專利名稱：產(chǎn)生由多個亞單位組成的aslv逆轉(zhuǎn)錄酶的方法
技術領域：
本發(fā)明為分子和細胞生物學領域。本發(fā)明一般涉及逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄核酸分子、尤其是信使RNA分子的方法。本發(fā)明具體涉及含有逆轉(zhuǎn)錄酶混合物的組合物，并涉及使用這些逆轉(zhuǎn)錄酶或其組合物產(chǎn)生、或擴增核酸分子(尤其是cDNA分子)或者測定其序列的方法。本發(fā)明還涉及由這些方法產(chǎn)生的核酸分子，并涉及使用這種核酸分子產(chǎn)生所需的多肽。本發(fā)明還涉及含有上述組合物的試劑盒。
背景技術：
cDNA和cDNA文庫在檢查生物體、組織或細胞的結(jié)構(gòu)和生理時，經(jīng)常需要測定其遺傳組成。生物體細胞和生殖細胞中所含脫氧核糖核酸(DNA)中的雙鏈核苷酸堿基序列編碼了該生物體的基因構(gòu)架。只有產(chǎn)生基因編碼的蛋白質(zhì)才能顯示特定DNA區(qū)段或基因的遺傳組成。為了產(chǎn)生蛋白質(zhì)，通過聚合酶產(chǎn)生了一條DNA雙螺旋鏈(“編碼”鏈)的互補拷貝，即特定的核糖核酸(RNA)序列。由于這種特定類型的RNA含有來自DNA、用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的遺傳信息，因而被稱為信使RNA(mRNA)。
在給定細胞、組織或生物體中，存在很多種mRNA，各編碼獨立的和特定的蛋白質(zhì)。這一事實為致力于研究組織或細胞中基因表達的研究者提供了強有力的工具，即通過多種分子生物學技術可分離和進一步操作mRNA分子，籍此闡明細胞、組織或生物體的全部功能性遺傳組成。
研究基因表達的常用方法之一是產(chǎn)生互補的DNA(cDNA)克隆。在此技術中，生物體的mRNA分子分離自生物體細胞或組織的提取物。分離中經(jīng)常使用固體層析基質(zhì)，如纖維素或瓊脂糖，其上絡合有胸苷(T)寡聚體。由于大多數(shù)真核mRNA分子的3’末端含有一段腺苷(A)堿基序列，而A可與T結(jié)合，因此可快速地將mRNA分子與組織或細胞提取物中的其它分子和物質(zhì)分離開。使用逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)，可由這些純化的mRNA分子制備cDNA拷貝，從而產(chǎn)生單鏈cDNA分子。然后通過DNA聚合酶的作用可將單鏈cDNA轉(zhuǎn)變?yōu)樵糾RNA的(因而是生物體基因組中所含的編碼此mRNA的原始雙鏈DNA序列的)完全雙鏈DNA拷貝(即雙鏈cDNA)。然后可將蛋白質(zhì)特異性的雙鏈cDNA插入質(zhì)粒或病毒載體，再將所述載體導入宿主細菌、酵母、動物或植物細胞。通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞可產(chǎn)生含有(在很多情況下為表達)所需基因的宿主細胞群體。
從分離mRNA到將cDNA插入質(zhì)?；蜉d體中、再培養(yǎng)含分離基因的宿主細胞群體的整個過程被稱為“cDNA克隆”。如果cDNA制備自大量不同的mRNA，則所得的一套cDNA被稱為“cDNA文庫”，這一術語是恰當?shù)?，因為此套cDNA代表含有來源細胞、組織或生物體中存在的功能性遺傳信息的基因“群體”。對這些cDNA文庫的基因型分析產(chǎn)生了很多有關其來源生物體之結(jié)構(gòu)和功能的信息。逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶已深入研究了3種原型形式的逆轉(zhuǎn)錄病毒RT，Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)RT含有一個78KDa亞單位，它具有依賴于RNA的DNA聚合酶和RNA酶H的活性。在大腸桿菌中克隆并表達了完全活性形式的此酶(參見Prasad，V.R.，逆轉(zhuǎn)錄酶，冷泉港，紐約冷泉港實驗室出版社，p.135(1993))。人免疫缺損病毒(HIV)RT是p66和p51亞單位的異二聚體，其中較小的亞單位通過蛋白酶水解衍生自較大的亞單位。p66亞單位具有依賴于RNA的DNA聚合酶和RNA酶H結(jié)構(gòu)域，而p51亞單位僅具有DNA聚合酶結(jié)構(gòu)域?；钚訦IV p66/p51 RT已在包括大腸桿菌的很多表達宿主中成功地被克隆和表達(參見Le Grice，S.F.J.，逆轉(zhuǎn)錄酶，冷泉港，紐約冷泉港實驗室出版社，p.163(1993))。在HIVp66/p51異二聚體中，51-KD亞單位無催化活性，66-KD亞單位具有DNA聚合酶和RNA酶H的活性(Le Grice，S.F.J.，等，EMBO J103905(1991)；Hostomsky，Z.，等，病毒學雜志，663179(1992))。禽肉瘤-白血病病毒(ASLV)RT包括但不限于Rous肉瘤病毒(RSV)RT，禽成髓細胞瘤病毒(AMV)RT，禽紅白血病病毒(AEV)輔助病毒MCAV RT，禽髓細胞瘤病毒MC29輔助病毒MCAV RT，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞瘤病毒(REV-T)輔助病毒REV-A RT，禽肉瘤病毒UR2輔助病毒UR2AV RT，禽肉瘤病毒Y73輔助病毒YAV RT，Rous伴隨病毒(RAV)RT和成髓細胞瘤伴隨病毒(MAV)RT，它們也是由兩個亞單位α(約62KDa)和β(約94KDa)構(gòu)成的異二聚體，其中α通過蛋白酶水解衍生自β(參見Prasad，V.R.，逆轉(zhuǎn)錄酶，冷泉港，紐約冷泉港實驗室出版社，p.135(1993))。ASLV RT可以另外兩個催化活性結(jié)構(gòu)形式ββ和α存在(Hizi，A.和Joklik，W.K.，生物化學雜志，2522281(1977))。沉降分析表明αβ和ββ是二聚體，α形式以等量的單體和二聚體形式存在(Grandgenett，D.P.，等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 70230(1973)；Hizi，A.和Joklik，W.K.，生物化學雜志，2522281(1977)；和Soltis，D.A.和Skalka，A.M.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 853372(1988))。ASLV αβ和ββ RT是已知的在相同蛋白質(zhì)復合物中包括3種不同活性DNA聚合酶，RNA酶H和DNA內(nèi)切核酸酶(整合酶)活性的唯一一個例子(參見Skalka，A.M.，逆轉(zhuǎn)錄酶，冷泉港，紐約冷泉港實驗室出版社，p.193(1993))。α形式缺乏整合酶結(jié)構(gòu)域和活性。
ASLV RT多種形式的各個亞單位已被克隆和表達。它們包括一般被蛋白酶水解加工成β的98-KDa前體多肽和得自β羧基末端的4-KDa多肽(Alexander，F(xiàn).，等，病毒學雜志，61534(1987)和Anderson，D等，F(xiàn)ocus 1753(1995))，和成熟的β亞單位(Weis，J.H.和Salstrom，J.S.，美國專利4,663,290(1987)；和Soltis，D.A.和Skalka，A.M.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 853372(1988))。異二聚體形式的RSV αβRT也可純化自表達克隆的RSV β基因的大腸桿菌細胞(Chernov，A.P.等，Biomed.Sci，249(1991))。然而，迄今為止未報道過同時表達克隆的ASLV RT α和β基因，形成異二聚體形式的αβ RT。逆轉(zhuǎn)錄效率如上所述，通過RT介導的逆轉(zhuǎn)錄使mRNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA是研究由克隆基因表達的蛋白質(zhì)的必需步驟。然而，使用未經(jīng)修飾的RT催化逆轉(zhuǎn)錄是無效的，原因至少有兩個。首先，在逆轉(zhuǎn)錄開始之前，RT有時會破壞RNA模板，這主要是RT中存在的內(nèi)在RNA酶H活性所致。第二，在逆轉(zhuǎn)錄過程開始之后，RT經(jīng)常不能完成逆轉(zhuǎn)錄(Berger，S.L.，等，生物化學，222365-2372(1983)；Krug，M.S.，和Berger，S.L.酶學方法，152316(1987))。除去RT的RNA酶H活性可消除第一個問題，并改善逆轉(zhuǎn)錄效力(Gerard，G.F.，等，F(xiàn)OCUS 11(4)60(1989)；Gerard，G.F.，等，F(xiàn)OCUS 14(3)91(1992))。然而，RT，包括其缺乏RNA酶H活性的形式(“RNA酶H-”形式)仍趨向于在核酸模板中某些二級結(jié)構(gòu)(Gerard，G.F.，等，F(xiàn)OCUS 11(4)60(1989)；Myers，T.W.，和Gelfand，D.H.，生物化學，307661(1991))和序列(Messer，L.I.，等，病毒學，146146(1985)；Abbotts，J.，等，生物化學雜志，26810312-10323(1993))屏障處過早終止DNA合成。
甚至在目前最有效的、使用RNA酶H-M-MLV RT的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中，總cDNA產(chǎn)物的量一般不超過mRNA投入量的50％，全長的產(chǎn)物組分不超過50％。經(jīng)常在一段同聚體序列中出現(xiàn)(Messer，L.I.，等，病毒學，146146(1985)；Huber，H.E.，等，生物化學雜志，2644669-4678(1989)；Myers，T.W.，和Gelfand，D.H.，生物化學，307661(1991))、如上所述可引起這些局限性的mRNA模板中二級結(jié)構(gòu)和序列的屏障，更常見的是序列屏障而非二級結(jié)構(gòu)屏障(Abbotts，J.，等，生物化學雜志，26810312-10323(1993))，對不同RT而言，所述屏障經(jīng)常各不相同(Abbotts，J.，等，生物化學雜志，26810312-10323(1993))。如果這些屏障能被克服，逆轉(zhuǎn)錄反應中總的和全長的cDNA產(chǎn)物的量即可增加。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了逆轉(zhuǎn)錄酶，含有此酶的組合物和用于克服上述cDNA長度限制的方法。一般地說，本發(fā)明提供了可用于逆轉(zhuǎn)錄核酸分子的組合物，所述組合物含有兩種或多種不同的、具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽。這種組合物中還可包括一種或多種核苷酸，適當?shù)木彌_液，和/或一種或多種DNA聚合酶。本發(fā)明的組合物中也可包括一個或多個寡核苷酸引物。本發(fā)明組合物中所用的各個逆轉(zhuǎn)錄酶在給定mRNA分子上可能具有不同的轉(zhuǎn)錄停頓位點。優(yōu)選這些組合物中逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性降低或大大降低，最優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄酶選自Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)H-逆轉(zhuǎn)錄酶，Rous肉瘤病毒(RSV)H-逆轉(zhuǎn)錄酶，禽成髓細胞瘤病毒(AMV)H-逆轉(zhuǎn)錄酶，Rous伴隨病毒(RAV)H-逆轉(zhuǎn)錄酶，成髓細胞瘤伴隨病毒(MAV)H-逆轉(zhuǎn)錄酶，和人免疫缺損病毒(HIV)H-逆轉(zhuǎn)錄酶或其它ASLV H-逆轉(zhuǎn)錄酶。在優(yōu)選的組合物中，逆轉(zhuǎn)錄酶以工作濃度存在。
本發(fā)明也涉及制備一種或多種核酸分子的方法，所述方法包括將一種或多種核酸模板(優(yōu)選為一種或多種RNA模板，最優(yōu)選為一種或多種信使RNA模板)與兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽混合，并在足以制備與所述一種或多種核酸模板之全部或部分互補的第一核酸分子的條件下，保溫上述混合物。在優(yōu)選的實施方案中，該第一核酸分子是單鏈cDNA。根據(jù)本發(fā)明的此方面適于逆轉(zhuǎn)錄的核酸模板包括任何核酸分子或核酸分子群體(優(yōu)選為RNA，最優(yōu)選為mRNA)，尤其是得自細胞或組織的核酸分子或其群體。根據(jù)本發(fā)明，在優(yōu)選的方面，mRNA分子群體(一般為得自細胞或組織的大量不同的mRNA分子)被用于制備cDNA文庫。核酸模板的細胞來源優(yōu)選為細菌細胞，真菌細胞，植物細胞和動物細胞。
本發(fā)明也涉及制備一種或多種雙鏈核酸分子的方法，所述方法包括(a)將一種或多種核酸模板(優(yōu)選為RNA或mRNA，更優(yōu)選為mRNA模板群體)與兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽混合；(b)在足以制備與所述一種或多種模板之全部或部分互補的第一核酸分子的條件下，保溫上述混合物；和(c)在足以制備與第一核酸分子之全部或部分互補的第二核酸分子的條件下，保溫第一核酸分子，從而形成一個或多個含有第一和第二核酸分子的雙鏈核酸分子。這種方法將使用一種或多種DNA聚合酶作為制備該一種或多種雙鏈核酸分子之方法的一部分。本發(fā)明也涉及可用于制備這種雙鏈核酸分子的組合物，所述組合物含有兩種或多種逆轉(zhuǎn)錄酶，并任選含有一種或多種DNA聚合酶，還含有適當?shù)木彌_液和一種或多種核苷酸。
本發(fā)明還涉及擴增核酸分子的方法，所述擴增方法包括將如上述產(chǎn)生的雙鏈核酸分子與一種或多種DNA聚合酶混合，并在足以擴增該雙鏈核酸分子的條件下保溫混合物。在第一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及擴增核酸分子的方法，該方法包括(a)將一種或多種核酸模板(優(yōu)選為一種或多種RNA或mRNA模板，更優(yōu)選為mRNA模板群體)與兩個或多個具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的不同多肽，和一種或多種DNA聚合酶混合；和(b)在足以擴增與所述一種或多種模板之全部或部分互補的核酸分子的條件下，保溫混合物。優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性降低或大大降低，DNA聚合酶含有具有3’外切核酸酶活性的第一種DNA聚合酶和3’外切核酸酶活性大大降低的第二種DNA聚合酶。本發(fā)明還涉及含有兩種或多種逆轉(zhuǎn)錄酶和一種或多種DNA聚合酶的組合物，該組合物可用于擴增反應。該組合物中還可含有一種或多種核苷酸和適用于擴增的緩沖液。本發(fā)明的組合物也可含有一個或多個寡核苷酸引物。
根據(jù)本發(fā)明，可使用至少2種，至少3種，至少4種，至少5種，至少6種，或更多種逆轉(zhuǎn)錄酶。優(yōu)選在本發(fā)明的組合物和方法中使用2至6種，2至5種，2至4種，2至3種逆轉(zhuǎn)錄酶，最優(yōu)選使用2種逆轉(zhuǎn)錄酶。在本發(fā)明的組合物和方法中，可同時或以任何次序依次加入多種逆轉(zhuǎn)錄酶。或者，可分開進行使用不同酶的多個不同反應，再混合反應產(chǎn)物。因此，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的方法合成核酸分子，所述方法中同時或依次或分開使用多種逆轉(zhuǎn)錄酶。具體地說，本發(fā)明涉及制備一種或多種核酸分子的方法，所述方法包括在足以制備與所述一種或多種模板之全部或部分互補的一種或多種核酸分子的條件下，將所述一種或多種核酸模板(優(yōu)選為一種或多種RNA模板或mRNA模板，更優(yōu)選為mRNA模板群體)與第一種逆轉(zhuǎn)錄酶保溫。根據(jù)本發(fā)明，可在足以制備與模板之全部或部分互補的其它核酸分子或足以增加先前制備的核酸分子之長度的條件下，將一種或多種核酸分子(包括mRNA模板和/或合成的核酸分子)與第二種逆轉(zhuǎn)錄酶保溫。根據(jù)本發(fā)明，可以用本發(fā)明所述的相同或不同逆轉(zhuǎn)錄酶將此方法重復任意次。例如，第一種和第二種逆轉(zhuǎn)錄酶可以是相同的，或不同的。另外，第一種和第三種逆轉(zhuǎn)錄酶(在本發(fā)明的此方面，此時使用第一，第二和第三種逆轉(zhuǎn)錄酶將上述方法重復了3次)可以是相同的，而第二種逆轉(zhuǎn)錄酶可以與第一種和第三種逆轉(zhuǎn)錄酶不同。因此，在本發(fā)明的此方面，可聯(lián)合使用任何相同和/或不同的逆轉(zhuǎn)錄酶。當使用多種逆轉(zhuǎn)錄酶時，優(yōu)選至少兩種逆轉(zhuǎn)錄酶是不同的。
在本發(fā)明相關的方面，反應中所用的逆轉(zhuǎn)錄酶在隨后的反應步驟中可保留其全部或部分活性?；蛘?，在與其它逆轉(zhuǎn)錄酶一起保溫之前，可使用任何方法滅活反應中所用的逆轉(zhuǎn)錄酶。所述滅活包括但不限于熱滅活，有機抽提(如用苯酚和/或氯仿)，乙醇沉淀等。
通過同時或依次或分開加入逆轉(zhuǎn)錄酶制備的合成核酸分子可被用于制備雙鏈核酸分子。這種合成核酸分子可用作模板，當它在適當條件下(如優(yōu)選在一種或多種DNA聚合酶的存在下)保溫時可制備與合成核酸分子之全部或部分互補的核酸分子，從而形成大量雙鏈核酸分子，然后可根據(jù)本發(fā)明擴增雙鏈分子。
本發(fā)明還涉及根據(jù)上述方法產(chǎn)生的核酸分子(尤其是單鏈或雙鏈cDNA分子)或擴增的核酸分子，還涉及含有這些核酸分子或擴增的核酸分子的載體(尤其是表達載體)。
本發(fā)明還涉及含有上述核酸分子、擴增的核酸分子或載體的重組宿主細胞。優(yōu)選這種宿主細胞包括細菌細胞，酵母細胞，植物細胞和動物細胞(包括昆蟲細胞和哺乳動物細胞)。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)上述重組宿主細胞并分離多肽，本發(fā)明還涉及通過這種方法產(chǎn)生的多肽。
本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的組合物或酶測定一種或多種核酸分子的序列的方法，所述方法包括(a)將一種或多種待測序的核酸分子(如一種或多種RNA或DNA分子)與一個或多個引物，一種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽，一種或多種核苷酸和一種或多種終止試劑(如一個或多個雙脫氧核苷三磷酸)相混合；(b)在足以合成與所述一種或多種待測序之核酸分子的全部或部分互補的核酸分子群體的條件下保溫混合物；和(c)分離核酸分子群體以測定該一種或多種待測序之核酸分子的全部或部分核苷酸序列。在本發(fā)明的這些測序方法中，所述一種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽可被同時，依次或分開加入到上述反應混合物中。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明方法所用的試劑盒，可使用該試劑盒制備，測序或擴增核酸分子(單鏈或雙鏈)。本發(fā)明的試劑盒中含有載體，如盒或紙盒，密閉的載體中含有一個或多個容器，如小管，試管，瓶等。在本發(fā)明的試劑盒中，第一個容器中含有一種或多種逆轉(zhuǎn)錄酶(優(yōu)選為RNA酶H活性降低或大大降低的逆轉(zhuǎn)錄酶)或一種或多種本發(fā)明的組合物。另一方面，試劑盒可含有一個或多個容器，其中含有2或多種，3或多種，4或多種，5或多種，6或多種等逆轉(zhuǎn)錄酶，優(yōu)選一個或多個容器中含有2至6，2至5，2至4，2至3或更優(yōu)選2種逆轉(zhuǎn)錄酶。本發(fā)明的試劑盒也可在相同或不同容器中含有一種或多種DNA聚合酶(優(yōu)選為熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶)，核酸分析所用的適當緩沖液和一種或多種核苷酸。或者，組合物的組分可分開放在不同的容器中(如每個容器中放一種酶)。在本發(fā)明優(yōu)選的試劑盒中，逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性降低或大大降低，最優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄酶選自M-MLV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，RSV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，AMV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，RAV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，MAV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，和HIV H-逆轉(zhuǎn)錄酶。在本發(fā)明其它優(yōu)選的試劑盒中，容器中的酶(逆轉(zhuǎn)錄酶和/或DNA聚合酶)以工作濃度存在。
本發(fā)明也涉及產(chǎn)生RSV逆轉(zhuǎn)錄酶(和/或其亞單位)的方法。具體地說，本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有RNA酶H活性之RSV逆轉(zhuǎn)錄酶(和/或其亞單位)的方法。還涉及產(chǎn)生RNA酶H活性有所降低或大大降低的RSV逆轉(zhuǎn)錄酶(和/或其亞單位)的方法。還涉及由這些方法產(chǎn)生的RSV逆轉(zhuǎn)錄酶(和/或其亞單位)。
本發(fā)明還涉及使用這種逆轉(zhuǎn)錄酶的方法，并涉及含有這種逆轉(zhuǎn)錄酶的試劑盒。具體地說，在測序，擴增和(經(jīng)由例如逆轉(zhuǎn)錄)產(chǎn)生核酸分子的方法中可使用本發(fā)明的RSV逆轉(zhuǎn)錄酶(和/或其亞單位)。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(和/或其亞單位)的方法。具體地說，本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有RNA酶H活性之AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(和/或其亞單位)的方法。還涉及產(chǎn)生RNA酶H活性有所降低或大大降低的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(和/或其亞單位)的方法。還涉及由這些方法產(chǎn)生的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(和/或其亞單位)。
本發(fā)明還涉及使用這種逆轉(zhuǎn)錄酶的方法，并涉及含有這種逆轉(zhuǎn)錄酶的試劑盒。具體地說，在測序、擴增和(經(jīng)由例如逆轉(zhuǎn)錄)產(chǎn)生核酸分子的方法中可使用本發(fā)明的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(和/或其亞單位)。
本發(fā)明一般涉及產(chǎn)生ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶(和/或其亞單位)的方法。具體地說，本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有RNA酶H活性之ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶(和/或其亞單位)的方法。還涉及產(chǎn)生RNA酶H活性有所降低或大大降低的ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶(和/或其亞單位)的方法。還涉及由這些方法產(chǎn)生的ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶(和/或其亞單位)。
本發(fā)明還涉及使用這種逆轉(zhuǎn)錄酶的方法，并涉及含有這種逆轉(zhuǎn)錄酶的試劑盒。具體地說，在測序、擴增和(經(jīng)由例如逆轉(zhuǎn)錄)產(chǎn)生核酸分子的方法中可使用本發(fā)明的ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶(和/或其亞單位)。
本發(fā)明還涉及升溫或高溫逆轉(zhuǎn)錄核酸分子的方法，所述方法包括(a)將一種或多種核酸模板(優(yōu)選為一種或多種RNA分子(如一個或多個mRNA分子或polyA+RNA分子，更優(yōu)選為mRNA分子群體)或一個或多個DNA分子)與一種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽混合；和(b)在足以制備與所述一種或多種核酸模板之全部或部分互補的第一核酸分子(如全長cDNA分子)的條件下，于50℃或更高溫度下保溫混合物。在優(yōu)選的方面，于升高的溫度下或高溫下使用mRNA分子群體制備cDNA文庫。另一方面，用多種逆轉(zhuǎn)錄酶(即2或多種，3或多種，4或多種，5或多種，6或多種等，更優(yōu)選為2至6，2至5，2至4，2至3或更優(yōu)選2種逆轉(zhuǎn)錄酶)進行升溫或高溫下的核酸合成，可按上述將所述逆轉(zhuǎn)錄酶同時或依次或分開加入到反應混合物中。在優(yōu)選的此方法中，保溫混合物的溫度為約51℃或更高，約52℃或更高，約53℃或更高，約54℃或更高，約55℃或更高，約56℃或更高，約57℃或更高，約58℃或更高，約59℃或更高，約60℃或更高，約61℃或更高，約62℃或更高，約63℃或更高，約64℃或更高，約65℃或更高，約66℃或更高，約67℃或更高，約68℃或更高，約69℃或更高，約70℃或更高，約71℃或更高，約72℃或更高，約73℃或更高，約74℃或更高，約75℃或更高，約76℃或更高，約77℃或更高，約78℃或更高；或為以下溫度范圍約50℃至約75℃，約51℃至約75℃，約52℃至約75℃，約53℃至約75℃，約54℃至約75℃，約55℃至約75℃，約50℃至約70℃，約51℃至約70℃，約52℃至約70℃，約53℃至約70℃，約54℃至約70℃，約55℃至約70℃，約55℃至約65℃，約56℃至約65℃，約56℃至約64℃或約56℃至約62℃。本發(fā)明另外涉及的方法進一步包括在足以制備與第一核酸分子之全部或部分互補的第二核酸分子的條件下，保溫第一核酸分子。根據(jù)本發(fā)明，通過這些方法產(chǎn)生的第一和第二核酸分子可以是DNA分子，并可形成雙鏈DNA分子，該雙鏈DNA分子可以是全長的cDNA分子，如cDNA文庫。優(yōu)選地，這些方法中所用的一種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性之多肽的RNA酶H活性降低或大大降低，優(yōu)選所述多肽選自ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶(和/或其亞單位)，如AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的一個或多個亞單位和/或RSV逆轉(zhuǎn)錄酶的一個或多個亞單位和/或MAV逆轉(zhuǎn)錄酶的一個或多個亞單位，和/或RAV逆轉(zhuǎn)錄酶的一個或多個亞單位，尤其優(yōu)選所述亞單位的RNA酶H活性降低或大大降低。
本發(fā)明還涉及升溫或高溫下合成核酸的試劑盒，其中含有一種或多種選自下列的組分一種或多種逆轉(zhuǎn)錄酶(優(yōu)選為一種或多種ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV或RSV逆轉(zhuǎn)錄酶(或其一個或多個亞單位)，更優(yōu)選為一種或多種RNA酶H活性降低或大大降低了的AMV或RSV逆轉(zhuǎn)錄酶(或其一個或多個亞單位)，一種或多種核苷酸，一個或多個引物和一種或多種適當?shù)木彌_液。
