專利名稱：一種反轉(zhuǎn)錄pcr方法檢測sars冠狀病毒診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及SARS冠狀病毒的診斷，具體地說是一種反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測SARS冠狀病毒診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrom，SARS)，或稱非典型肺炎(Atypical Pneumonia)；2002年11月份前后始發(fā)生于廣東地區(qū)，隨后迅速蔓延到世界各地，造成2003年春全球爆發(fā)性流行性疾??；其發(fā)病之快，危害之深，影響面之廣是本世紀(jì)以來最嚴(yán)重的一次；為此，世界衛(wèi)生組織(WHO)在今年3月12日發(fā)出全球性預(yù)警，并聯(lián)合全球10個(gè)國家和地區(qū)的11個(gè)頂尖實(shí)驗(yàn)室，組成的合作研究網(wǎng)絡(luò)(文獻(xiàn)1.WHO WHOissues a global alert about cases of atypical pneumonia.March 12，2003.文獻(xiàn)2.WHO China joins WHO collaborative network.March 28，2003)，隨后，非典型肺炎的病原體被鑒定為一種新的冠狀病毒(文獻(xiàn)2.WHOChina joins WHO collaborative network.March 28，2003)，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室相繼在New England Journal of Medicine，Lancet和Science等多份國際知名雜志上公布對該病原體的鑒別和鑒定(文獻(xiàn)3.Poutanen SM，LowDE，Henry B，F(xiàn)inkelstein S，Rose D，Green K，Tellier R，Draker R，Adachi D，Ayers M，Chan AK，Skowronski DM，Salit I，Simor AE，SlutskyAS，Doyle PW，Krajden M，Petric M，Brunham RC，and McGeer AJ.Identification of severe acute respiratory syndrome in Canada.N EnglJ Med.Low-1_low-11(at www.nejm.org on March 31，2003).文獻(xiàn)4.Christian Drosten，Stephan Gunther，Wolfgang Preiser etc.Identification of a Novel Coronavirus in patients with Severe AcuteRespiratory Syndrome.NEJM，publ ished at www.nejm.org on April 10，2003.文獻(xiàn)5.Thomas G.Ksiazek，Dean Erdman，Cynthia Goldsmith etc.A Novel Coronavirus Associated with Severe Acute RespiratorySyndrome.NEJM，Published at www.nejm.org on April 10，2003.文獻(xiàn)6.J.S.M Peiris，S.T.Lai，L.L.M Poon etc，Coronavirus as apossible cause of Severe Acute Respuratory Syndrome.Lancet，Published online April 8，2003.文獻(xiàn)7.Paul A.Rota，M.Steven Oberste，Stepan S.Monroe etc，Characterization of a Novel CoronavirusAssociated with Severe Acute respiratory Syndrome.Science.www.scienceexpress.org，1 May 2003.文獻(xiàn)8.Susan M.Poutanen，DonaldE.Low，Bonnie Henry etc，Identification of Severe Acute RespiratorySyndrome in Canada.NEJM，published at www.nejm.org on March 31，2003.文獻(xiàn)9.Holmes K.V SARS-associated coronavirus NEJM 2003 May 15，348(20)1948-51.)。2003年4月6日，WHO在上述科研成果的基礎(chǔ)上，宣布非典型非炎的病原體為一種以前未知的冠狀病毒(Coronavirus)，并命名為SARS冠狀病毒(SARS Coronavirus，SARS-CoV)，其特癥是正義，單鏈RNA病毒(文獻(xiàn)10.WHO Coronavirus never before seen in Humans is thecause of SARS April 16，2003.)。隨著生物前沿技術(shù)，即基因組和功能基因組技術(shù)的快速發(fā)展，截止于5月底，全球科學(xué)家以爭分奪秒的速度，快速地公布了11株SARS冠狀病毒的基因組序列，并提交到基因庫中(Genebank)(文獻(xiàn)11.British Columbia Cancer Agency’s GenomeSciences Centre，SARS Coronavirus Genome.文獻(xiàn)12.The preliminaryanalysis of SARS coronaviruses 6enome.CMBI，April 26，2003.文獻(xiàn)13.Marco A.Marra，Steven J.M.Jones，Caroline R.Astell etc，TheGenome Sequence of the SARS-Asscociated Coronavirus，Science，www.sciencexpress.org 1 May 2003.