本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)的分析方法。

背景技術(shù)：

相互作用組學(xué)的研究對(duì)象是特定細(xì)胞內(nèi)部所發(fā)生直接相互作用的蛋白，這些蛋白質(zhì)往往通過非共價(jià)作用相互吸引。相互作用組學(xué)(interactomics)目前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來源主要是來自酵母雙雜交(yeasttwohybrid,y2h)或者親和純化與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(affinitypurification/massspectrometry,ap/ms)。這兩種技術(shù)目前雖然可以以所謂高通量的方法開展，但是具有非常明顯的局限性。

酵母雙雜交技術(shù)是基于酵母表達(dá)系統(tǒng)的通過基于一對(duì)重組蛋白的相互作用導(dǎo)致報(bào)告基因表達(dá)的一項(xiàng)生物技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)雖然較親和純化與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)有更大的通量，但是存在以下缺陷：1)異源重組蛋白在酵母表達(dá)系統(tǒng)中的折疊環(huán)境與原有系統(tǒng)差異很大，如分子伴侶系統(tǒng)不同，定位的信號(hào)不能被識(shí)別，通常會(huì)因?yàn)檎郫B錯(cuò)誤而導(dǎo)致假陽性和假陰性；2)酵母雙雜交技術(shù)是簡(jiǎn)單的把基因組編碼的所有蛋白強(qiáng)制性的成對(duì)的檢驗(yàn)可能的相互作用，完全沒有考慮蛋白的表達(dá)在細(xì)胞中受到空間和時(shí)間上的嚴(yán)格調(diào)控，被雙雜交系統(tǒng)認(rèn)定為相互作用的蛋白質(zhì)也許在原有細(xì)胞環(huán)境中根本就沒用同時(shí)存在的可能性；3)依靠酵母雙雜交技術(shù)無法對(duì)于細(xì)胞生理過程中相互作用的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)控。比如，同樣是高通量的酵母全蛋白質(zhì)組的相互作用分析，uetz和ito兩個(gè)工作小組分別對(duì)酵母蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究時(shí)，用了相似的文庫陣列進(jìn)行篩選，但是得到的結(jié)果中卻只有一小部分(141個(gè)蛋白質(zhì)相互作用對(duì))是重疊的，分別占篩出的相互作用蛋白質(zhì)對(duì)總量的21.6％和16.9％(itot,chibat,ozawar,etal.acomprehensivetwo-hybridanalysistoexploretheyeastproteininteractome.procnatlacadsciusa,2001,98(8):4569～4574)。再如，同樣是在基因組范圍內(nèi)篩選與拼接蛋白lsm2，lsm4和lsm8相互作用的蛋白，分別采用陣列篩選和文庫篩選兩種策略，結(jié)果得到的“獵物”蛋白系列也就只有一小部分是重疊的(uetzp,giotl,cagneyg,etal.acomprehensiveanalysisofpro-tein-proteininteractionsinsaccharomycescerevisiae.nature,2000,403(6770):623～627)。造成這種差異的原因在于酵母雙雜交系統(tǒng)本身存在大量的假陰性和假陽性問題。因此酵母雙雜交體系無論從數(shù)據(jù)的可信程度以及所獲得的數(shù)據(jù)量上都不令人滿意。

親和純化與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相對(duì)于酵母雙雜交系統(tǒng)而言，假陽性和假陰性出現(xiàn)的概率降低很多，是目前最為準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)方法。但是，親和純化首先要求研究物種可以被基因修飾，并且親和標(biāo)記末端的插入不會(huì)影響目標(biāo)蛋白的生理生化活性。從需要的工作量和獲得的數(shù)據(jù)量而言，此項(xiàng)技術(shù)還是存在于傳統(tǒng)的分子生物學(xué)范疇，所獲得的數(shù)據(jù)與后基因組時(shí)代完全不相稱，同時(shí)也無法完成對(duì)病體檢驗(yàn)或者實(shí)時(shí)監(jiān)控等潛在的未來醫(yī)學(xué)臨床研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法中的質(zhì)譜方法缺少所需的靈敏度、需要基質(zhì)分子促使分析對(duì)象發(fā)生離子化的缺陷、通量低和要求被研究物種能夠被基因修飾等缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)的分析方法，能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)的高通量檢測(cè)分析。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)的分析方法，首先利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建含氟聚合物的多孔硅基底和待分析蛋白的納米顆粒，其中紡絲溶劑為質(zhì)量體積百分比為1％～10％的plga溶液，然后利用基質(zhì)輔助激光解吸電離(maldi)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)納米顆粒內(nèi)蛋白質(zhì)間的作用關(guān)系進(jìn)行分析，其中樣品靶采用含氟聚合物的多孔硅材料作為基底，之后通過蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫檢索軟件對(duì)所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析確定各樣品顆粒中的蛋白質(zhì)的組成成分，最后利用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，確定細(xì)胞內(nèi)不同種蛋白質(zhì)相互作用的幾率，具體包括以下步驟：