本發(fā)明還涉及由上述方法產(chǎn)生的核酸分子，它們可以是全長的cDNA分子，還涉及含有這些核酸分子的載體(尤其是表達載體)，并涉及含有這些載體和核酸分子的宿主細胞。
本領域技術人員參照下列附圖、發(fā)明描述和權利要求書中所述的內(nèi)容，會很明了本發(fā)明其它優(yōu)選的實施方案。
圖的簡述

圖1-6以圖的形式(為了簡明起見省略了細微處)描述了表達載體(pDABH-His)的構(gòu)建，該載體將RSV RT α和β基因置于昆蟲病毒啟動子的控制之下圖1pJD100，pAMP18，pAMP18N，pAMP1，pAMP1C，pAMP18NM和pAMP18B。
圖2M13，M13RT，pAMP18BH-和M13RTH-。
圖3pAMP1A。
圖4pDBH-Kpn，pDABH-，pDBH-KpnHis。
圖5pFastBacDUAL，pFastBacDUAL Nde，pDBH-和pDA。
圖6pDABH-His。
圖7-21是圖1-6所述質(zhì)粒更詳細的圖譜圖7pJD100。
圖8pAMP18N。
圖9pAMP1C。
圖10pAMP18NM。
圖11pAMP18B。
圖12M13RT。
圖13M13RTH-。
圖14pAMP18BH-。
圖15pDBH-。
圖16pAMP1A。
圖17pDBH-Kpn。
圖18pDBH-KpnHis。
圖19pDA。
圖20pDABH-。
圖21pDABH-His。
圖22-25以圖的形式(為了簡明起見省略了細微處)描述了表達載體(pDAMVAH-BH-)的構(gòu)建，該載體將AMV RT α和β基因置于昆蟲病毒啟動子的控制之下圖22由RNA克隆AMV RT基因；pSPORT8。
圖23構(gòu)建His標記的AMV RT β基因；pAMVN，pAMVNM，pAMVNMH-，pAMVC和pAMVBH-。
圖24通過PCR構(gòu)建AMV RT α亞單位的克隆；pAMVA和pAMVAH-。
圖25構(gòu)建含有AMV RT α和β基因的載體；pD，pDAMVAH-，pDAMVA，pAMVH-BH-，pDAMVABH-和pJAMVBH-。
圖26-38是圖22-25所述質(zhì)粒的更詳細圖譜圖26pAMVN。
圖27pAMVC。
圖28pAMVNM。
圖29pAMVNMH-。
圖30pAMVBH-。
圖31pAMVA。
圖32pAMVAH-。
圖33pFastBacDual(pD)。
圖34pDAMVA。
圖35pDAMVAH-。
圖36pDAMVABH-。
圖37pJAMVBH-。
圖38pDAMVAH-BH-。
圖39是闡明在所示溫度下保溫所示時間的多種RT之RT活性的半對數(shù)圖。
圖40是在所示溫度(℃)下，在50分鐘的反應時間內(nèi)，通過多種RT由1.4-，2.4-，4.4-和7.5-kb mRNA合成的cDNA產(chǎn)物的放射自顯影圖。M32P標記的1Kb DNA梯度標志。
圖41是在所示溫度(℃)下，在30分鐘的反應時間內(nèi)，通過RSV H-RT和SS II RT由1.4-，2.4-，4.4-和7.5-kb mRNA合成的cDNA產(chǎn)物的放射自顯影圖。M32P標記的1Kb DNA梯度標志。
圖42是圖41中通過SS II和RSV H-RT合成的全長cDNA的量作為保溫溫度之函數(shù)的圖。
圖43是質(zhì)粒pBP-RT(PCR)的限制性圖譜。
圖44是質(zhì)粒pBP-RT(ATG)的限制性圖譜。
圖45是質(zhì)粒pBK-RT15(ATG)的限制性圖譜。
圖46是質(zhì)粒pFBBH-His的限制性圖譜。
圖47是質(zhì)粒pJB-His的限制性圖譜。
圖48是質(zhì)粒pJBD110E-His的限制性圖譜。
圖49是質(zhì)粒pDAD110E的限制性圖譜。
圖50是質(zhì)粒pFBBD110E-His的限制性圖譜。
圖51是質(zhì)粒pDABHis的限制性圖譜。
圖52是質(zhì)粒pDABD110EHis的限制性圖譜。
圖53是質(zhì)粒pDAD110EBHis的限制性圖譜。
圖54是質(zhì)粒pDAD110EB110E的限制性圖譜。
發(fā)明詳述概論本發(fā)明提供了可用于克服核酸分子逆轉(zhuǎn)錄過程中經(jīng)常觀察到的長度限制的組合物和方法。因此，本發(fā)明便于產(chǎn)生以前不可能產(chǎn)生的全長cDNA分子。
一般地說，本發(fā)明提供了可用于逆轉(zhuǎn)錄核酸分子的組合物，其含有2或多種，3或多種，4或多種，5或多種，6或多種等具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的不同的多肽。本發(fā)明的組合物優(yōu)選含有2至6，2至5，2至4，2至3種，更優(yōu)選含有2種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽。這些組合物中的酶優(yōu)選以工作濃度存在，并且其RNA酶H活性降低或大大降低，但本發(fā)明組合物中也可使用這樣的酶混合物，其中的一些酶具有RNA酶H活性，一些酶的RNA酶H活性降低或大大降低?；蛘?，本發(fā)明組合物中所用的逆轉(zhuǎn)錄酶可具有RNA酶H的活性。優(yōu)選的逆轉(zhuǎn)錄酶包括M-MLV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，RSV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，AMV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，RAV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，MAV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，和HIV H-逆轉(zhuǎn)錄酶或其它ASLV H-逆轉(zhuǎn)錄酶。
本發(fā)明還涉及逆轉(zhuǎn)錄一種或多種核酸分子的方法，所述方法包括將一種或多種核酸模板，優(yōu)選為RNA或信使RNA(mRNA)，更優(yōu)選為mRNA分子群體，與兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽(或與本發(fā)明的組合物)混合；并在足以制備與所述一種或多種模板之全部或部分互補的核酸分子的條件下保溫混合物?？赏ㄟ^依次或同時或分開加入多種逆轉(zhuǎn)錄酶完成上述核酸合成。優(yōu)選使用2或多種，3或多種，4或多種，5或多種，6或多種等逆轉(zhuǎn)錄酶，或使用2至6，2至5，2至4，2至3種，更優(yōu)選使用2種逆轉(zhuǎn)錄酶。為了制備與所述一種或多種模板互補的核酸分子，使用一種引物(如oligo(dT)引物)和一種或多種核苷酸以3’至5’的方向合成核酸。根據(jù)本發(fā)明的此方面，適用于逆轉(zhuǎn)錄的核酸分子包括任何核酸分子，特別是那些得自原核或真核細胞的核酸分子。所述細胞包括正常細胞，患病細胞，轉(zhuǎn)化細胞，建系細胞，祖細胞，前體細胞，胎兒細胞，胚胎細胞，細菌細胞，酵母細胞，動物細胞(包括人細胞)，禽細胞，植物細胞等，或分離自植物或動物(如人，牛，豬，小鼠，綿羊，馬，猴，狗，貓，大鼠，兔，鳥，魚，昆蟲等)的組織。這種核酸分子也可以分離自病毒。
本發(fā)明還提供了擴增或測序核酸分子的方法，所述方法包括將核酸分子與兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽(或與本發(fā)明的組合物)接觸。通過在反應混合物中依次或同時或分開加入兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽可完成此反應。優(yōu)選此方法包括一個或多個聚合酶鏈反應(PCR)。
本發(fā)明還提供了根據(jù)上述方法產(chǎn)生的cDNA分子或擴增的核酸分子，含有這些cDNA分子或擴增的核酸分子的載體(尤其是表達載體)，含有所述cDNA分子、擴增的核酸分子或載體的重組宿主細胞。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)上述重組宿主細胞并分離多肽，本發(fā)明還提供了由這種方法產(chǎn)生的多肽。
本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明的試劑盒，該試劑盒中含有載體，如盒或紙盒，在密閉的載體中含有一個或多個容器，如小管，試管，瓶等，其中試劑盒也可在相同或不同容器中含有兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽。本發(fā)明的試劑盒也可在相同或不同容器中含有一種或多種DNA聚合酶、適當緩沖液和/或一種或多種核苷酸(如脫氧核苷三磷酸(dNTP))。
本發(fā)明還涉及基本上純化的RSV逆轉(zhuǎn)錄酶(RSV RT)，其RNA酶H活性可以降低也可以不降低。這種RSV RT可含有一個或多個亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)，所述亞單位選自一個或多個α亞單位，一個或多個β亞單位和一個或多個βp4亞單位，其中的任何一個或全部亞單位的RNA酶H活性可以降低或大大降低，也可以不降低或基本上不降低。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，RSV RT可含有RNA酶H活性降低或大大降低的α亞單位和具有RNA酶H活性的β亞單位(即RSV αH-βH+RT)。在此實施方案的優(yōu)選方面，已對編碼α亞單位的基因進行了修飾或突變以降低RNA酶H活性，而未以此方式突變或修飾編碼β亞單位的基因。優(yōu)選在α亞單位的RNA酶H結(jié)構(gòu)域中進行這種突變或修飾。出乎意料的是，此構(gòu)建體的表型顯示出大大降低(即相對于野生型而言為5％)的RNA酶H活性。在另一個優(yōu)選的方面，RSV RT可含有RNA酶H活性也降低或大大降低的α亞單位和RNA酶H活性降低或大大降低的β亞單位(即RSV αH-/βH-RT)。在另一個優(yōu)選的方面，RSV RT可含有兩個β亞單位，其中的任一個或兩個的RNA酶H活性可以降低或大大降低，也可以不降低或基本上不降低(即RSV βH-/βH-RT；RSV βH-/βH+RT；或RSV βH+/βH+RT)。另一優(yōu)選的方面，RSV RT可含有單個α亞單位，其RNA酶H活性可以降低或大大降低，也可以不降低或基本上不降低(即RSV αH-RT或RSV αH+RT)。另一優(yōu)選的方面，RSV RT可含有一個或多個βp4亞單位，其中的任一個或所有亞單位的RNA酶H活性可以降低或大大降低，也可以不降低或基本上不降低(如RSV βp4H/βp4H-RT；RSV βp4H-/βp4H+RT；RSV βp4H+/βp4H+RT；RSV αH-/βp4H+RT；RSV αH+/βp4H+RT；RSV αH-/βp4H-RT；RSV αH+/βp4H-RT；RSV βH-/βp4H+RT；RSV βH-/βp4H-RT；RSV βH+/βp4H-RT；RSV βH+/βp4H+RT等)。應理解，本發(fā)明也可以使用上述任一或所有亞單位的衍生物，變體，片段或突變體。
在本發(fā)明相關的方面，若RSV RT含有兩個或多個亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)，優(yōu)選含有兩個亞單位(如二聚體)，則其中至少一個，但優(yōu)選不是所有亞單位可被修飾或突變以降低、大大降低或消除至少一個亞單位的聚合酶活性(如pol-)。在優(yōu)選的方面，對含有α和β亞單位的RSV RT而言，β亞單位經(jīng)修飾或突變(優(yōu)選通過重組技術)而降低、大大降低或消除了聚合酶活性，而未對α亞單位的聚合酶活性進行這種形式的突變或修飾。優(yōu)選此RSV RT的α亞單位經(jīng)修飾或突變而降低或大大降低了RNA酶H活性，而未對β亞單位進行這種形式的突變或修飾。將此構(gòu)建體稱為αH-/βH+pol-?？芍苽淙魏螖?shù)目亞單位的組合，其中對兩個亞單位酶中的一個亞單位進行了突變或修飾，這些構(gòu)建體可與例如降低或大大降低了RNA酶H活性的其它修飾或突變聯(lián)合。例子包括但不限于RSV αH-/βH-pol-；RSV αH+/βH+pol-；RSV αH-pol-/βH+；RSV αH-pol-/βH-；RSV αH+pol-/βH+；RSV βH-/βH-pol-；RSV βH-/βH+pol-；RSV βH+/βH+pol-；RSV βp4H-/βp4H-pol-；RSVβp4H-/βp4H+pol-；RSV βp4H+/βp4H+pol-；RSV αH-/βp4H-pol-；RSVαH+/βp4H+pol-；RSV αH+/βp4H-pol-；RSV βH-/βp4H+pol-；RSV βH-/βp4H+pol-；RSV βH+/βp4H-pol-等。在優(yōu)選的方面，經(jīng)重組技術修飾或突變(一個或多個點突變，缺失突變和/或插入突變)了亞單位的聚合酶結(jié)構(gòu)域。另一方面，修飾或突變了聚合酶結(jié)構(gòu)域的核苷酸結(jié)合位點。在優(yōu)選的方面，核苷酸結(jié)合位點內(nèi)的一個或多個酸性氨基酸被不同的氨基酸取代。核苷酸結(jié)合位點內(nèi)供突變或修飾的特別優(yōu)選的氨基酸包括但不限于Asp107，Leu108，Lys109和Asp110或相應的氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明RSV RT的方法，所述方法包括得到宿主細胞，該細胞中含有編碼一個或多個α亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)的核酸序列和/或編碼一個或多個β亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)的核酸序列和/或編碼一個或多個βp4亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)的核酸序列，并在足以產(chǎn)生本發(fā)明的RSV RT的條件下培養(yǎng)宿主細胞。編碼這樣的α亞單位和/或β亞單位和/或βp4亞單位的核酸序列可包含在相同或不同的載體中。根據(jù)本發(fā)明，可分開產(chǎn)生這樣的α亞單位和/或β亞單位和/或βp4亞單位，并在分離各亞單位之前或之后將它們混合以形成本發(fā)明的RSV RT?；蛘?，可在同一宿主細胞中同時表達(即共表達)上述α和/或β亞單位和/或βp4亞單位，從而產(chǎn)生含有α和β亞單位，僅含α亞單位，僅含β亞單位，僅含βp4亞單位，含有β亞單位和βp4亞單位，含有兩個β亞單位或兩個βp4亞單位，或其衍生物、變體、片段或突變體的RSV RT。在優(yōu)選的方面，在宿主細胞中同時表達α亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)和β亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)。在本發(fā)明相關的方面，β或βp4亞單位(或其衍生物，片段或突變體)可在宿主或宿主細胞中表達，所述宿主或宿主細胞在體內(nèi)完成一些或全部β或βp4亞單位的加工以形成相應的α亞單位。β和α亞單位的同時存在允許體內(nèi)形成含有α和β亞單位的RSV RT。優(yōu)選通過在宿主細胞中表達β和/或βp4亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)來完成上述體內(nèi)加工，所述宿主細胞可以是原核或真核細胞，它們具有適當?shù)募庸っ富虻鞍踪|(zhì)可裂解β或βp4亞單位以形成相應的α亞單位。通過重組方法可將這種加工酶或蛋白質(zhì)導入宿主系統(tǒng)中并在其中表達，它們也可以天然存在于宿主系統(tǒng)中。用于體內(nèi)加工的優(yōu)選宿主包括真核細胞或細胞器，如酵母，真菌，植物，動物，昆蟲，魚等。可克隆β或βp4亞單位(或其衍生物，片段或突變體)以進行體內(nèi)加工的重組系統(tǒng)(載體，表達載體，啟動子等)是本領域技術人員熟知的。如上所述，通過這些重組技術產(chǎn)生的RSV RT的任何或所有α和/或β和/或βp4亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)的RNA酶H活性可能已降低或大大降低了。
然后可從宿主細胞中分離這些RSV RT或其亞單位，并通過本領域技術人員熟知的任何蛋白質(zhì)純化方法(如層析，電泳，透析，高鹽沉淀或其組合)基本上純化之。本發(fā)明還涉及含有一種或多種本發(fā)明RSV RT的試劑盒。
本發(fā)明還涉及基本上純的禽成髓細胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV RT)，其RNA酶H活性可以降低或大大降低，也可以不降低或基本上不降低。這種AMV RT可含有一個或多個亞單位，所述亞單位選自一個或多個α亞單位，一個或多個β亞單位和一個或多個βp4亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)，其中的任一個或全部亞單位的RNA酶H活性可以降低或大大降低，也可以不降低或基本上不降低。在本發(fā)明一個優(yōu)選的方面，AMV RT可含有RNA酶H活性降低或大大降低的α亞單位，和具有RNA酶H活性的β亞單位(即AMV αH-/βH+RT)。在此實施方案特別優(yōu)選的方面，編碼α亞單位的基因已經(jīng)修飾或突變而降低了RNA酶活性(優(yōu)選在RNA酶H結(jié)構(gòu)域內(nèi))，而編碼β亞單位的基因未經(jīng)修飾或突變以影響RNA酶H活性。出乎意料的是，此構(gòu)建體顯現(xiàn)的表型中含有α亞單位和β亞單位之AMV RT的RNA酶H活性大大降低(即約為野生型的5％)。在另一個優(yōu)選的方面，AMV RT可含有RNA酶H活性也降低或大大降低的α亞單位和RNA酶H活性降低或大大降低的β亞單位(即AMVαH-/βH-RT)。在另一個優(yōu)選的方面，AMV RT可含有兩個β亞單位，其中之一或兩者的RNA酶H活性可降低或大大降低，也可不降低或基本上不降低(即AMV βH-/βH-RT；AMV βH-/βH+RT；或AMV βH+/βH+RT)。在另一個優(yōu)選的方面，AMV RT可含有單個α亞單位，其RNA酶H活性可降低或大大降低，也可不降低或基本上不降低(即AMV αH-RT或AMVαH+RT)。在另一個優(yōu)選的方面，AMV RT可含有一個或多個βp4亞單位，其中之一或兩者的RNA酶H活性可以降低或大大降低，也可以不降低或基本上不降低(如AMV βp4H-/βp4H-RT；AMV βp4H-/βp4H+RT；AMVβp4H+/βp4H+RT；AMV αH-/βp4H+RT；AMV αH-/βp4H-RT；AMV αH+/βp4H-RT；AMV βH-/βp4H-RT；AMV βH+/βp4H-RT等)。
在本發(fā)明相關的方面，AMV RT含有兩個或多個亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)，優(yōu)選含有兩個亞單位(如二聚體)，其中可以有至少一個、但優(yōu)選不是所有亞單位被修飾或突變以降低、大大降低或消除至少一個亞單位的聚合酶活性(如pol-)。在優(yōu)選的方面，對含有α和β亞單位的AMV RT而言，β亞單位已經(jīng)修飾或突變(優(yōu)選通過重組技術)而降低、大大降低或消除了聚合酶活性，而未對α亞單位的聚合酶活性進行這種形式的突變或修飾。優(yōu)選此AMV RT的α亞單位也已經(jīng)修飾或突變而降低或大大降低了RNA酶H活性，而未對β亞單位進行這種形式的突變或修飾。將此構(gòu)建體稱為αH-/βH+pol-?？芍苽淙魏螖?shù)目亞單位的組合，其中兩亞單位酶中的一個亞單位具有突變或修飾，這些構(gòu)建體可與例如降低或大大降低RNA酶H活性的其它修飾或突變聯(lián)合。例子包括但不限于AMV αH-/βH-pol-；AMV αH+/βH+pol-；AMV αH-pol-/βH+；AMV αH-pol-/βH-；AMV αH+pol/βH+；AMV βH-/βH-pol-；AMV βH-/βH+pol-；AMV βH+/βH+pol-；AMV βp4H-/βp4H-pol-；AMVβp4H-/βp4H+pol-；AMV βp4H+/βp4H+pol-；AMV αH-/βp4H-pol-；AMVαH+/βp4H+pol-；AMV αH+/βp4H-pol-；AMV αH-/βp4H+pol-；AMV βH-/βp4H+pol-；AMV βH+/βp4H-pol-等。在優(yōu)選的方面，經(jīng)重組技術修飾或突變(一個或多個點突變，缺失突變和/或插入突變)了亞單位的聚合酶結(jié)構(gòu)域。另一方面，修飾或突變了聚合酶結(jié)構(gòu)域的核苷酸結(jié)合位點。在優(yōu)選的方面，核苷酸結(jié)合位點內(nèi)的一個或多個酸性氨基酸被不同的氨基酸取代。核苷酸結(jié)合位點內(nèi)供突變或修飾的特別優(yōu)選的氨基酸包括但不限于Asp107，Leu108，Lys109和Asp110或相應的氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明AMV RT的方法，所述方法包括得到宿主細胞，該細胞中含有編碼一個或多個α亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)的核酸序列和/或編碼一個或多個β亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)的核酸序列和/或編碼一個或多個βp4亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)的核酸序列，并在足以產(chǎn)生AMV RT的條件下培養(yǎng)宿主細胞。編碼上述α亞單位和/或β亞單位和/或βp4亞單位的核酸序列可包含在相同載體或不同的載體中。根據(jù)本發(fā)明，可分開產(chǎn)生上述α亞單位和/或β亞單位和/或βp4亞單位，并在分離各亞單位之前或之后將它們混合以形成本發(fā)明的AMV RT?；蛘撸稍谕凰拗骷毎型瑫r表達(即共表達)上述α和/或β亞單位和/或βp4亞單位，從而產(chǎn)生含有α和β亞單位，僅含α亞單位，僅含β亞單位，僅含βp4亞單位，含有β亞單位和βp4亞單位，含有兩個β亞單位或兩個βp4亞單位，或其衍生物、變體、片段或突變體的AMV RT。在優(yōu)選的方面，宿主細胞中同時表達了α亞單位和β亞單位。在本發(fā)明相關的方面，β或βp4亞單位(或其衍生物，片段或突變體)可在宿主或宿主細胞中表達，所述宿主或宿主細胞可在體內(nèi)完成上述加工以形成RSV RT。因此，通過在具有適當加工酶或蛋白質(zhì)的宿主系統(tǒng)中表達β和/或βp4亞單位(或其衍生物，片段或突變體)，可產(chǎn)生相應的α亞單位，以形成含有α和β亞單位，α和βp4亞單位等的AMV RT。如上所述，AMV RT的任何或所有α和/或β和/或βp4亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)的RNA酶H活性可能有所降低或大大降低。然后可從宿主細胞中分離這些AMV RT或其亞單位，再通過上述純化RSV RT的方法基本上純化之。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的一種或多種AMV RT的試劑盒。
本發(fā)明還涉及其它基本上純的ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶，其RNA酶H活性可降低或大大降低，也可不降低或基本上不降低。這種ASLV RT可含有一個或多個亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)，與上述RSV RT和AMV RT相同，所述亞單位選自一個或多個α亞單位，一個或多個β亞單位和一個或多個βp4亞單位。與上述RSV RT和AMV RT相同，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明之ASLV RT的方法。
本發(fā)明還涉及具有功能活性的RSV逆轉(zhuǎn)錄酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶或其它ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶及其亞單位(及其衍生物，變體，片段和突變體)，這種活性通過諸蛋白質(zhì)由mRNA模板產(chǎn)生第一條cDNA鏈的能力即可測定出。根據(jù)本發(fā)明，基于合成反應過程中制備的總的全長逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可測定出上述功能活性。優(yōu)選基于所產(chǎn)生產(chǎn)物的質(zhì)量(如納克)測定產(chǎn)物的量，但其它測定產(chǎn)物量的方法也是本領域技術人員熟知的。另外，功能活性可測定為cDNA合成反應過程中產(chǎn)生的全長產(chǎn)物的百分比。例如，通過用全長產(chǎn)物的量除以cDNA合成反應過程中產(chǎn)生的總產(chǎn)物的量，再將結(jié)果乘以100即得到百分比，從而測定出全長功能活性百分比。本發(fā)明的RSV和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶及其亞單位(及其衍生物，變體，片段和突變體)在核酸合成反應中產(chǎn)生的全長cDNA約大于4％，優(yōu)選約大于5％，更優(yōu)選約大于7.5％，更優(yōu)選約大于10％，更優(yōu)選約大于20％，最優(yōu)選約大于25％。上述百分比的優(yōu)選范圍包括約5％至約100％，約7.5％至約75％，約7.5％至約50％，約10％至約50％，約15％至約40％，約20％至約40％，和約20％至約50％。根據(jù)本發(fā)明，也可通過測定合成反應過程中總cDNA產(chǎn)物相對于mRNA投入量的百分比來測定功能活性。因此，用cDNA產(chǎn)物總量除以mRNA投入量，再將結(jié)果乘以100即測定出功能活性的百分比，該百分比與相對于所用模板量所產(chǎn)生的產(chǎn)物量相關。優(yōu)選本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶在cDNA合成反應過程中相對于投入的mRNA產(chǎn)生了約大于15％的cDNA，更優(yōu)選約大于20％，更優(yōu)選約大于25％，更優(yōu)選約大于30％，最優(yōu)選約大于40％的cDNA。上述百分比的優(yōu)選范圍包括約5％至約100％，約10％至約80％，約15％至約80％，約15％至約75％，約20％至約75％，約20％至約70％，約25％至約75％，約25％至約70％，約25％至約60％和約25％至約50％。優(yōu)選本發(fā)明的AMV和RSV逆轉(zhuǎn)錄酶及其亞單位(及其衍生物，變體，片段和突變體)具有的比活性約大于5個單位/mg，更優(yōu)選約大于50個單位/mg，更優(yōu)選約大于100個單位/mg，250個單位/mg，500個單位/mg，1000個單位/mg，5000個單位/mg或10,000個單位/mg，最優(yōu)選大于約15,000個單位/mg，大于約16,000個單位/mg，大于約17,000個單位/mg，大于約18,000個單位/mg，大于約19,000個單位/mg和大于約20，000個單位/mg。本發(fā)明的AMV和RSV逆轉(zhuǎn)錄酶及其亞單位(及其衍生物，變體，片段和突變體)的優(yōu)選比活范圍包括約5個單位/mg至約140,000個單位/mg的比活，約5個單位/mg至約125,000個單位/mg的比活，約50個單位/mg至約100,000個單位/mg的比活，約100個單位/mg至約100,000個單位/mg的比活，約250個單位/mg至約100,000個單位/mg的比活，約500個單位/mg至約100,000個單位/mg的比活，約1000個單位/mg至約100,000個單位/mg的比活，約5000個單位/mg至約100,000個單位/mg的比活，約10,000個單位/mg至約100,000個單位/mg的比活，約25,000個單位/mg至約75,000個單位/mg的比活。其它優(yōu)選的比活范圍包括約20,000個單位/mg至約140,000個單位/mg的比活，約20,000個單位/mg至約130,000個單位/mg的比活，約20,000個單位/mg至約120,000個單位/mg的比活，約20,000個單位/mg至約110,000個單位/mg的比活，約20,000個單位/mg至約100,000個單位/mg的比活，約20,000個單位/mg至約90,000個單位/mg的比活，約25,000個單位/mg至約140,000個單位/mg的比活，約25,000個單位/mg至約130,000個單位/mg的比活，約25,000個單位/mg至約120,000個單位/mg的比活，約25,000個單位/mg至約110,000個單位/mg的比活，約25,000個單位/mg至約100,000個單位/mg的比活，約25,000個單位/mg至約90,000個單位/mg的比活。優(yōu)選比活范圍的低端值為30,000，35,000，40,000，45,000，50,000，55,000，60,000，65,000，70,000，75,000和80,000個單位/mg，而比活范圍的高端值為150,000，140,000，130,000，120,000，110,000，100,000和90,000個單位/mg。根據(jù)本發(fā)明，比活是蛋白質(zhì)或酶相對于反應所用蛋白質(zhì)或酶之總量的酶活性(以單位計)測定結(jié)果。通過本領域技術人員熟知的標準技術可測定比活。下列實施例中詳細描述了測定酶或蛋白質(zhì)之比活的優(yōu)選實驗。