文獻(xiàn)14.Qin E’De Zhu Qingyu，WangJian，Li Wei etc.，A complete sequence and comparative analysis ofa Sars-associated Virus(Isolate BJ01)Chinese Science Bulletin 2003Vol.48，No.10，941-948.文獻(xiàn)15.中國醫(yī)學(xué)生物信息網(wǎng)非典型非炎專題網(wǎng)頁-SARS基因組分頁。文獻(xiàn)16.Yijun Ruanm，Chia Lin Wei，Ling AiEe etc，Comparative Full-length genome sequence analysis of 14 SARScoronavirus isolates and common mutantions associated with putativeorigins of infection Lancet，published online May 9，2003)。正是由于SARS基因組的快速公布，就為非典病毒的早期基因診斷打下了很好的基礎(chǔ)。在獲得SARS病毒的核苷酸序列前提下，國際上許多科研單位據(jù)此設(shè)計(jì)了成套的特異性引物，SARS的診斷也已由細(xì)胞培養(yǎng)的方法轉(zhuǎn)到了以RT-PCR為主流的快速檢測方法上，已形成多種RT-PCR方法來檢測SARS病毒。其中德國Bernhard-Nocht熱帶病研究所的巢式PCR和熒光定量PCR中所采用的引物其特異性已得到證實(shí)，成功地開發(fā)出一種快速的檢測方法并受到WHO的推薦(文獻(xiàn)17.WHO SARS virus isolated，new diagnostic testproducing reliable results，March 22，2003.文獻(xiàn)18.WHO SARS RT-PCRprimers.)。我國政府和廣大的科技人員經(jīng)過日日夜夜的努力，也已開發(fā)出具有快速的檢測方法，這也標(biāo)志著我國科技水平已發(fā)展到世界先進(jìn)水平，與西方國家基本取得同步的科研成果。然而，上述的檢測方法都存在著一個(gè)嚴(yán)重的缺陷，此方法僅適用非典發(fā)病期的患者，普遍存在著靈敏度不高的弊??；通常要用巢式雙重PCR來提高檢測的靈敏度；由于操作繁瑣，重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性不高，據(jù)實(shí)檢人員報(bào)道，準(zhǔn)確率只有40-60％；人們希望通過重新評估所公布的非典冠狀病毒得基因組序列，借助自行設(shè)計(jì)的微流控芯片技術(shù)，開發(fā)出一種高度靈敏的檢測方法，能對可疑病人和隔離的人群進(jìn)行有效地篩選，達(dá)到早期診斷攜帶非典病毒的人群。這將對提前治療和提前排除提供有效的手段具有非常關(guān)鍵和現(xiàn)實(shí)的意義。
由于SARS病毒是RNA病毒，所以需要RT-PCR；國內(nèi)大多報(bào)道的是巢式PCR試劑盒。
現(xiàn)有文獻(xiàn)(文獻(xiàn)17.WHO SARS virus isolated，new diagnostic testproducing reliable results，March 22，2003.文獻(xiàn)18.WHO SARS RT-PCRprimers.文獻(xiàn)19.WHO SARS virus close to conclusive identification，new tests for rapid diagnosis ready soon March 27，2003.文獻(xiàn)21.Vabret A，Mouthon F，Mourez T，Gouarin S，Petitjean J，and FreymuthF.Direct diagnosis of human respiratory coronaviruses 229E and OC43 by the polymerase chain reaction.J Virol Methods.2001，9759-66.文獻(xiàn)22.朱汝南，等。用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)鑒別呼吸道合胞病毒亞型。中華兒科雜志，1998，361-3。文獻(xiàn)23.王艷，馬文麗，宋艷斌，等。反轉(zhuǎn)錄巢式PCR方法檢測SARS冠狀病毒。第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，23(5)421-423.文獻(xiàn)24.楊潔，王戰(zhàn)會，陳金軍，侯金林。SARS冠狀病毒多聚酶基因臨床檢測方法的建立。第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，23(5)424-427.)所述的檢測內(nèi)容只是針對呼吸道致熱病毒單一的病原體檢測方法，無論是通過抗原抗體原理分析檢測的抗體法，還是通過基因分析的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的早期診斷法都是如此。就PCR檢測法而言，常規(guī)PCR法都是將病原體的基因經(jīng)PCR反應(yīng)后將產(chǎn)物經(jīng)電泳分離得到目的產(chǎn)物進(jìn)行確認(rèn)的，PCR反應(yīng)體系和電泳檢測是分開的，較難進(jìn)行定量，檢測靈敏度較低；其次，操作亦不方便；另一種PCR檢測法是實(shí)時(shí)定量PCR(real-timequantitative PCR)，該方法PCR反應(yīng)和定量檢測基本上是同時(shí)進(jìn)行的，是目前最為先進(jìn)的PCR方法。盡管該法具有靈敏度高、定量等優(yōu)點(diǎn)，但是，它對非特異性的PCR反應(yīng)無法進(jìn)行識別，因?yàn)樗鼪]有對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離的過程，因此，它會產(chǎn)生假陽性結(jié)果。文獻(xiàn)(17～24)闡述了反病毒和SARS病毒檢測中所采用的逆轉(zhuǎn)錄PCR和巢式PCR方法，最終運(yùn)用的分析方法是普通凝膠電泳，所以存在檢測靈敏度低且不能對產(chǎn)物進(jìn)行定量等問題。
