本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)中的貝類(lèi)性別鑒定技術(shù)，具體地說(shuō)，是一種簡(jiǎn)便高效地運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)貝類(lèi)性別鑒定的方法。

背景技術(shù)：

貝類(lèi)養(yǎng)殖是我國(guó)海水養(yǎng)殖的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一，其產(chǎn)量占海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70％以上。性別鑒定是貝類(lèi)養(yǎng)殖和育種工作中不可缺少的環(huán)節(jié)。但除少數(shù)貝類(lèi)第二性征比較明顯外，絕大多數(shù)難以根據(jù)外部性征判定其性別。目前，對(duì)其性別鑒定的方法主要有兩種，表型觀察法和組織切片法。表型觀察法雖然簡(jiǎn)單，但只適用于一些在生長(zhǎng)期或成熟期雌雄性腺顏色有明顯區(qū)別的物種；組織切片法適用于對(duì)增殖期、生長(zhǎng)期和成熟期性腺的性別鑒定，對(duì)于休止期性腺則較困難，且該方法操作繁瑣。

迄今為止，在貝類(lèi)中未見(jiàn)有關(guān)于性染色體的報(bào)道，尚難以從DNA水平實(shí)現(xiàn)性別鑒定。但已有對(duì)蝦夷扇貝，太平洋牡蠣等的性腺轉(zhuǎn)錄組分析顯示，成熟的卵巢和精巢存在大量的差異表達(dá)基因，其中包括一些已知的脊椎動(dòng)物性別決定基因，這些基因可能在貝類(lèi)性別的維持中起著重要作用，有望用于貝類(lèi)性別鑒定。FOXL2為叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是脊椎動(dòng)物卵巢發(fā)育、分化及功能維持的關(guān)鍵基因。DMRT則是很多無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物所共有的性別分化的關(guān)鍵基因，對(duì)精巢的形成和維持起著重要作用。雖然貝類(lèi)的性別決定的分子機(jī)制至今尚不清晰，我們發(fā)現(xiàn)，根據(jù)FOXL2和DMRT在卵巢和精巢中差異表達(dá)這一特征，可對(duì)貝類(lèi)各發(fā)育時(shí)期的性腺進(jìn)行性別鑒定。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是對(duì)特定核酸序列進(jìn)行準(zhǔn)確定量的方法，被認(rèn)為是基因表達(dá)定量的“金標(biāo)準(zhǔn)”。其原理是對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析。它不僅操作簡(jiǎn)便、快速高效，還具有極高的靈敏性、重復(fù)性和特異性。該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。

本發(fā)明旨在選取合適的貝類(lèi)雌雄性別表征基因組合，建立一種準(zhǔn)確的定量與計(jì)算方法，穩(wěn)定地對(duì)處于各發(fā)育時(shí)期(包括休止期)的性腺進(jìn)行性別鑒定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有表型觀察法和組織切片法存在的缺陷，提供一種基于實(shí)時(shí)定量PCR的貝類(lèi)性別鑒定的方法，簡(jiǎn)便高效地實(shí)現(xiàn)貝類(lèi)的性別鑒定。

本發(fā)明提供一種鑒定貝類(lèi)性別的方法，即通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)貝類(lèi)性腺組織中雌性表征基因FOXL2和雄性表征基因DMRT的表達(dá)量，從而確定性別。具體標(biāo)準(zhǔn)為：實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)FOXL2和DMRT表達(dá)量，用2^-△Ct方法計(jì)算DMRT和FOXL2的相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)LOG₁₀轉(zhuǎn)換后的值確定性別；如果獲得的數(shù)值大于2，則該個(gè)體為雄性；如果獲得的數(shù)值小于0，則該個(gè)體為雌性。在上述方案的基礎(chǔ)上，需針對(duì)不同的貝類(lèi)設(shè)計(jì)兩對(duì)雌雄性別表征基因FOXL2和DMRT的特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。

具體步驟如下：

(1)受檢個(gè)體性腺取材

受檢貝類(lèi)材料低溫取回后在循環(huán)池中暫養(yǎng)，待新陳代謝穩(wěn)定再進(jìn)行解剖，性腺取材需規(guī)避其它組織的污染。

(2)總RNA提取

Trizol法提取總RNA，所得RNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，并通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定濃度。