可使用本發(fā)明的RSV RT和AMV RT或其它ASLV RT及其亞單位(及其衍生物，變體，片段或突變體)，由一種或多種模板制備核酸分子。所述方法包括將一種或多種核酸模板(如mRNA，更優(yōu)選為mRNA分子群體)與本發(fā)明的一種或多種RSV RT和/或一種或多種AMV RT和/或其它ASLV RT混合，并在足以制備與所述一種或多種核酸模板之全部或部分互補的一種或多種核酸分子的條件下保溫混合物。
本發(fā)明還涉及擴增一種或多種核酸分子的方法，所述方法包括將一種或多種核酸模板與本發(fā)明的一種或多種RSV RT和/或一種或多種AMV RT和/或其它ASLV RT和任選與一種或多種DNA聚合酶混合，并在足以擴增與所述一種或多種核酸模板之全部或部分互補的一種或多種核酸分子的條件下保溫混合物。
本發(fā)明還涉及測序一種或多種核酸分子的方法，所述方法包括(a)將一種或多種待測序的核酸分子與一個或多個引物核酸分子、本發(fā)明的一種或多種RSV RT和/或一種或多種AMV RT和/或其它ASLV RT、一種或多種核苷酸和一種或多種終止試劑混合；(b)在足以合成與所述一種或多種待測序的核酸分子之全部或部分互補的核酸分子群體的條件下保溫混合物；和(c)分離核酸分子群體以測定該一種或多種待測序之核酸分子的全部或部分的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及升溫或高溫逆轉(zhuǎn)錄核酸分子的方法，所述方法包括(a)將核酸模板(優(yōu)選為RNA(如mRNA分子或polyA+RNA分子)或DNA分子)與一種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽混合；和(b)在足以制備與所述核酸模板之全部或部分互補的第一核酸分子(如全長cDNA分子)的條件下，于50℃或更高溫度下保溫混合物。在優(yōu)選的此方法中，保溫混合物的溫度為約51℃或更高，約52℃或更高，約53℃或更高，約54℃或更高，約55℃或更高，約56℃或更高，約57℃或更高，約58℃或更高，約59℃或更高，約60℃或更高，約61℃或更高，約62℃或更高，或為以下溫度范圍約50℃至約70℃，約51℃至約70℃，約52℃至約70℃，約53℃至約70℃，約54℃至約70℃，約55℃至約70℃，約55℃至約65℃，約56℃至約65℃，約56℃至約64℃或約56℃至約62℃。本發(fā)明另外涉及這樣的方法，其中進一步包括在足以制備與第一核酸分子之全部或部分互補的第二核酸分子的條件下，保溫第一核酸分子。根據(jù)本發(fā)明，通過這些方法產(chǎn)生的第一和第二核酸分子可以是DNA分子，并可形成雙鏈DNA分子，該雙鏈DNA分子可以是全長的cDNA分子。優(yōu)選地，這些方法中所用的一種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性之多肽的RNA酶H活性可能有所降低或大大降低，優(yōu)選所述多肽選自AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的一個或多個亞單位和RSV逆轉(zhuǎn)錄酶的一個或多個亞單位和其它ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶的一個或多個亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)。如上所述，AMV RT或RSV RT或其它ASLV RT可包括一個或多個α亞單位，一個或多個β亞單位和/或一個或多個βp4亞單位，其中的任一個或全部亞單位的RNA酶H活性降低或大大降低。特別優(yōu)選用于這些方法中的具有RT活性的聚合酶是上述RSV RT和AMVRT或其它ASLV RT及其亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)。
本發(fā)明還涉及由上述方法產(chǎn)生的核酸分子(可以是全長cDNA分子)，含有這些核酸分子的載體(尤其是表達載體)，和含有這些載體和核酸分子的宿主細胞。酶的來源可用于本發(fā)明組合物、方法和試劑盒的酶包括任何具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶。所述酶包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶，乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，花椰菜花葉病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，細菌逆轉(zhuǎn)錄酶，Tth DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶(Saiki，R.K.等，科學，239487-491(1988)；美國專利4,889,818和4,965,188)，Tne DNA聚合酶(WO 96/10640)，Tma DNA聚合酶(美國專利5,374,553)及其突變體，片段，變體或衍生物(例見1996年9月9日提交的共同擁有的待審美國專利申請08/706,702和08/706,706，其全文列入本文作為參考)。本領域技術人員應懂得通過本領域常規(guī)的和眾所周知的重組或基因工程技術可得到經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶。例如，通過使用定點或隨機誘變使編碼所需逆轉(zhuǎn)錄酶的一個或多個基因發(fā)生突變，可得到突變的逆轉(zhuǎn)錄酶。所述突變包括點突變，缺失突變和插入突變。優(yōu)選使用一個或多個點突變(如用一個或多個不同的氨基酸取代一個或多個氨基酸)構(gòu)建本發(fā)明突變的逆轉(zhuǎn)錄酶。通過本領域常規(guī)的和眾所周知的重組技術進行缺失突變，或通過使用多種眾所周知的蛋白酶中的任一種酶解消化所需的逆轉(zhuǎn)錄酶，可得到逆轉(zhuǎn)錄酶片段。
優(yōu)選用于本發(fā)明的酶包括RNA酶H活性降低或大大降低的酶。通過突變所需逆轉(zhuǎn)錄酶內(nèi)的RNA酶H結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選如上所述通過一個或多個點突變、一個或多個缺失突變和/或一個或多個插入突變，可得到RNA酶H活性降低或大大降低的酶?！癛NA酶H活性大大降低”的酶指的是所述酶的RNA酶H活性只占相應野生型或RNA酶H+酶[如野生型Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)，禽成髓細胞瘤病毒(AMV)或Rous肉瘤病毒(RSV)逆轉(zhuǎn)錄酶]之RNA酶H活性的約30％以下，約25％、20％以下，更優(yōu)選約15％以下，約10％以下，約7.5％以下，或約5％以下，和最優(yōu)選約5％以下或約2％以下。通過多種檢測法可測定任何酶的RNA酶H活性，所述方法例見美國專利5,244,797，Kotewicz，M.L.等，核酸研究，16265(1988)，Gerard，G.F，等，F(xiàn)OCUS 14(5)91(1992)和美國專利5,668,005(皆全文列入本文作為參考)中所述。
特別優(yōu)選用于本發(fā)明的酶包括但不限于M-MLV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，RSV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，AMV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，RAV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，MAV H-逆轉(zhuǎn)錄酶和HIV H逆轉(zhuǎn)錄酶。然而，本領域技術人員應理解本發(fā)明的組合物、方法和試劑盒中同樣可以使用任何能由核糖核酸分子產(chǎn)生DNA分子(即具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性)、且其RNA酶H活性大大降低的酶。
針對模板核酸的不同，本發(fā)明所用的酶可具有不同的逆轉(zhuǎn)錄停頓位點。通過多種檢測法，包括例如電泳分析由兩種酶產(chǎn)生的DNA分子的鏈長度(Weaver，D.T和DePamphilis，M.L.，生物化學雜志，257(4)2075-2086(1982)；Abbots，J等，生物化學雜志，268(14)10312-10323(1993))，或通過本領域技術人員熟知的其它檢測法，可測定兩種酶是否具有不同的逆轉(zhuǎn)錄停頓位點。如上所述，這些不同的轉(zhuǎn)錄終止位點可能代表了核酸模板中的二級結(jié)構(gòu)和序列屏障，所述屏障常出現(xiàn)在一段同聚體序列中。因此，第二種酶可逆轉(zhuǎn)錄至模板核酸上的某位點(如發(fā)夾序列)，該位點處于第一種酶逆轉(zhuǎn)錄模板核酸所至位點的近端或遠端(即位于其3’或5’端)。具有不同逆轉(zhuǎn)錄停頓位點的兩種或多種酶的組合便于產(chǎn)生全長的cDNA分子，因為二級結(jié)構(gòu)和序列屏障可被克服。另外，本發(fā)明的升溫或高溫逆轉(zhuǎn)錄也可能有助于克服核酸合成過程中的二級結(jié)構(gòu)和序列屏障，因此，升溫或高溫合成可與兩種或多種逆轉(zhuǎn)錄酶聯(lián)合使用(優(yōu)選使用AMV RT，RSV RT或其它ASLVRT)，以便于全長cDNA的合成。
本發(fā)明可使用多種DNA聚合酶，所述聚合酶包括但不限于嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶，水生棲熱菌(Thermusaquaticus)(Tap)DNA聚合酶，那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoganeapolitana)(Tne)DNA聚合酶，海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)(Tma)DNA聚合酶，Thermococcus litoralis(Tli或VENTTM)DNA聚合酶，激烈熱球菌(Pyrococcus furiosis)(Pfu)DNA聚合酶，DEEPVENTTMDNA聚合酶，沃氏熱球菌(Pyrococcus woosii)(Pwo)DNA聚合酶，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus sterothermophilus)(Bst)DNA聚合酶，Bacillus caldophilus(Bca)DNA聚合酶，嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius)(Sac)DNA聚合酶，嗜酸熱原體(Thermoplasma acidophilum)(Tac)DNA聚合酶，黃棲熱菌(Thermusflavus)(Tfl/Tub)DNA聚合酶，紅棲熱菌(Thermus ruber)(Tru)DNA聚合酶，Thermus brockianus(DYNAZYMETM)DNA聚合酶，熱自養(yǎng)甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth)DNA聚合酶，分枝桿菌(Mycobacterium)DNA聚合酶(Mtb，Mlep)，及其突變體，變體和衍生物。
本發(fā)明中所用的DNA聚合酶可以是能由核酸模板合成DNA分子(一般以5’至3’方向合成)的任何酶。所述聚合酶可以是嗜中溫的，也可以是嗜熱的，但優(yōu)選是嗜熱的。嗜中溫的聚合酶包括T5 DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶，Klenow片段DNA聚合酶，DNA聚合酶III等。優(yōu)選的DNA聚合酶是耐熱的DNA聚合酶，如Taq，Tne，Tma，Pfu，VENTTM，DEEPVENTTM，Tth及其突變體，變體和衍生物(美國專利5,436,149；美國專利5,512,462；WO92/06188；WO92/06200；WO96/10640；Barnes，W.M.，基因，11229-35(1992)；Lawyer，F(xiàn).C等，PCR Meth.Appl.2275-287(1993)；Flaman，J.M.等，核酸研究，22(15)3259-3260(1994))。擴增長核酸分子(如長度約大于3-5Kb的核酸分子)時，一般至少使用兩種DNA聚合酶(一種基本上缺乏3’外切核酸酶活性，另一種具有3’外切核酸酶活性)。見美國專利5,436,149；美國專利5,512,462；Barnes，W.M.，基因，11229-35(1992)；和1997年2月14日提交的共同擁有的待審美國專利申請08/801,720(皆全文列入本文作為參考)?；旧先狈?’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的例子包括但不限于Taq，Tne(exo-)，Tma，Pfu(exo-)，Pwo和Tth DNA聚合酶及其突變體，變體和衍生物。具有3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的非限制性例子包括Pfu/DEEPVENTTM和Tli/VENTTM及其突變體，變體和衍生物。
本發(fā)明可用的具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽可以商購得到，例如可購自Life Technologies公司(Rockville，Maryland)，Pharmacia(Piscataway，New Jersey)，Sigma(Saint Louis，Missouri)或Boehringer Mannheim Biochemicals(Indianapolis，Indiana)。或者，可根據(jù)本領域技術人員熟知的分離和純化天然蛋白質(zhì)的標準方法，可以從其天然的病毒或細菌來源中分離具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽(例見Houts，G.E等，病毒學雜志，29517(1979))。另外，也可通過本領域技術人員熟知的重組DNA技術制備具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽(例見Kotewicz，M.L等，核酸研究，16265(1988)；Soltis，D.A和Skalka，A.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 853372-3376(1988))。
本發(fā)明可用的DNA聚合酶可以商購得到，例如可購自LifeTechnologies公司(Rockville，Maryland)，Perkin-Elmer(Branchburg，NewJersey)，New England BioLabs(Beverly，Massachusetts)或BoehringerMannheim Biochemicals(Indianapolis，Indiana)。酶組合物的配制為了形成本發(fā)明的組合物，優(yōu)選將兩種或多種逆轉(zhuǎn)錄酶混合于緩沖鹽溶液中?？扇芜x加入一種或多種DNA聚合酶和/或一種或多種核苷酸以制備本發(fā)明的組合物。更優(yōu)選以溶于穩(wěn)定的緩沖鹽溶液中的工作濃度提供酶。本文所用術語“穩(wěn)定的”和“穩(wěn)定性”一般指的是酶或含酶組合物在約4℃的溫度下保存約1周、在約-20℃的溫度下保存約2-6個月、在約-80℃的溫度下保存約6個月或更長時間之后，組合物(如酶組合物)仍能保留原始酶活性(以單位計)的至少70％，優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少90％。本文所用術語“工作濃度”指的是酶濃度為溶液行使特定功能(如逆轉(zhuǎn)錄核酸)所用的最適濃度或接近該最適濃度。
用于形成本發(fā)明組合物的水優(yōu)選為蒸餾水，去離子水和無菌過濾水(通過0.1-0.2微米的濾膜)，且不含DNA酶和RNA酶。這種水可以商購，如購自Sigma Chemicals公司(Saint Louis，Missouri)，需要時也可根據(jù)本領域技術人員熟知的方法制備之。
除了酶組分外，本發(fā)明的組合物優(yōu)選含有一種或多種緩沖液和合成核酸分子(如cDNA分子)所必需的輔因子。用于形成本發(fā)明組合物的特別優(yōu)選的緩沖液是醋酸鹽，硫酸鹽，鹽酸鹽，磷酸鹽或游離酸形式的三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)，但使用大致離子強度和pKa與TRIS相同的其它緩沖液也可得到同樣的結(jié)果。除了緩沖鹽外，組合物中還包括輔因子鹽，如鉀鹽(優(yōu)選為氯化鉀或醋酸鉀)和鎂鹽(優(yōu)選為氯化鎂或醋酸鎂)。在組合物和/或合成反應混合物中加入一種或多種碳水化合物和/或糖也是有利的，因為儲存時它們可增強組合物和/或反應混合物的穩(wěn)定性。本發(fā)明的組合物和/或合成反應混合物中可包含的碳水化合物或糖優(yōu)選包括但不限于蔗糖，海藻糖等。另外，可將這種碳水化合物和/或糖加入生產(chǎn)本發(fā)明酶組合物和試劑盒所用的酶的儲存緩沖液中。可從多種來源購得上述碳水化合物和/或糖，包括Sigma(St.Louis，MO)。
經(jīng)常優(yōu)選先將緩沖鹽、輔因子鹽和碳水化合物或糖以工作濃度溶于水中，并在加入酶之前調(diào)節(jié)溶液pH。以此方式，pH敏感的酶在本發(fā)明組合物的配制過程中就會較少遇到酸或堿介導的滅活。
為了配制緩沖鹽溶液，將緩沖鹽，優(yōu)選為三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)的鹽，最優(yōu)選為其鹽酸鹽，與足夠量的水混合，以產(chǎn)生TRIS濃度為5-150mM、優(yōu)選為10-60mM、最優(yōu)選約為20-60mM的溶液。在此溶液中，可加入鎂鹽(優(yōu)選為氯化鎂或醋酸鎂)以使其工作濃度為1-10mM，優(yōu)選為1.5-8.0mM，最優(yōu)選為3-7.5mM。也可在溶液中加入鉀鹽(優(yōu)選為氯化鉀或醋酸鉀)以使其工作濃度為10-100mM，最優(yōu)選為約75mM。溶液中也可加入如二硫蘇糖醇的還原劑，優(yōu)選其終濃度約為1-100mM，更優(yōu)選其濃度約為5-50mM或約7.5-20mM，最優(yōu)選其濃度約為10mM。本發(fā)明組合物中可含的碳水化合物和/或糖的優(yōu)選濃度范圍為約5％(w/v)-約30％(w/v)，約7.5％(w/v)-約25％(w/v)，約10％(w/v)-約25％(w/v)，約10％(w/v)-約20％(w/v)，優(yōu)選為約10％(w/v)-約15％(w/v)。也可加入少量的乙二胺四乙酸(EDTA)鹽，如EDTA二鈉鹽(優(yōu)選約為0.1mM)，但EDTA的加入對本發(fā)明組合物的功能或穩(wěn)定性似乎并不是必需的。加入所有的緩沖液和鹽之后，將緩沖的鹽溶液充分混合直至所有的鹽溶解為止，使用本領域已知的方法將pH調(diào)節(jié)至pH7.4-9.2，優(yōu)選為pH8.0-9.0，最優(yōu)選約為pH8.4。
在這些緩沖鹽溶液中加入酶(逆轉(zhuǎn)錄酶和/或DNA聚合酶)以產(chǎn)生本發(fā)明的組合物。優(yōu)選在溶液中以工作濃度加入M-MLV RT，所述濃度為約1,000-50,000單位/ml，約2,000-30,000單位/ml，約2,500-25,000單位/ml，約3,000-22,500單位/ml，約4,000-20,000單位/ml，最優(yōu)選以工作濃度約5,000-20,000單位/ml加入。優(yōu)選在溶液中以工作濃度加入AMV RT，MAV RT，RSV RT和RAV RT，包括本發(fā)明上述的那些酶，所述濃度為約100-5000單位/ml，約125-4000單位/ml，約150-3000單位/ml，約200-2500單位/ml，約225-2000單位/ml，最優(yōu)選以工作濃度約250-1000單位/ml加入。優(yōu)選在溶液中以工作濃度加入嗜熱DNA聚合酶組中的酶(Taq，Tne，Tma，Pfu，VENTTM，DEEPVENTTM，Tth及其突變體，變體和衍生物)，所述濃度為約100-1000單位/ml，約125-750單位/ml，約150-700單位/ml，約200-650單位/ml，約225-550單位/ml，最優(yōu)選以工作濃度約250-500單位/ml加入。向溶液中加入酶的次序是任意的，也可以同時加入酶。
本發(fā)明的組合物還可含有一種或多種核苷酸，優(yōu)選為脫氧核苷三磷酸(dNTP)或雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。本發(fā)明組合物的dNTP組分作為新合成之核酸的“組建模塊”，其通過聚合酶的作用摻入核酸中，根據(jù)本發(fā)明，ddNTP可用于測序方法中。適用于本發(fā)明組合物的核苷酸的例子包括但不限于dUTP，dATP，dTTP，dCTP，dGTP，dITP，7-脫氮-dGTP，α-硫代-dATP，α-硫代-dTTP，α-硫代-dGTP，α-硫代-dCTP，ddUTP，ddATP，ddTTP，ddCTP，ddGTP，ddITP，7-脫氮-ddGTP，α-硫代-ddATP，α-硫代-ddTTP，α-硫代-ddGTP，α-硫代-ddCTP或其衍生物，上述核苷酸都可以商購，其來源包括Life Technologies公司(Rockville，Maryland)，New England BioLabs(Beverly，Massachusetts)和Sigma Chemicals公司(Saint Louis，Missouri)。核苷酸可以不標記，也可以通過本領域已知的方法使其與放射性同位素(如3H，14C，32P或35S)、維生素(如生物素)、熒光組成成分(如熒光素，羅丹明，德克薩斯紅或藻紅蛋白)、化學發(fā)光標記(如使用PHOTO-GENETM或ACESTM化學發(fā)光系統(tǒng)，可購自Life Technologies公司Rockville，Maryland)，地高辛等偶聯(lián)以可測地標記之。經(jīng)標記的核苷酸也可商購，如得自Life Technologies公司(Rockville，Maryland)或Sigma Chemicals公司(Saint Louis，Missouri)。在本發(fā)明的組合物中，加入核苷酸以使每種核苷酸的工作濃度為約10-4000μM，約50-2000μM，約100-1500μM，或約200-1200μM，最優(yōu)選濃度約為1000μM。
為了降低組分變質(zhì)的程度，優(yōu)選在約4℃下儲存試劑組合物不超過1天，或最優(yōu)選于-20℃儲存不超過1年。
另一方面，可在一種或多種碳水化合物、糖或合成聚合物的存在下，以干燥劑型制備和儲存本發(fā)明的組合物和逆轉(zhuǎn)錄酶。用于制備干組合物或逆轉(zhuǎn)錄酶的優(yōu)選碳水化合物、糖或聚合物包括但不限于蔗糖，海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或其混合物，例見美國專利5,098,893，4,891,319和5,556,771(皆全文列入本文作為參考)?？梢詫⑦@種干燥的組合物和酶于多種溫度下儲存更長時間而不會使本發(fā)明組合物的酶或組分顯著變質(zhì)。優(yōu)選于4℃或-20℃儲存干燥的逆轉(zhuǎn)錄酶或組合物。cDNA分子的產(chǎn)生核酸分子的來源根據(jù)本發(fā)明，可由多種核酸模板分子制備cDNA分子(單鏈或雙鏈)。用于本發(fā)明的核酸分子優(yōu)選包括單鏈或雙鏈DNA和RNA分子，以及雙鏈DNARNA雜合體。更優(yōu)選的核酸分子包括信使RNA(mRNA)，轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)和核糖體RNA(rRNA)分子，但本發(fā)明優(yōu)選的模板是mRNA分子。
可以根據(jù)本領域技術人員熟知的標準有機化學合成法合成制備本發(fā)明方法中用于制備cDNA分子的核酸分子。更優(yōu)選核酸分子得自天然來源，如多種細胞、組織、器官或生物體。可用作核酸分子來源的細胞可以是原核細胞(細菌細胞，包括但不限于下列屬的種埃希氏菌，芽孢桿菌，沙雷氏菌，沙門氏菌，葡萄球菌，鏈球菌，梭菌，衣原體，奈瑟氏球菌，密螺旋體，枝原體，疏螺旋體，軍團菌，假單胞菌，分枝桿菌，螺桿菌，歐文氏桿菌，土壤桿菌，根瘤菌，黃單胞菌和鏈霉菌)或真核細胞(包括真菌(尤其是酵母)，植物，原生動物和其它寄生蟲，和動物，包括昆蟲(尤其是果蠅細胞)，線蟲(尤其是Caenorhabditiselegans細胞)和哺乳動物(尤其是人細胞))。
可用作核酸來源的哺乳動物體細胞包括血細胞(網(wǎng)織紅細胞和白細胞)，內(nèi)皮細胞，上皮細胞，神經(jīng)元細胞(得自中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng))，肌肉細胞(包括骨骼肌、平滑肌或心肌的肌細胞和成肌細胞)，結(jié)締組織細胞(包括成纖維細胞，脂肪細胞，軟骨細胞，成軟骨細胞，骨細胞和成骨細胞)和其它基質(zhì)細胞(如巨噬細胞，樹突細胞，神經(jīng)膜細胞)。哺乳動物生殖細胞(精母細胞和卵母細胞)也可用作本發(fā)明所用核酸的來源，能產(chǎn)生上述體細胞和生殖細胞的祖細胞、前體細胞和干細胞也可使用。其它適用的核酸來源是哺乳動物組織或器官，它們可得自例如腦，腎臟，肝臟，胰腺，血液，骨髓，肌肉，神經(jīng)，皮膚，泌尿生殖系統(tǒng)，循環(huán)系統(tǒng)，淋巴，胃腸道和結(jié)締組織，以及哺乳動物(包括人)胚胎或胎兒。
上述任何原核或真核細胞，組織和器官可以是正常的，患病的，經(jīng)轉(zhuǎn)化的，已建成的，祖代的，前體的，胎兒的或胚胎的。患病細胞包括例如涉及傳染病(由細菌，真菌或酵母，病毒(包括AIDS，HIV，HTLV，皰疹病毒，肝炎病毒等)或寄生蟲引起)的細胞，涉及基因或生化病理學(如膽囊纖維樣變性，血友病，Alzheimer’s病，肌營養(yǎng)不良或多發(fā)性硬化)的細胞或者涉及癌癥進程的細胞。經(jīng)轉(zhuǎn)化的或已建成的動物細胞系包括例如COS細胞，CHO細胞，VERO細胞，BHK細胞，HeLa細胞，HepG2細胞，K562細胞，293細胞，L929細胞，F(xiàn)9細胞等。適用于本發(fā)明所用核酸之來源的其它細胞、細胞系、組織、器官和生物體對本領域技術人員而言是顯而易見的。
一旦得到起始細胞、組織、器官或其它樣品，可通過本領域眾所周知的方法從中分離核酸分子(如mRNA)(例見Maniatis，T等，細胞，15687-701(1978)；Okayama，H和Berg，P，分子細胞生物學，2161-170(1982)；Gubler，U和Hoffman，B.J，基因，25263-269(1983))。然后可使用所分離的核酸分子制備本發(fā)明的cDNA分子和cDNA文庫。