即使是定量PCR的方法，仍然無法告訴，非特異性擴(kuò)增的實(shí)況；所以，各法的靈敏性和準(zhǔn)確性均有相當(dāng)大的程度的局限性。
目前國內(nèi)外用于非典病毒診斷有如下三種方法1)抗體檢驗(yàn)法a.如免疫酶聯(lián)法，可以靠檢驗(yàn)出患者血清中的病毒抗體(顯色反應(yīng))來判斷患者體內(nèi)是否有病毒；但是這需要病人出現(xiàn)體征后21天方可檢出；北京華大基因已經(jīng)研制成功；無需特殊技術(shù)和設(shè)備；b.熒光免疫檢驗(yàn)顯微鏡和一個(gè)有經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)技術(shù)員；需出現(xiàn)體征10天后才有效，一般醫(yī)院均不具備這樣的條件；上述兩種抗體檢驗(yàn)法屬于中后期確診；但是由于非典的發(fā)病進(jìn)程急速；這些方法對于非典的早期控制沒有效。
2)化學(xué)分子試驗(yàn)(基因擴(kuò)增，PCR法；基因芯片法)
PCR法可以檢測出在各種樣本(唾液，痰液、簌口水、血液，糞便、呼吸道分泌物，組織切片等等)中的SARS病毒的遺傳物質(zhì)。一個(gè)簡易的包括引物的陽性和陰性對照的PCR檢測盒技術(shù)兩周前已經(jīng)發(fā)展起來；已經(jīng)在許多國家廣泛使用，可以在2-4小時(shí)內(nèi)檢測出是否有SARS病毒，快速而準(zhǔn)確。盡管本周內(nèi)國內(nèi)廈門大學(xué)和北京軍科院已有兩家試驗(yàn)成功，但是靈敏度較差，主要因?yàn)殛栃越Y(jié)果可能已經(jīng)顯示足夠的特異性，但是一次陰性試驗(yàn)結(jié)果并不能完全排除患者是否以前就沒有出現(xiàn)非典病毒。所以，WHO仍然呼吁開發(fā)高靈敏度的方法。同時(shí)要求每一次檢測都包括適當(dāng)?shù)年栃院完幮詫φ铡?br> 國外已有Affymatrix公司開發(fā)出基因芯片法，國內(nèi)北京本元正陽基因技術(shù)股份有限公司也開發(fā)出全基因組芯片檢測系統(tǒng)。
3)細(xì)胞培養(yǎng)從非典患者所采集的樣本(如呼吸道分泌物，血液或者糞便)中的病毒可以通過感染細(xì)胞培養(yǎng)并產(chǎn)生出病毒來進(jìn)行檢驗(yàn)；但是該法需要高培養(yǎng)條件(至少P3級實(shí)驗(yàn)室)，一般醫(yī)院無此條件。
所以，基因擴(kuò)增的方法是相對最簡便快捷的早期診斷方法。
但是，通過基因組的比較，北京的基因的5’端的兼并基因和突變部位較多；廣東的非典病毒基因同海外的非典病毒具有同源性，變異很小；由于，前期BNI的RT-PCR是基于德國的基因組測序結(jié)果來進(jìn)行設(shè)計(jì)引物和探針的，由于時(shí)間的關(guān)系，不同的區(qū)域使用的基因序列也有所差別，目前已有6種試用的引物。
例如其中幾個(gè)已在試驗(yàn)的檢測方法引物設(shè)計(jì)1)BNIoutS/BNout正義ATGAAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC；反義CAT AAC CAG TCG GTA CAGCTA C，片斷長度195bp；2)BNIinS/BNIAs正義GAA GCT ATT CGT CACGTT CG；反義CTGTAGAAA ATC CTA GCT GGA G，片斷長度110bp；3)SAR1s/SARlas正義CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA；反義TAT AGT GAGCCG CCA CAC ATG，片斷長度150bp；擴(kuò)增物序列(BNI-1，Bernhard-NochtInstitute，Hamburg，Germany)TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGACACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAAAACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC(擴(kuò)增產(chǎn)物長度301b)；美國IN-2，IN-4正義引物5’GGGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA 3’；反義引物5’TAACACACAAACACCAT CATCA 3’；擴(kuò)增產(chǎn)物長度452bp；香港(中國)HKU正義引物5’TACACA CTCAGCGTTG 3’；反義引物5’CACGAACGTGACGAAT 3’擴(kuò)增長度182bps；由此可見，各個(gè)RT-PCR的設(shè)計(jì)所選用的引物是各不相同的，同時(shí)比較的序列也不相同；所以很難說那個(gè)更有效，而且，到目前為止，尚無臨床統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)公布；如果僅從效率上說，是沒有意義的，也沒有可比性，這也是為什么，WHO呼吁開發(fā)更準(zhǔn)確的PCR檢測方法的原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高準(zhǔn)確性和靈敏性、穩(wěn)定易操作的反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測SARS冠狀病毒診斷試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為通過對現(xiàn)有11條SARS病毒的基因組序列分析，選擇SARS-COV的基因序列具有高特異性，非同源性的開發(fā)閱讀框1b(Orf1b)部分進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，使檢測范圍擴(kuò)大到15000-19000的段落；為了比較檢測方法的靈敏性和特異性，以北京華大基因公布的序列(基因組序列名稱BJ01，AC注冊號AY278488)為分析對象，同時(shí)對其他公布在基因庫中的序列(AY274119，AY278741，AY278491，AY278554，AY282752，AY283794，AY283795，AY283796，AY283797，AY283798)進(jìn)行比對分析，得出下例正反義引物，9對正反義巢式引物如下1)BIT001引物對正義引物5’-AGAGCCATGCCTAACATGCT-3’反義引物5’-AAGCGTAAAACTCATCCACG-3’GI#30275666；病毒名稱SARS-Cov