專利名稱：人源化抗體和制備人源化抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人源化抗體和制備人源化抗體的方法。具體地講，本發(fā)明涉及用單價(jià)噬菌體展示系統(tǒng)來制備人源化抗體的方法，以及對(duì)單一人構(gòu)架的一小組關(guān)鍵構(gòu)架殘基進(jìn)行隨機(jī)誘變而產(chǎn)生的抗體變異體。更具體地講，本發(fā)明涉及對(duì)結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的鼠抗體進(jìn)行人源化。
背景技術(shù)：
單克隆抗體(mAb)作為治療劑有巨大的潛力，尤其是它們可用于調(diào)節(jié)血管生成系統(tǒng)。例如，在某些情況下當(dāng)新的毛細(xì)血管從現(xiàn)有小血管的壁上形成時(shí)可能需要調(diào)節(jié)(例如)血管生成系統(tǒng)。在受傷或感染之后，血管生成通常很重要，以便能夠在受損組織附近刺激毛細(xì)血管的急速生長(zhǎng)。然而，血管生成在腫瘤生長(zhǎng)中也很重要，因?yàn)闉榱顺掷m(xù)生長(zhǎng)，腫瘤必須誘導(dǎo)形成進(jìn)入腫瘤塊的毛細(xì)血管網(wǎng)。
某些調(diào)節(jié)血管生成的生長(zhǎng)因子已得到鑒定。特別令人感興趣的是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，它似乎是某些腫瘤獲得豐富血液供應(yīng)所依靠的物質(zhì)(Molecular Biology of the Cell，3版，Alberts等人，Garland Publishing，1154頁(1994))。因此，例如抗VEGF的單克隆抗體，出于多種原因是很有用的，包括用于調(diào)節(jié)血管生成而且更具體地講可用作抗腫瘤劑。一種阻斷VEGF受體結(jié)合的鼠抗-VEGF單克隆抗體A4.6.1已有描述。表明，該抗體可抑制促細(xì)胞有絲分裂的信號(hào)傳導(dǎo)(Kim等人，生長(zhǎng)因子(Growth Factors)7，53(1992)；Kim等人，自然(Nature)362，841(1993))。
包括上述抗-VEGF抗體在內(nèi)的大多數(shù)單克隆抗體，來自于小鼠或其他非人動(dòng)物來源，這限制了其臨床效力。具體地講，身體常常會(huì)發(fā)生反應(yīng)，對(duì)非人類抗體產(chǎn)生免疫原性應(yīng)答反應(yīng)，這樣這種抗體會(huì)在發(fā)生治療效果之前就被快速地從身體系統(tǒng)中清除掉。除了施用于人時(shí)非人類單克隆抗體具有免疫原性之外，還會(huì)因效應(yīng)子功能的弱招募性而導(dǎo)致其他限制。
作為克服這些缺陷的一種巧妙手段，可通過一種已知的抗體“人源化”過程而將非人單克隆抗體的抗原結(jié)合特性賦予人抗體。人源化抗體含有移植在人抗體構(gòu)架上、來自親代或相應(yīng)的非人mAb的6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(抗體分子的抗原結(jié)合位點(diǎn))的氨基酸序列。因此，非人抗體的人源化通常被稱為“CDR移植”。在這種人源化抗體中非人序列的含量低(約5％)，已表明可有效地降低其免疫原性并延長(zhǎng)施用于人的抗體的血清半衰期。其中，人源化的單克隆抗體(“嵌合的免疫球蛋白”)在美國(guó)專利No.4,816,567中有描述。
不幸的是，單純地移植CDR序列常常會(huì)產(chǎn)生與抗原的結(jié)合力遠(yuǎn)弱于親代非人mAb的人源化抗體。為了恢復(fù)高親和力，抗體必須進(jìn)一步地進(jìn)行基因工程改造以微調(diào)抗原結(jié)合環(huán)的結(jié)構(gòu)。這是通過用親代鼠抗體的匹配序列來替換抗體可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)域中的關(guān)鍵殘基而實(shí)現(xiàn)的。這些構(gòu)架殘基常涉及支持CDR環(huán)的構(gòu)象，盡管某些構(gòu)架殘基本身可能直接與抗原接觸。已進(jìn)行了研究，注意到某些構(gòu)架殘基對(duì)CDR構(gòu)象的重要性，并編纂了所有可能影響抗原結(jié)合的構(gòu)架殘基的全面清單(Chothia等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)224，487(1992)；Foote等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)224，489(1992))。該全面清單包括近30種對(duì)CDR結(jié)構(gòu)有潛在貢獻(xiàn)的“游標(biāo)”(vernier)殘基。雖然通過編輯人源化抗體內(nèi)整套游標(biāo)殘基從而與相應(yīng)的親代非人序列匹配，可能會(huì)導(dǎo)致更高的抗原親和力，然而這通常是不利的，因?yàn)樘砑臃侨诵蛄械脑袑?dǎo)致免疫原性增大的危險(xiǎn)。因此，從治療角度出發(fā)，宜將構(gòu)架的改變限定在能夠提供高親和力人源化抗體的最小改變范圍內(nèi)。
因此，需要鑒別一小套足以優(yōu)化結(jié)合的改變，然而預(yù)計(jì)所需的改變會(huì)因各人源化抗體而有所不同。為了實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果，一種方法是，通過構(gòu)建一組變異體，此變異體中的“可疑”構(gòu)架殘基被其鼠對(duì)應(yīng)殘基所取代，來鑒別突變的合適組合。這些變異體應(yīng)各自獨(dú)立地制備并測(cè)試對(duì)抗原的結(jié)合情況，然后將其與發(fā)現(xiàn)的有滿意結(jié)合親和力的其他變異體組合。然而，這種方法涉及對(duì)各個(gè)定點(diǎn)誘變、分離和篩選的重復(fù)循環(huán)，因費(fèi)時(shí)費(fèi)力而不理想。
作為一種簡(jiǎn)化抗體人源化的手段，已經(jīng)開發(fā)出了多種不同方法。參見，例如Queen等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86，10029(1989)；Kettleborough等人，蛋白質(zhì)工程(Protein Eng.)4，773(1991)；Tempest等人，Biotechnology 9，266(1991)；Padlan，分子免疫學(xué)(Mol.Immunol.)28，489(1991)；Roguska等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91，969(1994)；Studnicka等人，蛋白質(zhì)工程(Protein Eng.)7，805(1994)；Allen等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)135，368(1985)；Carter等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，4285(1992)；Presta等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)15l，2623(1993)；Eigenbrot等人，蛋白質(zhì)(Proteins)18，49(1994)；Shalaby等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)175，217(1992)；Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，(5th)，Public Health Service，NIH，Bethesda，MD(1991)和Rosok等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)271，22611(1996)。本發(fā)明的目的是提供一種通用的快速選擇構(gòu)架突變的方法，它可改進(jìn)人源化抗體與其相關(guān)抗原的結(jié)合，其中取消了目前根據(jù)多輪的各個(gè)定點(diǎn)誘變和篩選的構(gòu)架優(yōu)化方法。
另一目的是提供快速地使抗體人源化的方法，它提供低免疫原性的抗體而且采用單一的人構(gòu)架作為通用性支架。
本發(fā)明的另一目的是提供人源化抗體，與構(gòu)架未改變的最初人源化抗體相比、該抗體經(jīng)突變具有更高的抗原親和力。
本發(fā)明的另一目的是提供人源化抗體，它具有更低的清除速率因而能在全身施用后在體內(nèi)保留更長(zhǎng)時(shí)間，這樣對(duì)于全身施用可用更低劑量就可實(shí)現(xiàn)治療效果。
本發(fā)明的另一目的是提供人源化的針對(duì)VEGF的單克隆抗體。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的人源化抗體。最初的人源化的抗-VEGF具有最豐富的人亞類共有序列的構(gòu)架，即VLκ亞組I(V1κI)和VH亞組III(VHIII)，其上移植有非人的抗-VEGF抗體的CDR。對(duì)該初始構(gòu)建物上的關(guān)鍵構(gòu)架殘基進(jìn)行隨機(jī)誘變，產(chǎn)生了本文所述的人源化抗-VEGF抗體，它與構(gòu)架未改變的最初人源化抗體相比具有高125倍的抗原親和力。一個(gè)額外的突變可使結(jié)合力再提高6倍。這種人源化抗-VEGF抗體可通過本文所述的方法再生產(chǎn)，或者通過在給出本文提供的序列信息的情況下用傳統(tǒng)重組技術(shù)再生產(chǎn)。