(3)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

以mRNA為模板，dNTP為底物，Oligo d(T)為引物，用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。

(4)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)FOXL2和DMRT的表達(dá)量

利用兩對(duì)雌雄性別表征基因FOXL2和DMRT的特異性引物，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)FOXL2和DMRT表達(dá)量。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)個(gè)體設(shè)三個(gè)技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)條件如下：50℃2min；94℃10min；94℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)；94℃15s，每10s降溫0.5℃直至55℃，55℃1min。為排除引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)基因表達(dá)定量的影響，反應(yīng)過(guò)程中溫度由94℃至55℃緩慢降低，連續(xù)采集熒光信號(hào)并獲取熔解曲線。

(5)用2^-△Ct方法處理數(shù)據(jù)，計(jì)算LOG₁₀(DMRT/FOXL2)，確定性別

如果獲得的數(shù)值大于2，則該個(gè)體為雄性；如果獲得的數(shù)值小于0，則該個(gè)體為雌性。

本發(fā)明操作方法具有原創(chuàng)性，步驟清晰，優(yōu)點(diǎn)如下：

(1)解決了貝類(lèi)第二性征不明顯，通過(guò)性腺表型觀察或組織切片無(wú)法判定部分個(gè)體性別的難題，從分子水平進(jìn)行性別鑒定。

(2)不受性腺發(fā)育時(shí)期、個(gè)體大小等因素限制，只用少量性腺組織即可鑒定性別。

(3)本方法基于實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，無(wú)需使用特殊儀器，只需掌握一般實(shí)驗(yàn)操作技能，具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為對(duì)組織切片確定性別與性腺發(fā)育時(shí)期的蝦夷扇貝的性別鑒定結(jié)果。

圖2為對(duì)組織切片無(wú)法確定性別的蝦夷扇貝的性別鑒定結(jié)果。

圖3為對(duì)組織切片無(wú)法確定性別的櫛孔扇貝的性別鑒定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明：

以下部分是具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做的進(jìn)一步說(shuō)明，但以下實(shí)施方式僅僅是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步解釋?zhuān)淮砥浔Ｗo(hù)范圍僅限于此，凡是以本發(fā)明思路所做的等效替換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

(1)受檢個(gè)體性腺取材

二齡蝦夷扇貝取自遼寧省大連市獐子島綜合試驗(yàn)站，于2015年7月至2016年3月每月低溫取回些許成體材料，放于實(shí)驗(yàn)室充氣循環(huán)水池中暫養(yǎng)。待新陳代謝穩(wěn)定再進(jìn)行解剖，性腺取材需規(guī)避其它組織的污染，將其剪切成直徑為5mm左右小塊。一部分用波恩氏液固定24h，然后保存于4℃的70％酒精中，用于石蠟切片；一部分在液氮中速凍后，存放于-80℃超低溫冰箱，用于RNA提取。

(2)石蠟切片確定時(shí)期

流程為：脫水，透明，滲蠟、包埋，切片、貼片、展片，染色、封片，鏡檢拍照。然后顯微鏡觀察細(xì)胞類(lèi)型及形態(tài)，挑選出處于休止期、增殖期、生長(zhǎng)期和成熟期的雌雄性腺各三個(gè)。

(3)總RNA提取

選取上一步驟中所得時(shí)期確定的24個(gè)個(gè)體，Trizol法提取總RNA。所得RNA用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，并通過(guò)分光光度計(jì)Nanovue Plus spectrophotometer測(cè)定濃度。

(4)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

在200μl PCR(RNase&DNase-free)管中配制如下混合液：

總RNA 2μg

Oligo d(T)₁₈(20μM) 1μl

H₂O(RNase&DNase-free) 補(bǔ)至12.5μl

65℃溫育5min后迅速在冰上冷卻2min以上，然后在上述混合液中再加入如下反應(yīng)物：

混勻離心后置于PCR儀中，42℃90min，70℃10min。得到的cDNA溶液-20℃保存。

(5)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)FOXL2和DMRT的表達(dá)量

設(shè)計(jì)蝦夷扇貝FOXL2和DMRT基因的特異性引物，引物序列為：

FOXL2 F:AACTTCTGGACATTGGACCCTGCTT

R:CCGCAGTGGTTGTCAGCAAATAAGG

DMRT F:ACAGATTCCCTACAGATGCT

R:TTATTCATGGCGGCGTCTAT

每個(gè)實(shí)驗(yàn)個(gè)體設(shè)三個(gè)技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系如下：

