本發(fā)明屬于病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可視化檢測(cè)Hobi-like瘟病毒的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物、試劑盒和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

Hobi-like瘟病毒為2004年從巴西胎牛血清中分離的一種新的瘟病毒，與牛病毒性腹瀉病毒1型（BVDV-1）、牛病毒性腹瀉病毒2型（BVDV-2）、豬瘟病毒（CSFV）和羊邊界病毒(BDV)同屬于黃病毒科。之后又相繼在其他國(guó)家，如歐洲的意大利、瑞士，大洋洲的澳大利亞，美洲的墨西哥和亞洲的日本、印度和孟加拉等國(guó)發(fā)現(xiàn)了該病毒分布和存在。該病毒感染牛后表引起的癥狀與BVDV-1和BVDV-2感染牛表現(xiàn)出的癥狀相似，臨床主要表現(xiàn)為呼吸道、消化道和生殖道疾病，因此某些病毒學(xué)研究者將其試命名為“BVDV-3”型。

我國(guó)學(xué)者2012年從污染的MDBK細(xì)胞中首次分離到該病毒，本實(shí)驗(yàn)室于2015年首次從患有呼吸道疾病的病羊體內(nèi)分離到Hobi-like瘟病毒，毒株全基因登錄號(hào)GenBank KU563155，表明該病毒不僅可以自然感染牛，而且可以感染羊等小反芻動(dòng)物。目前獸醫(yī)臨床上對(duì)該病毒認(rèn)識(shí)還不足夠，臨床上也沒(méi)有建立良好的檢測(cè)方法；只有少量實(shí)驗(yàn)室建立了常規(guī)的RT-PCR檢測(cè)方法，套式RT-PCR方法和熒光定量PCR；這些方法往往存在需要精密儀器和特殊實(shí)驗(yàn)條件的限制，制約了現(xiàn)地應(yīng)用。因此，建立一種實(shí)際應(yīng)用性強(qiáng)的檢測(cè)技術(shù)在基層推廣應(yīng)用，具有很強(qiáng)的臨床意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) （Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的一種核酸快速擴(kuò)增的新型技術(shù)之一，該方法具有方便快速、操作簡(jiǎn)單、敏感性高、適用性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)。此方法原理主要利用自動(dòng)循環(huán)的鏈置換反應(yīng)，核酸擴(kuò)增一般可在60 min內(nèi)完成，擴(kuò)增效率一般高達(dá)到10⁹~10¹⁰個(gè)數(shù)量級(jí)。不僅如此，該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)所用的儀器要求非常低，一臺(tái)普通的水浴鍋就可以完成全部實(shí)驗(yàn)反應(yīng)。

中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN103924006A公開(kāi)了一種用于檢測(cè) HoBi 樣瘟病毒（HoBi-like pestivirus）核苷酸片段的引物序列，屬于動(dòng)物病原微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。 引物對(duì)包括 ：由序列為 TGGTTCGACGCATTAAGGAAT 的上游引物 HoBi-F 和序列為 TCTCTGCAGCACCCTATCAG 的下游引物 HoBi-R 組成的引物對(duì)。該套引物序列根據(jù)GenBank 上 HoBi 樣瘟病毒 5′-UTR 基因序列設(shè)計(jì)，具有較高的靈敏度和特異性。但是，該專(zhuān)利引物所針對(duì)的序列并不能完全匹配某些經(jīng)典毒株所對(duì)應(yīng)的序列，即引物序列不能檢測(cè)到所有Hobi-like瘟病毒的典型毒株，會(huì)造成漏檢，而且需要昂貴的熒光定量PCR儀，臨床實(shí)用性差。