在實施本發(fā)明的過程中，通過在適于經(jīng)酶或組合物的作用逆轉(zhuǎn)錄核酸分子以形成cDNA分子(單鏈或雙鏈)的條件下，將上文所得的一種或多種核酸分子，優(yōu)選為一個或多個mRNA分子(如mRNA分子群體)，與兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽，或與一種或多種本發(fā)明的組合物，或與一種或多種本發(fā)明的RSV RT和/或AMV RT和/或其它ASLV RT混合即可產(chǎn)生cDNA分子或cDNA文庫。因此，本發(fā)明的方法包括(a)將一種或多種核酸模板(優(yōu)選為一種或多種RNA或mRNA模板，如mRNA分子群體)與一種或多種本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶混合，和(b)在足以制備與所述一種或多種模板的全部或部分互補的一種或多種核酸分子的條件下保溫混合物。該方法還包括使用一種或多種DNA聚合酶。本發(fā)明也可與cDNA合成法聯(lián)合使用以產(chǎn)生cDNA分子或文庫，所述cDNA合成法如下文實施例中所述的方法，或為本領域眾所周知的其它方法(例見Gubler，U和Hoffman，B.J，基因，25263-269(1983)；Krug，M.S和Berger，S.L.，酶學方法，152316-325(1987)；Sambrook，J等，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港，紐約冷泉港實驗室出版社，p8.60-8.63(1989))。
本發(fā)明還特別地涉及升溫下逆轉(zhuǎn)錄核酸分子的方法。如實施例5所述，在高于37℃至42℃的溫度下，一般不使用逆轉(zhuǎn)錄病毒RT來拷貝核酸模板(如RNA分子)，因為這些嗜中溫酶的熱穩(wěn)定性是有限的。然而，在這些溫度下，mRNA的二級結(jié)構(gòu)會干擾逆轉(zhuǎn)錄(Gerard，G.F等，F(xiàn)OCUS 1160(1989)；Myers，T.W和Gelfand，D.H.，生物化學，307661(1991))，在基因特異性逆轉(zhuǎn)錄方法(如RT-PCR)的過程中引物結(jié)合的特異性可能會降低，導致高背景信號(Myers，T.W和Gelfand，D.H.，生物化學，307661(1991)；Freeman，W.N等，生物技術，20782(1996))。為了幫助解決這些問題，本發(fā)明提供了在更高的溫度下，即50℃以上進行RNA逆轉(zhuǎn)錄的方法。
因此，本發(fā)明涉及逆轉(zhuǎn)錄核酸分子的方法，所述方法包括(a)將核酸模板與一種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽混合；和(b)在足以制備與所述核酸模板之全部或部分互補的第一核酸分子的條件下，于約50℃或更高的溫度下保溫混合物。根據(jù)本發(fā)明可被拷貝的核酸模板包括但不限于RNA分子(如mRNA分子或poly+RNA分子)和DNA分子(如單鏈或雙鏈DNA分子)。根據(jù)本發(fā)明，由所述方法產(chǎn)生的第一核酸分子可以是全長的cDNA分子。盡管約50℃或更高的任何保溫溫度都可以用于本發(fā)明，但特別優(yōu)選的保溫溫度包括但不限于約51℃或更高，約52℃或更高，約53℃或更高，約54℃或更高，約55℃或更高，約56℃或更高，約57℃或更高，約58℃或更高，約59℃或更高，約60℃或更高，約61℃或更高，約62℃或更高，約63℃或更高，約64℃或更高，約65℃或更高，約66℃或更高，約67℃或更高，約68℃或更高，約69℃或更高或者約70℃或更高。在其它這種方法中，保溫溫度為一個溫度范圍，所述范圍包括但不限于約50℃至約70℃，約51℃至約70℃，約52℃至約70℃，約53℃至約70℃，約54℃至約70℃，約55℃至約70℃，約55℃至約69℃，約55℃至約68℃，約55℃至約67℃，約55℃至約66℃，約55℃至約65℃，約56℃至約65℃，約56℃至約64℃或約56℃至約62℃。本發(fā)明另外涉及這樣的方法，其中進一步包括在足以制備與第一核酸分子之全部或部分互補的第二核酸分子的條件下，保溫第一核酸分子。根據(jù)本發(fā)明，通過這些方法產(chǎn)生的第一和第二核酸分子可以是DNA分子，并可形成雙鏈DNA分子，該雙鏈DNA分子可以是全長的cDNA分子。如上文方法所述，優(yōu)選這些高溫方法中使用的一種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性之多肽的RNA酶H活性有所降低或大大降低，所述多肽可選自一種或多種AMV逆轉(zhuǎn)錄酶或其亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)，一種或多種RSV逆轉(zhuǎn)錄酶或其亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)，或者其它ASLV RT或其亞單位(或其衍生物，變體，片段或突變體)。特別優(yōu)選的AMV RT和RSV RT和其它ASLV RT包括本發(fā)明提供的和上文詳述的那些。更優(yōu)選的是基因型為AMV αH-/βH+RT或RSV αH-/βH+RT的AMV RT和RSV RT。優(yōu)選通過突變或修飾編碼α亞單位的基因以使RNA酶H活性降低或大大降低，而編碼β亞單位的基因未經(jīng)突變或修飾，由此制得這種構(gòu)建體。所得多肽(共表達產(chǎn)生)的RNA酶H活性將會有所降低或大大降低。
利于使用本發(fā)明的其它cDNA合成法對本領域技術人員而言是顯而易見的。
根據(jù)本發(fā)明得到cDNA分子或文庫后，分離這些cDNA以進一步分析或處理。純化cDNA的詳細方法學可參見GENETRAPPERTM手冊(LifeTechnologies公司；Rockville，Maryland)(其全文列入本文作為參考)，但也可使用如下文實施例所述或本領域已知的其它標準cDNA分離技術(例見Sambrook，J等，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港，紐約冷泉港實驗室出版社，p8.60-8.63(1989))。
在本發(fā)明的其它方面，本發(fā)明可用于擴增和測序核酸分子的方法中。根據(jù)本發(fā)明此方面的核酸擴增方法可以是一步(如一步RT-PCR)或兩步(如兩步RT-PCR)反應。根據(jù)本發(fā)明，一步RT-PCR型反應可在一個試管中完成，從而降低了污染的可能性。這種一步反應包括(a)將核酸模板(如mRNA)與兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽和一種或多種DNA聚合酶混合，和(b)在足以擴增與模板之全部或部分互補的核酸分子的條件下保溫混合物?；蛘?，可通過將模板與兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性(和任選具有DNA聚合酶活性)的多肽混合來完成擴增。在允許擴增與模板之全部或部分互補的核酸分子的適當條件下保溫這種反應混合物。這種擴增可僅通過逆轉(zhuǎn)錄酶活性完成，或與DNA聚合酶活性聯(lián)合來完成。兩步RT-PCR可由兩個獨立的步驟完成。所述方法包括(a)將核酸模板(如mRNA)與兩種或多種逆轉(zhuǎn)錄酶混合，(b)在足以制備與模板之全部或部分互補的核酸分子(如DNA分子)的條件下保溫混合物，(c)將核酸分子與一種或多種DNA聚合酶混合，和(d)在足以擴增核酸分子的條件下保溫步驟(c)的混合物。擴增長核酸分子(即長度約大于3-5Kb的核酸分子)時，可聯(lián)合使用多種DNA聚合酶，如一種DNA聚合酶具有3’外切核酸酶活性，另一種DNA聚合酶的3’外切核酸酶活性大大降低。其它兩步法包括使用兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性和DNA聚合酶活性的多肽(如Tth，Tma或Tne DNA聚合酶等)，而不是分開加入逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶。
根據(jù)本發(fā)明此方面的核酸測序方法包括循環(huán)測序(測序與擴增聯(lián)合)和標準測序反應。因此，本發(fā)明的測序方法包括(a)將待測序的核酸分子與一個或多個引物、兩個或多個逆轉(zhuǎn)錄酶、一種或多種核苷酸和一種或多種終止試劑混合；(b)在足以合成與待測序之分子的全部或部分互補的核酸分子群體的條件下保溫混合物；和(c)分離群體以測定待測序之分子的全部或部分核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，可將一種或多種DNA聚合酶(優(yōu)選為耐熱DNA聚合酶)與逆轉(zhuǎn)錄酶聯(lián)合使用或分開使用。
可根據(jù)本發(fā)明使用的擴增方法包括PCR(美國專利4,683,195和4,683,202)，鏈置換擴增(SDA；美國專利5,455,166；EP 0684 315)，基于核酸序列的擴增(NASBA；美國專利5,409,818；EP 0329 822)?？衫帽景l(fā)明組合物的核酸測序技術包括如美國專利4,962,022和5,498,523所述的雙脫氧測序法以及更復雜的基于PCR的核酸指紋分析技術，如隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)分析(Williams，J.G.K等，核酸研究，18(22)6531-6535，1990)，任意引物PCR(AP-PCR；Welsh，J和McClelland，M，核酸研究，18(24)7213-7218，1990)，DNA擴增指紋分析(DAF；Caetano-Anolles等，Bio/Technology 9553-557，1991)，微衛(wèi)星PCR或小衛(wèi)星區(qū)DNA的定向擴增(DAMD；Heath，D.D等，核酸研究，21(24)5782-5785，1993)，和擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)分析(EP 0534 858；Vos，P等，核酸研究，23(21)4407-4414，1995；Lin，J.J和Kuo，J，F(xiàn)OCUS 17(2)66-70，1995)。在特別優(yōu)選的方面，本發(fā)明也可用于包括一個或多個聚合酶鏈反應(PCR)的擴增或測序核酸分子的方法中，如上述任一基于PCR的方法中。試劑盒在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可被裝入試劑盒中以用于逆轉(zhuǎn)錄或擴增核酸分子，或裝入試劑盒中以用于測序核酸分子。根據(jù)本發(fā)明此方面的試劑盒中含有載體，如盒、紙盒、管等，密閉的載體中含有一個或多個容器，如小管、試管、安瓿、瓶等，其中第一個容器中含有一種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽。這些具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽可以作為兩種或多種多肽的混合物放在一個容器中，也可以分開放在各自的容器中。本發(fā)明的試劑盒也可在相同或不同容器中含有一種或多種DNA聚合酶，適當緩沖液，一種或多種核苷酸和/或一個或多個引物。
在本發(fā)明具體的方面，逆轉(zhuǎn)錄和擴增試劑盒中可含有(分開或混合的)一種或多種組分，所述組分包括一種或多種、優(yōu)選為兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的本發(fā)明多肽，一種或多種合成核酸分子所需的核苷酸，和/或引物(如逆轉(zhuǎn)錄所用的oligo(dT))。這種逆轉(zhuǎn)錄和擴增試劑盒中可進一步含有一種或多種DNA聚合酶。本發(fā)明的測序試劑盒中可含有一種或多種、優(yōu)選為兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的本發(fā)明多肽，任選含有一種或多種DNA聚合酶，一種或多種測序核酸分子所需的終止試劑(如雙脫氧核苷三磷酸分子)，一種或多種核苷酸和/或一個或多個引物。適用于本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄、擴增和測序試劑盒的優(yōu)選的具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽、DNA聚合酶、核苷酸、引物和其它組分包括上述的那些。本發(fā)明此方面包含的試劑盒可進一步含有進行標準的核酸逆轉(zhuǎn)錄、擴增或測序方案所必需的其它試劑和化合物。具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的本發(fā)明多肽、DNA聚合酶、核苷酸、引物和其它試劑、組分或化合物可放在一個或多個容器中，或以兩種或多種上述組分的混合物形式放在容器中，或分開放在不同的容器中裝入本發(fā)明的試劑盒。核酸分子的用途由本發(fā)明方法制備的核酸分子或cDNA文庫可通過本發(fā)明的測序方法或通過本領域已知的其它標準方法(例見涉及DNA測序方法的美國專利4,962,022和5,498,523)克隆和測序(即測定核酸分子的核苷酸序列)而進一步鑒定?；蛘撸稍诠I(yè)方法中使用這些核酸分子制備多種物質(zhì)，如通過本領域熟知的方法制備雜交探針。由cDNA產(chǎn)生雜交探針使得醫(yī)學領域的人員能夠檢查患者細胞或組織中特定基因標記的存在，所述標記如癌癥的標記，傳染病或遺傳疾病的標記或胚胎發(fā)育的標記。另外，也可使用這種雜交探針從制備自不同細胞、組織或生物體的基因組DNA或cDNA文庫中分離DNA片段以進一步鑒定。
也可使用本發(fā)明的核酸分子制備組合物以用于重組DNA方法學。因此，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明cDNA或擴增的核酸分子的重組載體，用重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，使用所述載體和宿主細胞產(chǎn)生重組多肽的方法和使用這些方法產(chǎn)生的重組多肽。
根據(jù)本發(fā)明的此方面，可使用本領域熟知的方法將根據(jù)本發(fā)明方法制備的一種或多種cDNA分子或擴增的核酸分子插入載體中，由此制備重組載體。本發(fā)明的此方面使用的載體可以是例如噬菌體或質(zhì)粒，優(yōu)選為質(zhì)粒。優(yōu)選載體含有編碼所需多肽之核酸的順式作用調(diào)控區(qū)。適當?shù)姆词阶饔靡蜃涌捎伤拗魈峁?，由互補載體提供，或通過導入宿主而由載體自身提供。
在此方面，某些優(yōu)選的實施方案中，載體提供了特異性的表達(因此被稱為“表達載體”)，該表達可以是誘導型的和/或細胞類型特異性的。其中特別優(yōu)選的載體是能由易操作的環(huán)境因素(如溫度和營養(yǎng)物添加劑)誘導的載體。
可用于本發(fā)明的表達載體包括衍生自染色體、附加體和病毒的載體，如衍生自細菌質(zhì)?；蚴删w的載體，和衍生自這兩者的載體，如粘粒和噬菌粒，所述表達載體優(yōu)選包括至少一個選擇標記，如四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因，以在細菌宿主細胞中培養(yǎng)。將本發(fā)明的cDNA或擴增的核酸分子插入這種表達載體之前，應將其與適當啟動子可操作地連接，所述啟動子如噬菌體λPL啟動子，大腸桿菌lac，trp和tac啟動子。其它適當?shù)膯幼邮潜绢I域技術人員已知的。
本發(fā)明優(yōu)選使用的載體包括可得自Qiagen的pQE70，pQE60和pQE-9；可得自Stratagene的pBS載體，Phagescript載體，Bluescript載體，pNH8A，pNH16A，pNH18A，pNH46A；可得自Invitrogen的pcDNA3；可得自Pharmacia的pGEX，pTrxfus，pTrc99a，pET-5，pET-9，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5；和可得自Life Technologies公司的pSPORT1，pSPORT2和pSV·SPORT1。其它適當?shù)妮d體對本領域技術人員而言是顯而易見的。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的cDNA分子、擴增的核酸分子或重組載體的重組宿主細胞的生產(chǎn)方法，以及由該方法產(chǎn)生的宿主細胞。根據(jù)本發(fā)明可產(chǎn)生的代表性宿主細胞(原核或真核細胞)包括但不限于細菌細胞、酵母細胞、植物細胞和動物細胞。優(yōu)選的細菌宿主細胞包括大腸桿菌細胞(最優(yōu)選大腸桿菌菌株DH10B和Stb12，它們可購自LifeTechnologies公司；Rockville，Maryland)，枯草芽孢桿菌細胞，巨大芽孢桿菌細胞，鏈霉菌細胞，歐文氏菌細胞，克雷伯氏菌細胞和鼠傷寒沙門氏菌細胞。優(yōu)選的動物宿主細胞包括昆蟲細胞(最優(yōu)選草地夜蛾Sf9和Sf21細胞和Trichoplusa High-Five細胞)和哺乳動物細胞(最優(yōu)選CHO，COS，VERO，BHK和人細胞)?？赏ㄟ^本領域技術人員熟知的轉(zhuǎn)化、電穿孔或轉(zhuǎn)染技術來制備上述宿主細胞。
另外，本發(fā)明提供了生產(chǎn)重組多肽的方法和由該方法生產(chǎn)的多肽。根據(jù)本發(fā)明的此方面，通過在利于宿主細胞產(chǎn)生多肽和分離多肽的條件下培養(yǎng)任何上述重組宿主細胞即可產(chǎn)生重組多肽。培養(yǎng)重組宿主細胞、從中產(chǎn)生和分離多肽的方法是本領域技術人員熟知的。
相關領域的技術人員清楚地知道可對本文所述的方法和應用作其它適當?shù)男揎椇妥兓@一點是顯而易見的，并可在本發(fā)明或其任何實施方案的范圍內(nèi)進行這種修飾和變化。本文詳細描述了本發(fā)明，參照下列實施例會更清楚地理解本發(fā)明，以下實施例只是為了闡明、而不是限制本發(fā)明。實施例1克隆和表達RSV RNA酶H-RT一般方法RSV H-RT是逆轉(zhuǎn)錄病毒RT的克隆形式，其中α和β亞單位因單個氨基酸的改變被突變，從而消除了RNA酶H活性。只突變了α亞單位從而大大降低RNA酶H活性(β亞單位的RNA酶H結(jié)構(gòu)域未突變)時，也產(chǎn)生了RNA酶H活性大大降低的RSV RT。使用按下述改進的標準分子生物學方法(例見Sambrook，J等，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港，紐約實驗室出版社(1989))進行突變和質(zhì)粒構(gòu)建。
質(zhì)粒制備。通過堿裂解法(Sambrook，J等，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港，紐約實驗室出版社(1989))從1ml大腸桿菌培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒。將由10ml培養(yǎng)物得到的質(zhì)粒制品經(jīng)苯酚-氯仿處理，乙醇沉淀，并重新懸浮于50μl Tris-EDTA(TE)緩沖液(20mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中。對桿粒制品要小心操作以避免處理過程中發(fā)生DNA剪切作用(即不要渦流旋轉(zhuǎn)；苯酚氯仿提取時應緩慢轉(zhuǎn)動而不是振蕩；緩慢移液)。
PCR。在Perkin-Elmer 9600熱循環(huán)儀上進行聚合酶鏈反應。反應混合物(各50μl)含有0.5個單位Taq DNA聚合酶，1μM各種寡核苷酸，各50μM的dCTP，dGTP，dTTP和dATP和約100ng靶DNA，該混合物處于由50mM KCl，20mM Tris-HCl(pH8.3)和5mM MgCl2組成的反應緩沖液中。除非另有說明，每次PCR的循環(huán)條件是94℃5分鐘，接著是55℃ 15秒/72℃ 30秒/94℃ 15秒共8輪循環(huán)，然后是72℃ 1分鐘。
凝膠電泳和DNA片段分離和克隆。在溶于含0.3μg/ml溴化乙錠的Tris-醋酸鹽-EDTA緩沖液的瓊脂糖凝膠中，以約10V/cm電泳DNA(Sambrook，J等，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港，紐約實驗室出版社(1989))。用紫外燈觀察片段并通過GlassMAX法從凝膠切片中分離片段(Simms，D等，F(xiàn)ocus 1399(1991))。在標準條件下使用T4 DNA連接酶進行DNA連接反應(King，P.W，和Blakesley，R.W，F(xiàn)ocus 81(1986))，使用經(jīng)改良的CaCl2法(Lorow，D和Jessee，J，F(xiàn)ocus 1219(1990))轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B細胞。
昆蟲細胞培養(yǎng)和桿狀病毒的產(chǎn)生。根據(jù)已知方法(Anderson，D等，F(xiàn)ocus 1653(1995))，用溶于0.2ml SF900-II無血清昆蟲細胞培養(yǎng)基(Life Technologies公司；Rockville，Maryland；見Godwin，G和Whitforg，W，F(xiàn)ocus 1544(1993))中的1μg桿粒DNA和8μlCellfectin混合物轉(zhuǎn)染5×105個細胞/ml的Sf21昆蟲細胞樣品(1ml)。為了培養(yǎng)和增殖，于27℃，在振蕩溫箱中以100rpm(針對600ml培養(yǎng)物)或130rpm(針對所有其它的培養(yǎng)物)，在SF900-II培養(yǎng)基中傳代Sf9和Sf21昆蟲細胞。應盡量避免培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中超過4×106個細胞/ml或在稀釋過程中降到0.5×106個細胞/ml以下。為了擴展病毒群體，用足夠的病毒儲存液(約0.2％(v/v)病毒/培養(yǎng)物)感染約為1×106個細胞/ml的Sf21細胞以使其生長為約2×106個細胞/ml，但不超過4×106個細胞/ml。72小時之后，離心培養(yǎng)物(2,000rpm，10分鐘)，傾析上清液，將其儲存于4℃，黑暗中。為了感染細胞以產(chǎn)生蛋白質(zhì)，用足夠的病毒感染約為1.5×106個細胞/ml的Sf21昆蟲細胞以使其不生長或生長為約2.5×106個細胞/ml以下。72小時之后，以1,000rpm離心5分鐘以收獲培養(yǎng)物，每500ml培養(yǎng)物中的細胞以15ml PBS(0.2g/l KCl，0.2g/l KH2PO4，8g/l NaCl，1.15g/l Na2HPO4，2.16g/l Na2HPO4·7H2O)重新懸浮?？寺『捅磉_編碼RSV RT α和β亞單位的基因RSV RT α和β亞單位都是通過蛋白酶水解加工較大的多肽前體產(chǎn)生的(Gerard，G.F核酸合成和修飾酶，第I卷DNA酶，Jacob，S.T編，Boca Raton，F(xiàn)LCRC出版社，p1-38(1983))。為了免除對蛋白酶水解加工的需求，可誘變RSV RT的編碼序列并亞克隆之以使α和β亞單位都由具有標準起始和終止翻譯信號的基因編碼。兩個基因的RNA酶H區(qū)域都被誘變，但也可以相同的方法構(gòu)建任何亞單位組合(如α RNA酶H-/β RNA酶H+；α RNA酶H+/β RNA酶H+；α RNA酶H+/β RNA酶H-；αRNA酶H-/β RNA酶H-)。已發(fā)現(xiàn)RSV RT α RNA酶H-/β RNA酶H+的RNA酶H活性大大降低(約為野生型的5％)。在β亞單位的羧基末端添加了編碼親和標記物的序列。
誘變和亞克隆RSV RT β亞單位的氨基末端，羧基末端和中間部分。誘變RSV RT基因以在編碼成熟RT多肽之序列的氨基末端添加ATG密碼子和NdeI位點。這一誘變是使用pJD100靶(圖1，7)(Wilkerson，V.W等，病毒學雜志，55314-321(1985))和下列寡核苷酸經(jīng)PCR完成的AUG GAG AUC UCU CAT ATG ACT GTT GCG CTA CAT CTG GCT(SEQ ID NO1)AAC GCG UAC UAG U GTT AAC AGC GCG CAA ATC ATG CAG(SEQ ID NO2)按上述進行PCR，純化PCR產(chǎn)物，通過UDG克隆(Buchman，G.W等，F(xiàn)ocus 1536(1993))將PCR產(chǎn)物克隆至pAMP18中以形成質(zhì)粒pAMP18N(圖1，8)。
誘變并克隆了氨基末端之后，使用下列寡核苷酸經(jīng)PCR誘變pJD100中RSV β亞單位基因的羧基末端，并經(jīng)UDG克隆法將PCR產(chǎn)物亞克隆至pAMP1(圖1)CUA CUA CUA CUA GGT ACC CTC TCG AAA AGT TAA ACC(SEQ ID NO3)CAU CAU CAU CAU CTC GAG TTA TGC AAA AAG AGG GCT CGC CTCATC(SEQ ID NO4)這些寡核苷酸被設計成可在β基因中于“p4”區(qū)域從βp4多肽上裂解下來的位點處導入翻譯終止密碼子，以及在基因末端之后添加XhoI位點。通過凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物并通過UDG克隆克隆至pAMP1，形成了pAMP1C(圖1，9)。注意此羧基末端沒有His標記物，該標記物在稍后的時間添加，從而形成最終的構(gòu)建體。
為了添加RSV RT β亞單位的中間區(qū)域，將pJD100(圖1)中編碼RSVRT β亞單位中間區(qū)域的2.3kb HpaI-KpnI片段克隆至pAMP18N的HpaI-KpnI位點，形成pAMP18NM(圖1，10)。為了添加RSV RT β亞單位的羧基末端，將pAMP1C中編碼β亞單位基因羧基末端的113bpKpnI-EcoRI片段克隆至pAM18NM的KpnI-EcoRI位點，形成pAMP18B(圖2，11)。
構(gòu)建了含有RNA酶H活性的RSV RT β亞單位之后，通過定點誘變誘變此基因，以產(chǎn)生編碼RNA酶H活性大大降低了(即“RNA酶H-”)的RSV RT β亞單位的構(gòu)建體。將pJD100(圖2)中含有整個RT基因的3Kb PstI片段克隆至M13mp19中，形成M13RT(圖2，12)。用含有PstI片段的M13RT噬菌體感染之后，從大腸桿菌菌株CJ236(Bio-Rad；Hercules，CA和Cathy Joyce，Yale University，New Haven，CT)中分離含尿嘧啶的單鏈DNA。為了突變RNA酶H區(qū)域和導入SstII位點，使用了下列寡核苷酸GGA CCC ACT GTC TTT ACC GCG GCC TCC TCA AGC ACC(SEQ ID NO5)此寡核苷酸誘導RT第450位的天冬氨酸殘基被丙氨酸殘基取代，形成M13RTH-(圖2，13)。在產(chǎn)生RNA酶H-RSV RT的另一個方法中，Glu484可被突變?yōu)楣劝滨０泛?或Asp505可被突變?yōu)樘於０?。為了使β亞單位回復成RNA酶H+，可使用具有野生型序列的寡核苷酸引物。或者，可在RNA酶H區(qū)域進行缺失或插入以大大降低RNA酶H活性。使用DNA測序以進一步證實Asp450至Ala450的突變，將M13RTH-中的426bp BglII-BstEII片段克隆至pAMP18B的BglII-BstEII位點，替代RNA酶H區(qū)域并形成pAMP18BH-(圖2，14)。
誘變和亞克隆編碼RSV RT α亞單位的基因。為了產(chǎn)生編碼RSV RTα亞單位的基因，使用兩個寡核苷酸誘變pDBH-中RNA酶H-突變型RSV RT基因的氨基末端(圖3，15)，并在禽逆轉(zhuǎn)錄病毒的蛋白酶p15正常地裂解前體聚蛋白質(zhì)得到α亞單位的位點處導入翻譯終止密碼子CAU CAU CAU CAU CCC GGG TTA ATA CGC TTG GAA GGT GGC(SEQ ID NO6)CUA CUA CUA CUA TCA TGA CTG TTG CGC TAC ATC TG(SEQ ID NO7)PCR循環(huán)條件為94℃ 5分鐘，接著是55℃ 15秒/72℃ 2分鐘/94℃15秒共8輪循環(huán)，然后是72℃ 2分鐘。如上所述，通過UDG克隆法將PCR產(chǎn)物克隆至pAMP1中，形成pAMP1A(圖3，16)。