根據(jù)480(Roche)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀說(shuō)明書(shū)的要求，反應(yīng)條件如下：50℃2min；94℃10min；94℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)；94℃15s，每10s降溫0.5℃直至55℃，55℃1min。為排除引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)基因表達(dá)定量的影響，反應(yīng)過(guò)程中溫度由94℃至55℃緩慢降低，連續(xù)采集熒光信號(hào)并獲取熔解曲線。

(6)用2^-△Ct方法處理數(shù)據(jù)，計(jì)算LOG₁₀(DMRT/FOXL2)，確定性別

根據(jù)所得結(jié)果，處于各時(shí)期的二齡蝦夷扇貝均可根據(jù)本方法確定性別：LOG₁₀(DMRT/FOXL2)大于2為雄性個(gè)體，LOG₁₀(DMRT/FOXL2)小于0為雌性個(gè)體。如圖1所示，三個(gè)個(gè)體為一組，依次為休止期、增殖期、生長(zhǎng)期、成熟期卵巢和休止期、增殖期、生長(zhǎng)期和成熟期精巢。

該方法鑒定的結(jié)果，與性腺石蠟切片鑒定結(jié)果完全一致。說(shuō)明本發(fā)明適用于各性腺發(fā)育時(shí)期成體蝦夷扇貝的性別鑒定。

實(shí)施例2

(1)受檢個(gè)體性腺取材

二齡蝦夷扇貝取自遼寧省大連市獐子島綜合試驗(yàn)站，于2015年7月至2015年12月每月低溫取回些許成體材料，放于實(shí)驗(yàn)室充氣循環(huán)水池中暫養(yǎng)。待新陳代謝穩(wěn)定再進(jìn)行解剖，性腺取材需規(guī)避其它組織的污染，將其剪切成直徑為5mm左右小塊。一部分用波恩氏液固定24h，然后保存于4℃的70％酒精中，用于石蠟切片；一部分在液氮中速凍后，存放于-80℃超低溫冰箱，用于RNA提取。

(2)石蠟切片確定時(shí)期

流程為：脫水，透明，滲蠟、包埋，切片、貼片、展片，染色、封片，鏡檢拍照。

(3)總RNA提取

選取性腺透明且無(wú)法通過(guò)組織切片確定性別的12個(gè)蝦夷扇貝，Trizol法提取總RNA。所得RNA用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，并通過(guò)分光光度計(jì)Nanovue Plus spectrophotometer測(cè)定濃度。

(4)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

在200μl PCR(RNase&DNase-free)管中配制如下混合液：

總RNA 2μg

Oligo d(T)₁₈(20μM) 1μl

H₂O(RNase&DNase-free) 補(bǔ)至12.5μl

65℃溫育5min后迅速在冰上冷卻2min以上，然后在上述混合液中再加入如下反應(yīng)物：

混勻離心后置于PCR儀中，42℃90min，70℃10min。得到的cDNA溶液-20℃保存。

(5)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)FOXL2和DMRT的表達(dá)量

設(shè)計(jì)蝦夷扇貝FOXL2和DMRT基因的特異性引物，引物序列為：

FOXL2 F:AACTTCTGGACATTGGACCCTGCTT

R:CCGCAGTGGTTGTCAGCAAATAAGG

DMRT F:ACAGATTCCCTACAGATGCT

R:TTATTCATGGCGGCGTCTAT

每個(gè)實(shí)驗(yàn)個(gè)體設(shè)三個(gè)技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系如下：

根據(jù)480(Roche)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀說(shuō)明書(shū)的要求，反應(yīng)條件如下：50℃2min；94℃10min；94℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)；94℃15s，每10s降溫0.5℃直至55℃，55℃1min。為排除引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)基因表達(dá)定量的影響，反應(yīng)過(guò)程中溫度由94℃至55℃緩慢降低，連續(xù)采集熒光信號(hào)并獲取熔解曲線。