BJ01；瞄準(zhǔn)的基因序列15221-15593測試類型RT-PCR2)BIT002引物對正義引物5’-GTCAAGCTGTTACAGCCAAT-’反義引物5’-AAGCGTAAAACTCATCCACG-3’GI30275666；病毒名稱SARS-Cov BJ01；瞄準(zhǔn)的基因序列15441-15593測試類型RT-PCR3)BIT003引物對正義引物TAGGATTGCCTACGCAGACT反義引物CCACATTGCGACGTGGTATTGI30275666；病毒名稱SARS-Cov BJ01；瞄準(zhǔn)的基因序列17724-18161測試類型RT-PCR4)BIT004引物對正義引物TAGGATTGCCTACGCAGACT反義引物TAGGGTAACCATTGACTTGGGI30275666；病毒名稱SARS-Cov BJ01；瞄準(zhǔn)的基因序列17724-18161測試類型RT-PCR5)BIT005引物對正義引物AATACCACGTCGCAATGTGG反義引物TAGGGTAACCATTGACTTGGGI30275666；病毒名稱SARS-Cov BJ01；瞄準(zhǔn)的基因序列17920-18161測試類型RT-PCR6)BIT006引物對正義引物AATACCACGTCGCAATGTGG反義引物GTGTCAACATAACCAGTCGGGI30275666；病毒名稱SARS-Cov BJ01；瞄準(zhǔn)的基因序列17920-18330測試類型RT-PCR7)BIT007引物對正義引物CTGGTCTTCATCCTACAC反義引物TCGGTACAGCTACTAAGTGI30275666；病毒名稱SARS-Cov BJ01；瞄準(zhǔn)的基因序列17997-18314測試類型RT-PCR8)BIT008引物對正義引物AGGACATGACCTACCGTA反義引物TAACACCTGTAGAAAATCGI30275666；病毒名稱SARS-Cov BJ01；瞄準(zhǔn)的基因序列18090-18296測試類型RT-PCR9)BIT009引物對正義引物CCAAGTCAATGGTTACCCTA反義引物GTGTCAACATAACCAGTCGGGI30275666；病毒名稱SARS-Cov BJ01；瞄準(zhǔn)的基因序列18142-18330測試類型RT-PCR反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測SARS冠狀病毒診斷試劑盒，包括緩沖液體系，以非典病毒的RNA中Orf1b反轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cDNA片斷為模板(即BJ01非典病毒的外顯子31-38經(jīng)PCR擴(kuò)充所得的cDNA片斷，作為陽性模板；)；所采用的引物為上述9對引物對之一或其組合。
PCR擴(kuò)充產(chǎn)物所獲得的cDNA通過基因載體，克隆到質(zhì)粒上作為試劑盒的陽性模板；所述的引物可采用熒光標(biāo)記物標(biāo)記，形成引物的熒光標(biāo)記物應(yīng)用于常規(guī)和定量的PCR反應(yīng)的試劑盒中。
為了能夠更好地對非典病毒基因進(jìn)行準(zhǔn)確、高效地早期檢測，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種適于SARS病毒反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒應(yīng)用的多通道組合式微流控芯片，利用微流控芯片上的PCR實(shí)現(xiàn)現(xiàn)時(shí)RT-PCR聯(lián)運(yùn)檢測。
微流控芯片，由管道、盛液池等組成，在盛液池間的進(jìn)樣管道上設(shè)有反應(yīng)池；可高度集成和高通量的PCR微流控芯片由可耐100度左右溫度的光透性好的材料組成，例如有機(jī)材料，如聚碳酸酯(PC)塑料等，以及無機(jī)材料，如石英、玻璃等；其結(jié)構(gòu)中包括有多個(gè)盛液池、微通道和毫米級的反應(yīng)管道或反應(yīng)孔(池)組成。其中芯片一側(cè)壁的厚度為1毫米～200微米；在進(jìn)樣管道上的反應(yīng)池與盛液池間可設(shè)有提取區(qū)；管道及反應(yīng)池深度為10～50微米，寬度或直徑為50微米～5毫米；在管道的末端打有2～4毫米直徑的孔；其結(jié)構(gòu)如圖8所示。
較佳的適于SARS病毒檢測的RT-PCR微流控芯片檢測條件為Taq酶的用量為2.5-5.0U/50μL，最佳引物和模板配料比為＞108∶101，引物濃度范圍為2.0-5μM。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.靈敏性高。本發(fā)明借助自行設(shè)計(jì)的微流控芯片聯(lián)機(jī)現(xiàn)時(shí)PCR儀，可以使得非典病毒的RT-PCR反應(yīng)在微流控芯片上進(jìn)行，可以達(dá)到分子水平的檢測；常規(guī)PCR無法檢出的RNA，本法依然能夠檢出；一個(gè)陽性對照模板，結(jié)合微流控芯片PCR技術(shù)摸索了較好的試劑盒，9對獲得特異性SARS基因序列擴(kuò)增產(chǎn)物，適于非典病毒的早期診斷；又因采用了高靈敏的激光誘導(dǎo)熒光檢測技術(shù)，所以其靈敏度比常規(guī)PCR技術(shù)大大提高；非典病毒可以在極低的濃度下檢測到，檢測限度可達(dá)10-2拷貝/100微升。