步驟1，待分析蛋白樣品的獲?。簩⒓?xì)胞或菌體破碎、離心、沉淀后得到待分析蛋白樣品；

步驟2，含氟聚合物的多孔硅基底的制備：以n，n-二甲基甲酰胺(dmf)和丙酮的混合溶液作為紡絲溶劑，然后將聚偏氟乙烯(pvdf)溶于紡絲溶劑中得到紡絲溶液，再將紡絲溶液進(jìn)行靜電紡絲，以多孔硅材料為接收裝置，紡絲結(jié)束后真空干燥，得到含氟聚合物的多孔硅基底；

步驟3，待分析蛋白樣品顆粒的制備：將聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)，plga)溶于有機(jī)溶劑中配制紡絲溶劑，將步驟1得到的待分析蛋白樣品溶于紡絲溶劑中得到紡絲溶液，采用靜電紡絲的方法，以步驟2制備的含氟聚合物的多孔硅基底為接收裝置，得到鋪排于含氟聚合物的多孔硅材料基底的待分析蛋白樣品顆粒；

步驟4，maldi質(zhì)譜分析：對(duì)步驟3制備的待分析蛋白樣品顆粒進(jìn)行maldi質(zhì)譜分析，得到各樣品顆粒的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)；

步驟5，將各樣品顆粒獲得的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)在蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，確定樣品顆粒內(nèi)的蛋白質(zhì)組成成分；

步驟6，統(tǒng)計(jì)分析各蛋白質(zhì)相互作用的幾率：利用蛋白質(zhì)組學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)步驟5得到的樣品顆粒內(nèi)的蛋白質(zhì)組成成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，確定細(xì)胞內(nèi)不同種蛋白質(zhì)相互作用的幾率。

優(yōu)選地，步驟2中，n，n-二甲基甲酰胺和丙酮的體積比為7～18:3，聚偏氟乙烯與紡絲溶劑的質(zhì)量體積比為20％～30％，紡絲參數(shù)為噴絲針頭內(nèi)徑為0.22mm，電壓為8kv，接收距離為9cm，推進(jìn)速度為0.4ml/h。

優(yōu)選地，步驟3中，聚乳酸-羥基乙酸共聚物與有機(jī)溶劑的質(zhì)量體積比為1％～10％，所述的有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、氯仿或乙醇；紡絲參數(shù)為噴絲針頭內(nèi)徑為0.22mm，電壓為5～15kv，接收距離為6～15cm，推進(jìn)速度為0.2～1ml/h。

優(yōu)選地，步驟4中，maldi質(zhì)譜分析時(shí)，分子量小于4000的樣品顆粒采用反射模式(linear)，分子量大于4000的樣品顆粒采用線性模式(reflection)，激光能量為10～60j。

本發(fā)明將靜電紡絲技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，利用納米級(jí)多孔層制備技術(shù)(2微米厚度，體積氣孔率為55％)將含氟聚合物聚集到多孔硅表面(孔徑為10納米左右)，再將分析物分子鋪排于其上，由于聚合物分子在受到激光或離子束照射時(shí)會(huì)猛烈爆發(fā)，從而釋放出離子化的分析物用于檢測(cè)，解決了離子化過程對(duì)基質(zhì)的依賴。本發(fā)明利用激光或離子束從納米尺度的小囊中氣化材料，克服了一般質(zhì)譜方法靈敏度低和需要基質(zhì)分子促使分析對(duì)象發(fā)生離子化的缺陷，而且利用靜電紡絲技術(shù)制備的樣品數(shù)量多，實(shí)現(xiàn)了組學(xué)分析中的高通量數(shù)據(jù)要求，且準(zhǔn)確率較高，最終為構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)各生物分子間的三維相互作用圖提供云數(shù)據(jù)支持。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的一種細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)的分析方法的流程示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

步驟一：大腸桿菌膜蛋白的獲取

樣品來源：經(jīng)過基因重組技術(shù)獲得表達(dá)emre膜蛋白的重組大腸桿菌，然后通過菌體培養(yǎng)，細(xì)胞裂解后超速離心等步驟獲得含有emre蛋白的細(xì)胞膜碎片。具體實(shí)施步驟為：