在RSVβ亞單位的羧基末端添加His6標記物。通過定點誘變將His6標記物添加至RSV RT β亞單位的羧基末端，如上所述，使用下列寡核苷酸通過PCR和UDG克隆法從pJD100中亞克隆突變的序列CUA CUA CUA CUA GGT ACC CTC TCG AAA AGT TAA(SEQ ID NO8)CAU CAU CAU CAU GAG GAA TTC AGT GAT GGT GAT GGT GAT GTGCAA AAAG AGG(SEQ ID NO9)這些寡核苷酸被設計為可在基因中導入翻譯終止密碼子，并在蛋白質(zhì)的末端添加組氨酸標記物。因此，基因產(chǎn)物是羧基末端添加有6個組氨酸的多肽。通過凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，并通過UDG克隆法插入pAMP1，形成pAMPChis。
為了除去RSV RT β基因的羧基末端，并用含His6標記物的羧基末端取代之，不得不減少含RSV RT β基因的桿狀病毒載體中KpnI位點的數(shù)目。用AflIII裂解質(zhì)粒pDBH-(圖4)，用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段使位點成為平端，經(jīng)熱處理滅活聚合酶，用PvuII進一步裂解載體(圖4)。然后通過凝膠電泳純化缺失的載體(5.9kb)，自身連接后用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH10B，形成pDBH-Kpn(圖4，17)。將pAMPChis中含有帶His6標記物的β羧基末端的KpnI-SstI片段克隆至pDBH-Kpn的KpnI-SstI位點，形成pDBH-KpnHis(圖4，18)。
將RSV α和β亞單位克隆至桿狀病毒表達載體。在此項工作的過程中，制備其中RSV RT β基因在桿狀病毒載體中被表達成氨基末端具有His6標記物形式的構(gòu)建體。然而，在構(gòu)建過程中導入的突變使得標記物的閱讀框架與β基因的不同。由于使用了此構(gòu)建體的部分來構(gòu)建最終的桿狀病毒表達載體，本文描述了其構(gòu)建過程。
為了在桿狀病毒載體中導入His6標記物和NdeI位點，將下列寡核苷酸退火并克隆至pFastBac Dual(Harris，R和Polayes，D.A，F(xiàn)ocus 196-8(1997)；圖5)中ACTG GAA TTC ATG CCA ATC CAT CAC CAT CAC CAT CAC CCG T(SEQ ID NO10)ACGT GTC GAC CAT ATG GAT GAC TAG GTG AAA CGG GTG ATG G(SEQ ID NO11)將兩種寡核苷酸配制于TE緩沖液中，使其濃度為100μM，在單個管中將5μl各種寡核苷酸制劑與15μl水和2μl 10倍React2緩沖液(500mM NaCl，500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，pH8.0)混合。將此試管置于65℃水浴中加熱，在60分鐘內(nèi)緩慢冷卻至25℃。所得產(chǎn)物為5+末端具有EcoRI位點(下劃線)、3’末端具有SalI位點(斜體)的雙鏈DNA分子5′-ACTGGAA TTCATG CCA ATC CAT CAC CAT CAC CAT CAC CCGTTT CAC CTA GTC ATC CAT ATG GTC GAC ACGT-3′(SEQ ID NO12)用EcoRI和SalI裂解此產(chǎn)物，通過標準技術(Harris，R和Polayes，D.A.，F(xiàn)ocus 196-8(1997))將所需片段克隆至載體pFastBac Dual的EcoRI-SalI位點，形成質(zhì)粒pFastBac Dual Nde(圖5)。將pAMP18BH-的NdeI-XhoI B片段克隆至pFastBac Dual Nde的NdeI-SalI位點，產(chǎn)生pDBH-(圖5，15)。
為了將RSV RT α基因克隆至桿狀病毒載體中，用SmaI和BspHI從pAMP1A上切下α基因并亞克隆至pFastBac Dual的NcoI-SmaI位點，產(chǎn)生pDA(圖5，19)。這樣將RSV RT α基因置于桿狀病毒P10啟動子的下游。用RsrII和SmaI切下RSVα肽基因和P10啟動子，克隆至pDBH-的RsrII-SmaI位點，形成pDABH-(圖4，20)。
為了用pDBH-KpnHis中羧基末端經(jīng)His6標記的β基因取代pDABH-中的RSV RT β基因，用NdeI裂解pDBH-KpnHis，用Klenow片段使位點成為平端，然后用SstI釋放羧基末端具有His6標記物的β基因(圖6)。用EcoRI裂解pDABH-，用Klenow片段使位點成為平端，然后通過用SstI消化除去β基因。將pFastBac Dual中于p10啟動子前克隆了α基因的平端SstI片段，即載體片段，與pDBH-KpnHis中含羧基末端經(jīng)His標記的β基因的平端SstI片段連接。用此構(gòu)建體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B細胞，選擇含有pDABH-His的轉(zhuǎn)化子(圖6，21)。
于1997年4月15日將含有質(zhì)粒pDABH-His的重組宿主細胞大腸桿菌DH10B(pDABH-His)保藏于美國農(nóng)業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心(NRRL)，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604 USA，保藏號為NRRL B-21679。
本領域技術人員使用保藏的質(zhì)粒和標準的基因工程技術(如上述的定點誘變等)，可以很容易制備編碼RSV RT之多種形式的α和/或β亞單位(如αRNA酶H-/β RNA酶H+；αRNA酶H+/β RNA酶H+；αRNA酶H+/βRNA酶H-；和αRNA酶H-/β RNA酶H-)的質(zhì)粒。
轉(zhuǎn)染昆蟲細胞以產(chǎn)生病毒和RSV RT。為了制備轉(zhuǎn)染昆蟲細胞所用的載體，首先必需將RSV RT基因構(gòu)建體插入桿狀病毒基因組中。一種插入方法是使用位點特異性的轉(zhuǎn)座子Tn7(Luckow，V.A重組DNA技術和應用，Prokop，A等編，紐約McGraw-Hill(1991))。在DH10Bac宿主細胞中，大多數(shù)桿狀病毒基因組顯現(xiàn)在低拷貝質(zhì)粒(“桿粒”)上，該質(zhì)粒在基因內(nèi)還含有Tn7插入位點(Harris，R和Polayes，D.A，F(xiàn)ocus 196-8(1997))。DH10Bac宿主細胞中的另一種質(zhì)粒產(chǎn)生的Tn7轉(zhuǎn)座酶利于Tn7的轉(zhuǎn)座，構(gòu)建在啟動子和克隆位點側(cè)翼有Tn7“右”和“左”區(qū)域的pFastBac DUAL。
為了將此構(gòu)建體插入桿粒表達載體，用pDABH-His轉(zhuǎn)化DH10Bac細胞，編碼RSV RT β基因(其合成由桿狀病毒多角體蛋白啟動子介導)和RSV RT α基因(其合成由桿狀病毒P10啟動子介導)的序列轉(zhuǎn)座之后，篩選轉(zhuǎn)座至桿粒上編碼β半乳糖苷酶α肽之位點后β-半乳糖苷酶活性的缺失(Harris，R和Polayes，D.A，F(xiàn)ocus 196-8(1997))。然后，通過稍加改動的標準微量制備法(Sambrook，J等，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港，紐約實驗室出版社(1989))從10ml轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物中制備桿粒DNA。使用陽離子脂質(zhì)Cellfectin(Anderson，D等，F(xiàn)ocus 1653(1995))，用約1μg桿粒DNA轉(zhuǎn)染Sf21昆蟲細胞。
為了擴展原代病毒，轉(zhuǎn)染后約72小時時從轉(zhuǎn)染細胞中取上清液，用1ml上清液感染35ml Sf21昆蟲細胞(約1.2×105個細胞/ml)。72小時之后，離心培養(yǎng)物(2,000rpm，10分鐘)，傾析上清液以用作繼代病毒原種。類似地，通過用0.1ml繼代儲液感染35ml Sf21細胞以擴展繼代病毒原種。
然后使用病毒原種感染Sf21細胞以表達RSV RT。在預備實驗中，發(fā)現(xiàn)感染后約72小時時，感染細胞表達的RT活性最高。為了檢測表達，用5ml病毒原種感染70ml Sf21細胞，感染后72小時，以1,000rpm離心5分鐘以收獲細胞，將細胞重新懸浮于PBS(占培養(yǎng)物體積的2.5％)中，以1,000rpm再離心5分鐘。除去上清液，將細胞儲存于-70℃待用。為了進行大規(guī)模生產(chǎn)，用2ml病毒原種感染2.8升Fernbach燒瓶中的600ml細胞，感染72小時后收獲細胞。實施例2分離RSV RNA酶H-RT為了提供純化的重組RSV H-RT，如實施例1所述在培養(yǎng)的昆蟲細胞中過量表達克隆的RSV H-RT，并通過親和和離子交換層析純化，所得RSV RT含有α和β亞單位。RSV RT分離提供了基本上純的RSV RT，其中已基本上除去了污染的酶和其它蛋白質(zhì)，但不必完全除去這種污染物。
緩沖液。所有緩沖液的pH都是在23℃時測定的，將緩沖液儲存于4℃待用。Crack緩沖液含有50mM Tris-HCl(pH7.9)，0.5M KCl，0.02％(v/v)曲通X-100和20％(v/v)甘油。使用前以所示終濃度將下列蛋白酶抑制劑(Boehringer Mannheim；Indianapolis，IN)加入Crack緩沖液中亮抑蛋白酶肽(2μg/ml)，Pefabloc(48μg/ml)，胃酶抑制劑A(2μg/ml)，芐脒(800μg/ml)和PMSF(50μg/ml)。緩沖液A含有20mMTris-HCl(pH7.9)，0.25M KCl，0.02％(v/v)曲通X-100和10％(v/v)甘油。緩沖液B是其中加入1M咪唑的緩沖液A。緩沖液S含有50mMTris-HCl(pH8.2)，0.02％(v/v)曲通X-100，10％(v/v)甘油，0.1mM EDTA和1mM二硫蘇糖醇(DTT)。緩沖液T是其中加入1M KCl的緩沖液S。緩沖液H含有20mM磷酸鉀(pH7.1)，0.02％(v/v)曲通X-100，20％(v/v)甘油，0.1mM EDTA和1mM DTT。緩沖液J是其中加入1M KCl的緩沖液H。儲存緩沖液含有200mM磷酸鉀(pH7.1)，0.05％(v/v)NP-40，50％(v/v)甘油，0.1mM EDTA，1mM DTT和10％(w/v)海藻糖。
制備提取物。融化冷凍的昆蟲細胞(25g)，4℃下，用50ml Crack緩沖液+抑制劑制備細胞懸浮液。4℃下，用Fisher 550超聲處理儀，以最大功率的25％超聲處理破碎細胞。4℃下，以27,000×g離心30分鐘以澄清破碎的粗提取物。
分離RSV RT。澄清后，于4℃，通過柱層析分級分離提取物并純化RSV RT。按照廠商的說明，用NiSO4使30ml Chelating Sepharose FastFlow柱(Pharmacia；Piscataway，NJ)帶電，并用99.5％緩沖液A+0.5％緩沖液B平衡該柱，再將澄清的粗提取物上樣于該柱。用1倍柱體積的99％緩沖液A+1％緩沖液B洗滌該柱，再用10個柱體積的98.5％緩沖液A+1.5％緩沖液B洗滌該柱。用10倍柱體積的98.5％緩沖液A+1.5％緩沖液B至75％緩沖液A+25％緩沖液B的線性梯度洗脫RT。
在純化過程中，用特異于逆轉(zhuǎn)錄酶的poly(C)-oligo(dG)檢測逆轉(zhuǎn)錄酶活性(Gerard G.F等，生物化學131632-1641(1974))。按文獻所述(Houts，G.E等，病毒學雜志，29517-522(1979))定義和檢測RT單位活性。使用poly(C)-oligo(dG)檢測法，集中ChelatingSepharose Fast Flow柱的RT活性峰級分(10至17％緩沖液B)，用等體積的緩沖液S稀釋，上樣于5ml已用緩沖液S平衡過的AF-Heparin-650M柱(TosoHaas；Montgomeryville，PA)中。用12倍柱體積的90％緩沖液S+10％緩沖液T洗滌之后，用15倍柱體積的緩沖液S至30％緩沖液S+70％緩沖液T的線性梯度洗脫該柱。集中RT活性峰級分(43至50％緩沖液T)，用2.5倍體積的緩沖液H稀釋，上樣于已用緩沖液H平衡過的Mono S HR 5/5柱(Pharmacia；Piscataway，NJ)中。用20倍柱體積的85％緩沖液H+15％緩沖液J洗滌之后，用20倍柱體積的85％緩沖液H+15％緩沖液J至50％緩沖液H+50％緩沖液J的線性梯度洗脫該柱，集中RT峰級分，對儲存緩沖液透析過夜，儲存于-20℃。
純化之后，經(jīng)SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)RSV H-RT均質(zhì)程度在95％以上。還發(fā)現(xiàn)純化的酶基本上沒被RNA酶和DNA酶污染，其RNA酶H活性大大降低。實施例3制備全長的cDNA分子酶。SuperScript II RT(SS II RT)是缺乏可測的RNA酶H活性的Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)RT(即“RNA酶H-RT”)的克隆形式，它得自Life Technologies公司(Rockville，Maryland)。M-MLV RT是具有完整的RNA酶H活性的克隆的鼠RT(即“RNA酶H+RT”)，它也得自Life Technologies公司。AMV RT是禽成髓細胞瘤病毒RT的RNA酶H+非克隆形式，它得自Seikagaku America公司。按實施例1和2所述制備RSV H-RT。重組的Tth DNA聚合酶得自嗜熱棲熱菌，它具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，是克隆的嗜熱DNA聚合酶，它得自Perkin Elmer。
合成的mRNA。將具有120-核苷酸3’poly(A)尾的7.5千堿基(Kb)長的合成mRNA(Life Technologies公司；Rockville，Maryland)用作模板以檢測多種酶單獨或組合的效力。
cDNA合成反應混合物。除非另有說明，反應混合物(各20μl)含有下列組分50mM Tris-HCl(24℃下pH為8.4)，75mM KCl，10mM二硫蘇糖醇，各為1mM的[3PP]dCTP(300cpm/pmole)，dGTP，dTTP和dATP，25μg/ml(p(dT)25-30)，125μg/ml 7.5Kb mRNA和35個單位的克隆大鼠RNA酶抑制劑。僅含RT或含有RT組合的反應混合物含有下列成分
當聯(lián)合使用RT時，首先加入一種酶，緊接著加入第二種酶的等分試樣。在使用一種酶的情況下，加入相同酶的第二個等分試樣作為對照以評估一種酶的量加倍后的作用。
于45℃將所有cDNA合成反應進行50分鐘，通過由RT催化32P-通過用酸沉淀cDNA產(chǎn)物部分并用閃爍計數(shù)器計數(shù)以測定cDNA總量。通過堿性瓊脂糖凝膠電泳(Carmichael，G.G和McMaster，G.K，酶學方法，65380-385(1980))分級分離其余反應混合物中32P-標記的cDNA產(chǎn)物。使凝膠干燥，通過放射自顯影確定cDNA產(chǎn)物的大小分布。使用放射自顯影膠片作為模板，切下干燥的凝膠，通過閃爍計數(shù)分析之以確定所合成的全長(7.5Kb)產(chǎn)物的級分。
表1和2分別顯示出通過單獨一種酶或多種酶的組合由7.5Kb mRNA所合成的cDNA和全長cDNA的總量?？傻贸鱿铝薪Y(jié)論1.當使用一種RT時，用RT的RNA酶H-形式得到最高產(chǎn)量的總產(chǎn)物和全長產(chǎn)物。用RSV H-RT或SS II RT時，總量幾乎雙倍于用RNA酶H+酶所得的最高產(chǎn)量(分別為1011和946ng對607ng)。當檢查全長產(chǎn)量時，從反應中除去RNA酶H的作用甚至更加顯著。在這種情況下，產(chǎn)量至少增加到3倍(分別為RSV H-和SS II RT的234和208ng對M-MLVH+RT和AMV RT的79和26ng)。這些結(jié)果顯示出從RT中除去RNA酶H具有顯著的積極作用。
2.當使用多種RT的組合時，觀察到幾種效果。混合不同來源的RT(RNA酶H-或RNA酶H+)會增加總產(chǎn)量和全長產(chǎn)量。這與具有不同中止位點的第二種RT可減少在第一種酶的獨特位點處的中止這一假說一致。然而，當聯(lián)合使用兩種不同的RNA酶H-RT時，得到最高產(chǎn)量的總產(chǎn)物和全長cDNA產(chǎn)物(見表1和2中的陰影部分)。這些結(jié)果表明兩種RNA酶H-酶協(xié)作合成全長的cDNA分子第一種酶合成截短的cDNA分子，然后經(jīng)由第二種酶的活性將該分子延伸為全長，因此，本發(fā)明的組合物和方法便于合成全長的cDNA分子。
1總cDNA產(chǎn)物的量(ng)；2未測。
1全長(7.5kb)cDNA產(chǎn)物的量；2未測在表1和2概述的混合實驗中，在可能對一種給定的RT而言為亞最適的條件下，將兩種逆轉(zhuǎn)錄酶同時加入反應中。這是同時使用禽和鼠RT時的情況，因為MgCl2的濃度被設置為5mM，介于鼠和禽RT的最適值3mM和7.5mM之間。另外，在這些實驗中，在含有熱穩(wěn)定性較差的鼠RT的反應中無法再利用禽RNA酶H-RT的熱穩(wěn)定性。
為了使用多種酶，且顧及到不同酶可能具有不同的最適條件這一事實，根據(jù)本發(fā)明可以依次加入或分開使用酶。例如，可在對各種RT為最適的反應條件下，在含不同RT的不同反應管中由相同RNA的不同等分試樣合成cDNA。隨后，在進行其它操作之前混合各個反應中得到的cDNA?；蛘撸稍谝粋€反應管中單獨和連續(xù)使用RT以進行cDNA合成。即首先可在最適反應條件下使用SuperScript II來拷貝RNA群體，然后將同一反應管中的條件調(diào)節(jié)為對RSV H-RT而言為最適，并在升高的溫度下用禽RT進行進一步合成。實施例4克隆和表達禽成髓細胞瘤病毒(AMV)RT和AMV RNA酶H-(AMVH-)RT一般方法本發(fā)明的AMV RT是禽逆轉(zhuǎn)錄病毒RT的克隆形式，AMV H-RT是克隆的AMV RT的變體，其中α和β亞單位因單個氨基酸的改變被突變，從而消除了RNA酶H活性。只突變了α亞單位(β亞單位的RNA酶H結(jié)構(gòu)域未突變)時，也產(chǎn)生了RNA酶H活性大大降低的AMV RT。使用按下述改良的標準分子生物學方法(例見Sambrook，J等，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港，紐約實驗室出版社(1989))進行突變和質(zhì)粒構(gòu)建。完全按照實施例1中RSV RT克隆和表達一節(jié)中所述進行質(zhì)粒制備、PCR、凝膠電泳、DNA片段的分離和克隆，昆蟲細胞培養(yǎng)和桿狀病毒制備?？寺『捅磉_編碼AMV RT α和β亞單位的基因為了克隆AMV RT，由得自Life Science(St.Petersburg，F(xiàn)lorida)的純化的AMV(Grandgenett，D.P等，應用微生物學，26452(1973))制備AMV病毒RNA(Strauss，E.M等，病毒學方法雜志，1213(1980))。根據(jù)試劑盒手冊中的說明，用cDNA合成和質(zhì)?？寺∷玫腟uperScript質(zhì)粒系統(tǒng)(Life Technologies公司Rockville，Maryland)由AMV病毒RNA制備AMV RT cDNA。使用特異于AMV RT的引物在cDNA中添加NotI位點。制備之后，將AMV RT cDNA克隆至已用SalI和NotI處理的pSPORT1中，產(chǎn)生含有AMV RT基因的載體(pSPORT8)(圖22)。
通過蛋白酶水解加工較大的多肽前體產(chǎn)生AMV RT的α和β亞單位(Gerard，G.F核酸合成和修飾酶，第I卷DNA酶，Jacob，S.T編，Boca Raton，F(xiàn)loridaCRC出版社，p1-38(1983))。為了免除對蛋白酶水解加工的需求，可誘變AMV RT的編碼序列并亞克隆之，以使α和β亞單位都由具有標準起始和終止翻譯信號的基因編碼。為了制備RNA酶H-構(gòu)建體，α和β基因的RNA酶H區(qū)域都被誘變，以相同的方法也可構(gòu)建任何亞單位組合(如α RNA酶H-/β RNA酶H+；αRNA酶H+/β RNA酶H+；α RNA酶H+/β RNA酶H-；α RNA酶H-/β RNA酶H-)。已發(fā)現(xiàn)AMVRT α RNA酶H-/β RNA酶H+的RNA酶H活性大大降低(約為野生型的5％)。在β亞單位的羧基末端添加編碼親和標記物的序列。
由AMV RNA合成cDNA。使用與AMV RT基因3’末端互補的3’引物將AMV RNA拷貝成DNA，該引物將在基因的3’末端添加NotI位點(圖22)。通過加入SalI銜接子將所得cDNA的5’末端制成SalI末端。然后將此cDNA克隆至經(jīng)SalI-NotI裂解的載體(pSPORT1)中。使用Superscript II RT(Gerard，G.F等，F(xiàn)OCUS 1166(1989))，并用基因特異性的引物(寡核苷酸#1)代替NotI引物-銜接子來合成cDNA的第一鏈cDNA寡核苷酸#1(SEQ ID NO13)5′GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCATTAACTCTCGTTGGCAGC 3′于16℃，聯(lián)合使用DNA聚合酶I與大腸桿菌RNA酶H和DNA連接酶，隨后用T4 DNA聚合酶處理末端以合成第二條鏈。將cDNA去蛋白化，并用乙醇沉淀，再與由寡核苷酸#2和#3組成的SalI銜接子連接寡核苷酸#2(SEQ ID NO14)5′TCGACCCACGCGTCCG 3′寡核苷酸#3(SEQ ID NO15)5′CGGACGCGTGGG 3′添加銜接子之后，用NotI消化。在由cDNA克隆試劑盒提供的1ml預裝柱上對cDNA進行大小分級分離。由摻入的32P標記物的比活計算各個級分中cDNA的量，通過瓊脂糖凝膠上的放射自顯影測定cDNA的大小。選擇大于3Kb的那些級分用于克隆。
將AMV cDNA克隆至載體中。將cDNA連接至經(jīng)SalI-NotI裂解的pSPORT1載體中，然后使用連接的cDNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌MAX EFFICIENCYDH10BTM感受態(tài)細胞(Life Technologies公司，Rockville，Maryland)。轉(zhuǎn)化后，將細胞等分試樣鋪于含氨芐青霉素的LB平板上。挑選12個菌落，培養(yǎng)1ml培養(yǎng)物用于微量制備。用限制性酶SalI，MluI，PstI，ApaI，DraIII，SphI和BglII消化之后，進行凝膠電泳以檢查某些片段。選擇出一個質(zhì)粒pSPORT8，因為其中的插入物大得足以編碼AMV RT基因(3Kb)，并且其中存在PstI位點，這表明存在AMV RT基因的5’末端(圖22)。
誘變和亞克隆AMV RT β亞單位的氨基末端，羧基末端和中間部分。誘變AMV RT基因以在編碼成熟RT多肽之序列的氨基末端添加ATG密碼子和EcoRI位點。這一誘變是使用pSPORT8作為靶和下列寡核苷酸經(jīng)PCR完成的寡核苷酸#4(SEQ ID NO16)5′AUG GAG AUC UCU GAA TTC ATG ACT GTT GCG CTA CAT CTGGCT 3′寡核苷酸#5(SEQ ID NO2)5′AAC GCG UAC UAG U GTT AAC AGC GCG CAA ATC ATG CAG 3′按上述進行PCR，純化PCR產(chǎn)物，用DpnI處理PCR反應產(chǎn)物以破壞靶，通過UDG克隆法(Buchman，G.W等，F(xiàn)ocus 1536(1993))將PCR產(chǎn)物克隆至pAMP18中以形成質(zhì)粒pAMVN(圖23，26)。
誘變并克隆了氨基末端之后，使用下列寡核苷酸，經(jīng)PCR在pSPORT8中AMV RT β亞單位基因的羧基末端添加His6親和標記物、XhoI位點和翻譯終止密碼子寡核苷酸#6(SEQ ID NO3)5′CUA CUA CUA CUA GGT ACC CTC TCG AAA AGT TAA ACC 3′寡核苷酸#7(SEQ ID NO9)5′CAU CAU CAU CAU GAG GAA TTC AGT GAT GGT GAT GGT GATGTG CAAA AAG AGG 3′按上述進行PCR，純化PCR產(chǎn)物，用DpnI處理PCR反應產(chǎn)物以破壞靶，通過UDG克隆法(Buchman，G.W等，F(xiàn)ocus 1536(1993))將PCR產(chǎn)物克隆至pAMP18中以形成質(zhì)粒pAMVC(圖23，27)。
為了加入AMV RT β亞單位的中間部分，將pSPORT8中編碼AMV RTβ亞單位中間部分的2.3kb HpaI-KpnI片段克隆至pAMVN的HpaI-KpnI位點，形成pAMVNM(圖23，28)。為了加入AMV RT β亞單位的羧基末端，因pAMVC具有兩個KpnI位點(圖27)，故用KpnI部分裂解，再用ScaI完全裂解，然后分離出含有AMV RT羧基末端的3Kb片段，將此片段與pAMVNMH-(圖29)的3.5Kb ScaI-KpnI片段連接，形成pAMVBH-(圖23，30)。
將β亞單位誘變?yōu)镽NA酶H-。RSV RT和AMV RT基因是相關的(RSV-C的GenBank序列為J02342，J02021和J02343；AMV的為L10922，L10923，L10924)。在RNA酶H區(qū)域的一段短距離內(nèi)，這些基因編碼相同的氨基酸序列。如上文實施例1所述，在克隆和誘變RSV RT基因的過程中，通過定點誘變制備了RSV RT β基因的RNA酶H-衍生物。所用寡核苷酸(寡核苷酸#8)將氨基酸Asp450改變?yōu)锳la450，并導入了SstII位點(下劃線)。寡核苷酸#8GGA CCC ACT GTC TTT ACC GCG GCC TCC TCA AGC ACCRSV RT β基因中具有RNA酶H-突變的質(zhì)粒為pAMP18BH-(圖2，14)。將pAMP18BH-中129bp的BsrGI-BstEII片段克隆至pAMVNM的BsrGI-BstEII位點，取代此質(zhì)粒中的RNA酶H+區(qū)域，形成pAMVNMH-(圖23，29)。這一取代是通過將AMV β基因中的Asp450改變?yōu)锳la450而達到的，而未改變?nèi)魏纹渌被?。為了將β亞單位恢復為RNA酶H+，可使用具有野生型序列的寡核苷酸引物。
誘變和亞克隆編碼AMV RT α亞單位的基因。為了產(chǎn)生編碼AMV RTα亞單位的基因，使用寡核苷酸#9和#10誘變pAMVNM中AMV RT基因的氨基末端，以在禽逆轉(zhuǎn)錄病毒的蛋白酶p15正常地裂解前體聚蛋白質(zhì)得到α亞單位的位點處導入翻譯終止密碼子寡核苷酸#9(SEQ ID NO6)5′CAU CAU CAU CAU CCC GGG TTA ATA CGC TTG GAA GGT GGC 3′寡核苷酸#10(SEQ ID NO7)5′CUA CUA CUA CUA TCA TGA CTG TTG CGC TAC ATC TG 3′PCR循環(huán)條件為94℃ 5分鐘，接著是55℃ 15秒/72℃ 2分鐘/94℃15秒共8輪循環(huán)，然后是72℃ 2分鐘。用DpnI處理PCR反應產(chǎn)物以破壞靶，通過UDG克隆法(Buchman，G.W等，F(xiàn)ocus 1536(1993))將PCR產(chǎn)物克隆至pAMP18中以形成質(zhì)粒pAMVA(圖24，31)。為了制備AMV RT α亞單位的RNA酶H-等位基因，使用pAMVBH-作為靶，根據(jù)上述方法形成質(zhì)粒pAMVAH-(圖24，32)。
將AMV RT α和β基因克隆至pFastBac Dual中。用SmaI和BspHI從pAMVA上切下α基因，并亞克隆至pFastBac Dual(pD；圖33)的NcoI-PvuII位點，產(chǎn)生pDAMVA(圖25，34)。類似地，由pAMVAH-克隆RNA酶H-AMV RT α基因，形成質(zhì)粒pDAMVAH-(圖25，35)。在這兩個質(zhì)粒中，AMV RT α基因均位于桿狀病毒P10啟動子的下游。用EcoRI從pAMVBH-切下RNA酶H-AMV RT β基因，并克隆至pDAMVA的EcoRI位點。選擇克隆，所述克隆中EcoRI插入物的定向使得AMV RT β基因位于多角體蛋白啟動子的下游，形成質(zhì)粒pDAMVABH-(圖25，36)。在此構(gòu)建體中，AMV RT α基因為RNA酶H+，而β基因為RNA酶H-。用RsrII和NotI從pDAMVABH-上切下AMV RNA酶H-RT β基因和多角體蛋白啟動子，克隆至pSPORT1的RsrII-NotI位點，形成質(zhì)粒pJAMVBH-(圖25，37)。用RsrII和NotI從pJAMVBH-上切下AMV RNA酶H-RT β基因和多角體蛋白啟動子，克隆至pDAMVAH-的RsrII-NotI位點，形成質(zhì)粒pDAMVAH-BH-(圖25，38)。