本文還提供了一種快速產(chǎn)生和鑒別構(gòu)架突變的方法，它提高了人源化抗體對(duì)其相關(guān)抗原的結(jié)合力。在一優(yōu)選實(shí)例中，非人CDR被移植于人的V1κI-VHIII構(gòu)架。還對(duì)一小套關(guān)鍵構(gòu)架殘基進(jìn)行了隨機(jī)誘變，然后在絲狀噬菌體的表面上將形成的抗體分子文庫單價(jià)展示出來。接著，根據(jù)親和力的選擇方法來鑒別最佳的構(gòu)架序列。任選地，被選出的抗體可以進(jìn)一步突變，以便用匹配非人親代抗體的的殘基來替換位于VL-VH界面的游標(biāo)殘基。
本文所述的方法可用于任何非人抗體。因此，本發(fā)明提供了人源化抗體。
附圖簡(jiǎn)述

圖1描述了小鼠抗體A4.6.1(SEQ ID NO6和9分別是VL和VH區(qū))、人源化的A4.6.1變異抗體hu2.0(SEQ ID NO7和10分別是VL和VH區(qū))和人源化的A4.6.1變異抗體hu2.10(SEQ ID NO8和11分別是VL和VH區(qū))的氨基酸序列。序列編號(hào)根據(jù)Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，(5th)，Public HealthService，NIH，Bethesda，MD(1991)，并且錯(cuò)配用星號(hào)(A4.6.1 vs hu2.0)或點(diǎn)(hu2.0 vs hu2.10)表示。變異抗體hu2.0僅含有鼠抗體的CDR序列(粗體)，它被移植于人輕鏈κ亞組I，重鏈亞組III構(gòu)架上。變異抗體hu2.10是用本文所述的噬菌體分揀試驗(yàn)而獲得的共有人源化克隆。
圖2顯示了隨機(jī)誘變所針對(duì)的構(gòu)架殘基。
圖3顯示了噬菌體表面展示Fab-pIII融合蛋白的噬菌粒構(gòu)建物。此噬菌粒構(gòu)建物編碼融合于一部分M13基因III外被蛋白的人源化A4.6.1抗體Fab片段。該融合蛋白包括Fab，F(xiàn)ab在重鏈的羧基未端連于一個(gè)谷氨酰胺殘基(受SupE E.coli的琥珀密碼子的抑制)，然后連于基因III蛋白的C末端區(qū)域(殘基249-406)。轉(zhuǎn)入F+大腸桿菌，然后用M13KO7輔助噬菌體進(jìn)行超感染，這樣產(chǎn)生了噬菌粒顆粒，其中一小部分展示出單一拷貝的融合蛋白。
發(fā)明詳述A.定義“抗體(Ab)”和“免疫球蛋白(Ig)”是有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白?？贵w表現(xiàn)出對(duì)特異抗原的結(jié)合特異性，而免疫球蛋白包括抗體和其它缺乏抗原特異性的抗體樣分子。后一類多肽可在由(例如)淋巴系統(tǒng)低水平地產(chǎn)生，而骨髓瘤可高水平地產(chǎn)生。
“天然抗體”和“天然免疫球蛋白”是約150000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩個(gè)相同的輕鏈(L)和兩個(gè)相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型重鏈之間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈也有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)(VH)，其后是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)(VL)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)相對(duì)，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對(duì)。據(jù)信特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面(Clothia等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)186，651(1985)；Novotny等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82，4592(1985))。
術(shù)語“可變”表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個(gè)抗體可變區(qū)中。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或稱為高變區(qū)的三個(gè)節(jié)段中?？勺儏^(qū)中較高度保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個(gè)FR區(qū)，它們大致上呈β-折疊構(gòu)型，由三個(gè)CDR連結(jié)。這些CDR形成連接β折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)并且在某些情況下是β折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈中的CDR通過FR區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結(jié)合部位(參見Kabat等人，同上)。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是表現(xiàn)出不同的效應(yīng)子功能，例如參與抗體依賴的細(xì)胞毒性。
木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生了兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段(稱為“Fab”片段，每個(gè)片段有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn))以及一個(gè)殘余的“Fc”片段(該名稱反映了其容易結(jié)晶的能力)。用胃蛋白酶處理產(chǎn)生了一個(gè)F(ab′)2片段，該片段有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，并仍能與抗原交聯(lián)。
“Fv”是最小的抗體片段，它含有全部抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)。該區(qū)域由非共價(jià)緊密結(jié)合的一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變區(qū)的二聚物組成。在該構(gòu)型中，各可變區(qū)中的三個(gè)CDR相互作用，在VH-VL二聚物表面上界定了抗原結(jié)合位點(diǎn)。6個(gè)CDR共同地賦予抗體抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單一可變區(qū)(或Fv的一半，它只包含對(duì)抗原有特異性的三個(gè)CDR)也能識(shí)別并結(jié)合抗原，只是其親和力比完整的結(jié)合位點(diǎn)低。
“Fab”片段含有輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)(CH1)。Fab′片段與Fab片段的不同之處在于，在重鏈CH1區(qū)的羧基端添加有幾個(gè)殘基(包括來自鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸)。Fab′-SH在本文表示恒定區(qū)的半胱氨酸殘基攜帶了游離巰基的Fab′。F(ab′)2抗體片段最初是以Fab′片段對(duì)的形式產(chǎn)生的，在其間有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)方式也是已知的。
脊椎動(dòng)物抗體(免疫球蛋白)的輕鏈，可根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列歸類為明顯不同的兩類(稱為kappa(κ)和lambda(λ))中的一類。
根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類。主要有5類免疫球蛋白IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些還可進(jìn)一步分成亞類(同種型)，如IgG-1，IgG-2，IgG-3和IgG4；以及IgA-1和IgA-2。對(duì)應(yīng)于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。
術(shù)語“抗體”被最廣義地使用，并且具體地包括單一的單克隆抗體(包括促效的和拮抗的抗體)、具有多表位特異性的抗體復(fù)合物、以及抗體片段(例如Fab、F(ab′)2、和Fv)，只要它們表現(xiàn)出所需的生物活性即可。
本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”指從一類基本均一抗體獲得的抗體，即該群體中包含的各抗體是相同的，除少數(shù)可能存在的天然發(fā)生的突變之外。單克隆抗體是高特異性的，針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。而且，與常規(guī)的(多克隆)抗體制劑(它通常是包括針對(duì)不同的決定簇(表位)的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對(duì)抗原上的一個(gè)決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)還在于它們是通過雜交瘤培養(yǎng)來合成的，沒有被其它免疫球蛋白污染。修飾語“單克隆”表示了抗體的特性-即從基本均一的抗體群中獲得的，而不應(yīng)被解釋成需要用任何特殊方法來生產(chǎn)抗體。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可用雜交瘤方法(由Kohler等，Nature，256495(1975)首先提出)制得，或可用重組DNA方法(例如參見美國(guó)專利No.4,816,567)制得。