中國(guó)專(zhuān)利CN101696453B公開(kāi)了一種檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的方法逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑盒的制備及其使用方法，它涉及反應(yīng)試劑盒的制備及其使用方法。而且該試劑盒需要專(zhuān)業(yè)設(shè)備及專(zhuān)業(yè)人員參與檢測(cè)且不適于現(xiàn)階段中國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展?fàn)顩r的問(wèn)題。方法：首先設(shè)計(jì)引物，然后配制逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液，即完成。使用方法 ：取含牛病毒性腹瀉病毒樣品的 RNA 提取物， 加入反應(yīng)液， 混合后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，再離心檢測(cè)；或加入10000×SYBR GREEN I，然后置于紫外燈下檢測(cè)；或進(jìn)行電泳檢測(cè)；或采用 Real-time PCR 儀進(jìn)行保溫反應(yīng)檢測(cè)。但是，該專(zhuān)利試劑盒只能檢測(cè)BVDV-1型毒株，并不能檢測(cè)HoBi-like瘟病毒，而且采用紫外檢測(cè)或者電泳檢測(cè)，仍然不能直接肉眼觀察，操作成本高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服上述缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種可視化檢測(cè)Hobi-like瘟病毒的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物、試劑盒和檢測(cè)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種可視化檢測(cè)Hobi-like瘟病毒的的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，所述等溫?cái)U(kuò)增引物包括上游內(nèi)引物FIP、下游內(nèi)引物BIP、上游外引物F3和下游外引物B3，序列分別如下：

FIP：TACCCGGGGCTTCGGTAATCCGACGAGCATAATGGGGGAC；

BIP：GGTTCGACGCATCAACGAGTGGCCCGCTTGGGTTAAGACAT；

F3：GCGAAGGCCGAAATAGGTTA；

B3：GGCCACATAATCGACCATCT。

一種含有上述等溫?cái)U(kuò)增引物的可視化檢測(cè)Hobi-like瘟病毒的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，所述試劑盒包括如下組分：10×Thermo Pol反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgSO₄、Bst DNA聚合酶、AMV Reverse Transcriptase、Ribonuclease Ihibitor、DEPC水、顯色試劑和上述的引物。

優(yōu)選地，所述試劑盒包括如下組分：

10×Thermo Pol反應(yīng)緩沖液 2.5μL

FIP/BIP 1.2μM

F3/B3 0.3μM

MgSO₄ 0.8mM

dNTP 1.4nM

Bst DNA聚合酶 8U

Ribonuclease Ihibitor 10U

AMV ReverseTranscriptase 10U

顯色試劑 3mM

DEPC水 補(bǔ)足至24μL。

優(yōu)選地，所述的顯色試劑為羥基萘酚藍(lán)。

一種利用上述的試劑盒進(jìn)行的可視化檢測(cè)Hobi-like瘟病毒的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，包括以下步驟：

（1）取病料樣品，初步處理后，利用病毒RNA提取試劑盒提取樣品基因組；

（2）在24μL環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒中的檢測(cè)溶液中加入步驟（1）樣品基因組1μL，于61℃恒溫反應(yīng)1h；同時(shí)，以在24μL環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒中的檢測(cè)溶液中加入Hobi-like瘟病毒RNA模板1μL作為陽(yáng)性對(duì)照；

（3）反應(yīng)結(jié)束后直接肉眼觀察，陽(yáng)性結(jié)果顯示為天藍(lán)色，陰性結(jié)果顯示為紫色。

優(yōu)選地，所述的Hobi-like瘟病毒RNA模板為使用病毒RNA提取試劑盒提取的細(xì)胞培養(yǎng)Hobi-like瘟病毒液基因組RNA。

優(yōu)選地，步驟（2）所述反應(yīng)于PCR儀或者恒溫水浴鍋中進(jìn)行。

本發(fā)明的積極有益效果：

1. 本發(fā)明使用兩對(duì)引物，四個(gè)識(shí)別區(qū)域，相對(duì)現(xiàn)有的檢測(cè)方法，特異性更高。

2. 本發(fā)明可視化檢測(cè)Hobi-like瘟病毒的的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫試劑盒具有特異性強(qiáng)：利用Hobi-like瘟病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)檢測(cè)試劑盒對(duì)提取的牛病毒性腹瀉病毒1型（BVDV-1）、牛皰疹病毒1型（BHV-1）、牛輪狀病毒（BRV）、牛副流感病毒3型（BPIV3）的病毒基因組，同時(shí)進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增結(jié)果表明以其它病毒作為模板時(shí)沒(méi)有陽(yáng)性擴(kuò)增，本發(fā)明LAMP方法特異性高；