于1997年6月17日將含有質(zhì)粒pDAMVABH-的重組宿主細胞大腸桿菌DH10B(pDAMVABH-)保藏于美國農(nóng)業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心(NRRL)，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604 USA，保藏號為NRRL B-21790。
本領域技術人員使用保藏的質(zhì)粒，和標準的基因工程技術(如上述的定點誘變等)，可很容易制備編碼AMV RT之多種形式的α和/或β亞單位(如α RNA酶H-/β RNA酶H+；αRNA酶H+/β RNA酶H+；αRNA酶H+/βRNA酶H-；和α RNA酶H-/β RNA酶H-)的質(zhì)粒。
轉(zhuǎn)染昆蟲細胞以產(chǎn)生病毒和AMV RT。為了制備轉(zhuǎn)染昆蟲細胞所用的載體，首先必需將AMV RT基因構(gòu)建體插入桿狀病毒基因組中。使用位點特異性的轉(zhuǎn)座子Tn7，按照實施例1中所述的將RSV RT基因構(gòu)建體插入桿粒的方法，進行插入。用質(zhì)粒pDAMVABH-轉(zhuǎn)化DH10Bac細胞，編碼AMV RT β基因(其合成由桿狀病毒多角體蛋白啟動子介導)和AMV RTα基因(其合成由桿狀病毒P10啟動子介導)的序列轉(zhuǎn)座之后，篩選轉(zhuǎn)座至桿粒上編碼β半乳糖苷酶α肽之位點后β-半乳糖苷酶活性的缺失(Harris，R和Polayes，D.A，F(xiàn)ocus 196-8(1997))。然后，按實施例1所述，通過稍加改動的標準微量制備法，從轉(zhuǎn)化子(10ml培養(yǎng)物)制備桿粒DNA。使用陽離子脂質(zhì)Cellfectin(Anderson，D等，F(xiàn)ocus1653(1995))，用約1μg桿粒DNA轉(zhuǎn)染Sf21昆蟲細胞。
為了擴展原代病毒，轉(zhuǎn)染后約72小時時從轉(zhuǎn)染細胞中取上清液，用1ml上清液感染35ml Sf21昆蟲細胞(約1.2×105個細胞/ml)。72小時之后，離心培養(yǎng)物(2,000rpm，10分鐘)，傾析上清液以用作繼代病毒原種。類似地，通過用0.1ml繼代原種感染35ml Sf21細胞以擴展繼代病毒原種。
然后使用病毒原種感染Sf21細胞以表達AMV RT。在預備實驗中，發(fā)現(xiàn)感染后約72小時時，感染細胞表達的RT活性最高。為了檢測表達，用5ml病毒原種感染70ml Sf21細胞，感染后72小時時，以1,000rpm離心5分鐘收獲細胞，將細胞重新懸浮于PBS(占培養(yǎng)物體積的2.5％)中，以l,000rpm再離心5分鐘。除去上清液，將細胞儲存于-70℃待用。為了進行大規(guī)模生產(chǎn)，用2ml病毒原種感染2.8升Fernbach燒瓶中的600ml細胞，感染72小時后收獲細胞。然后按實施例2所述分離RSV RT的方法分離AMV RT。實施例5在高于55℃的溫度下用逆轉(zhuǎn)錄病毒RT進行逆轉(zhuǎn)錄以前曾使用逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶，在37℃至42℃的溫度范圍內(nèi)催化mRNA逆轉(zhuǎn)錄(見RT供貨商LTI，Pharmacia，Perkin Elmer，Boehringer Mannheim和Amersham等的科技文獻)。人們普遍相信，在這些溫度下，mRNA的二級結(jié)構(gòu)會干擾逆轉(zhuǎn)錄(Gerard，G.F等，F(xiàn)OCUS1160(1989)；Myers，T.W和Gelfand，D.H.生物化學307661(1991))，并且在基因特異性逆轉(zhuǎn)錄過程(如RT-PCR)中，引物結(jié)合的特異性會降低，導致高的背景信號(Myers，T.W和Gelfand，D.H.生物化學307661(1991)；Freeman，W.N等，生物技術20782(1996))。因此需要在更高的溫度下，即高于55℃的溫度下進行RNA逆轉(zhuǎn)錄，以便減輕這些問題。
如上所述，一般不在高于37℃至42℃的溫度下使用逆轉(zhuǎn)錄病毒RT拷貝RNA，因為這些嗜中溫酶的熱穩(wěn)定性是有限的。然而，最近據(jù)報道可在50℃，最高至55℃的溫度下使用AMV RT進行小擴增子(＜500個堿基)的RT-PCR(Freeman，W.N等，生物技術20782(1996)；Mallers，F(xiàn)等，生物技術18678(1995)；Wang，R.F等，生物技術12702(1992))。因除去了RNA酶H區(qū)域(Gerard，G.F等，F(xiàn)OCUS1160(1989))或因RT基因中的點突變(Gerard，G.F等，F(xiàn)OCUS1491(1992))而缺乏RNA酶H活性的M-MLV RT形式也可在50℃時使用以催化cDNA合成，但不能在55℃時使用。
因此，檢查了RNA酶H-RSV RT的熱穩(wěn)定性及其在較高溫度(即高于50℃)下進行逆轉(zhuǎn)錄反應以合成較大cDNA的能力。方法酶和RNA。SuperScript RT(SS RT)，SuperScript II RT(SS II RT)和Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)RT均得自LTI。AMV RT得自SeikagakuAmerica公司，或按上文實施例4中所述制備之。SS RT是通過除去RT多肽的RNA酶H區(qū)域，使酶分子量為57KDa而不是78KDa，從而消除了RNA酶H活性的RNA酶H-型M-MLV RT(Gerard，G.F等，F(xiàn)OCUS1166(1989)；Kotewicz，M.L等，核酸研究16265(1988))。SS IIRT是通過在M-MLV RT的RNA酶H區(qū)域內(nèi)導入三個點突變，從而消除了RNA酶H活性的RNA酶H-型M-MLV RT(Gerard，G.F等，F(xiàn)OCUS1491(1992))。Rous相關病毒(RAV)RT得自Amersham。按實施例1和2所述克隆、表達和純化RSV RNA酶H-RT和RSV RNA酶H+RT。用作模板的RNA是得自LTI的1.4，2.4，4.4和7.5Kb的合成RNA，它們的3’末端各含有120個核苷酸長的poly(A)尾。合成的CAT mRNA得自LTI。
測定逆轉(zhuǎn)錄酶功能性熱穩(wěn)定性的模型系繞。使用1.4，2.4，4.4和7.5Kb的mRNA混合物檢測多種RT在不同溫度下合成全長cDNA拷貝的能力。由RT催化32P-標記的脫氧核糖核苷三磷酸前體的摻入來放射性標記所合成的cDNA產(chǎn)物。通過堿性瓊脂糖凝膠電泳(Carmichael，G.G和McMaster，G.K，酶學方法，65380-385(1980))分級分離32P-標記的cDNA產(chǎn)物。使凝膠干燥，通過放射自顯影確定cDNA產(chǎn)物的大小分布。使用放射自顯影膠片作為模板，從干燥的凝膠上切下1.4，2.4，4.4和7.5Kb的全長cDNA帶，通過閃爍計數(shù)確定所合成的各個全長產(chǎn)物的量。
cDNA合成反應條件。所有cDNA合成反應都在所示溫度下進行30或50分鐘。除非另有說明，所有反應混合物都為20μl并含有下列組分50mM Tris-HCl(24℃下pH為8.4)，75mM KCl，10mM二硫蘇糖醇，各為1mM的[32P]dCTP(300cpm/pmole)，dGTP，dTTP和dATP，25μg/mlp(dT)25-30，各為12.5μg/ml的1.4，2.4，4.4和7.5Kb mRNA和35個單位克隆的大鼠RNA酶抑制劑。另外，反應混合物各含有下列成分<
含有除酶以外的所有組分的該反應混合物預先置于所需溫度下保溫3分鐘，然后加入RT起始cDNA合成。
半壽期測定。通過將各管RT置于所需溫度下保溫適當長的時間并通過將管置于冰上終止保溫來測定RT的半壽期。在20μl含有50mMTris-HCl(pH8.4)，75mM KCl，7.5mM MgCl2，10mM二硫蘇糖醇，50μg/mlCAT mRNA，25μg/ml p(dT)12-18，和350-700單位/ml RT的等分試樣中保溫RSV RT，RAV RT和AMV RT。在除MgCl2為3mM，酶為2,500個單位/ml外，其余組分相同的混合物中保溫鼠RT(SS RT，SS II RT，M-MLV RT)。檢測各管等分試樣(禽RT為5μl，鼠RT為1μl)在單位檢測反應混合物中的RT活性以測定殘留的RT活性。
單位檢測試驗。單位檢測反應混合物(50μl)含有50mMTris-HCl(pH8.4)，40mM KCl，6mM MgCl2，10mM二硫蘇糖醇，500μM[3H]dTTP(30cpm/pmol)，0.5mM poly(A)和0.5mM(dT)12-18。將反應混合物置于37℃保溫10分鐘，在GF/C玻璃纖維上用酸沉淀經(jīng)標記的產(chǎn)物，在閃爍計數(shù)器中計數(shù)。結(jié)果和討論除了極少數(shù)情況外，測定了RSV H+RT，RAV RT，AMV RT，RSV H-RT，M-MLV H+RT，SS RT和SS II RT在模板引物的存在下，于45℃，50℃，55℃和60℃時的半壽期。結(jié)果示于圖39和表3。表3.逆轉(zhuǎn)錄酶的半壽期1
1半壽期是由圖39所示數(shù)據(jù)測定的。2ND未測定。3ND未測定，因為此反應混合物中的半壽期太短以致于不能被精確測定。
圖39和表3所示的結(jié)果清楚地表明RNA酶H+RT(RSV，RAV和AMV)比M-MLV RT更加穩(wěn)定，在50℃時有較長的半壽期。另外，突變這些RT以產(chǎn)生其相應的RNA酶H-型進一步增加了其半壽期。最顯著的是，45℃，50℃和55℃時，RNA酶H-RSV RT比任何其它逆轉(zhuǎn)錄病毒RT的半壽期都高很多。因此，在RSV RT各個亞單位的RNA酶H區(qū)域中導入單個氨基酸的變化會使其在50℃時的半壽期增加約5倍。
熱穩(wěn)定性的增加對于高于50℃的溫度下cDNA合成的影響是顯著的。圖40顯示出45℃，50℃，55℃和60℃下，這些RT拷貝長度為1.4至7.5Kb之mRNA的能力的比較結(jié)果。除了RSV H-RT外，任何RT都不能在55℃或60℃時產(chǎn)生大量長度大于2.4Kb的產(chǎn)物。與之相比，RSVH-RT于55℃持續(xù)產(chǎn)生全長的7.5Kb cDNA，于60℃產(chǎn)生4.4Kb cDNA。圖41和42顯示出在圖40中表現(xiàn)最好的兩種RT(即SS II RT和RSV HRT)更詳細的比較。在高于55℃的溫度下，RSV H-RT能持續(xù)合成所有長度的cDNA，而SS II RT對于長度大于1Kb的cDNA僅產(chǎn)生低水平的量。
總之，這些結(jié)果表明RNA酶H-RSV RT比任何其它可商購的逆轉(zhuǎn)錄病毒RT的熱活性均高很多，可在60℃時用于合成較長(長達4Kb)的cDNA。50℃至60℃時RNA酶H-RSV RT熱活性增強是相對于RNA酶H+RT而言其熱穩(wěn)定性增加所致，這使RSV H-RT成為50℃至60℃時逆轉(zhuǎn)錄mRNA可使用的理想的酶。實施例6升溫時用禽RT進行逆轉(zhuǎn)錄在實施例5中(表3和圖39)中顯示出多種RT的半壽期。特別是報道了其中各個亞單位的RNA酶H區(qū)域經(jīng)突變消除了RNA酶H活性的克隆RSV RT的半壽期(實施例1；α和β亞單位中均發(fā)生Asp450→Ala)。
為了進一步檢查這些突變對RT半壽期的作用，按上述產(chǎn)生構(gòu)建體，其中一次僅突變兩個亞單位中的一個，得到多個突變體組合(如αRNA酶H-/β RNA酶H+；和αRNA酶H+/β RNA酶H-)。按實施例5方法一節(jié)所述，測定這些RSV RT以及克隆的AMV α RNA酶H-/β RNA酶H+RT的半壽期。
如表4所示，當RSV或AMV RT中的α亞單位被突變，而β亞單位為完整的野生型時，所得RT表現(xiàn)出比其它禽RT更強的熱穩(wěn)定性。使用實施例5方法一節(jié)中所述的模型系統(tǒng)檢查這些RT突變體功能性的熱穩(wěn)定性。對各個酶而言，發(fā)現(xiàn)其增加的熱穩(wěn)定性與改善的功能表現(xiàn)相關，例如α RNA酶H-/β RNA酶H+禽RT在55℃時顯示出最高的熱穩(wěn)定性(表4)，也表現(xiàn)出在多個升高的溫度下具有最高的功能活性(表5)。表4.RSV和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的半壽期<
表5.升溫下RSV RT的功能活性
實施例7產(chǎn)生禽逆轉(zhuǎn)錄酶的其它方法及其特性的鑒定如上文相關技術一節(jié)中所述，已詳細研究了3個逆轉(zhuǎn)錄病毒RT原型，它們是M-MLV RT，HIV RT和ASLV RT(包括RSV和AMV RT)。盡管這些逆轉(zhuǎn)錄病毒RT各以α和β亞單位異二聚體形式存在，但迄今為止仍無報道表明可以同時表達克隆的ASLV RT α和β基因，導致形成二聚體形式的αβ RT。
上文實施例1-4描述了能有效拷貝mRNA的αβ型RSV和AMV RT的克隆、表達和純化。通過在被桿狀病毒感染的昆蟲細胞中從雙啟動子載體共表達α和β基因，即可形成αβ RT。本實施例中提供的研究被設計為通過多種其它方法產(chǎn)生RSV αβ RT，所述方法已被成功用于克隆和表達HIV p66/p51 RT。另外，如下文所述，目前已克隆、表達和純化了RSV RT的各個亞單位，包括βp4，、β和α，還鑒定了這些亞單位拷貝mRNA的能力。材料和方法一般方法使用按下述改進的標準分子生物學方法(例見Sambrook，J等，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港，紐約實驗室出版社(1989))進行突變和質(zhì)粒構(gòu)建。按照實施例1中RSV RT克隆和表達一節(jié)中所述進行質(zhì)粒制備，PCR，凝膠電泳，DNA片段的分離和克隆，昆蟲細胞培養(yǎng)和桿狀病毒制備。在大腸桿菌中克隆和表達RSV RT在大腸桿菌中，嘗試多種方法由RSV RT βp4產(chǎn)生RSV αβ RT。
NdeI-XbaI片段的PCR。使用下列寡核苷酸，通過pJD100(圖7)的PCR(94℃5分鐘1個循環(huán)；94℃10秒，55℃15秒，72℃15秒15個循環(huán)；72℃5分鐘1個循環(huán))誘變RSV RT βp4基因的氨基末端以導入NdeI位點寡核苷酸#11(SEQ ID NO17)5′-ATT ATT CAT ATGACT GTT GCG CTA CAT CTG GC-3′寡核苷酸#12(SEQ ID NO18)5′-TAC GAT CTC TCT CCA GGC CAT TTT C-3′上述寡核苷酸#11中的NdeI位點以黑體和斜體表示，而寡核苷酸#11和#12中下劃線的堿基得自真正的RT基因序列。具有這兩個寡核苷酸的PCR產(chǎn)物在基因的開始處含有NdeI位點，并保留了RT基因中存在的XbaI位點。將PCR產(chǎn)物克隆至pUC18的NdeI和XbaI位點之間，形成pUC18#3。
定點誘變導入SmaI位點以克隆p15。將pJD100中含有整個RSV RT基因的3Kb PstI片段克隆至M13mp19中。使用下列誘變寡核苷酸，經(jīng)定點誘變(見實施例1)在RSV RT βp4基因的羧基末端導入SmaI位點，產(chǎn)生克隆RF-SmaI寡核苷酸#13(SEQ ID NO19)5′-ACT CGA GCA GCC CGG GAA CCT TTG-3′重構(gòu)RT基因。將RF-SmaI中2.8Kb的SmaI-PstI片段克隆至pUC18的SmaI/PstI位點，將此克隆稱為pUC18-PstI-SmaI。將pUC18#3中的NdeI-XbaI片段導入pUC18-PstI-SmaI中，以再現(xiàn)起始密碼子處具有NdeI位點的整個RSV RT βp4基因，將此克隆稱為pUC18-RT。
將整個RT基因克隆至pRE2中。將pUC18#3中的NdeI-XbaI片段克隆至表達載體pRE2中，產(chǎn)生pRE2-Nde-Xba。pRE2含有可誘導的λpL啟動子。將pUC18-PstI-SmaI中RSV RT βp4基因的其余部分作為NdeI-SstI片段克隆至經(jīng)XbaI和SstI消化的pRE2-Nde-Xba中，產(chǎn)生pRE2-RT。
將p15克隆至pRE2-RT中。通過RSV p15蛋白酶將RSV RT由RSV RTβp4加工為αβ異二聚體。為了制備出真正的αβ，按下述用RSV RT βp4基因克隆和表達p15蛋白酶基因。使用pJD100作為靶，通過上述方法進行PCR，以產(chǎn)生RSV p15蛋白酶基因。PCR所用的寡核苷酸如下寡核苷酸#14(SEQ ID NO20)5′-AT TAC CCGGGA GGA TATCAT ATGTTA GCG ATG ACA ATGGAA CAT AAA G-3′寡核苷酸#15(SEQ ID NO21)5′-A TAT GTC GAC TCA CAG TGG CCC TCC CTA TAA ATT TG-3′在上述寡核苷酸#14和#15中，黑體字母表示的是限制性位點(SmaI，NdeI和SalI)，而下劃線的堿基區(qū)域是核糖體結(jié)合位點。使用這些寡核苷酸的PCR產(chǎn)生了約450bp長的片段，用SmaI和SalI消化之并克隆至pUC19中，將此克隆稱為pUC19-p15。通過將450bp的SmaI-SalI片段亞克隆至SmaI/SalI位點而使p15基因?qū)雙RE2-RT中。將最終的質(zhì)粒稱為pRE2-RT.p15。
由pRE2-RT和pRE2-RT.p15表達RT。于30℃，在含有氨芐青霉素(100μg/ml)和氯霉素(30μg/ml)的EG肉湯中將含有pRE2-RT或pRE2-RT.p15的大腸桿菌CJ374培養(yǎng)至A590為0.5。于42℃將一半培養(yǎng)物誘導45分鐘，再于30℃快速生長2小時。將另一半置于30℃培養(yǎng)作為未誘導的對照。經(jīng)SDS-PAGE檢查未發(fā)現(xiàn)任何培養(yǎng)物產(chǎn)生任何可見的誘導蛋白質(zhì)，細胞提取物無一顯示出任何RT活性。
重新將RT.p15克隆至pRE1中。上述構(gòu)建體中未表達RT這一現(xiàn)象說明，可能(i)在PCR的過程中，RT基因中已導入突變使其失活，或(ii)在克隆過程中，λpL啟動子中產(chǎn)生了突變，因為據(jù)認為RT對大腸桿菌是有毒的。因此，將完整的RT.p15基因作為NdeI-SalI片段重新克隆至pRE1中，pRE1與pRE2相同，只是多克隆位點的方向相反，然后將構(gòu)建體導入大腸桿菌CJ374。另外，用pJD100中相同的HpaI-KpnI片段取代所得克隆中2269bp的HpaI-KpnI片段。取代后僅剩下約200bp的氨基末端區(qū)域得自PCR。另外，測序此區(qū)域(NdeI位點至HpaI位點)以進一步證實PCR未導致突變。此質(zhì)粒被稱為pRE1-RT.15。將此質(zhì)粒導入蛋白酶缺損的大腸桿菌菌株BL21。通過用XhoI和SalI消化質(zhì)粒pRE1-RT.15，重新環(huán)化質(zhì)粒，從而缺失掉上面的p15基因。所得質(zhì)粒被稱為pRE1-RT。
在攜有pRE1-RT和pRE1-RT.15的大腸桿菌CJ374和BL21中表達RT。按上述進行培養(yǎng)，檢測可溶性細胞提取物的RT活性。盡管活性非常低，但經(jīng)誘導的細胞提取物的RT活性顯然比未經(jīng)誘導的細胞提取物的高10倍。CJ374和BL21中的活性水平相似。pRE1-RT和pRE1-RT.15中的RT表達水平相似。
克隆RT基因，使其處于tac啟動子控制下。由于RSV RT βp4處于λpL啟動子之下不能被很好地表達，因此嘗試了在不同啟動子控制之下進行表達?？寺【哂泻筒痪哂衟15基因的RSV RT βp4基因，使其在tac啟動子的控制下。為了克隆RT基因，用NsiI消化pRE1-RT，用T4 DNA聚合酶使其成為平端，最后用XhoI消化。從瓊脂糖凝膠中純化RT片段。為了克隆RT.15基因，用NsiI消化pRE1-RT.15，用T4DNA聚合酶使其成為平端，最后用SalI消化。從瓊脂糖凝膠中純化RT.15基因組合片段。用NcoI消化載體pTrc99A(Pharmacia)，用Klenow片段使其成為平端，最后用SalI消化。純化大的載體片段并與純化的RT或RT.15片段連接。將所得構(gòu)建體導入大腸桿菌DH10B，篩選具有正確插入物的克隆，將所得克隆稱為pTrcRT和pTrcRT.15。
在tac啟動子控制下表達RT基因。于37℃，在緩沖加富的培養(yǎng)基中將攜有pTrcRT或pTrcRT.15的大腸桿菌細胞培養(yǎng)至A590為0.1或0.6，然后加入IPTG(1mM)以誘導RSV RT βp4表達。誘導后2小時收集細胞，不加入任何誘導物以類似的方法培養(yǎng)未經(jīng)誘導的培養(yǎng)物?？扇苄约毎崛∥镏械腞T酶活性等同于含λpL啟動子的構(gòu)建體中的RT酶活性。
表達蛋白質(zhì)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。RSV RT由分子量為94KD(β)和62KD(α)的兩個亞單位組成。α亞單位是得自β亞單位的蛋白酶水解片段。蛋白酶水解是通過RSV p15蛋白酶在體內(nèi)完成的。然而，當檢查攜有所述質(zhì)粒的經(jīng)誘導大腸桿菌提取物時，檢測到兩種誘導的蛋白質(zhì)，分子量為75KD和62KD。這兩種蛋白質(zhì)主要在大腸桿菌提取物的不可溶級分中。大腸桿菌中表達之后存在75KD而不是預期的94KD蛋白質(zhì)，這表明(i)在羧基末端附近具有突變，導致翻譯提前終止，(ii)在大腸桿菌的胞質(zhì)溶膠中具有蛋白酶水解，或(iii)具有RT內(nèi)部翻譯起始。當測序RT基因的羧基末端區(qū)域時，未發(fā)現(xiàn)可能會導致翻譯提前終止的突變。為了檢查是否有內(nèi)部翻譯起始，將RT基因作為HpaI-XhoI片段克隆至經(jīng)SmaI和SalI消化的pTrc99中。未檢測到誘導的蛋白質(zhì)，這表明沒有內(nèi)部起始產(chǎn)生75KD或62KD的蛋白質(zhì)。
在多種大腸桿菌宿主中表達RT。如上所述，在大腸桿菌DH10B，CJ374和BL21中檢查RSV RT的表達。這些大腸桿菌宿主都不產(chǎn)生αβRT，每種宿主中的RT活性水平都很低。由于M-MLV RT能在大腸桿菌N4830中很好地表達，HIV RT能在大腸桿菌RR1中很好地表達，因此檢查RSV RT在這兩個宿主中的表達水平。未發(fā)現(xiàn)其中任何一個宿主表達活性RT的能力比其它受試的宿主更好，它們也都不能產(chǎn)生任何全長的94KD蛋白質(zhì)。
將RT表達為融合蛋白。目前已很清楚，不能在大腸桿菌中很好表達的一些蛋白質(zhì)作為翻澤融合蛋白能較好地表達，其中能很好表達的基因編碼的蛋白質(zhì)形成融合蛋白的氨基末端。一個這種融合配對物，即硫氧還蛋白的基因位于載體pTrxfus(Genetics Institute；Cambridge，MA)中。因此檢查了與硫氧還蛋白融合的RSV RT βp4的表達水平。
在桿狀病毒系統(tǒng)中表達RSV RT的過程中，將RSV RT基因片段作為SmaI-XhoI片段克隆至pBacPAK9中以構(gòu)建pBacPak-RT(見下文)。為了制備硫氧還蛋白融合物，用XmaI(與SmaI識別位點相同)和PstI消化pBacPak-RT，在瓊脂糖凝膠上純化RT片段。用XmaI和PstI消化載體pTrxfus，純化大的載體片段。連接純化的片段，用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌CJ374和GI724或GI698(Genetic Institute，MA)。篩選具有正確插入物的克隆。當誘導培養(yǎng)物并檢測細胞提取物的酶活性時，未檢測到RT活性。然而，經(jīng)提取物的SDS-PAGE判斷，兩個經(jīng)誘導的培養(yǎng)物均產(chǎn)生了大量預期大小的不溶性融合蛋白。也檢測到其它融合蛋白。RSV RT β基因與GST(谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶)基因融合，RSV RT α基因與λCRO蛋白質(zhì)基因融合。在大腸桿菌菌株DH10B中，任一融合蛋白在trc啟動子的控制之下表達都會產(chǎn)生大量不可溶的適當分子量的蛋白質(zhì)，但在誘導細胞的提取物中幾乎檢測不到RT活性。構(gòu)建具有兩種融合(GST-β和CRO-α)的表達載體，其中通過誘導trc啟動子共表達融合蛋白。在大腸桿菌菌株DH10B中兩種融合蛋白的共表達產(chǎn)生了大量適當分子量的不可溶蛋白質(zhì)，但幾乎檢測不到RT活性。在桿狀病毒系統(tǒng)中分開克隆和表達編碼RSV RTα、β和βp4亞單位的基因在桿狀病毒系統(tǒng)中克隆RSV RT βp4為了在桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBacPAK9(Clontech)中克隆RSV RT βp4基因，通過PCR產(chǎn)生RSV RT基因片段。為了便于進行PCR，設計了下列寡核苷酸，其中在RSV βp4基因的開始處具有BamHI位點(黑體)和ATG起始密碼子寡核苷酸#16(SEQ ID NO22)5′-TAT TAG GAT CCCATGACT GTT GCG CTA CAT CTG GC-3′使用pJD100作為模板，用寡核苷酸#12和#16(分別為SEQ ID NO18和22)進行PCR。用BamHI和XbaI消化PCR產(chǎn)物，再與經(jīng)BamHI和XbaI消化的pBacPAK9連接。其中一個克隆pBP-RT(PCR)(圖43)被用于進一步克隆。為了重建完整的RT基因，用pRE1-RT.15中2500bp的HpaI-XhoI片段取代pBP-RT(PCR)中小的HpaI-XhoI片段，重建的質(zhì)粒被稱為pBP-RT(ATG)(圖44)。
將p15克隆至pBacPAK-RT(ATG)中。通過三步克隆法將RSV p15蛋白酶基因置于pBP-RT(ATG)中。首先，將pUC19-p15(見上文)中的p15基因片段作為KpnI-SalI片段亞克隆至pSport1(LTI)中，產(chǎn)生pSport-p15。然后，將pSport-p15中的p15片段作為NotI-SmaI片段亞克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcUW43中，產(chǎn)生pAcUW43-p15。進行此克隆的目的是將p15基因置于p10啟動子的控制之下。最后，將pAcUW43-p15中包括p10啟動子的p15基因作為XhoI-NotI片段亞克隆至pBP-RT(ATG)中，產(chǎn)生pBP-RT15(ATG)(圖45)。
在昆蟲細胞產(chǎn)表達RSV RT βp4。用pBP-RT15(ATG)和線性化桿狀病毒載體DNA(BaculoGold，Pharmingen)的混合物轉(zhuǎn)染昆蟲細胞(SF9)。在此系統(tǒng)中，pBP-RT15(ATG)質(zhì)粒和桿狀病毒DNA之間的重組產(chǎn)生了重組病毒基因組，基因組中含有位于多角體蛋白啟動子下游的RSV RT βp4基因。通過標準技術從上清液中分離重組病毒，制備病毒原種，選擇其中一個供進一步研究。用純的病毒原種感染昆蟲細胞，在感染后不同時間收獲感染細胞。在感染細胞中可很容易檢測到RT活性。
產(chǎn)生RNA酶H-RSV RT。實施例1中詳細描述了在RSV RT βp4基因的RNA酶H區(qū)域產(chǎn)生突變的過程。為了在pBP-RT(ATG)中導入突變，用M13RTH-(圖13)的HpaI-KpnI片段取代pBP-RT(ATG)中的HpaI-KpnI片段，新構(gòu)建的質(zhì)粒被稱為pBP-RT(H-)ATG。用pBP-RT(H-)和線性化桿狀病毒載體DNA(BaculoGold，Pharmingen)的混合物轉(zhuǎn)染昆蟲細胞(SF9)。pBP-RT(H-)質(zhì)粒和桿狀病毒DNA之間的重組產(chǎn)生了重組病毒基因組，其中含有位于多角體蛋白啟動子下游的RSV RT βH-p4基因。通過標準技術從上清液中分離重組病毒。用病毒原種感染昆蟲細胞，在感染后不同時間收獲感染細胞，在感染細胞中可很容易檢測到RT活性。