“嵌合”抗體(免疫球蛋白)是這樣的抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與某一特定物種的抗體對(duì)應(yīng)序列相同或同源，或是屬于特定的抗體類別或亞類，而鏈的其余部分則與另一物種的抗體對(duì)應(yīng)序列相同或同源、或是屬于另一種抗體類別或亞類，以及這種抗體的片段，只要該片段具有所需的生物活性即可(美國(guó)專利No.4,816,567)。
“人源化”形式的非人(如鼠)抗體是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2或抗體的其它抗原結(jié)合序列)，它們含有非人免疫球蛋白的最小序列。對(duì)于大多數(shù)情況，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受者抗體)，其中受者互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被非人源(供者抗體)(例如有所需特異性、親和力和活性的小鼠、大鼠或兔抗體)的CDR殘基所代替。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架殘基被對(duì)應(yīng)的非人殘基代替。另外，人源化的抗體可包括既不存在于受者抗體、又不存在于導(dǎo)入的CDR或構(gòu)架序列中的殘基。這些修飾能進(jìn)一步提高和優(yōu)化抗體的性能。通常，人源化抗體包含了基本上所有的(至少一個(gè)、通常兩個(gè))可變區(qū)，其中所有或基本上所有的CDR區(qū)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，而所有或基本上所有FR區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的FR區(qū)。人源化抗體最好還包括免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白)恒定區(qū)(Fc)的至少一部分。更詳細(xì)的情況可參見Jones等人，Nature，321522-525(1986)；Reichmann等人，Nature，332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)。
“在人中無免疫原性”指施用時(shí)一旦治療有效量的人源化抗體與人體的適當(dāng)組織接觸，基本上不表現(xiàn)出對(duì)人源化抗體的敏感性和耐受性狀態(tài)。
如本文所用，“血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子”或“VEGF”指在美國(guó)專利NO5,332,671中所定義的哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)因子，包括在圖1中所示的人氨基酸序列。天然VEGF的生物活性也可由其類似物或變異物所具有，該類似物或變異物能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的選擇性生長(zhǎng)但是不促進(jìn)牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞、晶狀體內(nèi)皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、BHK-21成纖維細(xì)胞或角化細(xì)胞的生長(zhǎng)，或擁有能夠與針對(duì)相應(yīng)天然VEGF的至少一個(gè)表位的抗體發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的免疫表位。
“定點(diǎn)誘變”是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，它是用一合成的寡核苷酸引物進(jìn)行的，該寡核苷酸引物除了有限的錯(cuò)配(提供了所需的突變)之外互補(bǔ)于待誘變的單鏈?zhǔn)删wDNA。簡(jiǎn)而言之，合成的寡核苷酸被用作引物來指導(dǎo)合成互補(bǔ)于噬菌體的鏈，然后將形成的雙鏈DNA轉(zhuǎn)入支持噬菌體的宿主細(xì)菌中。將轉(zhuǎn)化細(xì)菌的培養(yǎng)物接種于瓊脂頂部中，讓攜帶噬菌體的單個(gè)細(xì)胞形成噬菌斑。理論上，50％的新噬菌斑所含的噬菌體具有突變形式的單鏈；而50％具有原始的序列。用激酶化的合成引物與噬菌斑雜交，雜交所用溫度允許準(zhǔn)確匹配的雜交但是與原始鏈的錯(cuò)配足以防止雜交。然后，選出與探針雜交的噬菌斑并培養(yǎng)，回收DNA。
“表達(dá)系統(tǒng)”指含有操作性連接的所需編碼序列和控制序列的DNA序列，從而使得用這些序列轉(zhuǎn)化的宿主能夠產(chǎn)生所編碼的蛋白質(zhì)。為了實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，表達(dá)系統(tǒng)可被包含在載體中；然而，有關(guān)DNA然后也可整合入宿主的染色體中。
本文所用的術(shù)語“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，而且所有這些名稱均包括子代。因此，術(shù)語“轉(zhuǎn)化體”或“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括原代細(xì)胞及其衍生的培養(yǎng)物(不論傳代多少次)。還應(yīng)理解，由于有意或無意的突變，所有子代也許在DNA內(nèi)容上并不精確相同。它包括了篩選出的、具有與原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞相同功能的突變型子代。當(dāng)采用不同的命名時(shí)，可以從上下文中明顯看出。
“質(zhì)?！钡拿且孕懙摹皃”后跟大寫字母和/或數(shù)字來表示。本文中的最初質(zhì)粒來源是購得、可在沒有限制的情況下從公共途徑獲得、或可根據(jù)已公開的程序用上述質(zhì)粒構(gòu)建而得。另外，其他等價(jià)的質(zhì)粒是本領(lǐng)域中已知的，并且對(duì)一般的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
“親和結(jié)合”指抗體上的單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)與單個(gè)表位之間的非共價(jià)鍵相互作用力的總和。低親和力的抗體與抗原的結(jié)合弱并且傾向于易解離，而高親和力的抗體與抗體的結(jié)合牢得多并且結(jié)合可維持更長(zhǎng)。
“轉(zhuǎn)化”意味著將DNA引入某個(gè)生物體，從而使該DNA或作為染色體外的元件或通過整合到染色體上而被復(fù)制。取決于所用的宿主細(xì)胞，用適合該細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用氯化鈣進(jìn)行的鈣處理法(如Cohen美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)69，2110(1972)和Mandel等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)53，154(1970)中所述)，一般可以用于原核或其他含有基本細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞。對(duì)于沒有細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選的是Graham和van der Eb(病毒學(xué)(Virology)52456(1978))的磷酸鈣沉淀法。哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的總體情況，已經(jīng)描述于1983年8月16日授于Axel的美國(guó)專利No.4,399,216中。轉(zhuǎn)化入酵母通常是按Van Solingen等人，J.Bact.130946(1977)和Hsiao等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)763829(1979)的方法進(jìn)行。然而，其他將DNA引入細(xì)胞的方法，如核內(nèi)注射、電穿孔、原生質(zhì)體融合等也可使用。
限制酶消化后，DNA片段的“回收”或“分離”是指通過聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳使消化產(chǎn)物分開，根據(jù)與已知分子量的標(biāo)記DNA片段比較電泳遷移率來鑒別目的片段，切下含有所需片段的凝膠塊，并將凝膠與DNA分開。這個(gè)程序已普遍知曉。例如，可參見Lawn等人，核酸研究(Nucleic.Acids Res.)96103以及Goeddel等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，84057。
“連接”指二個(gè)雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程。除非另外說明，連接可用已知的緩沖液和條件來進(jìn)行，對(duì)于每0.5毫克大約等摩爾量的待連接的DNA使用10單位T4 DNA連接酶(“連接酶”)。
術(shù)語“控制序列”指在特定宿主生物體中表達(dá)操作性相連的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適用于原核細(xì)胞的控制序列包括啟動(dòng)子、任選的操縱基因序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及其他可能目前還不甚了解的序列。已知真核細(xì)胞可采用啟動(dòng)子、聚腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。