2.準(zhǔn)確性高。本發(fā)明通過跨越SARS-Cov開放閱讀框1b(Orf1b)，設(shè)計(jì)多位點(diǎn)擴(kuò)增，利用微流控毛細(xì)管電泳的高靈敏性和平行多通道掃描，準(zhǔn)確率高；利用所設(shè)計(jì)的9對引物，在自行設(shè)計(jì)的微流控芯片基因擴(kuò)增儀上對五種病毒(SARS-Cov樣品；流感病毒；副流感病毒；合胞病毒；腺病毒)進(jìn)行一次性多重?cái)U(kuò)增，其擴(kuò)增反應(yīng)在擴(kuò)增反應(yīng)芯片擴(kuò)增器中進(jìn)行，然后在線進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)記和芯片電泳分離，同時(shí)以已知量的DNA作內(nèi)標(biāo)，可將產(chǎn)物進(jìn)行定量分析(也可以經(jīng)熒光標(biāo)記，直接用于定量PCR檢測)，既保持了實(shí)時(shí)定量PCR的定量優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了其假陽性的缺點(diǎn)，較少出現(xiàn)假陰性，陽性檢出率高。
3.穩(wěn)定易操作。本發(fā)明設(shè)計(jì)的模板為基于非典病毒的RNA中Orf1b反轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cDNA片斷，因此模板比RNA陽性模板穩(wěn)定(陽性對照不需RNA模板)；并且PCR擴(kuò)充產(chǎn)物所獲得的cDNA可以通過基因載體，克隆到質(zhì)粒上作為試劑盒的陽性模板，進(jìn)一步提高試劑盒的穩(wěn)定性；所設(shè)計(jì)的引物無需熒光標(biāo)記，即可在微流控芯片上檢測出；具有新穎性，多樣性和全面性的特點(diǎn)；同時(shí)，比全基因組方法省時(shí)，而價(jià)廉。
4.特異性好。本發(fā)明是在基因組序列分析指導(dǎo)下設(shè)計(jì)的新的高效引物；對具有獨(dú)特遺傳特性的國產(chǎn)狀病毒具有專一性；適于具有我國獨(dú)特遺傳特性的SARS病毒的準(zhǔn)確PCR醫(yī)療、衛(wèi)生、檢疫的特異性檢測。
5.檢測速度快。本發(fā)明在操作上采用在線技術(shù)，如現(xiàn)時(shí)定量PCR一樣克服了常規(guī)PCR那種多步驟、離線、易污染的分析方法，操作方便；其反應(yīng)體積在5微升以下，大大減少了試劑用量，同時(shí)提高了擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)器的體表面積，使擴(kuò)增效率提高，可縮短擴(kuò)增反應(yīng)的時(shí)間，使擴(kuò)增與檢測時(shí)間縮短至25分鐘內(nèi)完成，達(dá)到快速檢測目的。采用多通道組合式微流芯片的RT-PCR，可集成和實(shí)現(xiàn)高通量，即可在同一塊芯片上實(shí)現(xiàn)多人份多病原體的同時(shí)檢測；微流控芯片上反轉(zhuǎn)錄現(xiàn)時(shí)PCR聯(lián)運(yùn)檢測，能夠?qū)Ψ堑洳《镜幕蜻M(jìn)行準(zhǔn)確、高效地早期檢測。本發(fā)明適用于呼吸道五種致熱性病毒病原體的聯(lián)合基因鑒別達(dá)到非典病毒的早期排查；這五種致熱性病毒包括呼吸道非典型性肺炎(SARS)病毒、呼吸道流感病毒、呼吸道副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒；它們的發(fā)病特點(diǎn)有許多相似性，如傳染性、引起肺炎嚴(yán)重者導(dǎo)致患者死亡等，給人們的生命財(cái)產(chǎn)造成重大損失；均為病毒感染癥狀有許多相似性，如發(fā)熱、導(dǎo)致肺炎等；臨床血液學(xué)檢查均為白細(xì)胞總數(shù)下降，嚴(yán)重者所造成的肺部感染的X胸片相類同，以此難以作出鑒別診斷；特別是在病源學(xué)不清的情況下，易造成大流行，造成重大的損失，SARS在中國的流行就是其中最近的一例。
6.成本低。試劑盒省略巢式法，一步即可獲得最佳結(jié)果；引物無需熒光標(biāo)記；如果是標(biāo)記的引物，也可以適用于常規(guī)定量PCR儀檢測；反應(yīng)產(chǎn)物的電泳分離檢測可在一塊微流控芯片上進(jìn)行或用常規(guī)定量PCR離線檢測；PCR擴(kuò)充后產(chǎn)物無需熒光探針附加檢測，進(jìn)一步降低成本。


圖1為非典病毒的基因組蛋白表達(dá)相關(guān)圖；圖2為非典病毒RT-PCR原理圖；圖3為陽性對照擴(kuò)增產(chǎn)物使用Marker前的電泳檢測譜圖；圖4為陽性對照擴(kuò)增產(chǎn)物使用Marker后的電泳檢測譜圖；圖5為實(shí)例一陽性模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物側(cè)序結(jié)果圖；圖6為本發(fā)明陰性對照組電泳譜圖；圖7為PCR產(chǎn)物DNA片段檢測靈敏度比較圖；圖8為本發(fā)明微流控芯片示意圖；其中1為盛液池，2為熱循環(huán)區(qū)，3為反應(yīng)池，4為檢測點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
首先，自2003年3月份以后，非典病毒被鑒定為宿主依賴性冠狀病毒，含有29736左右的正義單股RNA(ssRNA)，該病毒通過胞吞方式進(jìn)入正常細(xì)胞，然后經(jīng)過細(xì)胞膜融合釋放成熟mRNA進(jìn)入胞液；其次，從報(bào)道的非典病毒基因組分析初步結(jié)果來看，整個(gè)ssRNA的第一個(gè)20kb的所有功能只是復(fù)制成SARS病毒的一個(gè)聚合酶(參見圖1所示)，由此而知，SARS冠狀病毒和同家族的其他冠狀病毒一樣，是一類單鏈的正義RNA病毒(single-stranded，(+)sense RNA Virus)；以，在進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)需要加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)一步，先制備非典病毒基因序列中片斷所對應(yīng)的cDNA，后遵從常規(guī)PCR的操作規(guī)程；基本原理見圖2所示；本發(fā)明涉及通過對現(xiàn)有11條SARS基因組的分析和比較各SARS基因組序列后，基于ORF1a和ORF1b兩個(gè)開放閱讀框序列中的編碼序列，設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物，再以引物所在的位置選取包含PCR擴(kuò)充產(chǎn)物序列在內(nèi)的基因片斷進(jìn)行克隆，做成DNA陽性模板。