將組氨酸標記物結(jié)合于RSV RT βp4上。用BamHI和XbaI裂解pBP-RT(H-)，將具有RSV RT βp4基因氨基末端的0.9kb片段克隆至pFastBacHT的BamHI-XbaI位點，(通過翻譯融合)產(chǎn)生氨基末端具有組氨酸標記物的βp4部分構(gòu)建體(pFBHTβp4)。將pBP-RT(H-)中具有RSVRT βH-p4羧基末端的2kb XbaI-XhoI片段插入pFBHTβp4的XbaI-XhoI位點，產(chǎn)生pFBH-Tβp4。將pFBH-Tβp4轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10Bac細胞中，組氨酸標記的RSV RT βH-p4基因被轉(zhuǎn)座至桿粒中。分離桿粒DNA，將其轉(zhuǎn)染至SF9感染細胞中。使用由昆蟲細胞培養(yǎng)物制備的病毒制品感染SF21細胞，分離并鑒定感染細胞中組氨酸標記的RSV RT βH-p4。
轉(zhuǎn)染昆蟲細胞。使用Baculogold病毒(Pharmingen，CA)和pBP-RT(H-)ATG產(chǎn)生重組病毒以轉(zhuǎn)染Sf9細胞。在兩個6孔(60mm)組織培養(yǎng)板的10個孔中接種1×106個Sf9細胞(LTI)。于27℃使細胞貼壁30分鐘，當細胞貼壁時，取10個小管，各加入200μl Sf-900II SFM培養(yǎng)基(LTI)，在管1中加入500ng Baculogold和2μg pBP-RT(H-)ATG，管2中加入250ng Baculogold和1μg pBP-RT(H-)ATG，管3中加入125ngBaculogold和500ng pBP-RT(H-)ATG。管6至管9中含有36μlLipofectin(LTI)。將管1，管2，管3，管4和管5中的內(nèi)容物分別轉(zhuǎn)移到管6，7，8，9和10中。在各個管中加入2ml Sf-900 II SFM。除去各個孔中的培養(yǎng)基，將2ml DNA/lipofectin混合物分散到兩個孔中，各加1ml。因此，含有管1和6，2和7，和3和8之混合物的孔中含有不同量的DNA混合物；含有管4和9之混合物的孔是含有l(wèi)ipofectin但不含DNA的對照；含有管5和10之混合物的孔是既不含lipofectin也不含DNA的對照。將培養(yǎng)板置于27℃保溫4小時，除去培養(yǎng)基，換入4ml新鮮的Sf-900 II SFM，將培養(yǎng)板置于27℃再保溫72小時。取出含DNA孔中的噬菌體上清液，標記為原代噬菌體原種。通過用1ml原代噬菌體原種感染1×106個Sf9細胞進行第二次感染，以擴增重組噬菌體。將培養(yǎng)板置于27℃保溫48小時，收集噬菌體原種。
注射昆蟲幼蟲。按文獻所述(Medin，J.A等，分子生物學方法3926(1995))，用攜有pBP-RT(H-)ATG的重組病毒注射粉紋夜蛾幼蟲并收獲幼蟲。在桿狀病毒系統(tǒng)中表達RSV RT αH-將pDA(圖19)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10Bac細胞中，RT αH-基因被轉(zhuǎn)座至桿粒中。純化桿粒DNA，將其轉(zhuǎn)染至SF21昆蟲細胞中。使用由感細胞培養(yǎng)物制備的病毒制品感染SF21細胞，分離并鑒定感染細胞中的RSV RT αH-。在桿狀病毒系統(tǒng)中表達RSV RT βH-His用RsrII和PstI裂解pDABH-His(圖21)，將含有βH-His基因的2.6kb片段克隆至pFastBac的RsrII-PstI位點。將pFBBH-His轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10Bac細胞中，RT βH-His基因被轉(zhuǎn)座至桿粒，純化桿粒DNA，將其轉(zhuǎn)染至SF21昆蟲細胞中。使用由感染細胞培養(yǎng)物制備的病毒制品感染SF21細胞，分離并鑒定感染細胞中的RSV RT βH-His。克隆和表達編碼其中聚合酶活性位點突變了的RSV αβ RT的基因產(chǎn)生聚合酶結(jié)構(gòu)域被突變的RSV RT。將RSV RT肽序列與HIV RT，M-MLV RT的序列和其它RT基因的序列進行排列對比，結(jié)果表明RSV RT聚合酶結(jié)構(gòu)域中可能存在一個催化殘基D110(第110位的天冬氨酸殘基)。根據(jù)文獻，HIV RT較大鏈中相應氨基酸由D(天冬氨酸)至E(谷氨酸)的突變會使聚合酶活性幾乎完全喪失。通過用M13KO7感染大腸桿菌DH5αF’IQ/pJB-His細胞從pJB-His中分離出單鏈DNA，用下列寡核苷酸經(jīng)定點誘變(詳細方法見實施例1)突變此DNA寡核苷酸#17(SEQ ID NO23)5′-GCAATCCTTGAGCTCTAAGACCATCAGGG 3′此寡核苷酸誘導第110位或RSV RT催化結(jié)構(gòu)域中的天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼?D110E)，并添加了SstI位點(黑體)，形成質(zhì)粒pJBD110E-His(圖48)。通過將pJBD110E-His中460bp的NheI-Eco47III片段插入經(jīng)NheI-Eco47III裂解的pDA的6.5kb片段中，將此突變位點導入RSV RT α基因，形成pDAD110E(圖49)。通過將460bp的NheI-Eco47III片段插入經(jīng)NheI-Eco47III裂解的pFBBH-His(圖46)中，將D110E突變導入β基因，形成pFBBD110E-His(圖50)。將pFBBD110E-His中2.6kbRSV RT βD110E基因作為2.6kb的RsrII-EcoRI片段克隆至pDABHis(圖51)中替代RSV RT β-His基因，形成pDABD110EHis(圖52)。用XhoI+PvuI裂解pDABHis，將4.6kb含β基因的片段與4.9kb pDAD110E XhoI-PvuI片段連接，形成pDAD110EBHis(圖53)。將4.6kb含βD110E基因的pDAD110EBHis XhoI-PvuI片段與4.9kb pDAD110E XhoI-PvuI片段連接，形成pDAD110EBD110E(圖54)(盡管其名稱變短了，但仍具有組氨酸標記物)。用pDAD110EBHis，pDABD110EHis和pDAD110EBD110E轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B-Bac細胞，RT基因被轉(zhuǎn)座至桿粒中，純化桿粒DNA，將其轉(zhuǎn)染至SF21昆蟲細胞中。使用由感染細胞培養(yǎng)物制備的病毒制品感染SF21細胞，分離并鑒定感染細胞中的RSV RT。
下表概述了3個突變體質(zhì)粒，其中“w.t.”指的是第110位的野生型氨基酸(D，天冬氨酸)，D110E指的是第110位的突變(D至E，谷氨酸)質(zhì)粒α βpDABHis w.t.w.t.pDABD110EHisw.t.D110EpDAD110EBHisD110E w.t.pDAD110EB110E D110E D110E在酵母中克隆和表達RSV βp4 RT克隆RSV βp4 RT基因。用EcoRI消化得自InVitrogen(CA)的pHIL-D2載體，用Klenow片段使其成為平端并用堿性磷酸酶處理。用NdeI消化pRE1-RT.15并用Klenow片段使其成為平端。NdeI消化產(chǎn)生了不含p15蛋白酶基因的完整RSV RT基因。連接片段，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，選擇有以適當方向插入的插入物的正確克隆。8個受試克隆中有2個具有正確方向的RT基因片段。將其中一個克隆pHILD2-RT用于進一步實驗。為了在此質(zhì)粒中導入RNA酶H-結(jié)構(gòu)域，用BamHI和XhoI消化pHILD2-RT，用pBacPAK-RT(H-)ATG中的BamHI-XhoI片段替代野生型片段。用SstII篩選最終的克隆，將克隆稱為pHILD2-RT(H-)。
轉(zhuǎn)化Pichia pastoris。根據(jù)InVitrogen推薦的方法，將Pichiapastoris GS115(InVitrogen)用于轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化之前，用NotI消化質(zhì)粒pHILD2-RT和pHILD2RT(H-)，并用苯酚氯仿提取和乙醇沉淀。轉(zhuǎn)化后在再生平板上產(chǎn)生了20個野生型RSV RT克隆和12個RSV H-RT克隆。篩選能在含甲醇的平板上生長的克隆，從最初的20個克隆(野生型RT)中選擇兩個推定的克隆，其中一個，即H1完全不能在甲醇中生長，另一個，即H2能在甲醇中非常緩慢地生長。對RSV H-RT克隆而言，從篩選的12個克隆中選擇3個，其中一個克隆，即H-3能在甲醇中非常緩慢地生長。另兩個，即H-4和H-5能在甲醇中中度生長。選擇克隆H1和H-3進行表達研究。
Pichia pastoris中的RSV βp4 RT表達?；旧习磸S商(InVitrogen)提供的用戶手冊所述培養(yǎng)和誘導克隆H1和H-3。同時培養(yǎng)和誘導含有β-半乳糖苷酶基因(InVitrogen)的GS115作為對照。在GS115/β-gal細胞中未檢測到RT活性，但在H1(野生型RT)和H-3(H-RT)細胞中都可檢測到可測水平的活性。另外，活性隨誘導時間的增加而增加。分離RSV ββ，α和βp4βp4分離RSV ββ RT。按實施例2純化RSV αβ RT的方法純化RSV ββ RT，不同之處在于用55-62％緩沖液T從AF-肝素-650M柱，和用58-62％緩沖液J從Mono S HR 5/5柱上洗脫RSV ββ RT。經(jīng)SDS-PAGE檢測，RSV ββ RT為90％均質(zhì)。
分離RSV α RT。按實施例2純化RSV αβ RT的方法純化RSV α RT，不同之處在于用100％緩沖液A平衡Chelating Sepharose Fast Flow柱，并在澄清的粗提取物流過柱之后用100％緩沖液A洗滌。用10倍柱體積的100％緩沖液A至75％緩沖液A+25％緩沖液B的線性梯度洗脫RSV α RT。收集Chelating Sepharose Fast Flow柱上RT活性的峰級分(10-12％緩沖液B)，在收集物中加入二硫蘇糖醇和EDTA以使終濃度分別為1mM和0.1mM，將收集物對95％緩沖液S+5％緩沖液T透析過夜。將經(jīng)透析的收集物上樣于22ml用緩沖液S平衡的AF-肝素-650M柱中，用9倍柱體積的95％緩沖液S+5％緩沖液T洗滌之后，用9倍柱體積的95％緩沖液S+5％緩沖液T至60％緩沖液S+40％緩沖液T的線性梯度洗脫柱，收集RT活性的峰級分(11-20％緩沖液J)，對97.5％緩沖液H和2.5％緩沖液J透析3至4小時。將經(jīng)透析的收集物上樣于3.5ml用100％緩沖液H平衡過的磷酸纖維素柱(Whatman)中，用12倍柱體積的97.5％緩沖液H+2.5％緩沖液J洗滌之后，用14倍柱體積的97.5％緩沖液H+2.5％緩沖液J至60％緩沖液H+40％緩沖液J的線性梯度洗脫柱，收集RT活性的峰級分(12-20％緩沖液J)，對99％緩沖液S+1％緩沖液T透析過夜。將經(jīng)透析的收集物上樣于用緩沖液S平衡過的Mono SHR 5/5柱中，用10倍柱體積的100％緩沖液S洗滌之后，用20倍柱體積的100％緩沖液S至75％緩沖液S+25％緩沖液T的線性梯度洗脫柱，收集RT峰級分(15-17％緩沖液T)，對儲存緩沖液透析過夜，儲存于-20℃。經(jīng)SDS-PAGE判斷，RSV α RT為80％均質(zhì)。
分離RSV βp4βp4 RT。按實施例2純化RSV αβ的方法純化RSVβp4βp4 RT，不同之處在于將從Chelating Sepharose Fast Flow柱中收集的RT級分對90％緩沖液H+10％緩沖液J透析過夜。RSV βp4βp4RT在此緩沖液中沉淀。離心回收RT，溶解于含0.5M KCl的儲存緩沖液中，儲存于-20℃。經(jīng)SDS-PAGE判斷，RSV βp4βp4 RT均質(zhì)程度在95％以上。估計桿狀病毒感染的昆蟲細胞α，αβ和ββ RSV RT的量可以使用實施例2所述的層析方法分離病毒感染的昆蟲細胞的粗提取物中存在的任何α，αβ和ββ RSV RT。通過在Chelating SepharoseFast Flow柱上進行層析能將RSV RT α與其它兩種類型的酶分開，其中咪唑濃度＜30mM時，α不能結(jié)合或被洗脫出來，咪唑濃度＞50mM時，αβ和ββ一起被洗脫出來。這可能利用了β而不是α上存在的His6標記物。隨后，通過在肝素-650M上進行層析可將RSV αβ和ββ RT分開(αβ在0.45M KCl中洗脫，ββ在0.58M KCl中洗脫)。通過用poly(C)·oligo(dG)檢測定量逆轉(zhuǎn)錄酶(Gerard，G.F等，生物化學131632(1974))。用poly(C)·oligo(dG)測得RSV RT α，αβ和ββ的比活分別為140,000，90,000和6,000個單位/mg蛋白質(zhì)。克隆、表達、純化和使用RSV病毒蛋白酶p15在大腸桿菌中以連接的二聚體形式克隆和表達RSV病毒蛋白酶，并按文獻所述從包函體中純化該蛋白酶(Bizub，D等，生物化學雜志，2664951(1991))。
用RSV蛋白酶消化RSV βp4 RT所用的反應混合物(25μl)含有100mMNaPO4(pH6.0至7.0)，1mM 2-巰基乙醇，0.01％(w/v)曲通X-100，2.4MNaCl，5μg RSV βp4 RT和5μg RSV蛋白酶。4℃下保溫1至16小時。通過SDS-PAGE分析消化產(chǎn)物，并檢測其RT活性的回復。檢測RSV RT的RNA酶H活性通過監(jiān)測[3H]poly(A)在[3H]poly(A)·poly(dT)中的溶解情況來測定RSV RT的RNA酶H活性。反應混合物(50μl)含有50mMTris-HCl(pH8.4)，20mM KCl，10mM MgCl2，溶于[3H]poly(A)·poly(dT)中的各10μM[3H]poly(A)(300cpm/pmole)和poly(dT)，和10mM二硫蘇糖醇。將反應混合物置于37℃保溫20分鐘，加入80μl 20％(w/v)TCA和10μl 1mg/ml tRNA以終止保溫，離心后，通過在含水閃爍液中計數(shù)上清液測定溶解的[3H]poly(A)量。一個單位的RNA酶H活性是于37℃，在20分鐘內(nèi)溶解1nmole[3H]poly(A)的酶量。用poly(C)·oligo(dG)12-18檢測DNA聚合酶活性通過監(jiān)測不溶于酸的[3H]poly(dG)型poly(C)·oligo(dG)的合成，測定RSV RT的RNA依賴性DNA聚合酶活性。反應混合物(50μl)含有50mM Tris-HCl(pH8.4)，50mM KCl，10mM MgCl2，0.5mM poly(C)，0.2mMoligo(dG)12-18，0.5mM[3H]dGTP(40cpm/pmole)和10mM二硫蘇糖醇。將反應混合物置于37℃保溫10分鐘，將標記產(chǎn)物酸沉淀于GF/C玻璃纖維上，用閃爍計數(shù)器計數(shù)。一個單位的DNA聚合酶活性是于37℃，在10分鐘內(nèi)摻入1nmole[3H]dGTP的酶量。結(jié)果和討論產(chǎn)生RSV αβ RT的其它方法實施例1至6闡明了RNA酶H-型禽RT比RNA酶H+型RT能更有效地拷貝mRNA。這些實施例中描述的研究被設計成用于測定RSV RNA酶H-αβ RT拷貝mRNA的效力，所述RT是通過在幾個表達系統(tǒng)中共表達RSV α和β基因產(chǎn)生的。
在大腸桿菌中表達。已從大腸桿菌中純化出少量可溶性的和具有活性的α，ββ，βp4βp4和αβ RSV RT(Alexander，F(xiàn)等，病毒學雜志61534(1987)；Weis，J.H和Salstrom，J.S，美國專利4,663,290(1987)；Soltis，D.A和Skalka，A.M.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 853372(1988)；和Cherhov，A.P等，生物醫(yī)學科學249(1991))。然而，這些報道中由大腸桿菌表達的RSV RT大多數(shù)為不溶性的。
本實施例中的材料和方法一節(jié)記載了在大腸桿菌中表達大量易于純化的RSV RT蛋白的嘗試。一般說來，得到了與文獻所述類似的結(jié)果；即在大腸桿菌表達的RSV RT蛋白大多數(shù)為不溶性的，僅可觀察到少量的RT活性。由于RT水平低，故未嘗試純化大腸桿菌中表達的RSV RT。
在培養(yǎng)的昆蟲細胞中表達RSV RT βp4或β基因。當HIV p66的克隆基因被表達時，在大腸桿菌和酵母宿主細胞中產(chǎn)生了異二聚體形式的p66/p51 HIV RT(Lowe，D.M等，生物化學278884(1988)；Muller，B等，生物化學雜志26413975(1989)；和Barr，P.J等，生物技術5486(1987))。通過內(nèi)源性的宿主蛋白酶酶解加工p66/p66即可形成異二聚體。與之形成對照的是，在培養(yǎng)的昆蟲細胞中表達HIV RT p66基因僅產(chǎn)生了p66/p66同二聚體(Kawa，S等，蛋白質(zhì)的表達和純化4298(1993))。
在本發(fā)明的研究中，類似地發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的昆蟲細胞中表達RSV RTβp4基因時僅產(chǎn)生了βp4/βp4同二聚體(結(jié)果未附)；幾乎觀察不到加工為αβ或α。然而，當在這些細胞中表達RSV RT β基因時，產(chǎn)生了RSV RT所有3種形式(表6)。細胞中存在的RT大多數(shù)為ββ(50-80％)；產(chǎn)生了少量αβ(約10％)；甚至還得到了α(10-40％)。這些結(jié)果表明培養(yǎng)的昆蟲細胞中的內(nèi)源性宿主蛋白酶水解ββ成為αβ，但不水解βp4βp4。通過蛋白酶水解ββ產(chǎn)生的RSV αβ RT與通過共表達RSV RT α和β基因產(chǎn)生的αβ的功能活性相比低得多(表7)。
表6.被RSV RT β基因感染的昆蟲細胞中RSV RT的表達水平
在昆蟲幼蟲中表達RSV RT βp4。通過體內(nèi)注射病毒，用攜有RSV RTβp4基因的桿狀病毒感染活的幼蟲。幼蟲和幼蟲提取物中存在的蛋白酶水平比培養(yǎng)的昆蟲細胞中的高很多。觀察到βp4被加工成多種形式的蛋白酶解RT，包括加工為α。可從這些提取物中純化的RT的主要種類在SDS-PAGE上遷移后顯示出4條主要的帶，即97KDa(組氨酸標記的β)，87KDa(蛋白酶解的β)，67KDa(部分加工的組氨酸標記的α)和62KDa(通過蛋白酶解除去了組氨酸標記物的α)。此RSV RT的比活為55,000個單位/mg蛋白質(zhì)，和RSV αβ RT的差不多。然而，在功能活性檢測中(實施例3)，從幼蟲中純化的RT具有的總產(chǎn)物和全長產(chǎn)物功能活性分別為由共表達α和β產(chǎn)生的RSV αβ RT的85％和60％(表7)。表7.昆蟲細胞表達的多種形式RSV RT的比活和功能活性
a比活＝poly(A)·oligo(dT)試驗中RT活性單位(U)數(shù)/mg RT蛋白質(zhì)(Houts等，病毒學雜志29517(1979))。b如實施例3中所述用7.5Kb RNA確定的功能活性。c總的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量，使用每μg RT產(chǎn)生的產(chǎn)物ng數(shù)。d全長逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量，使用每μg RT產(chǎn)生的產(chǎn)物ng數(shù)。e“NP”＝表達所示基因的昆蟲細胞不產(chǎn)生的RT形式。f“ND”＝由昆蟲細胞產(chǎn)生的RT形式，但在本發(fā)明的研究中未分析。
在培養(yǎng)的昆蟲細胞中共表達RSV RT βp4和RSV蛋白酶p15。通過在大腸桿菌中共表達HIV蛋白酶和HIV RT p66能有效產(chǎn)生了異二聚體p66/p51 HIV RT(Mizuahi，V等，Arch.Biochem Biophys.273347(1989)和Le Grice，S.F.J和Gruninger-Leitch，F(xiàn)，歐洲生物化學雜志，187307(1990))。共表達病毒蛋白酶使p66/p66轉(zhuǎn)變?yōu)楫惗垠w的效力全面增加。如本文實施例材料和方法一節(jié)中所述，在大腸桿菌中共表達RSV RT β和RSV蛋白酶p15基因不會使RSV αβ RT的產(chǎn)量增加。類似地，在培養(yǎng)的昆蟲細胞中共表達RSV RT βp4和RSV蛋白酶p15也不會可測地增加RSV αβ RT的產(chǎn)量。
在體外用RSV蛋白酶p15加工RSV RT βp4。通過在體外用HIV蛋白酶處理，由純化自大腸桿菌的p66產(chǎn)生異二聚體形式的p66/p51 HIVRT(Chattopodhyay，D等，生物化學雜志26714227(1992))。用RSV蛋白酶p15處理純化的RSV RT βp4以產(chǎn)生RSV αβ RT。根據(jù)SDS-PAGE分析，此方法已由βp4成功產(chǎn)生了一些αβ，但也遇到幾個困難。首先，與用病毒蛋白酶處理HIV p66 RT所觀察到的結(jié)果相反，由βp4至αβ的加工不會總停止在αβ階段，因為蛋白酶解進行的過程中形成了比β過量的α。第二，在蛋白酶解的過程中觀察到DNA聚合酶活性的顯著損失，這表明RSV蛋白酶所需的酸性pH反應條件使RSV RT部分失活。
在體外用胰凝乳蛋白酶加工RSV RT βp4。通過用α胰凝乳蛋白酶進行限制性蛋白酶解，由p66也產(chǎn)生了異二聚體形式的p66/p51 HIVRT(Lowe，D.M等，生物化學278884(1988))。此方法未能成功用于RSV RT βp4，我們發(fā)現(xiàn)用α胰凝乳蛋白酶消化βp4難以控制，并觀察到蛋白酶解不會停止在αβ階段，而會繼續(xù)將βp4轉(zhuǎn)變?yōu)棣痢?br> 在體外混合RSV RT α和β以產(chǎn)生αβ。通過將僅含有p51和僅含有p66的分開的粗細胞裂解物混合可產(chǎn)生異二聚體形式的p66/p51 HIVRT(Stahlhut，M等，蛋白質(zhì)表達和純化5614(1994))。混合分開的亞單位形成了摩爾比為1∶1的p66/p51復合物。與之形成對照的是，將純化的RSV α RT與純化的RSV β RT按1∶1摩爾比混合時不會形成αβ復合物。這些結(jié)果與RSV亞單位一旦獨自折疊成活性構(gòu)象后，再混合時則優(yōu)選保持分開狀態(tài)這一假設一致。多種RSV RT形式拷貝RNA的相對能力比較4種不同形式的RSV RT(αβ，ββ，α和βp4βp4)拷貝RNA的能力。突變這些酶中各個亞單位的RNA酶H活性位點以消除RNA酶H活性。通過上述方法和實施例1中所述的方法在培養(yǎng)的昆蟲細胞中表達各種RT并純化之。利用兩種RNA作比較合成的同聚物poly(A)和7.5KbmRNA。以poly(A)·oligo(dT)為模板-引物，通過測定以有限濃度的酶催化的poly(dT)合成初速度，然后根據(jù)反應中RT的量(mg)使速度標準化，從而計算出比活。該比活僅顯示了給定RT用人工模板摻入單個脫氧核苷酸的能力，而不必顯示酶拷貝異聚體RNA的能力。以7.5Kb RNA作為模板，評估RT制備長的異聚體RNA的全長拷貝的能力(詳見實施例3)，結(jié)果示于上表7。
表7中鑒定了兩種不同形式的αβ，一種形式是在宿主昆蟲細胞中表達RSV RT β基因，隨后進行蛋白酶解加工產(chǎn)生的，它的比活和功能活性降低，另一種αβ形式是通過共表達RSV RT α和β基因產(chǎn)生的。這一αβ形式具有與α類似的比活，約50,000個單位/mg，其比活比ββ或βp4βp4(約16,000個單位/mg)的高。αβ形式與其它RT形式之間功能活性的比較顯示出更加顯著的反差。與ββ、βp4βp4和α相比，RSV αβ RT每個單位酶由7.5Kb RNA產(chǎn)生的總cDNA分別增加7，9和15倍。當評估全長產(chǎn)物的產(chǎn)量時，甚至觀察到更大的差別與ββ、βp4βp4和α相比，RSV αβ RT每個單位酶產(chǎn)生的全長產(chǎn)物分別增加21，13和146倍。因此，通過共表達RSV RT α H-和βH-基因產(chǎn)生的RSV αβ RT比通過類似方法制備的任何其它RSV RT形式能更有效地拷貝mRNA。RSV αβ RT中只有α亞單位具有活性的證據(jù)對HIV RT異二聚體形式的p66/p51進行選擇性DNA聚合酶活性位點誘變，結(jié)果表明只有p66的DNA聚合酶活性位點對其DNA聚合酶活性是必不可少的(LeGrice，S.F.J等，EMBO J 103905(1991)和Hostomsky，Z等，病毒學雜志663179(1992))。HIV p66/p51異二聚體中的p51亞單位顯然采取一種不具有底物結(jié)合裂口、因此不直接參與dNTP結(jié)合和摻入的構(gòu)象(Jacob-Molina，A等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 906320(1993))。
在本發(fā)明的研究中，針對RSV αβ RT提出了相同的問題。此時，由于各個亞單位均含有DNA聚合酶和RNA酶H活性位點，因此鑒定了DNA聚合酶單突變體和RNA酶H單突變體的聯(lián)合，結(jié)果示于表8。表8.多種形式RSV RT的DNA聚合酶和RNA酶H活性
如表8所示，當兩個亞單位中的RNA酶H活性位點都被突變以消除RNA酶H活性時，純酶中的RNA酶H活性降低到可測水平之下，而DNA聚合酶活性未變。當用相同的突變改變β中的RNA酶H活性位點而α RNA酶H活性位點為野生型時，酶的聚合酶和RNA酶H活性類似于野生型。與之形成對照的是，α亞單位而不是β亞單位的RNA酶H發(fā)生突變時，會使RNA酶H活性降低200倍。因此，對RSV αβ RT而言，大亞單位(β)的RNA酶H結(jié)構(gòu)域折疊為無活性的構(gòu)象。對RSV αβ RT中DNA聚合酶活性位點突變體的檢查揭示出相同結(jié)果(表8)。α亞單位而不是β亞單位提供了DNA聚合酶催化活性，因此，與HIV p66/p51 RT相反，較小的RSV αβ RT亞單位，而不是較大的亞單位維持酶活性。兩種酶共同之處是具有DNA聚合酶和RNA酶H結(jié)構(gòu)域的亞單位折疊成活性構(gòu)象，而缺乏RNA酶H結(jié)構(gòu)域或具有其它結(jié)構(gòu)域(整合酶)的亞單位折疊為無活性的構(gòu)象。
總之，這些結(jié)果表明只有αβ型ASLV RT能有效拷貝mRNA。另外，本文的結(jié)果表明在大腸桿菌中表達ASLV RT很少或不產(chǎn)生有活性的RT，而通過在昆蟲細胞和酵母中克隆和表達ASLV RT能顯著增加表達和活性。最后，通過在RSV αβ RT α或β亞單位的DNA聚合酶或RNA酶H活性位點導入點突變，發(fā)現(xiàn)RSV RT αβ異二聚體的DNA聚合酶和RNA酶H催化活性僅存在于α亞單位中。
為了清楚地理解本發(fā)明，通過附圖和實施例詳細完整地描述了本發(fā)明，在不影響本發(fā)明范圍或其任何具體的實施方案的前提下、在條件，配比和其它參數(shù)寬的和等價的范圍內(nèi)修飾或改變本發(fā)明，也可達到本發(fā)明的目的，這一點對于本領域技術人員而言是顯而易見的，這樣的修飾或改變意欲包括在所附權利要求書的范圍之內(nèi)。
說明書中提及的所有文獻、專利和專利申請顯示出本發(fā)明所涉及領域中技術人員的水平，將它們以相同的程度列入本文作為參考，就象各篇文獻、專利或?qū)＠暾埍惶貏e地，單獨地列出作為本文參考文獻一樣。