當(dāng)核酸與另一核酸序列置于功能上相關(guān)位置時(shí)，則核酸是“可操作地連接的”或“操作性相連的”。例如，前序列(presequense)或分泌性前導(dǎo)序列的DNA是與多肽的DNA操作性相連的，如果它被表達(dá)成參與多肽分泌的前蛋白原(preprotein)；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子是與編碼序列操作性相連的，如果它影響到編碼序列的轉(zhuǎn)錄；或者，核糖體結(jié)合位點(diǎn)是與編碼序列操作性相連的，如果它的位置能夠促進(jìn)翻譯。通常，“可操作地連接”或“操作性相連”指相連的DNA序列是毗鄰的，而在分泌性前導(dǎo)序列情況下，是毗鄰的并處于同一閱讀框。然而，增強(qiáng)子不必毗鄰?？赏ㄟ^方便的限制性位點(diǎn)處的連接來實(shí)現(xiàn)連接。如果這樣的位點(diǎn)不存在，則可按常規(guī)實(shí)踐采用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
如本文所用，“代表性編號(hào)”指在一具體序列中殘基的位置編號(hào)以及在不同序列中的相應(yīng)位置編號(hào)。對(duì)應(yīng)的位置編號(hào)是序列(通常是人抗體構(gòu)架序列)中的當(dāng)用于構(gòu)建人源化抗體時(shí)與代表性編號(hào)位置在功能上等價(jià)的位置。
通常，術(shù)語“氨基酸”指所有天然存在的L-α-氨基酸。然而，在某些實(shí)施例中，在本發(fā)明的多肽或肽中也可存在D-氨基酸以便有利于構(gòu)象的限制。下面是單字符或三字符表示的氨基酸。AspD天冬氨酸 Ile I異亮氨酸ThrT蘇氨酸 Leu L亮氨酸SerS絲氨酸 Tyr Y酪氨酸GluE谷氨酸 Phe F苯丙氨酸ProP脯氨酸 His H組氨酸GlyG甘氨酸 Lys K賴氨酸AlaA丙氨酸 Arg R精氨酸CysC半胱氨酸 Trp W色氨酸ValV纈氨酸 Gln Q谷氨酰胺MetM甲硫氨酸 Asn N天冬酰胺術(shù)語“氨基酸序列變異體”指與天然氨基酸序列相比在氨基酸序列中有某些差異的分子取代性變異體是在天然序列中至少有一個(gè)氨基酸殘基被除去并且在同一位置上插入一個(gè)不同氨基酸而形成的變異體。取代可以是單個(gè)，即分子中只有一個(gè)氨基酸被取代；也可以是多個(gè)，即在同一分子中有兩個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代。
雜交宜在“嚴(yán)謹(jǐn)條件”下進(jìn)行?！皣?yán)謹(jǐn)條件”指(1)在低離子強(qiáng)度和高溫下進(jìn)行洗滌，如50℃，0.015M NaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基磺酸鈉，或者(2)在雜交過程中使用甲酰胺等變性劑，如42℃下50％(v/v)的甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mMpH6.5的磷酸鈉緩沖液及750mMNaCl、75mM檸檬酸鈉。另一例子是42℃下用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5×Denhardt’s溶液，超聲處理的鮭精DNA(50微克/毫升)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，并在42℃下用0.2×SSC和0.1％SDS洗滌。另一例子是用10％硫酸葡聚糖、2×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)和50％甲酰胺的緩沖液在55℃進(jìn)行雜交，然后用含EDTA的0.1×SSC在55℃進(jìn)行高嚴(yán)謹(jǐn)度的洗滌。當(dāng)提供了一核酸分子的核酸序列時(shí)，能夠在上述條件下與其雜交的其他核酸分子被認(rèn)為在序列范圍之內(nèi)。
在描述氨基酸序列時(shí)，應(yīng)理解可以通過用合成或突變方法重建氨基酸序列來再生產(chǎn)這些序列?；蛘?，應(yīng)理解，可用重組技術(shù)從而回收編碼這些氨基酸序列的DNA。可如下回收DNA用編碼所需氨基酸序列的DNA形成文庫。再根據(jù)氨基酸序列來產(chǎn)生探針。然后分離與探針雜交的DNA并進(jìn)行分析，以確定DNA編碼的產(chǎn)物是否是所需產(chǎn)物。通常，可用DNA(或RNA)來轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并進(jìn)行表達(dá)研究。
B.使抗體人源化的通用方法學(xué)本文所述的方法可用于使任何抗體人源化。類似地，應(yīng)理解此處具體所述的人源化抗體(人源化的抗-VEGF抗體)可以用本文描述的方法或傳統(tǒng)的DNA重組技術(shù)再生產(chǎn)。具體地講，因?yàn)殛P(guān)鍵的構(gòu)架殘基突變本文已作描述，因此再生產(chǎn)具有相同突變的人源化抗體而不使用單價(jià)噬菌體展示系統(tǒng)。相反，編碼所述氨基酸序列的DNA可用傳統(tǒng)的DNA重組技術(shù)合成或再生產(chǎn)。然后，該DNA產(chǎn)物可以被表達(dá)、鑒別和回收。或者，可用本領(lǐng)域已知的方法對(duì)抗體進(jìn)行定點(diǎn)誘變，或者可以合成具有本文所述突變的抗體。
一種特別優(yōu)選的生產(chǎn)本文所述人源化抗體的方法涉及以下步驟制備用于單價(jià)展示具有CDR序列的Fab片段的抗體噬菌粒載體，其中CDR序列通過定點(diǎn)誘變被移植到編碼人VLκI-Cκ1輕鏈和人VHIII-CHtlγ重鏈Fd的載體上；通過對(duì)一小套選定的關(guān)鍵構(gòu)架殘基進(jìn)行隨機(jī)誘變而構(gòu)建抗體Fab噬菌粒文庫；表達(dá)和純化人源化Fab片段；選擇人源化的Fab變異體；和測(cè)定結(jié)合親和力。這些步驟并不必須以任何特定的次序進(jìn)行。這些步驟在以下“具體實(shí)施例”中有具體描述，但是通?？扇缦逻M(jìn)行制備用于單價(jià)展示Fab片段的抗體噬菌粒載體首先，選擇需人源化的抗體并鑒定其互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)?？贵w的CDR序列可根據(jù)Kabat等人(同上)的序列定義加以鑒定。將CDR序列通過定點(diǎn)誘變移植到編碼人VLκI-Cκ1輕鏈和人VHIII-CHlγ重鏈Fd的載體上。然后，將Fab編碼序列亞克隆入噬菌粒載體。該構(gòu)建物編碼最初的人源化抗體，其中重鏈的C末端被精確地融合于噬菌體外被蛋白的羧基部分。較佳地，選出可在大腸桿菌的supE抑制型菌株中表達(dá)兩種分泌性重鏈或重鏈-基因III融合蛋白的噬菌粒載體。
構(gòu)建抗體Fab噬菌粒文庫根據(jù)將大量非人抗體在人VLκI-VHIII構(gòu)架上人源化所獲得的累積結(jié)果，認(rèn)為優(yōu)化抗原結(jié)合所需的構(gòu)架變化局限于某些亞組的殘基。參見Carter等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，4285(1992)；Presta等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)151，2623(1993)；Eigenbrot等人，蛋白質(zhì)(Proteins)18，49-62(1994)；Shalaby等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)175，217(1992)。因此，選出了一個(gè)新的殘基組用于隨機(jī)化處理。這些被鑒別出的關(guān)鍵構(gòu)建殘基的隨機(jī)化，可使所需的Fab變異體文庫展示在絲狀噬菌體表面。具體地講，VL殘基4和71以及VH殘基24、37、67、69、71、73、75、76、78、93和94被選定為對(duì)抗原結(jié)合至關(guān)重要的關(guān)鍵構(gòu)架殘基，并定點(diǎn)隨機(jī)誘變。
人源化Fab片段的表達(dá)和純化本領(lǐng)域已知的各種不同的方法可用于表達(dá)和純化片段。如本文所述，用噬菌粒pMB419或其變異噬菌粒來轉(zhuǎn)化大腸桿菌34B8菌株(一種非抑制型菌株)。使單菌落在5毫升含50微克/毫升羧芐青霉素的2YT培養(yǎng)基中37℃生長(zhǎng)過夜。將這些培養(yǎng)物稀釋于200毫升含20微克/毫升羧芐青霉素的AP5培養(yǎng)液中(該培養(yǎng)基描述于Chang等人，Gene，55，189(1987))，然后30℃孵育26小時(shí)。細(xì)胞以4000×g離心沉淀，-20℃冷凍至少2小時(shí)。然后將細(xì)胞沉淀重懸浮于5毫升含1mM EDTA的10mM Tris-HCl(pH7.6)中，4℃振搖90分鐘，然后10,000×g離心15分鐘。將上清液加至1毫升鏈球菌G蛋白-Sepharose柱(Pharmacia生產(chǎn)的柱)上，用10毫升10mM MES(pH5.5)洗滌。結(jié)合的Fab片段用2.5毫升100mM乙酸洗脫并立刻用0.75毫升1M Tris-HCl，pH8.0中和。Fab制劑的緩沖液被換成PBS，然后用CENTRICON-30濃縮器(Amicon生產(chǎn))濃縮。在G蛋白純化之后，典型的Fab產(chǎn)量約為1毫克/升培養(yǎng)物。純化的Fab樣品用電噴射質(zhì)譜法進(jìn)行特性分析，而濃度用氨基酸分析確定。
選擇人源化Fab變異體將純化的標(biāo)記抗原包被微量滴定板。棄去包被溶液，封閉各孔，然后加入噬菌粒原液。過了一段時(shí)間后，洗滌各孔，然后洗脫結(jié)合的噬菌體并測(cè)定效價(jià)。從包被VEGF的孔中洗脫下剩余噬菌體并使其繁殖，以用于下一輪選擇。該過程可重復(fù)數(shù)次以獲得所需數(shù)目的克隆。例如，可選出幾十個(gè)各種克隆并測(cè)序。