(6)用2^-△Ct方法處理數(shù)據(jù)，計(jì)算LOG₁₀(DMRT/FOXL2)，確定性別

根據(jù)所得結(jié)果，性腺透明且組織切片無(wú)法確定性別的二齡蝦夷扇貝均可根據(jù)本方法確定性別：LOG₁₀(DMRT/FOXL2)大于2為雄性個(gè)體，LOG₁₀(DMRT/FOXL2)小于0為雌性個(gè)體，如圖2所示。

經(jīng)過(guò)該方法鑒定的蝦夷扇貝，性別識(shí)別率高達(dá)100％。說(shuō)明本發(fā)明適用于性腺透明且組織切片無(wú)法確定性別的成體蝦夷扇貝的性別鑒定。

實(shí)施例3

(1)受檢個(gè)體性腺取材

二齡櫛孔扇貝取自山東省青島市八仙墩養(yǎng)殖有限公司，于2015年12月至2016年4月每月低溫取回些許成體材料，放于實(shí)驗(yàn)室充氣循環(huán)水池中暫養(yǎng)。待新陳代謝穩(wěn)定再進(jìn)行解剖，性腺取材需規(guī)避其它組織的污染，將其剪切成直徑為5mm左右小塊。一部分用波恩氏液固定24h，然后保存于4℃的70％酒精中，用于石蠟切片；一部分在液氮中速凍后，存放于-80℃超低溫冰箱，用于RNA提取。

(2)石蠟切片確定時(shí)期

流程為：脫水，透明，滲蠟、包埋，切片、貼片、展片，染色、封片，鏡檢拍照。

(3)總RNA提取

選取性腺透明且無(wú)法通過(guò)組織切片確定性別的12個(gè)櫛孔扇貝，Trizol法提取總RNA。所得RNA用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，并通過(guò)分光光度計(jì)Nanovue Plus spectrophotometer測(cè)定濃度。

(4)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

在200μl PCR(RNase&DNase-free)管中配制如下混合液：

總RNA 2μg

Oligo d(T)₁₈(20μM) 1μl

H₂O(RNase&DNase-free) 補(bǔ)至12.5μl

65℃溫育5min后迅速在冰上冷卻2min以上，然后在上述混合液中再加入如下反應(yīng)物：

混勻離心后置于PCR儀中，42℃90min，70℃10min。得到的cDNA溶液-20℃保存。

(5)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)FOXL2和DMRT的表達(dá)量

設(shè)計(jì)櫛孔扇貝FOXL2和DMRT基因的特異性引物，引物序列為：

FOXL2 F:CCTAAGGTGGAGATGTGTGGACGAG

R:AATACAGTCCAAGGCAAGTGGTCGT

DMRT F:CTCCCCTTCGCTCCCCTAA

R:GCAGAATCGCTTGTGCCCCT

每個(gè)實(shí)驗(yàn)個(gè)體設(shè)三個(gè)技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系如下：

根據(jù)480(Roche)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀說(shuō)明書(shū)的要求，反應(yīng)條件如下：50℃2min；94℃10min；94℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)；94℃15s，每10s降溫0.5℃直至55℃，55℃1min。為排除引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)基因表達(dá)定量的影響，反應(yīng)過(guò)程中溫度由94℃至55℃緩慢降低，連續(xù)采集熒光信號(hào)并獲取熔解曲線。

(6)用2^-△Ct方法處理數(shù)據(jù)，計(jì)算LOG₁₀(DMRT/FOXL2)，確定性別

根據(jù)所得結(jié)果，性腺透明且組織切片無(wú)法確定性別的二齡櫛孔扇貝均可根據(jù)本方法確定性別：LOG₁₀(DMRT/FOXL2)大于2為雄性個(gè)體，LOG₁₀(DMRT/FOXL2)小于0為雌性個(gè)體，如圖3所示。

經(jīng)過(guò)該方法鑒定的櫛孔扇貝，性別識(shí)別率高達(dá)100％。說(shuō)明本發(fā)明適用于成體櫛孔扇貝的性別鑒定。

上面以舉例方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說(shuō)明，但本發(fā)明不限于上述具體實(shí)施例，凡基于本發(fā)明所做的任何改動(dòng)或變型均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。