1)將培養(yǎng)的菌體離心后取菌體沉淀重懸于適量pbs+1mmpmsf+5mmβ-me的緩沖液中，然后使用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行菌體破碎；

2)將破碎后的樣品20,000g，4℃離心25min，離心結(jié)束后取上清；

3)將上清100,000g，4℃離心2h；

4)離心結(jié)束后取上述步驟中的沉淀用高濃度的去污劑(ddm，1％)溶解沉淀，4℃攪拌至少2h，使其完全溶解，然后再20,000g，4℃離心25min，將未溶解部分沉淀下來，取上清，得到細(xì)胞膜碎片。

步驟二：利用靜電紡絲技術(shù)制備含氟聚合物的多孔硅基底并將分析物分子鋪排于其上

具體實(shí)施步驟為：

1)含氟聚合物的多孔硅基底制備：以n，n-二甲基甲酰胺和丙酮作為紡絲溶劑，dmf/丙酮體積比4：1，將聚偏氟乙烯(pvdf)(美國(guó)elfatochem公司，商品名kynarpvdf)溶于紡絲溶劑中，得無色透明的粘稠液體，其中pvdf所占比例為20％(g/ml)，將配制好的含氟聚合物溶液吸入注射器中，用電紡裝置進(jìn)行紡絲，紡絲的接收裝置為多孔硅材料，噴絲針頭內(nèi)徑為0.22mm，電壓為8kv，接收距離為9cm，推進(jìn)速度為0.4ml/h紡絲結(jié)束后將其真空干燥，得到含氟聚合物的多孔硅基底；

2)樣品顆粒的制備：用乙醇配制質(zhì)量體積比為5％濃度的聚乳酸-羥基乙酸共聚物溶液作為紡絲溶劑，然后將步驟一中獲得的細(xì)胞膜碎片與plga溶液混合均勻后再離心出去溶液中的氣泡得到紡絲溶液，以含氟聚合物的多孔硅(孔徑為10納米左右)材料作為接收裝置，進(jìn)行靜電紡絲，噴絲針頭內(nèi)徑為0.22mm，電壓為5kv，接收距離為8cm，推進(jìn)速度為0.2ml/h。

步驟三：樣品顆粒的maldi質(zhì)譜儀分析

將步驟二制備好的裝載有樣品顆粒的樣品靶經(jīng)加熱或風(fēng)吹烘干形成共結(jié)晶后放入離子源內(nèi)，選擇反射模式(linear)，激光能量為20j，當(dāng)激光照射到靶點(diǎn)上時(shí)，多孔硅材料基底吸收了激光的能力躍遷到激發(fā)態(tài)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)電離和汽化，電離的結(jié)果通常是基底的質(zhì)子轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)上，然后由高電壓將電離的蛋白質(zhì)從離子源轉(zhuǎn)送到質(zhì)量分析器內(nèi)，再經(jīng)離子檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理得到質(zhì)譜圖。

步驟四：使用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫檢索軟件gpm(x！tandem)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索

將每個(gè)樣品顆粒獲得的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)利用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫檢索軟件gpm(x！tandem)進(jìn)行檢索，檢索數(shù)據(jù)庫為sequest數(shù)據(jù)庫，編輯蛋白質(zhì)可能存在的乙?；?、甲?；胺核鼗揎椉皾撛诘难趸?、磷酸化修飾，trypsin及glu-c酶切位點(diǎn)等參數(shù)后運(yùn)行g(shù)pm中的x！tandem得出結(jié)果，明確樣品靶內(nèi)每一個(gè)樣品顆粒內(nèi)蛋白質(zhì)的組成成分。

步驟五：利用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件tpp對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

trans-proteomicpipeline(tpp)是用于lc/ms/ms蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析的軟件。tpp包含一系列蛋白質(zhì)鑒定和定量分析的模塊，能夠?qū)?jīng)sequest數(shù)據(jù)庫搜索引擎得到的結(jié)果進(jìn)行篩選過濾，從而達(dá)到蛋白質(zhì)鑒定和測(cè)序的目的，本步驟中采用分析軟件tpp對(duì)上述步驟中所得每一個(gè)樣品顆粒內(nèi)蛋白質(zhì)的組成成分的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，運(yùn)行proteinprophet，得到最終結(jié)果，明確細(xì)胞內(nèi)不同種蛋白質(zhì)相互作用的幾率，最終為構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)各生物分子間的三維相互作用圖提供云數(shù)據(jù)支持。