測(cè)定VEGF結(jié)合親和力測(cè)定人源化變異體與VEGF結(jié)合的結(jié)合常數(shù)和解離常數(shù)。分析結(jié)合曲線，并選出具有最高親和力的變異體。
人源化抗-VEGF抗體的給藥人源化抗-VEGF抗體的給藥，可根據(jù)Kim等人，生長(zhǎng)因子(Growth Factors)7，53(1992)；Kim等人，自然(Nature)362，841(1993)中所述的鼠抗-VEGF的數(shù)據(jù)來制造。具體地講，Kim等人表明，低至每周施用給藥2次10微克VEGF抗體可導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)明顯被抑制。在抗體劑量為50-100微克時(shí)獲得了最大的效果。
下列實(shí)施例只是為了說明目前已知的實(shí)施本發(fā)明的最佳方式，不應(yīng)認(rèn)為本發(fā)明受到該實(shí)施例的細(xì)節(jié)的限制。
具體實(shí)施例I構(gòu)建噬菌粒載體和最初的人源化抗-VEGF鼠抗-VEGF單克隆抗體A4.6.1早已由Kim等人描述，生長(zhǎng)因子(Growth Factors)7，53(1992)；Kim等人，自然(Nature)362，841(1993)中。A4.6.1的第一個(gè)人源化Fab變異體hu2.0是這樣構(gòu)建的對(duì)編碼人VLκI-Cκ1輕鏈和人VHIII-CHlγ1重鏈Fd片段的質(zhì)粒pAK2的含脫氧尿苷的模板進(jìn)行定點(diǎn)誘變(Carter等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，4285(1992))。根據(jù)Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，(5th)，Public Health Service，National Instistutes of Health，Bethesda，MD(1991)中的序列定義，選出被移植的A4.6.1的CDR序列，除了CDR-H1之外，我們將CDR-H1延伸出去以便包括序列和結(jié)構(gòu)序列，即VH殘基26-35(Chothia等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)196，901(1987))。將Fab編碼序列亞克隆入噬菌粒載體phGHamg3(Bass and Wells，Proteins，8，309(1990)；Lowman等人，Biochem.30，10832(1991))。該構(gòu)建物pMB4-19編碼最初的人源化A4.6.1的Fab(即hu2.0)，其中重鏈的C末端被精確地融合于M13基因III外被蛋白的羧基部分。pMB4-19這個(gè)構(gòu)建物的構(gòu)建與pDH188(一種早已描述過的用于單價(jià)展示Fab片段的質(zhì)粒(Garrard等人，Biotechn.91373-1377(1991)))相似。pMB4-19與pDH188之間的明顯區(qū)別包括更短的M13基因III片段(密碼子249-406)以及使用緊跟在抗體重鏈Fd片段之后的琥珀終止密碼子。這樣可以在大腸桿菌的supE抑制型菌株中表達(dá)分泌的重鏈或重鏈-基因III融合蛋白兩種物質(zhì)。
在圖1中顯示了最初的人源化A4.6.1 Fab片段(hu2.0)，其中A4.6.1的CDR被移植枝于人的VLκI-VHIII構(gòu)架上。Hu2.0的VL區(qū)(結(jié)構(gòu)域)示于SEQ ID NO7中，而Hu2.0的VH區(qū)示于SEQ ID NO10中。
除了被移植的CDR之外，所有的殘基都保留與人序列相同。該最初的人源化抗體與VEGF的結(jié)合力如此之弱，以致于無法檢測(cè)。根據(jù)其他弱結(jié)合的人源化A4.6.1變異體的相對(duì)親和力(數(shù)據(jù)未示出)，hu2.0的結(jié)合KD估計(jì)大于7μM。這與嵌合Fab構(gòu)建物(由鼠A4.6.1的完整VL和VH區(qū)和人的恒定區(qū)所構(gòu)成)的1.6nM親和力形成了反差。因此，hu2.0與VEGF的結(jié)合比嵌合抗體下降了至少4000倍。
設(shè)計(jì)抗-VEGF Fab噬菌粒文庫為了優(yōu)化在使用人VLκI-VHIII構(gòu)架時(shí)的抗原結(jié)合性，選出優(yōu)化所需的構(gòu)架變化組，并示于表1和圖2。按照Kunkel等人，Methods Enzymol.204，125(1991)的方法，通過定點(diǎn)誘變構(gòu)建人源化A4.6.1噬菌粒文庫。制備用作誘變模板的pMB4-19的衍生質(zhì)粒，它在VH的密碼子24、37、67和93處含有TAA終止三聯(lián)體密碼(所有的序列編號(hào)按照Kabat等人，同上)。這種修飾可防止以后野生型序列所造成的背景污染。定點(diǎn)隨機(jī)變化的目標(biāo)密碼子是4和71(輕鏈)，以及24、37、67、69、71、73、75、76、78、93和94(重鏈)。
表1對(duì)于抗原結(jié)合至關(guān)重要以及作為定點(diǎn)隨機(jī)變化目標(biāo)的關(guān)鍵性構(gòu)架殘基
a在噬菌粒文庫中的氨基酸多樣性bVH71、73、75、76被隨機(jī)化以產(chǎn)生全鼠(L71/T73/A75/S76)或全人(R71/D73/K75/N76)的VHIII四聯(lián)體(tetrad)
在設(shè)計(jì)人源化A4.6.1噬菌粒文庫時(shí)的一個(gè)著眼點(diǎn)是，定點(diǎn)隨機(jī)化的目標(biāo)殘基是廣泛分布于VL和VH序列中的。合成的寡核苷酸長(zhǎng)度方面的限制，要求這些構(gòu)架位置中各點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行隨機(jī)化只能通過使用多個(gè)寡核苷酸而實(shí)現(xiàn)。然而，隨著寡核苷酸總數(shù)的增加，誘變的效率(即摻入了所有誘變寡核苷酸序列的突變體的比例)會(huì)下降。為了巧妙地克服這一問題，在文庫構(gòu)建中引入兩個(gè)特征。第一個(gè)特征是制備4個(gè)不同的、編碼每種可能的VL構(gòu)架組合的誘變模板。由于輕鏈構(gòu)架的多樣性很有限(僅4種不同序列)，這是簡(jiǎn)單可行的，但是其優(yōu)點(diǎn)是不再需要使用來自誘變策略的兩種寡核苷酸。第二，兩個(gè)126堿基的寡核苷酸用更小的合成片段預(yù)組裝成。這樣可以用一個(gè)長(zhǎng)寡核苷酸而不是用兩個(gè)較短的寡核苷酸隨機(jī)誘變VH密碼子67、69、71、73、75、76、93和94。因此，最終的隨機(jī)誘變策略是在4種不同模板上同時(shí)采用僅兩種寡核苷酸。
更具體地說，為了用一個(gè)誘變寡核苷酸來使重鏈密碼子67、69、71、73、75、76、93和94隨機(jī)化，2個(gè)126-聚物的寡核苷酸先通過模板協(xié)助式酶連接法用60-聚物和66-聚物的片段預(yù)組裝成。具體地講，將1.5nmol 5′磷酸化的寡核苷酸GAT TTC AAA CGT CGTNYTACTWTTTCT AGA GAC AAC TCC AAA AAC ACABYTTACCTG CAG ATG AAC(SEQ ID NO12)或與GAT TTC AAA CGT CGTNYTACTWTTTCTTTAGACACCTCCGCAAGCACABYTTAC CTG CAG ATG AAC(SEQ ID NO1)與1.5nmol AGC CTG CGC GCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGTDYAARGTAC CCCCAC TAT TAT GGG(SEQ ID NO2)混合。隨機(jī)化的密碼子帶下劃線，而N表示A/G/T/C；W表示A/T；B表示G/T/C；D表示G/A/T；R表示A/G；而Y表示C/T(“/”表示“或”)。然后，加入1.5nmol模板寡核苷酸CTC AGC GCG CAG GCTGTT CAT CTG CAG GTA(SEQ ID NO3)(具有與SEQ ID NO12和1的5′端以及SEQID NO3的3′端的互補(bǔ)序列)，使其與連接接頭處的各末端雜交。向該混合物中，加入Taq連接酶(New England Biolabs的耐熱連接酶)和緩沖液，反應(yīng)混合物經(jīng)過40輪熱循環(huán)(95℃1.25分鐘和50℃5分鐘)，從而使模板寡核苷酸在連接的和未連接的接頭之間循環(huán)。產(chǎn)物126-聚物寡核苷酸在6％尿素/TBE聚丙烯酰胺凝膠上純化，然后以緩沖液從聚丙烯酰胺膠上提取出來。將兩個(gè)126-聚物產(chǎn)物等比例地混合，乙醇沉淀，最后溶解在10mM Tris-HCl，1mM EDTA中。將混合的126-聚物寡核苷酸產(chǎn)物標(biāo)記為504-01。
這樣，在兩個(gè)步驟中實(shí)現(xiàn)對(duì)選定構(gòu)架密碼子(VL的4、71；VH的67、69、71、73、75、76、93和94)的隨機(jī)誘變。首先，通過制備修飾的pMB4-19模板的另外3個(gè)衍生模板而實(shí)現(xiàn)VL的隨機(jī)化。輕鏈的構(gòu)架密碼子4和71，用兩個(gè)誘變寡核苷酸GCT GAT ATC CAG TTG ACC CAG TCC CCG(SEQ ID NO13)和TCT GGG ACGGATTACACT CTG ACC ATC(SEQ ID NO4)單個(gè)地或成對(duì)地予以替換。從每個(gè)新的衍生模板制備含脫氧尿苷的模板。與最初的模板一起，這4個(gè)構(gòu)建物編碼輕鏈構(gòu)架序列4種可能組合中的每種組合(見表1)。