PCR芯片的構(gòu)建以玻璃PCR芯片為例將構(gòu)思好的芯片圖如圖8所示，利用CAD軟件在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行設(shè)計(jì)后，用5000dpi以上的打印機(jī)制成掩模，按標(biāo)準(zhǔn)的電子蝕刻工藝在符合分析化學(xué)用途的玻璃上蝕刻出所設(shè)計(jì)的圖案，其管道、反應(yīng)器、提取區(qū)管道、反應(yīng)腔等其深度一般在10微米至50微米之間，寬度或直徑一般在50微米至5毫米之間；蝕刻好的玻璃用超聲波打孔器在管道的末端打上2毫米至4毫米直徑的孔，然后與另一塊厚度為1毫米至200微米的同質(zhì)玻璃經(jīng)過嚴(yán)格的多步驟清洗過程后，將蝕刻有通道的玻璃面與另一準(zhǔn)備好的玻璃片對接好，放入程序控溫爐中，并在對接好的玻璃片上壓適當(dāng)?shù)闹匚?；然后，采用程序控溫的方法在?jīng)過約48小時(shí)的升溫和降溫程序，將二塊玻璃通過熱鍵合封接到一起；最后，根據(jù)玻璃表面的粗糙度進(jìn)行打磨和拋光，從而得到所需要的芯片。
實(shí)施例1.試劑盒11)材料陽性標(biāo)本來自國家軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，樣本為基因工程改造后的帶有非典病毒RNA的Vero-6病毒細(xì)胞株；-80C保存?zhèn)溆?。對照品為正常人唾液和其他病毒?br> 2)RNA樣品的制備RNA樣品的制備參見NEJM(文獻(xiàn)13.Marco A.Marra，Steven J.M.Jones，Caroline R.Astell etc，The Genome Sequenceof the SARS-Asscociated Coronavirus，Science，www.sciencexpress.org1 May 2003)，即向含有非典細(xì)胞的體液中加入等體積的N-乙?；腚装彼峋彌_液(0.9％NaCl融合的溶液，濃度為10g/l N-乙?；腚装彼峋彌_液)；緩慢搖動(dòng)30分鐘；取600μL該溶液，常規(guī)桌面離心機(jī)離心(10,000g)3分鐘，加入140μL的上清液到560μL的AVL緩沖液中(Qiagen病毒RNA試劑盒)，重新溶解細(xì)胞顆粒到560μL的AVL緩沖液中，在加入140μL的水；按照Qiaqen RNA試劑盒的指導(dǎo)進(jìn)行后續(xù)RNA制備操作。
3)合成BIT009引物對。
4)陽性DNA模板的制備①反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(所有試劑來自Takara RNA LA PCR kit)Mgcl2(25mM)4μl10X RNA PCR Buffer 2μlRnase free H2O 7.5μlDNTP Mixture2μlRNase Inhibitor 0.5μl
AMV reverse transcriptase XL1μlSARS RNA2μlOlio dT adaptor Primer 1μl按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30℃ 10分鐘50℃ 30分鐘99℃ 5分鐘5℃ 5分鐘②PCR反應(yīng)取反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物2μl，加入下列成分10X LA PCR Buffer II 5μlMgcl2(25mM) 5μl滅菌蒸餾水 36.5μl引物(根據(jù)多倫多發(fā)表的sars序列GI30248028)正義引物CCACTAGAGGAGCTACTGTG反義引物GTCTGACAATCCTTTCAGGG擴(kuò)充產(chǎn)物瞄準(zhǔn)序列Tor 15112-18506擴(kuò)增產(chǎn)物長度3395bp引物量1μLTakala LA Taq 0.5μl按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃ 5分鐘，94℃ 30秒——55℃ 30秒——72℃ 4分鐘 30個(gè)循環(huán)72℃ 7分鐘；③制備感受態(tài)細(xì)胞a.取40μl大腸桿菌(DH5a)轉(zhuǎn)接于4ml LB培養(yǎng)基，37℃，250RPM，3小時(shí)；b.冰浴10分鐘，4℃，8000RPM，1分鐘；c.加入1×TSS溶液200μl，冰上混勻，分裝，冰浴50分鐘；d.-20℃ 3小時(shí)e.-70℃保存④轉(zhuǎn)化a.連接反應(yīng)產(chǎn)物50μl，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，對照Takala DL 15000DNA Marker進(jìn)行分離鑒定，將PCR產(chǎn)物回收；Omega公司E.Z.N.A GelExtraction Kit(200)D2501-02進(jìn)行純化，制成80μl溶液；取其中4μl，加入滅菌去離子水3μl，Promega pGEM T-easy載體1μl，45℃水浴5分鐘，冰浴，加T4 DNA連接酶1μl，10X DNA ligation buffer 1μl，室溫靜置3小時(shí)；b.取5μl連接產(chǎn)物加入含感受態(tài)細(xì)胞的200μl溶液中，混勻后轉(zhuǎn)至無菌試管，冰浴30分鐘；c.迅速放42℃水浴中90秒；d.迅速放置冰浴槽1分鐘，加入800μl LB液體培養(yǎng)基，37℃預(yù)溫5分鐘，隨后放置37℃搖床中，200RPM溫育45分鐘；e.取200μl轉(zhuǎn)化菌，涂布于含有氨芐青霉素(100μl/100ml LB培養(yǎng)基)、X-gal(200μl/100ml LB培養(yǎng)基)、IPTG(20μl/100ml LB 培養(yǎng)基)的LB固體培養(yǎng)基板上，37℃恒溫箱中溫育16小時(shí)；f.4℃放置8小時(shí)，挑取白色單菌落，放入4ml含有氨芐青霉素(1μl/ml)的LB液體培養(yǎng)試管中，37℃搖床中，250 RPM，12小時(shí)；⑤鑒定菌液放于1.5ml離心管中，8000RPM離心一分鐘；用Omega E.Z.N.APlasmid Miniprep Kit 1回收質(zhì)粒DNA，溶解于150μl去離子水中；取質(zhì)粒DNA10μl，加去離子水7μl，NEB 10×Buffer(New England Biolab)2μl，1mg/ml牛血清白蛋白(New England Biolab)0.5μl，SacI(New England Biolab)0.5μl，37℃溫育4小時(shí)；1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切片段。