本發(fā)明可視化檢測(cè)Hobi-like瘟病毒的的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫試劑盒具有敏感性高：利用Hobi-like瘟病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)檢測(cè)試劑盒和常規(guī)RT-PCR對(duì)倍比稀釋的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：LAMP方法可檢測(cè)到1 TCID₅₀/mL，而常規(guī)PCR擴(kuò)增的方法只能檢測(cè)到100 TCID₅₀/mL。由此可見(jiàn)，本發(fā)明LAMP方法具有更高的敏感性；

本發(fā)明可視化檢測(cè)Hobi-like瘟病毒的的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫試劑盒具有快速性：相對(duì)普通PCR反應(yīng)數(shù)小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間和檢測(cè)時(shí)間，本發(fā)明檢測(cè)方法僅需1個(gè)小時(shí)即可完成整個(gè)反應(yīng)和結(jié)果判定；

本發(fā)明可視化檢測(cè)Hobi-like瘟病毒的的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫試劑盒具有可操作性：相對(duì)于常規(guī)PCR，Hobi-like瘟病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)檢測(cè)試劑盒不需要昂貴的PCR儀，只需要一個(gè)簡(jiǎn)單的恒溫水浴鍋即可完成反應(yīng)；且結(jié)果的檢測(cè)可以直接肉眼判定，無(wú)需凝膠電泳等特殊儀器，因此本發(fā)明試劑盒具有較強(qiáng)的現(xiàn)地可操作性。

3. 本發(fā)明檢測(cè)方法容易操作，成本低廉，可廣泛應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫檢測(cè)方法敏感性結(jié)果示意圖，其中1：10⁴ TCID₅₀/mL；2：10³ TCID₅₀/mL；3：10² TCID₅₀/mL；4：10¹ TCID₅₀/mL；5：10⁰ TCID₅₀/mL；6：10^-1 TCID₅₀/mL；7：陰性對(duì)照；

圖2為常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法敏感性凝膠電泳圖，其中，1：陰性對(duì)照；2：10^-1 TCID₅₀/mL；3：10⁰ TCID₅₀/mL；4：10¹ TCID₅₀/mL；5：10² TCID₅₀/mL；6：10³ TCID₅₀/mL；7：10⁴ TCID₅₀/mL；M：DL2000 DNA Marker；

圖3為本發(fā)明反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫檢測(cè)方法特異性檢測(cè)凝膠電泳圖，其中1：BVDV-1；2：BHV-1；3：BRV；4：BPIV-3；5：陽(yáng)性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合一些具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。

1、試劑盒相關(guān)材料

牛病毒性腹瀉病毒1型（BVDV-1）和牛皰疹病毒1型（BHV-1）源于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛輪狀病毒（BRV）、牛副流感病毒3型（BPIV3）和Hobi-like瘟病毒為實(shí)驗(yàn)室分離保存毒株。病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），Betaine（SIGMA公司），BstDNA聚合酶及10×Thermo pol反應(yīng)緩沖液（Biolabs Inc公司），dNTP（clontech公司），AMV Reverse Transcriptase （promega公司）、Ribonuclease Ihibitor（NEB公司）、Mg²⁺及 DL2000（TAKARA公司）。

2、LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成

參考目前已發(fā)表的Hobi-like瘟病毒序列（登錄號(hào)GenBank KU563155），針對(duì)瘟病毒屬的保守區(qū)域5’-UTR區(qū)域，利用LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer設(shè)計(jì)了相關(guān)引物，引物包括：上游內(nèi)引物FIP(SEQ ID NO:1)和下游內(nèi)引物BIP(SEQ ID NO:2)，上游外引物F3(SEQ ID NO:3)和下游外引物B3(SEQ ID NO:4)，這4條引物序列如下所示：

FIP：TACCCGGGGCTTCGGTAATCCGACGAGCATAATGGGGGAC；

BIP：GGTTCGACGCATCAACGAGTGGCCCGCTTGGGTTAAGACAT；

F3：GCGAAGGCCGAAATAGGTTA；

B3：GGCCACATAATCGACCATCT；

設(shè)計(jì)完成的引物由蘇州泓迅生物合成。

3、病毒基因組提取

利用北京全式金生物技術(shù)有限公司的病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，提取細(xì)胞培養(yǎng)Hobi-like瘟病毒液、疑似有Hobi-like瘟病毒感染的患病動(dòng)物組織樣品、特異性對(duì)照病毒樣品的病毒基因組。