用寡核苷酸504-01(2種126-聚物寡核苷酸的混合物)以及CGT TTG TCC TGTGCA RYT TCT GGC TAT ACC TTC ACC AAC TAT GGT ATG AAC TGGRTCCGT CAG GCCCCG GGT AAG(SEQ ID NO5)，并使用剛才所述的4種模板中的一種模板，使重鏈構(gòu)架密碼子隨機(jī)誘變。將4種文庫電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌XL-1 BLUECELLS(Stratagene生產(chǎn)的標(biāo)記細(xì)胞)并合并。各種轉(zhuǎn)化子的總數(shù)估計(jì)＞1.2×108，比文庫中的DNA序列最大數(shù)約大1500倍。
用這個(gè)策略，輕鏈殘基4和71以及重鏈殘基24、37、67、78和93中的每一個(gè)殘基可部分地被隨機(jī)改變，從而可以選出鼠A4.6.1、人VLκI-VHIII序列、或在其他人和鼠構(gòu)架中常發(fā)現(xiàn)的序列(表1)。注意這些殘基的隨機(jī)變化局限于在人VLκI-VHIII共有序列或A4.6.1構(gòu)架序列之間作出選擇。當(dāng)然，若包含在其他人和鼠構(gòu)架序列中常見的額外氨基酸，就有可能因額外的多樣性而選出結(jié)合更牢固的變異體。
某些重鏈構(gòu)架殘基是根據(jù)人VHIII和鼠A4.6.1根據(jù)序列而以兩元方式進(jìn)行隨機(jī)化的。殘基VH71、73、75和76位于毗鄰抗原結(jié)合位點(diǎn)的發(fā)夾環(huán)中。VH71和73的側(cè)鏈大部分被包埋在正規(guī)的抗體結(jié)構(gòu)中，而它們?cè)谑笴DR-H2和CDR-H3構(gòu)型成形方面的潛在作用是眾所周知的。Kettleborough等人，蛋白質(zhì)工程(ProteinEng.)4，773(1991)；Carter等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，4285(1992)；Shalaby等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)175，217(1992)。另一方面，盡管VH745和76的側(cè)鏈?zhǔn)潜┞队谌軇┑?圖2)，但是仍然觀察到這兩個(gè)殘基也能影響抗原結(jié)合性(Eigenbrot等人，蛋白質(zhì)(Proteins)18，49(1994))，推測(cè)是由于在某些抗體-抗原復(fù)合物中直接的抗原接觸。因?yàn)樵谛蛄猩峡拷铱赡芟嗷ヒ蕾嚕鑼H71、73、75和76整塊地隨機(jī)變化，這樣這種四聯(lián)體只有兩種可能的組合可供選擇或者是全人VHIII，或者是全鼠A4.6.1序列。最后，VH殘基69和94也被隨機(jī)變化，但僅提供VHIII和A4.6.1序列。在早先的抗體人源化過程中，VH69和94不作替換，但是因?yàn)樗鼈冊(cè)赩HIII共有序列和A4.6.1序列之間有差別(圖1)而且已注意到對(duì)合適的CDR構(gòu)型有潛在重要性(Foote等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)224，489(1992))，因此它們也被包括在該隨機(jī)誘變策略中。
在噬菌粒表面上展示的人源化A4.6.1 Fab文庫已開發(fā)了各種不同的系統(tǒng)用于在絲狀噬菌體表面上功能性地展示抗體片段(Winter等人，Ann.Rev.Immunol.12，433(1994))。它們包括以融合于M13噬菌體基因III或基因VII外被蛋白的融合蛋白形式，來展示Fab或單鏈Fv(scFv)片段。本文所選的系統(tǒng)與Garrard等人，Biotechn.91373-1377(1991)所述的系統(tǒng)相似，其中Fab片段以基因III融合物形式被單價(jià)地展示(圖3)。該系統(tǒng)有兩個(gè)顯著特征。具體地講，與scFv不同，F(xiàn)ab片段沒有形成二聚體物質(zhì)的傾向，而二聚體的存在會(huì)因親合效應(yīng)而阻礙選出最強(qiáng)的結(jié)合物。此外，被展示蛋白質(zhì)的單價(jià)性消除了第二種親合效應(yīng)的潛在來源，而原本在每個(gè)噬菌粒顆粒上存在一個(gè)蛋白的多個(gè)拷貝時(shí)會(huì)產(chǎn)生這種親合效應(yīng)(Bass and Wells，Proteins，8，309(1990)；Lowman等人，Biochem.30，10832(1991))。
使展示人源化A4.6.1 Fab片段的噬菌粒顆粒，在大腸桿菌XL-1 Blue細(xì)胞中繁殖。簡(jiǎn)而言之，使攜帶隨機(jī)化pMB4-19構(gòu)建物的細(xì)胞，在25毫升含50微克/毫升羧芐青霉素和約1010M13KO7輔助噬菌體的2YT培養(yǎng)基中，37℃生長(zhǎng)過夜(Viera andMessing，Methods Enzymol.153，3)。噬菌粒原液通過用聚乙二醇鹽水溶液沉淀培養(yǎng)上清液而加以純化，然后重懸于100微升PBS中(約1014噬菌粒/毫升)。
選擇人源化的A4.6.1 Fab變異體將純化的VEGF121(100微升，10微克/毫升PBS)包被微量滴定板孔，4℃過夜。棄去包被溶液，用6％脫脂奶封閉該孔和未包被的孔1小時(shí)，并用含0.05％吐溫20(洗滌劑)的PBS洗孔。然后每孔加入噬菌粒原液10微升(用含1％BSA和0.05％吐溫20的20mMTris(pH7.5)稀釋至100微升)。2小時(shí)后洗滌各孔，然后用100微升0.1M甘氨酸(pH2.0)洗脫結(jié)合的噬菌體并用25微升1M Tris pH8.0中和。取一等份用于洗脫噬菌體數(shù)目的滴定。從VEGF包被孔上洗脫下的其余噬菌體被繁殖，以用于下一輪選擇循環(huán)?？傆?jì)進(jìn)行了8輪選擇，之后20個(gè)克隆可以被選出并測(cè)序(Sanger等人，PNAS USA，74，5463(1977))。
因此，根據(jù)與VEGF的結(jié)合性選出人源化的A4.6.1 Fab噬菌粒文庫的變異體。通過比較VEGF包被的和未包被的微量滴定板孔中所洗脫出的噬菌體效價(jià)，確定功能性噬菌粒的富集程度，在7輪親和力淘選之內(nèi)富集程度是增加的。在又一輪挑選之后，對(duì)20個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序以鑒定在每個(gè)隨機(jī)化位點(diǎn)處選出的優(yōu)選構(gòu)架殘基。這些結(jié)果總結(jié)于表2，揭示出在所選的克隆之間有強(qiáng)共有序列。20個(gè)克隆中的10個(gè)有相同的DNA序列，命名為h2.10。在13個(gè)被隨機(jī)化的構(gòu)架位置中，在hu2.10中選出了8個(gè)取代(VL71；VH37、71、73、75、76、78和94)。有趣的是，選出的殘基VH37(Ile)和78(Val)既不是人VHIII的也不是鼠A4.6.1序列的。這個(gè)結(jié)果提示，通過將多樣性擴(kuò)展至靶定的人和親代鼠構(gòu)架序列之外，可以使某些構(gòu)架位置受益。
表2從人源化A4.6.1噬菌粒Fab文庫中選出的序列
Hu2.0和鼠A4.6.1抗體之間的區(qū)別用下劃線標(biāo)出。對(duì)于每種噬菌體選出序列相同的克隆數(shù)目在括號(hào)中標(biāo)出。在噬菌體選出的克隆序列中的破折號(hào)表示選出的是人VlкI-VHIII構(gòu)架序列(即與hu2.0中相同)。
在被分析的其余10種克隆中，有另外4種獨(dú)特的氨基酸序列hu2.1、hu2.2、hu2.6和hu2.7。除了hu2.10之外，所有這些克隆在位置VH37(Ile)、78(Val)和94(Lys)處含有相同的構(gòu)架取代，但是在位置24和93保留了人VHIII共有序列。4個(gè)克隆丟失了輕鏈編碼序列，在噬菌體ELISA試驗(yàn)(Cunningham等人，EMBO J.13，2508(1994))中測(cè)試時(shí)不結(jié)合于VEGF。我們偶然注意到了其他Fab噬菌粒文庫中有丟失輕鏈或重鏈序列的情況(未公開數(shù)據(jù))，而且這些克隆是以更高的表達(dá)為基礎(chǔ)而假設(shè)地選出的。通過減少選擇循環(huán)次數(shù)或者通過在固相培養(yǎng)基上繁殖文庫，?？勺畲蟪潭葴p少這種人為現(xiàn)象。
測(cè)定VEGF的結(jié)合親和力通過表面胞質(zhì)團(tuán)共振法(surface plasmon resonance)(Karlsson等人，J.Immun.Methods 145，229(1991))，在Pharmacia BIAcore儀器上測(cè)定了人源化A4.6.1 Fab變異體與VEGF121結(jié)合的結(jié)合常數(shù)(kon)和解離常數(shù)(koff)。VEGF121通過伯氨基而共價(jià)固定于生物傳感器芯片上。人源化A4.6.1 Fab變異體的結(jié)合性的測(cè)定，是通過將Fab(以PBS/0.05％TWEEN-20(去污劑)配)溶液以20微升/分鐘的流速流過芯片。在每次結(jié)合測(cè)量之后，用5微升50mM鹽酸水溶液以3微升/分鐘速度洗滌，從而將殘留的Fab從固定化的配體上脫下。用簡(jiǎn)單的單價(jià)結(jié)合模式(BIAevalution軟件2.0版；Pharmacia)，通過非線性回歸法分析結(jié)合曲線。
用搖瓶在大腸桿菌中表達(dá)噬菌體選出的變異體hu2.1、hu2.2、hu2.6、hu2.7和hu2.10，然后用G蛋白親和層析從周質(zhì)提取物中純化得到Fab片段。這5種克隆的Fab回收產(chǎn)率在0.2(hu2.6)-1.7毫克/升(hu2.1)之間。這些變異體對(duì)抗原(VEGF)的親和力用表面胞質(zhì)團(tuán)共振法在BIAcore儀器上測(cè)定，示于表3。
表3人源化A4.6.1 Fab變異體的VEGF結(jié)合親和力