⑥RT-PCR實(shí)驗(yàn)規(guī)程采用一步法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)RT-PCR反應(yīng)液(1)10×One Step RNA PCR Buffer5μl(2)MgCl2(25mM) 10μl(3)dNTP mixture(10mM each)5μl(4)RNase Inhibi tor(40U/μl) 1μl(5)AMV-RTase XL(5U/μl) 1μl(6)AMV-Optimi zed Taq(5U/μl) 0.5μl(7)RNase Free H20 up to 50μl(8)(20μM each) 1μl(9)樣品RNA* 1μl上述試劑和原料(1-7)來自Takara SARS Virus RNA Detection Kit，購自寶生物大連生物工程有限公司。Code D303，Lot BK101；引物9(自行設(shè)計(jì))，和上述自行制備的陽性模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)。
●陽性對照時(shí)加入control DNA，不加樣品RNA；●陰性對照反應(yīng)不加非典樣品RNA和control DNA，但是加入副流感病毒RNA(由大連醫(yī)科大學(xué)微生物系提供。
RT-PCR反應(yīng)條件50℃ 15分鐘逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)94℃ 2分鐘 RTase失活 反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液進(jìn)行電泳，確認(rèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如樣品RNA檢測出189bp目的片段，則判定為陽性結(jié)果。
典型反應(yīng)實(shí)例PCR儀器TECHNE modelFTGENE5D SERIAL No.110657-4，產(chǎn)地英國反應(yīng)體系Mxd9-1/2AMV taq-105cDNA PCR反應(yīng)分析儀器自制芯片電泳儀、自制玻璃芯片PCR反應(yīng)液為緩沖液和試劑來自Takara10×One Step RNA PCR Buffer 5μlMgCl2(25mM) 10μldNTP mixture(10mM each) 5μlAMV-Optimized Taq(5U/μl) 0.5μl第9對引物(20μM each) 1μlSARS cDNA fragment(105)* 1μlRNase Free H20up to 50μlPCR反應(yīng)條件94℃ 5分鐘 預(yù)變性 72℃ 5分鐘 延伸⑦試劑盒的陽性對照實(shí)驗(yàn)和陰性對照實(shí)驗(yàn)及產(chǎn)物分析反應(yīng)結(jié)束后，將PCR反應(yīng)液稀釋10倍，取5-10μl PCR產(chǎn)物，用自制的玻璃芯片，在芯片電泳儀上進(jìn)行分析，確認(rèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測出了189bp目的片段，則判定為陽性結(jié)果。
陰性對照副流感病毒與第9對引物的RT-PCR結(jié)果；副流感病毒來自于大連醫(yī)科大學(xué)微生物系。
⑧第9對引物擴(kuò)增產(chǎn)物測序擴(kuò)充產(chǎn)物送交Takara(Dalian)Biotechnology Co.，Ltd.擴(kuò)增產(chǎn)物的序列參見(圖9)；Blast比對結(jié)果如下Blast Score＝375bits(189)，Expect＝e-101Identities＝189/189(100％)Strand＝Plus/Minus符，合預(yù)計(jì)的序列(BJ01，位置18142-18330)。
Blast比對結(jié)果如下PCR擴(kuò)充產(chǎn)物序列Query 1-189對比序列GI30027614，SARS Coronavirus BJ01Score＝364bits(189)，Expect＝4e-98Identities＝189/189(100％)Strand＝Plus/Plus
Query1 ttataccactcatgtataaaggcttgccctggaatgtagtgcgtattaagatagtacaaa 60||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct18142 ttataccactcatgtataaaggcttgccctggaatgtagtgcgtattaagatagtacaaa 18201Query61tgctcagtgatacactgaaaggattgtcagacagagtcgtgttcgtcctttgggcgcatg 120||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct18202 tgctcagtgatacactgaaaggattgtcagacagagtcgtgttcgtcctttgggcgcatg 18261Query121 gctttgagcttacatcaatgaagtactttgtcaagattggacctgaaagaacgtgttgtc 180||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct18262 gctttgagcttacatcaatgaagtactttgtcaagattggacctgaaagaacgtgttgtc 18321Query181 tgtgtgaca 189|||||||||Sbjct18322 tgtgtgaca 18330本發(fā)明微流控芯片RT-PCR顯示出很高的靈敏性，常規(guī)PCR無法檢測到的極微量的非典病毒利用所設(shè)計(jì)的特異性引物均可檢測到(參見圖7)。
