專利名稱：反轉(zhuǎn)錄方法
相關申請交叉文獻不適用。
關于聯(lián)邦政府贊助研究或開發(fā)的聲明不適用。
背景技術：
cDNA合成在Mn++存在下，各種DNA依賴的DNA聚合酶可作為反轉(zhuǎn)錄酶起作用，其利用RNA作為模板從寡核苷酸引物開始合成互補的cDNA(Karkas，J.D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 703834-3838,1973)。當與真正的反轉(zhuǎn)錄酶(如禽成髓細胞瘤病毒(AMV)或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶)的合成速度、cDNA總產(chǎn)量和產(chǎn)生的全長轉(zhuǎn)錄物的豐度相比時，該反應被認為是低效率的(Powell，L.M.等人，Cell 50831-840，1987)。
起反轉(zhuǎn)錄酶作用的熱穩(wěn)定的DNA依賴的DNA聚合酶已經(jīng)用于cDNA合成。在升高的溫度(高于50℃)下進行的反應預計會表現(xiàn)出高于嗜溫型酶反應的引導特異性和反轉(zhuǎn)錄通過RNA次級結構區(qū)域的能力。可用作反轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定DNA聚合酶還被用于RT-PCR方法來產(chǎn)生從RNA靶開始的DNA拷貝(擴增子)(Myers，T.W.和Gelfand，D.H.Biochemistry 307661-7666，1991和美國專利5,322,770；5,310,652；和5,407,800)。
甜菜堿已經(jīng)表明，甜菜堿(N，N，N-三甲基甘氨酸)能提高PCR效率。美國專利5,545,539(Miller，1994年10月18日提交)描述了用有效量的甘氨酸為基礎的滲壓劑來改善PCR擴增核苷酸靶序列的方法。該滲壓劑減少了擴增產(chǎn)物中的“模糊(stutter)條帶”的出現(xiàn)，因此能更容易地檢測核苷酸靶序列。
Rees等人(Biochemistry 32137-144，1993)證明了甜菜堿具有減少或消除DNA熱解鏈轉(zhuǎn)換的堿基對組成依賴性。
DE4411588C1公開了一種用于RNA和DNA聚合酶反應的含有甜菜堿的緩沖液，以及該緩沖液在PCR反應和用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶將RAN反轉(zhuǎn)錄成cDNA中的用途。
本領域所需的是一種提高cDNA總產(chǎn)量和全長轉(zhuǎn)錄物豐度的方法，以便提高整個RT-PCR方法的靈敏度和產(chǎn)量。
發(fā)明概述我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在Mn++存在下，甜菜堿提高了作為反轉(zhuǎn)錄酶起作用的熱穩(wěn)定DNA聚合酶合成的全長cDNA的產(chǎn)量。
本發(fā)明是一種DNA合成方法，該方法包括在有效提高反轉(zhuǎn)錄的甜菜堿用量下，使RNA模板與熱穩(wěn)定的DNA依賴的DNA聚合酶接觸的步驟。聚合酶反轉(zhuǎn)錄RNA模板，產(chǎn)生了該模板的DNA拷貝。較佳的是，甜菜堿的濃度在0.5-3.0M之間，最佳的為2.0M(±0.5M)。
本發(fā)明還涉及用于反轉(zhuǎn)錄反應的試劑盒。在一個較佳的實例中，該試劑盒包括含有甜菜堿的溶液、核苷酸、脫氧核苷酸和DNA依賴的DNA聚合酶。較佳的是，該試劑盒包括將含甜菜堿溶液中的熱穩(wěn)定的DNA依賴的DNA聚合酶用于反轉(zhuǎn)錄反應的說明書。
在本發(fā)明的另一個實例中，該方法與一種擴增方法相結合，最佳的是與聚合酶鏈反應相結合。
本發(fā)明的一個目的是提供一種改進的反轉(zhuǎn)錄反應。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種提高cDNA合成反應中全長轉(zhuǎn)錄物豐度和產(chǎn)量的方法。
本發(fā)明還有一個目的是改善RT-PCR方法的總的產(chǎn)量。
在審查了說明書和權利要求后，本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點是顯而易見的。
附圖
簡述不適用。
發(fā)明詳述本發(fā)明是一種DNA合成方法，該方法包括在有效提高反轉(zhuǎn)錄的甜菜堿用量下使RNA模板與熱穩(wěn)定的DNA依賴的DNA聚合酶接觸的步驟。該方法適用于本領域技術人員所知的用DNA依賴的DNA聚合酶作為反轉(zhuǎn)錄酶的方法。
盡管本發(fā)明在下文列舉了具體的DNA聚合酶，但是本發(fā)明并不局限于這些例子。文獻中已有報道的其它熱穩(wěn)定的聚合酶均可用于實施本文描述的方法。這些例子包括從嗜熱菌Bacillus stearothermophilus、Thermosipho africanus、Thermotogamaritima、嗜熱菌屬(Thermus species)SPS17、T.brockianus、T.flavus、T.lactues、T.rubens、T.ruber和T.species Z05。另外，還有從嗜熱古細菌例如Desulfurococcus mobilis，Methanobacterium thermoautotrophicum，Methanothermus fervidus，Pyrococcus furious，Pyrodictium occulturn，Sulfolobus acidocaldariu，S.solfataricus，Thermococcus litoralis和Thermoplasma acidophilum分離獲得的熱穩(wěn)定的聚合酶。
經(jīng)修飾的熱穩(wěn)定的聚合酶可從蛋白水解性降解獲得，或由截短的基因產(chǎn)生。這些蛋白也可用于實施本發(fā)明，只要它們具有用RNA模板聚合脫氧核糖核苷三磷酸的功能。