*Hu2.10V＝具有VLLeu46→Val突變的Hu2.10；估計(jì)在Biacore結(jié)合測(cè)量值中的誤差為±25％；**太弱以致于無法測(cè)量，更低結(jié)合的估計(jì)值這一結(jié)合數(shù)據(jù)的分析揭示，在5種被測(cè)試的變異體中，共有序列的克隆hu2.10對(duì)VEGF具有最高親和力。因此，我們的Fab噬菌粒文庫選擇性富集了結(jié)合最牢的克隆。計(jì)算出的hu2.10的KD是55nM，至少比沒有構(gòu)架變化的hu2.0(KD＞7μM)結(jié)合牢固125倍。其他4種選出的變異體都表現(xiàn)出與VEGF的弱結(jié)合，最弱的(hu2.7)低至KD為360nM。有趣的是，hu2.6的KD是67nM，只比hu2.10略低，但是在20個(gè)被測(cè)序克隆中僅有一個(gè)這樣的克隆。這可能是因?yàn)楸磉_(dá)和展示的水平較低，正如表達(dá)該變異體的可溶性Fab時(shí)一樣。然而，盡管表達(dá)率較低，該變異體仍可用作人源化抗體。
人源化變異體hu2.10的進(jìn)一步改進(jìn)盡管抗原親和性已比最初的人源化變異體有了大幅提高，hu2.10與VEGF的結(jié)合仍比含有鼠A4.6.1 VL和VH區(qū)的嵌合Fab片段弱35倍。這種相當(dāng)大的差別提示，可通過額外的突變使人源化構(gòu)架進(jìn)一步優(yōu)化。在Foote等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)196，901(1992)所鑒別的游標(biāo)殘基中，僅殘基VL46、VH2和VH48在A4.6.1和人VlκI-VHIII構(gòu)架之間是不同的(圖1)但在我們的噬菌粒文庫中沒有被隨機(jī)變化。人源化A4.6.1 Fv片段的分子模型顯示，VL46位于VL-VH界面處而且可能影響CDRH3的構(gòu)型。此外，該氨基酸在大多數(shù)Vlκ構(gòu)架中幾乎總是亮氨酸(Kabat等人，同上)，但是在A4.6.1中是纈氨酸。因此，在hu2.10的基礎(chǔ)上在該位置進(jìn)行了Leu→Val取代。對(duì)該新變異體hu2.10V的結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析表明，與VEGF結(jié)合的KD又提高了6倍。這樣，hu2.10V的KD(9.3nM)就在嵌合體KD的6倍之內(nèi)。與VL46相反，將VH2或VH48殘基用鼠A4.6.1的相應(yīng)殘基進(jìn)行替換時(shí)，未見hu2.10結(jié)合親和力的提高。
有趣的是，最后變化之前的親和力部分提高，是因?yàn)樘岣吡私Y(jié)合速率常數(shù)(kon)，這提示VL46可能在使抗體結(jié)構(gòu)預(yù)先形成更適合結(jié)合抗原的構(gòu)型方面起作用。影響抗原親和力的其他突變主要是因?yàn)榻Y(jié)合的解離速率常數(shù)(koff)發(fā)生變化。HU2.1和HU2.10的比較揭示，用A4.6.1序列替換VH殘基71、73、75、76導(dǎo)致親和力提高5倍。將VL71轉(zhuǎn)變?yōu)锳4.6.1序列(Phe→Tyr)對(duì)結(jié)合的影響可忽略不計(jì)(HU2.2對(duì)HU2.7)，而在VL4位上具有亮氨酸的變異體的結(jié)合力比那些具有甲硫氨酸(在A4.6.1和人
構(gòu)架中的天然存在的殘基)的變異體稍差(＜2倍)(HU2.2對(duì)HU2.1)。對(duì)此處未示出的其他人源化A4.6.1變異體的比較揭示，VH94 Arg→Lys改變導(dǎo)致KD提高5倍，這或者是因?yàn)樵摎埢苯优c抗原接觸，或者是因?yàn)槠湓诰S持CDR-H3合適構(gòu)型中在結(jié)構(gòu)方面起作用。變異體HU2.6與共有序列的克隆hu2.10相比有3個(gè)序列差別，但是仍有類似的KD，因而提示這3個(gè)取代對(duì)抗原結(jié)合只有很少影響。在VL4和71處保守性變化的可忽略不計(jì)的影響與其他變異體的結(jié)合數(shù)據(jù)是一致的，而VH67的變化(Phe→Thr)對(duì)結(jié)合的影響很小。
結(jié)束語上面描述的內(nèi)容詳細(xì)地說明了具體化的方法，它們可用于實(shí)施本發(fā)明。在詳細(xì)描述了這些具體方法之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)充分知曉如何設(shè)計(jì)其他可靠方法，從而通過應(yīng)用本發(fā)明的成果來獲得同樣信息。因此，無論文中前面的描述如何詳細(xì)，都不應(yīng)理解為限制其總體范圍；相反，本發(fā)明范圍僅由所附權(quán)利要求的法律結(jié)構(gòu)所確定。在本文中提及的所有文獻(xiàn)都明白地納入本文作為參考。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人GENENTECH，INC.(ii)發(fā)明名稱人源化抗體和制備人源化抗體的方法(iii)序列數(shù)目14(iv)通信地址(A)收信人Flehr Hohbach Test Albritton & Herbert(B)街道Four Embarcadero Center，Suite 3400(C)城市San Francisco(D)州California(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編94111(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)本申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朠CT HEREWITH(B)申請(qǐng)日02-4月-1998(C)分類(vi)本申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?8/833,504(B)申請(qǐng)日07-4月-1997(C)分類(viii)律師/代理人信息
(A)姓名Dreger Walter H(B)登記號(hào)24,190(C)參考/案卷號(hào)A-64254(ix)通訊信息(A)電話(415)781-1989(B)傳真(415)398-3249(2)SEQ ID NO1(i)序列特征(A)長(zhǎng)度66堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GATTTCAAAC GTCGTNYTAC TWTTTCTTTA GACACCTCCG CAAGCACABY TTACCTGCAG 60ATGAAC 66(2)SEQ ID NO2(i)序列特征(A)長(zhǎng)度60堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO2AGCCTGCGCG CTGAGGACAC TGCCGTCTAT TACTGTDYAA RGTACCCCCA CTATTATGGG 60(2)SEQ ID NO3(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3CTCAGCGCGC AGGCTGTTCA TCTGCAGGTA 30(2)SEQ ID NO4(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO4TCTGGGACGG ATTACACTCT GACCATC 27(2)SEQ ID NO5(i)序列特征(A)長(zhǎng)度75堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO5CGTTTGTCCT GTGCARYTTC TGGCTATACC TTCACCAACT ATGGTATGAA CTGGRTCCGT 60CAGGCCCCGG GTAAG 75(2)SEQ ID NO6(i)序列特征(A)長(zhǎng)度107氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Arg Val Ile Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Val Leu Ile35 40 45Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105(2)SEQ ID NO7(i)序列特征(A)長(zhǎng)度107氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO7Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105(2)SEQ ID NO8(i)序列特征(A)長(zhǎng)度107氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO8Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105(2)SEQ ID NO9(i)序列特征(A)長(zhǎng)度123氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO9Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Gln Pro Gly Glu1 5 10 15Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe50 55 60Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val100 105 110Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO10(i)序列特征(A)長(zhǎng)度123氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO10Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe50 55 60Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO11(i)序列特征(A)長(zhǎng)度123氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO11Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe50 55 60Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO12(i)序列特征(A)長(zhǎng)度66堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO12GATTTCAAAC GTCGTNYTAC TWTTTCTAGA GACAACTCCA AAAACACABY TTACCTGCAG 60ATGAAC 66(2)SEQ ID NO13(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO13GCTGATATCC AGTTGACCCA GTCCCCG 27(2)SEQ ID NO14(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6072堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(ix)FEATURE(A)名稱/關(guān)鍵符號(hào)混合特征(B)位置459..460(D)其他信息/注意＝＂輕鏈開始于堿基No.459.