酸和鎳的復(fù)合敏感膜后的mapping掃描圖。從圖中看出叉指換能器上生成的敏感膜為賴氨酸和鎳的混合敏感膜。

圖6為本發(fā)明提供的在已沉積鎳-賴氨酸混合敏感膜后的saw單端口諧振器檢測不同濃度多巴胺(da)的頻率偏移圖。從圖中看出鎳-賴氨酸混合敏感膜對多巴胺(da)有吸附作用，并且具有規(guī)律性，可依據(jù)此規(guī)律制作出檢測多巴胺(da)的生物傳感器。