(芯片PCR產(chǎn)物標(biāo)記為Polymer Chip PCR條帶)陰性對照非流感病毒，合孢病毒，腺病毒的RNA提取物經(jīng)上述試劑盒的RT-PCR擴(kuò)增，均得到譜圖如圖6所示；由此看出，所設(shè)計(jì)的引物對于SARS-Cov具有很高的特異性。由此可以看來，陰性對照均無PCR產(chǎn)物；說明該試劑盒中的引物和陽性模板對非典病毒基因序列具有極高的專屬性。
同時(shí)，與常規(guī)Agrose凝膠電泳(溴乙啶染色)比較，也顯示出芯片PCR的優(yōu)越的靈敏性(參見圖7)。
該微流控芯片試劑盒的反應(yīng)的靈敏性表現(xiàn)在，非典病毒陽性模板在100個(gè)拷貝的RNA分子/100ul的濃度便可檢出。
實(shí)施例2.試劑盒2引物使用BIT001號引物對，試劑盒其它部分同實(shí)例一。
實(shí)施例3.試劑盒3引物使用BIT002號引物對，試劑盒其它部分同實(shí)例一。
實(shí)施例4.試劑盒4引物使用BIT003號引物對，試劑盒其它部分同實(shí)例一。
實(shí)施例5.試劑盒5引物使用BIT004號引物對，試劑盒其它部分同實(shí)例一。
實(shí)施例6.試劑盒6引物使用BIT005號引物對，試劑盒其它部分同實(shí)例一。
實(shí)施例7.試劑盒7引物使用BIT006號引物對，試劑盒其它部分同實(shí)例一。
實(shí)施例8.試劑盒8引物使用BIT007號引物對，試劑盒其它部分同實(shí)例一。
實(shí)施例9.試劑盒9引物使用BIT008號引物對，試劑盒其它部分同實(shí)例一。
權(quán)利要求
1.一種反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測SARS冠狀病毒診斷試劑盒，包括緩沖液體系，其特征在于以非典病毒的RNA中Orf1b反轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cDNA片斷為模板；所采用的引物為下列引物對之一或其組合，1)BIT001引物對正義引物5’-AGAGCCATGCCTAACATGCT-3’反義引物5’-AAGCGTAAAACTCATCCACG-3’；2)BIT002引物對正義引物5’-GTCAAGCTGTTACAGCCAAT-3’反義引物5’-AAGCGTAAAACTCATCCACG-3’；3)BIT003引物對正義引物5’-TAGGATTGCCTACGCAGACT-3’反義引物5’-CCACATTGCGACGTGGTATT-3’；4)BIT004引物對正義引物5’-TAGGATTGCCTACGCAGACT-3’反義引物5’-TAGGGTAACCATTGACTTGG-3’；5)BIT005引物對正義引物5’-AATACCACGTCGCAATGTGG-3’反義引物5’-TAGGGTAACCATTGACTTGG-3’；6)BIT006引物對正義引物5’-AATACCACGTCGCAATGTGG-3’反義引物5’-GTGTCAACATAACCAGTCGG-3’；7)BIT007引物對正義引物5’-CTGGTCTTCATCCTACAC-3’反義引物5’-TCGGTACAGCTACTAAGT-3’；8)BIT008引物對正義引物5’-AGGACATGACCTACCGTA-3’反義引物5’-TAACACCTGTAGAAAATC-3’；9)BIT009引物對正義引物5’-CCAAGTCAATGGTTACCCTA-3’反義引物5’-GTGTCAACATAACCAGTCGG-3’。
2.按照權(quán)利要求1所述檢測SARS冠狀病毒診斷試劑盒，其特征在于所述1)BIT001引物對瞄準(zhǔn)的基因序列為15221-15593；2)BIT002引物對瞄準(zhǔn)的基因序列為15441-15593；3)BIT003引物對瞄準(zhǔn)的基因序列為17724-18161；4)BIT004引物對瞄準(zhǔn)的基因序列為17724-18161；5)BIT005引物對瞄準(zhǔn)的基因序列為17920-18161；6)BIT006引物對瞄準(zhǔn)的基因序列為17920-18330；7)BIT007引物對瞄準(zhǔn)的基因序列為17997-18314；8)BIT008引物對瞄準(zhǔn)的基因序列為18090-18296；9)BIT009引物對瞄準(zhǔn)的基因序列18142-18330；病毒名稱SARS-Cov BJ01，GI#30275666；測試類型為RT-PCR。
3.按照權(quán)利要求1所述檢測SARS冠狀病毒診斷試劑盒，其特征在于PCR擴(kuò)充產(chǎn)物所獲得的cDNA陽性模板，或通過基因載體，將該cDNA片斷克隆到質(zhì)粒上作為試劑盒的陽性模板。
4.按照權(quán)利要求1所述檢測SARS冠狀病毒診斷試劑盒，其特征在于所述的引物可采用熒光標(biāo)記物標(biāo)記，形成引物的熒光標(biāo)記物應(yīng)用于常規(guī)和定量的PCR反應(yīng)的試劑盒中。
全文摘要
本發(fā)明涉及SARS冠狀病毒的診斷，具體地說是一種反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測SARS冠狀病毒診斷試劑盒，包括緩沖液體系，以及非典病毒的RNA中Orflb反轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cDNA片斷為模板；所采用的引物對為BIT001－009。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為高靈敏性和準(zhǔn)確性，既保持了實(shí)時(shí)定量PCR的定量優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了其假陽性的缺點(diǎn)，陽性檢出率高，穩(wěn)定易操作，特異性好，檢測速度快，成本低。
文檔編號C12Q1/68GK1514010SQ03133770
公開日2004年7月21日 申請日期2003年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月22日
發(fā)明者梅曉丹, 周小棉, 劉大漁, 周潤濤, 夏志南, 張利平, 林炳承 申請人:珍奧集團(tuán)股份有限公司