4、Hobi-like瘟病毒RT-LAMP反應(yīng)體系的建立

所述試劑盒包括如下組分：

10×Thermo Pol反應(yīng)緩沖液 2.5μL

FIP/BIP 1.2μM

F3/B3 0.3μM

MgSO₄ 0.8mM

dNTP 1.4nM

Bst DNA聚合酶 8U

Ribonuclease Ihibitor 10U

AMV ReverseTranscriptase 10U

羥基萘酚藍(lán) 3mM

DEPC水 補(bǔ)足至24μL。

所述的反應(yīng)體系如下包括如下組分：

10×Thermo Pol反應(yīng)緩沖液 2.5μL

FIP/BIP 1.2μM

F3/B3 0.3μM

MgSO₄ 0.8mM

dNTP 1.4nM

Bst DNA聚合酶 8U

Ribonuclease Ihibitor 10U

AMV ReverseTranscriptase 10U

羥基萘酚藍(lán) 3mM

樣品模板RNA 1μL

DEPC水 補(bǔ)足至25μL；

將上述組分混勻后放置于PCR儀內(nèi)或者水浴鍋中恒溫61℃作用1小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后可以進(jìn)行凝膠檢測(cè)或者肉眼觀察對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，兩者判定結(jié)果一致；肉眼觀察時(shí)，陽(yáng)性結(jié)果顯示為天藍(lán)色，陰性結(jié)果顯示為紫色。

5、Hobi-like瘟病毒RT-LAMP檢測(cè)試劑盒條件的優(yōu)化

5.1 引物濃度優(yōu)化

在25 μL的反應(yīng)體系中以一對(duì)引物為變量，其他反應(yīng)底物成分相同，依次對(duì)FIP與BIP（0.4μM、0.6μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM、1.4μM、1.6μM、1.8μM、2.0μM）、F3與B3（0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM）兩對(duì)引物進(jìn)行濃度梯度優(yōu)化，每個(gè)濃度重復(fù)3次，反應(yīng)結(jié)束之后，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

5.2 擴(kuò)增時(shí)間優(yōu)化

配置反應(yīng)體系，每個(gè)時(shí)間條件的樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別在恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min、45 min、60 min、75 min后取出，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

5.3 擴(kuò)增溫度的優(yōu)化

配置反應(yīng)體系，每個(gè)溫度條件樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別在不同溫度60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃反應(yīng)1小時(shí)后取出，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

5.4 Mg2⁺濃度優(yōu)化

對(duì)Mg²⁺的濃度設(shè)置梯度為0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L、1.4 mmol/L，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。待所有濃度梯度反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

5.5 Bst DNA聚合酶濃度優(yōu)化

對(duì)Bst DNA聚合酶的濃度進(jìn)行優(yōu)化，其梯度設(shè)置為160 U/mL、320 U/mL、480 U/mL 、640 U/mL、800 U/mL，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。待所有濃度梯度反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

5.6 Reverse Transcriptase優(yōu)化

對(duì)AMV Reverse Transcriptase的濃度進(jìn)行優(yōu)化，其梯度設(shè)置為160 U/mL、320 U/mL、480 U/mL 、640 U/mL、800 U/mL，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。待所有濃度梯度反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

6、Hobi-like瘟病毒RT-LAMP方法的優(yōu)化結(jié)果

6.1 優(yōu)化體系和條件

通過(guò)上述條件的優(yōu)化，Hobi-like瘟病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)檢測(cè)試劑盒的最后優(yōu)化的體系為：

10×Thermo Pol反應(yīng)緩沖液 2.5μL

FIP/BIP 1.2μM

F3/B3 0.3μM

MgSO₄ 0.8mM

dNTP 1.4nM

Bst DNA聚合酶 8U

Ribonuclease Ihibitor 10U

AMV ReverseTranscriptase 10U

羥基萘酚藍(lán) 3mM

樣品模板RNA 1μL

DEPC水 補(bǔ)足至25μL

反應(yīng)條件為61℃作用1h。

6.2所述試劑盒包括如下組分：

10×Thermo Pol反應(yīng)緩沖液 2.5μL

FIP/BIP 1.2μM

F3/B3 0.3μM

MgSO₄ 0.8mM

dNTP 1.4nM

Bst DNA聚合酶 8U

Ribonuclease Ihibitor 10U

AMV ReverseTranscriptase 10U

羥基萘酚藍(lán) 3mM

DEPC水 補(bǔ)足至24μL。

7、RT-LAMP的特異性試驗(yàn)