據(jù)信，本發(fā)明的方法對可以在反轉(zhuǎn)錄酶或作為反轉(zhuǎn)錄酶起作用的DNA聚合酶的反轉(zhuǎn)錄底物的任何RNA模板上起作用。
下文描述的例子是一個典型反轉(zhuǎn)錄反應混合物。較佳的反轉(zhuǎn)錄反應混合物包括RNA模板分子、寡核苷酸引物、所有四種dNTP的混合物以及合適的緩沖液。下文公開的例子所用的緩沖液含有0.01M Tris-HCl，pH8.3，0.05M KCl，1.5mM MgCl2和0.75mM MnCl2。美國專利5,322,770；5,310,652和5,407,800描述了依賴于Mn的反轉(zhuǎn)錄反應。
然后在反應混合物中加入熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。較佳的，該熱穩(wěn)定的DNA依賴的DNA聚合酶分離自Thermus thermophilus或Bacillus stearothermophilus。然而，據(jù)信上述其它各種熱穩(wěn)定微生物的聚合酶也是合適的。
在甜菜堿存在下培育反應物，該甜菜堿宜從Sigma Chemical Company，St.Louis，MO按目錄號#B2754以甜菜堿單水合物的形式購得。最好采用0.5-2.5M濃度的甜菜堿。2M(±0.5M)的濃度是較佳的。我們的實驗表明，濃度為3M的甜菜堿至少勉強有效。
本發(fā)明需要聚合酶在產(chǎn)生的模板DNA拷貝中反轉(zhuǎn)錄RNA模板?？赏ㄟ^將反轉(zhuǎn)錄材料顯示在電泳凝膠上來檢測該DNA拷貝的存在與否。
在下述實施例中，我們能使cDNA的合成數(shù)量從不可觀察量增加到可觀察數(shù)量。但是，我們預計本發(fā)明的方法也適用于cDNA的合成僅僅是效率低但并不一定被完全抑制的場合。cDNA合成的任何改進(定義成產(chǎn)物增加至少10％(通過在全長產(chǎn)物中摻入放射性標記的dNTP來測定))是符合本發(fā)明的。
本發(fā)明還涉及一種用于用本發(fā)明的方法進行反轉(zhuǎn)錄反應的試劑盒。該試劑盒的最基本的形式包括含甜菜堿溶液或緩沖液的小瓶或容器，以及關于反應的說明書。較佳的是，試劑盒還包括脫氧核糖核苷酸以及熱穩(wěn)定的DNA依賴的DNA聚合酶。
實施例A.實驗在混合物中用大腸桿菌核糖體RNA作為靶模板RNA，用分離自Thermusthermophilus和Bacillus stearothermophilus的DNA聚合酶合成cDNA。含有1 μg核糖體RNA制備物的反應混合物含有23S、16S和5S rRNA物質(zhì)；在16S rRNA 3′末端附近退火的寡核苷酸引物；所有四種脫氧核糖核苷三磷酸(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)的混合物；合適的反應緩沖液(0.01M Tris-HCl，pH8.3，0.05M KCl，1.5mM MgCl2和0.75mM MnCl2)；以及5單位的Tth DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶。在各種濃度的甜菜堿(高達3.0M)存在或不存在下，60℃培育混合物20分鐘。用1％瓊脂糖凝膠電泳和DNA大小標準品分析反應混合物。用溴化乙啶染色和紫外光(312nm)透照使核酸條帶顯色。
B.結果電泳凝膠上的條帶圖形表明，反應混合物中存在約2M的甜菜堿提高了cDNA的合成(從出現(xiàn)強條帶遷移到約1.4kb處可以看出)。該大小與全長cDNA/16S rRNA雜交體所預計的大小一致。在沒有甜菜堿時，沒有顯示出這樣的條帶，反應混合物中主要是更小的產(chǎn)物。
當用堿性凝膠瓊脂糖電泳分析反應樣品時，導致所有RNA被破壞，結果發(fā)現(xiàn)一條cDNA條帶遷移至1.4kb，這再一次與全長cDNA的合成相符。在沒有甜菜堿時，在凝膠上再次看到了較小的產(chǎn)物。
關于甜菜堿增強TTh和Bst DNA聚合酶合成cDNA的機制還不清楚。在Mn++存在時升高的溫度下RNA的穩(wěn)定性提高、RNA的構型改變從而被更好地用作DNA聚合酶的模板、以及引導性改善是可能的因素。
權利要求
1.一種DNA合成方法，該方法包括在有效提高反轉(zhuǎn)錄的甜菜堿用量下，使RNA模板與熱穩(wěn)定的DNA依賴的DNA聚合酶接觸的步驟，其中聚合酶反轉(zhuǎn)錄RNA模板并產(chǎn)生了該模板的DNA拷貝。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中甜菜堿的濃度在0.5-3.0M之間。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中濃度為2.0M±0.5M。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中熱穩(wěn)定的DNA依賴的DNA聚合酶選自分離自Thermus thermophilus和Bacillus stearothermophilus的聚合酶。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，該方法還包括擴增DNA拷貝的步驟。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中擴增反應是聚合酶鏈反應。
7.一種用于反轉(zhuǎn)錄反應的試劑盒，該試劑盒包括含甜菜堿溶液的容器以及反轉(zhuǎn)錄方法的說明書。
8.根據(jù)權利要求7所述的試劑盒，它還包含脫氧核糖核苷酸。
9.根據(jù)權利要求7所述的試劑盒，它還包含等份熱穩(wěn)定的DNA依賴的DNA聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高Mn
文檔編號C12N15/09GK1261406SQ98806390
公開日2000年7月26日 申請日期1998年4月15日 優(yōu)先權日1997年4月21日
發(fā)明者J·J·詹德里薩 申請人:埃比中心技術有限公司