序列表1)一般資料(i)申請人(A)姓名Life Technologies公司(B)街道9800 Medical Center Drive(C)城市Rockville(D)州Maryland(E)國家美國(F)郵政編碼20850(ii)發(fā)明題目逆轉(zhuǎn)錄核酸分子的組合物和方法(iii)序列數(shù)23(iv)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(v)目前的申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(vi)優(yōu)選權申請資料(A)申請?zhí)朥S 60/049,874(B)申請日17-JUN-1997(vi)優(yōu)選權申請資料(A)申請?zhí)朥S 60/044,589(B)申請日22-APR-1997(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1AGGAGACCCA TATGACTGTT GCGCTACATC TGGCT 35(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO2AACGCGACAG GTTAACAGCG CGCAAATCAT GCAG34(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3CACACACAGG TACCCTCTCG AAAAGTTAAA CC 32(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度41個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4CACACACACT CGAGTTATGC AAAAAGAGGG CTCGCCTCAT C 41(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5GGACCCACTG TCTTTACCGC GGCCTCCTCA AGCACC 36(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO6CACACACACC CGGGTTAATA CGCTTGGAAG GTGGC 35(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7CACACACATC ATGACTGTTG CGCTACATCT G 31(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO8CACACACAGG TACCCTCTCG AAAAGTTAA 29(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO9CACACACAGA GGAATTCAGT GATGGTGATG GTGATGTGCA AAAAGAGG 48(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度41個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10ACTGGAATTC ATGCCAATCC ATCACCATCA CCATCACCCG T41(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度41個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11ACGTGTCGAC CATATGGATG ACTAGGTGAA ACGGGTGATG G41(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度71個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO12ACTGGAATTC ATGCCAATCC ATCACCATCA CCATCACCCG TTTCACCTAG TCATCCATAT60GGTCGACACG T 71(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO13GACTAGTTCT AGATCGCGAG CGGCCGCCCA TTAACTCTCG TTGGCAGC 48(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度16個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO14TCGACCCACG CGTCCG 16(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長度12個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO15CGGACGCGTG GG 12(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO16AUGGAGAUCU CUGAATTCAT GACTGTTGCG CTACATCTGG CT 42(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO17ATTATTCATA TGACTGTTGC GCTACATCTG GC32(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO18TACGATCTCT CTCCAGGCCA TTTT 24(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO19ACTCGAGCAG CCCGGGAACC TTTG 24(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO20ATTACCCGGG AGGATATCAT ATGTTAGCGA TGACAATGGA ACATAAAG 48(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO21ATATGTCGAC TCACAGTGGC CCTCCCTATA AATTTG36(2)SEQ ID NO22的資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO22TATTAGGATC CCATGACTGT TGCGCTACAT CTGGC 35(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓撲結(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO23GCAATCCTTG AGCTCTAAGA CCATCAGGG29
權利要求
1.用于逆轉(zhuǎn)錄核酸分子的組合物，所述組合物含有兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽。
2.權利要求1的組合物，其中所述多肽得自不同的來源。
3.權利要求1的組合物，其中各個所述多肽的轉(zhuǎn)錄停頓位點與所述組合物中各個其它多肽的轉(zhuǎn)錄停頓位點不同。
4.權利要求1的組合物，其中所述多肽的RNA酶H活性降低或大大降低。
5.權利要求4的組合物，其中所述多肽選自M-MLV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，RSV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，AMV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，RAV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，MAV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，和HIV H-逆轉(zhuǎn)錄酶，及其衍生物、變體、片段或突變體。
6.權利要求5的組合物，其中所述AMV H-逆轉(zhuǎn)錄酶選自AMV αH-/βH-逆轉(zhuǎn)錄酶，AMV αH-/βH+逆轉(zhuǎn)錄酶，AMV βH-/βH-逆轉(zhuǎn)錄酶，AMV βH+/βH-逆轉(zhuǎn)錄酶，AMV βp4/βp4逆轉(zhuǎn)錄酶和AMV αH-逆轉(zhuǎn)錄酶，及其衍生物、變體、片段或突變體。
7.權利要求5的組合物，其中所述RSV H-逆轉(zhuǎn)錄酶選自RSV αH-/βH-逆轉(zhuǎn)錄酶，RSV αH-/βH+逆轉(zhuǎn)錄酶，RSV βH-/βH-逆轉(zhuǎn)錄酶，RSV βH+/βH-逆轉(zhuǎn)錄酶，RSV βp4/βp4逆轉(zhuǎn)錄酶和RSV αH-逆轉(zhuǎn)錄酶，及其衍生物、變體、片段或突變體。
8.權利要求1的組合物，其中所述多肽選自Taq，Tne，Tma，Pfu，VENTTM，DEEPVENTTM，Tth DNA聚合酶，及其突變體、片段、變體和衍生物。
9.權利要求1的組合物，其中所述多肽以工作濃度存在于所述組合物中。
10.逆轉(zhuǎn)錄一種或多種核酸分子的方法，所述方法包括(a)將一種或多種核酸模板與兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽混合；和(b)在足以制備與所述一種或多種模板之全部或部分互補的一種或多種第一核酸分子的條件下保溫所述混合物。
11.權利要求10的方法，其中所述核酸模板是信使RNA分子或mRNA分子群體。
12.權利要求10的方法，所述方法還包括在足以制備與所述一種或多種第一核酸分子之全部或部分互補的一種或多種第二核酸分子的條件下，保溫所述一種或多種第一核酸分子。
13.根據(jù)權利要求10的方法制備的cDNA分子。
14.根據(jù)權利要求12的方法制備的cDNA分子。
15.擴增一種或多種核酸分子的方法，所述方法包括(a)將一種或多種核酸模板與兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽和一種或多種DNA聚合酶混合；和(b)在足以擴增與所述一種或多種核酸模板之全部或部分互補的一種或多種核酸分子的條件下保溫所述混合物。
16.擴增一種或多種核酸分子的方法，所述方法包括(a)將一種或多種核酸模板與兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性和DNA聚合酶活性的多肽混合；和(b)在足以擴增與所述一種或多種核酸模板之全部或部分互補的一種或多種核酸分子的條件下保溫所述混合物。
17.根據(jù)權利要求15或權利要求16的方法擴增的核酸分子。
18.含有權利要求14之cDNA分子的載體。
19.權利要求18的載體，其中所述載體是表達載體。
20.含有權利要求14之cDNA分子的宿主細胞。
21.對一種或多種核酸分子進行測序的方法，所述方法包括(a)將一種或多種待測序的核酸分子與一個或多個引物、兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽、一種或多種核苷酸和一種或多種終止試劑混合；(b)在足以合成與所述一種或多種待測序之分子的全部或部分互補的分子群體的條件下保溫混合物；和(c)分離所述群體以測定所述一種或多種待測序之分子的全部或部分核苷酸序列。
22.用于逆轉(zhuǎn)錄、擴增或測序核酸分子的試劑盒，所述試劑盒含有兩種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽。
23.權利要求22的試劑盒，所述試劑盒還含有一種或多種選自下列的組分一種或多種核苷酸，一種或多種DNA聚合酶，適當?shù)木彌_液，一個或多個引物和一種或多種終止試劑。
24.權利要求23的試劑盒，其中所述終止試劑是雙脫氧核苷酸。
25.權利要求23的試劑盒，其中所述試劑盒中兩種或多種組分以混合物的形式存在或以獨立的組分存在。
26.產(chǎn)生ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶的方法，所述方法包括(a)得到含有編碼ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶一個或多個亞單位的一種或多種核酸序列的宿主細胞；和(b)在足以產(chǎn)生所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶亞單位的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞。
27.權利要求26的方法，其中所述編碼ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶一個或多個亞單位的一種或多種核酸序列包含在一個或多個載體中。
28.權利要求26的方法，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶亞單位選自一種或多種ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶的一個或多個α亞單位，一個或多個β亞單位和一個或多個βp4亞單位，及其衍生物、變體、片段或突變體。
29.權利要求26的方法，其中所述亞單位是一個或多個α亞單位。
30.權利要求26的方法，其中所述亞單位是一個或多個β亞單位。
31.權利要求26的方法，其中所述亞單位是一個或多個βp4亞單位。
32.權利要求26的方法，其中所述亞單位是一種或多種ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶的一個α亞單位和一個β亞單位。
33.權利要求26的方法，其中所述亞單位被共表達以形成ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶，并且從所述宿主細胞分離所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶。
34.權利要求26的方法，其中對所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶亞單位進行分離并混合以形成ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶。
35.權利要求30的方法，其中所述β亞單位形成含有兩個β亞單位的ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶。
36.權利要求32的方法，其中所述α和β亞單位形成含有α和β亞單位的ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶。
37.權利要求26的方法，其中一個或多個所述亞單位經(jīng)修飾后降低或大大降低了所述亞單位的RNA酶H活性。
38.權利要求26的方法，其中所述亞單位由相同或不同載體中所含的一種或多種核苷酸序列編碼。
39.權利要求26的方法，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是RSV逆轉(zhuǎn)錄酶。
40.權利要求26的方法，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
41.根據(jù)權利要求26的方法產(chǎn)生的ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶。
42.權利要求41的ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶選自ASLV αβ逆轉(zhuǎn)錄酶，ASLV ββ逆轉(zhuǎn)錄酶，ASLV βp4βp4逆轉(zhuǎn)錄酶和ASLV α逆轉(zhuǎn)錄酶。
43.權利要求41的ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性有所降低或大大降低。
44.權利要求41的ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是RSV逆轉(zhuǎn)錄酶。
45.權利要求41的ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
46.一種分離的核酸分子，所述分子含有編碼ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶一個或多個亞單位的核苷酸序列。
47.權利要求46的核酸分子，其中所述分子編碼ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶的一個或多個α亞單位，或其衍生物、變體、片段或突變體。
48.權利要求46的核酸分子，其中所述分子編碼ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶的一個或多個β亞單位，或其衍生物、片段或突變體。
49.權利要求46的核酸分子，其中所述分子編碼ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶的一個或多個βp4亞單位，或其衍生物、片段或突變體。
50.權利要求46的核酸分子，其中所述分子編碼ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶的α和β亞單位，或其衍生物、片段或突變體。
51.含有權利要求46之核酸分子的載體。
52.含有權利要求46之核酸分子的宿主細胞。
53.權利要求51的載體，其中所述載體是質(zhì)粒pDABH-His。
54.權利要求52的宿主細胞，其中所述宿主細胞是大腸桿菌DH10B(pDABH-His)。
55.權利要求46的分離的核酸分子，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是RSV逆轉(zhuǎn)錄酶。
56.權利要求46的分離的核酸分子，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
57.通過逆轉(zhuǎn)錄一種或多種核酸模板產(chǎn)生一種或多種cDNA分子的方法，所述方法包括(a)將一種或多種核酸模板與含有一個或多個亞單位的ASLV RT混合；和(b)在足以制備與所述一種或多種模板之全部或部分互補的一種或多種第一核酸分子的條件下保溫所述混合物。
58.權利要求57的方法，其中所述亞單位是一個或多個α亞單位，一個或多個β亞單位和一個或多個βp4亞單位或其組合。
59.權利要求57的方法，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶選自ASLV αβ逆轉(zhuǎn)錄酶，ASLV ββ逆轉(zhuǎn)錄酶，ASLV βp4βp4逆轉(zhuǎn)錄酶和ASLV α逆轉(zhuǎn)錄酶。
60.權利要求57的方法，其中所述核酸模板是mRNA分子或mRNA分子群體。
61.權利要求57的方法，其中所述方法還包括在足以制備與所述一種或多種第一核酸分子之全部或部分互補的一種或多種第二核酸分子的條件下，保溫所述一種或多種第一核酸分子。
62.權利要求61的方法，其中所述第一和第二核酸分子形成雙鏈DNA分子。
63.權利要求62的方法，其中所述雙鏈DNA分子是全長的cDNA分子。
64.根據(jù)權利要求57的方法制備的cDNA分子。
65.根據(jù)權利要求61的方法制備的cDNA分子。
66.含有權利要求65的cDNA分子的載體。
67.權利要求66的載體，其中所述載體是表達載體。
68.含有權利要求65的cDNA分子的宿主細胞。
69.權利要求61的方法，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是RSV逆轉(zhuǎn)錄酶。
70.權利要求61的方法，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
71.擴增一種或多種核酸分子的方法，所述方法包括(a)將一種或多種核酸模板與一種或多種含有一個或多個亞單位的ASLV RT和任選與一種或多種DNA聚合酶混合；和(b)在足以擴增與所述一種或多種模板之全部或部分互補的一種或多種核酸分子的條件下保溫所述混合物。
72.權利要求71的方法，其中所述亞單位是一個或多個α亞單位，一個或多個β亞單位，一個或多個βp4亞單位或其組合。
73.權利要求71的方法，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶選自ASLV αβ逆轉(zhuǎn)錄酶，ASLV ββ逆轉(zhuǎn)錄酶，ASLV βp4βp4逆轉(zhuǎn)錄酶和ASLV α逆轉(zhuǎn)錄酶。
74.權利要求71的方法，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是RSV逆轉(zhuǎn)錄酶。
75.權利要求71的方法，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
76.對一種或多種核酸分子進行測序的方法，所述方法包括(a)將一種或多種待測序的核酸分子與一個或多個引物、含有一個或多個亞單位的ASLV RT、一種或多種核苷酸和一種或多種終止試劑混合；(b)在足以合成與所述一種或多種待測序之核酸分子的全部或部分互補的核酸分子群體的條件下保溫所述混合物；和(c)分離所述核酸分子群體以測定所述一種或多種待測序之核酸分子的全部或部分核苷酸序列。
77.權利要求76的方法，其中所述亞單位是一個或多個α亞單位，一個或多個β亞單位，一個或多個βp4亞單位或其組合。
78.權利要求76的方法，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶選自ASLV αβ逆轉(zhuǎn)錄酶，ASLV ββ逆轉(zhuǎn)錄酶，ASLV βp4βp4逆轉(zhuǎn)錄酶和ASLV α逆轉(zhuǎn)錄酶。
79.權利要求76的方法，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是RSV逆轉(zhuǎn)錄酶。
80.權利要求76的方法，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
81.一種試劑盒，其中含有一個或多個ASLV RT亞單位，或其一種或多種衍生物、變體、片段或突變體。
82.權利要求81的試劑盒，其中所述ASLV RT亞單位是一個或多個ASLV RT α亞單位，一個或多個ASLV RT β亞單位，一個或多個ASLVRT βp4亞單位或其組合。
83.權利要求81的試劑盒，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是RSV逆轉(zhuǎn)錄酶。
84.權利要求81的試劑盒，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
85.含有ASLV RT的試劑盒，其中所述ASLV RT選自ASLV αβ RT，ASLV ββ RT，ASLV βp4βp4 RT和ASLV α RT，或者其衍生物、片段或突變體。
86.權利要求85的試劑盒，其中所述ASLV RT含有α和β亞單位。
87.權利要求85的試劑盒，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是RSV逆轉(zhuǎn)錄酶。
88.權利要求85的試劑盒，其中所述ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
89.通過逆轉(zhuǎn)錄一種或多種核酸模板產(chǎn)生一種或多種cDNA分子的方法，所述方法包括(a)將一種或多種核酸模板與一種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽混合；和(b)在約50℃或更高的溫度下，在足以制備與所述一種或多種模板之全部或部分互補的一種或多種第一核酸分子的條件下保溫所述混合物。
90.權利要求89的方法，其中所述溫度是60℃或更高。
91.權利要求89的方法，其中所述溫度范圍是約50℃至約70℃。
92.權利要求89的方法，其中所述溫度范圍是約55℃至約65℃。
93.權利要求89的方法，其中所述核酸模板是RNA或DNA分子。
94.權利要求93的方法，其中所述RNA分子是mRNA分子或poly(A)+RNA分子。
95.權利要求89的方法，其中所述核酸模板是mRNA分子群體。
96.權利要求94的方法，其中所述第一核酸分子是全長cDNA分子。
97.權利要求89的方法，其中所述方法還包括在足以制備與所述一種或多種第一核酸分子之全部或部分互補的一種或多種第二核酸分子的條件下，保溫所述一種或多種第一核酸分子。
98.權利要求97的方法，其中所述第一和第二核酸分子是DNA分子。
99.權利要求98的方法，其中所述第一和第二DNA分子形成雙鏈DNA分子。
100.權利要求99的方法，其中所述雙鏈DNA分子是全長的cDNA分子。
101.權利要求89的方法，其中所述一種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽的RNA酶H活性有所降低或大大降低。
102.權利要求89的方法，其中所述一種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽是含有一個或多個亞單位的一種或多種ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶。
103.權利要求102的方法，其中所述一種或多種ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是一種或多種RSV逆轉(zhuǎn)錄酶。
104.權利要求102的方法，其中所述一種或多種ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶是一種或多種AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
105.權利要求102的方法，其中所述ASLV RT亞單位是一個或多個ASLV RT α亞單位，一個或多個ASLV RT β亞單位，一個或多個ASLVRT βp4亞單位或其組合。
106.權利要求102的方法，其中所述ASLV RT選自ASLV αβ RT，ASLV ββ逆轉(zhuǎn)錄酶，ASLV βp4βp4 RT和ASLVαRT，及其衍生物、變體、片段或突變體。
107.權利要求102的方法，其中所述ASLV RT是ASLV αβ RT或者其衍生物、變體、片段或突變體。
108.權利要求102的方法，其中所述一個或多個亞單位的RNA酶H活性有所降低或大大降低。
109.根據(jù)權利要求89的方法產(chǎn)生的核酸分子。
110.根據(jù)權利要求97的方法產(chǎn)生的核酸分子。
111.權利要求110的核酸分子，其中所述核酸分子是全長的cDNA分子。
112.含有權利要求110的核酸分子的載體。
113.權利要求112的載體，其中所述載體是表達載體。
114.含有權利要求109的核酸分子的宿主細胞。
115.含有權利要求110的核酸分子的宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及用于逆轉(zhuǎn)錄核酸分子,尤其是信使RNA分子的組合物和方法。本發(fā)明具體涉及含有具有逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性之多肽的混合物的組合物,并涉及使用這些組合物或多肽,在高于約55℃的溫度下產(chǎn)生、擴增或測序核酸分子(尤其是cDNA分子)的方法。本發(fā)明還涉及由這些方法產(chǎn)生的核酸分子,含有這些核酸分子的載體和宿主細胞,以及所述核酸分子用于產(chǎn)生所需多肽的用途。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生Rous肉瘤病毒(RSV)和禽成髓細胞瘤病毒(AMV)RT或其它禽肉瘤－白血病病毒(ASLV)RT(其α和/或β亞單位)的方法,涉及編碼所述RSV RT,AMV RT或其它ASLV RT亞單位的分離的核酸分子,涉及含有這些分離的核酸分子的載體和宿主細胞,并涉及由這些方法產(chǎn)生的RSV RT,AMV RT或其它ASLV RT亞單位。本發(fā)明還涉及編碼重組異二聚體RT全酶,尤其是異二聚體RSV RT,AMV RT或其它ASLV RT(可以是αβRT,ββRT或αRT)的核酸分子,涉及含有這些核酸分子的載體(尤其是桿狀病毒載體)和宿主細胞(尤其是昆蟲和酵母細胞),并涉及產(chǎn)生這些異二聚體RT的方法和由這些方法產(chǎn)生的異二聚體RT。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的組合物,多肽或者RSV RT,AMV RT或其它ASLV RT的試劑盒。
文檔編號C12N1/21GK1259957SQ98806006
公開日2000年7月12日 申請日期1998年4月22日 優(yōu)先權日1997年4月22日
發(fā)明者G·F·格拉德, M·D·史密斯, D·K·查特吉 申請人:生命技術公司