以臨床上常見(jiàn)的牛病毒性疾?。号２《拘愿篂a病毒1型（BVDV-1）、牛皰疹病毒1型（BHV-1）、牛輪狀病毒（BRV）、牛副流感病毒3型（BPIV3）的病毒基因組作為檢測(cè)對(duì)象，提取病毒的基因組，并以此為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，來(lái)驗(yàn)證其反應(yīng)的特異性，并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果參見(jiàn)圖3。

陽(yáng)性對(duì)照所述的反應(yīng)體系包括如下組分：

10×Thermo Pol反應(yīng)緩沖液 2.5μL

FIP/BIP 1.2μM

F3/B3 0.3μM

MgSO₄ 0.8mM

dNTP 1.4nM

Bst DNA聚合酶 8U

Ribonuclease Ihibitor 10U

AMV ReverseTranscriptase 10U

羥基萘酚藍(lán) 3mM

Hobi-like瘟病毒RNA模板 1μL

DEPC水 補(bǔ)足至25μL。

所述的Hobi-like瘟病毒RNA模板為使用病毒RNA提取試劑盒提取的細(xì)胞培養(yǎng)Hobi-like瘟病毒液基因組RNA。

擴(kuò)增結(jié)果顯示只有陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)彌散狀條帶，其他四種病毒均未出現(xiàn)，說(shuō)明以其它病毒作為模板時(shí)沒(méi)有陽(yáng)性擴(kuò)增，本發(fā)明LAMP方法特異性高。

8、RT-LAMP的敏感性試驗(yàn)

取已知TCID₅₀的Hobi-like瘟病毒毒液，然后用普通的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋?zhuān)蛊浞謩e相當(dāng)于含有1 TCID₅₀/mL、10 TCID₅₀/mL、100 TCID₅₀/mL、1000 TCID₅₀/mL、10000 TCID₅₀/mL、100000 TCID₅₀/mL，然后將病毒液提取RNA，并分成兩部分，一部分用優(yōu)化后的LAMP方法檢測(cè)，加入羥基溴酚藍(lán)后直接肉眼觀察，測(cè)定該方法的敏感性；另一部分用常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)，將兩者檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，參見(jiàn)圖1和圖2，以驗(yàn)證其反應(yīng)的敏感性。

結(jié)果表明：LAMP方法可檢測(cè)到1 TCID₅₀/mL，而常規(guī)PCR擴(kuò)增的方法只能檢測(cè)到100 TCID₅₀/mL。由此可見(jiàn)，本發(fā)明LAMP方法具有更高的敏感性。

9、RT-LAMP實(shí)際應(yīng)用的符合性

臨床采集57頭患呼吸道病牛的鼻腔拭子，提取樣品基因組，利用建立的的RT-LAMP檢測(cè)方法和常規(guī)的RT-PCR以及熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)對(duì)三種方法實(shí)際應(yīng)用中檢測(cè)結(jié)果比較，驗(yàn)證RT-LAMP的符合性。

結(jié)果表明：利用Hobi-like瘟病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)檢測(cè)試劑盒和常規(guī)RT-PCR以及熒光定量RT-PCR對(duì)獲得的57份樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RT-LAMP的檢出率（18/57）顯著高于傳統(tǒng)的RT-PCR方法（10/57），與熒光定量RT-PCR方法出率較為相近（17/57），且傳統(tǒng)的RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢出的陽(yáng)性樣品都可以被RT-LAMP方法檢出。

SEQUENCE LISTING

<110> 南陽(yáng)師范學(xué)院

<120> 可視化檢測(cè)Hobi-like瘟病毒的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物、試劑盒和檢測(cè)

方法

<130> /

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

tacccggggc ttcggtaatc cgacgagcat aatgggggac 40

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<400> 2

ggttcgacgc atcaacgagt ggcccgcttg ggttaagaca t 41

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<400> 3

gcgaaggccg aaataggtta 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<400> 4

ggccacataa tcgaccatct 20