＂(ix)FEATURE(A)名稱/關(guān)鍵符號(hào)混合特征(B)位置1101..1102(D)其他信息/注意＝＂輕鏈終止于堿基No.1101.＂(ix)FEATURE(A)名稱/關(guān)鍵符號(hào)混合特征(B)位置1254..1255(D)其他信息/注意＝＂重鏈開始于堿基No.1254.＂(ix)FEATURE(A)名稱/關(guān)鍵符號(hào)混合特征(B)位置2424..2425(D)其他信息/注意＝＂重鏈終止于堿基No..2424.＂(xi)序列描述SEQ ID NO14GAATTCAACT TCTCCATACT TTGGATAAGG AAATACAGAC ATGAAAAATC TCATTGCTGA 60GTTGTTATTT AAGCTTTGGA GATTATCGTC ACTGCAATGC TTCGCAATAT GGCGCAAAAT 120GACCAACAGC GGTTGATTGA TCAGGTAGAG GGGGCGCTGT ACGAGGTAAA GCCCGATGCC 180AGCATTCCTG ACGACGATAC GGAGCTGCTG CGCGATTACG TAAAGAAGTT ATTGAAGCAT 240CCTCGTCAGT AAAAAGTTAA TCTTTTCAAC AGCTGTCATA AAGTTGTCAC GGCCGAGACT 300TATAGTCGCT TTGTTTTTAT TTTTTAATGT ATTTGTAACT AGAATTCGAG CTCGGTACCC 360GGGGATCCTC TAGAGGTTGA GGTGATTTTA TGAAAAAGAA TATCGCATTT CTTCTTGCAT 420CTATGTTCGT TTTTTCTATT GCTACAAACG CGTACGCTGA TATCCAGATG ACCCAGTCCC 480CGAGCTCCCT GTCCGCCTCT GTGGGCGATA GGGTCACCAT CACCTGCAGC GCAAGTCAGG 540ATATTAGCAA CTATTTAAAC TGGTATCAAC AGAAACCAGG AAAAGCTCCG AAAGTACTGA 600TTTACTTCAC CTCCTCTCTC CACTCTGGAG TCCCTTCTCG CTTCTCTGGA TCCGGTTCTG 660GGACGGATTA CACTCTGACC ATCAGCAGTC TGCAGCCAGA AGACTTCGCA ACTTATTACT 720GTCAACAGTA TAGCACCGTG CCGTGGACGT TTGGACAGGG TACCAAGGTG GAGATCAAAC 780GAACTGTGGC TGCACCATCT GTCTTCATCT TCCCGCCATC TGATGAGCAG TTGAAATCTG 840GAACTGCTTC TGTTGTGTGC CTGCTGAATA ACTTCTATCC CAGAGAGGCC AAAGTACAGT 900GGAAGGTGGA TAACGCCCTC CAATCGGGTA ACTCCCAGGA GAGTGTCACA GAGCAGGACA 960GCAAGGACAG CACCTACAGC CTCAGCAGCA CCCTGACGCT GAGCAAAGCA GACTACGAGA 1020AACACAAAGT CTACGCCTGC GAAGTCACCC ATCAGGGCCT GAGCTCGCCC GTCACAAAGA 1080GCTTCAACAG GGGAGAGTGT TAAGCTGATC CTCTACGCCG GACGCATCGT GGCCCTAGTA 1140CGCAACTAGT CGTAAAAAGG GTATCTAGAG GTTGAGGTGA TTTTATGAAA AAGAATATCG 1200CATTTCTTCT TGCATCTATG TTCGTTTTTT CTATTGCTAC AAACGCGTAC GCTGAGGTTC 1260AGCTGGTGGA GTCTGGCGGT GGCCTGGTGC AGCCAGGGGG CTCACTCCGT TTGTCCTGTG 1320CAGCTTCTGG CTATACCTTC ACCAACTATG GTATGAACTG GATCCGTCAG GCCCCGGGTA 1380AGGGCCTGGA ATGGGTTGGA TGGATTAACA CCTATACCGG TGAACCGACC TATGCTGCGG 1440ATTTCAAACG TCGTTTTACT ATTTCTTTAG ACACCTCCGC AAGCACAGTT TACCTGCAGA 1500TGAACAGCCT GCGCGCTGAG GACACTGCCG TCTATTACTG TGCAAAGTAC CCCCACTATT 1560ATGGGAGCAG CCACTGGTAT TTCGACGTCT GGGGTCAAGG AACCCTGGTC ACCGTCTCCT 1620CGGCCTCCAC CAAGGGCCCA TCGGTCTTCC CCCTGGCACC CTCCTCCAAG AGCACCTCTG 1680GGGGCACAGC GGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGT 1740CGTGGAACTC AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCGGCTGTC CTACAGTCCT 1800CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGCACCCAGA 1860CCTACATCTG CAACGTGAAT CACAAGCCCA GCAACACCAA GGTCGACAAG AAAGTTGAGC 1920CCAAATCTTG TGACAAAACT CACCTCTAGA GTGGCGGTGG CTCTGGTTCC GGTGATTTTG 1980ATTATGAAAA GATGGCAAAC GCTAATAAGG GGGCTATGAC CGAAAATGCC GATGAAAACG 2040CGCTACAGTC TGACGCTAAA GGCAAACTTG ATTCTGTCGC TACTGATTAC GGTGCTGCTA 2100TCGATGGTTT CATTGGTGAC GTTTCCGGCC TTGCTAATGG TAATGGTGCT ACTGGTGATT 2160TTGCTGGCTC TAATTCCCAA ATGGCTCAAG TCGGTGACGG TGATAATTCA CCTTTAATGA 2220ATAATTTCCG TCAATATTTA CCTTCCCTCC CTCAATCGGT TGAATGTCGC CCTTTTGTCT 2280TTAGCGCTGG TAAACCATAT GAATTTTCTA TTGATTGTGA CAAAATAAAC TTATTCCGTG 2340GTGTCTTTGC GTTTCTTTTA TATGTTGCCA CCTTTATGTA TGTATTTTCT ACGTTTGCTA 2400ACATACTGCG TAATAAGGAG TCTTAATCAT GCCAGTTCTT TTGGCTAGCG CCGCCCTATA 2460CCTTGTCTGC CTCCCCGCGT TGCGTCGCGG TGCATGGAGC CGGGCCACCT CGACCTGAAT 2520GGAAGCCGGC GGCACCTCGC TAACGGATTC ACCACTCCAA GAATTGGAGC CAATCAATTC2580TTGCGGAGAA CTGTGAATGC GCAAACCAAC CCTTGGCAGA ACATATCCAT CGCGTCCGCC2640ATCTCCAGCA GCCGCACGCG GCGCATCTCG GGCAGCGTTG GGTCCTGGCC ACGGGTGCGC2700ATGATCGTGC TCCTGTCGTT GAGGACCCGG CTAGGCTGGC GGGGTTGCCT TACTGGTTAG2760CAGAATGAAT CACCGATACG CGAGCGAACG TGAAGCGACT GCTGCTGCAA AACGTCTGCG2820ACCTGAGCAA CAACATGAAT GGTCTTCGGT TTCCGTGTTT CGTAAAGTCT GGAAACGCGG2880AAGTCAGCGC CCTGCACCAT TATGTTCCGG ATCTGCATCG CAGGATGCTG CTGGCTACCC2940TGTGGAACAC CTACATCTGT ATTAACGAAG CGCTGGCATT GACCCTGAGT GATTTTTCTC3000TGGTCCCGCC GCATCCATAC CGCCAGTTGT TTACCCTCAC AACGTTCCAG TAACCGGGCA3060TGTTCATCAT CAGTAACCCG TATCGTGAGC ATCCTCTCTC GTTTCATCGG TATCATTACC3120CCCATGAACA GAAATTCCCC CTTACACGGA GGCATCAAGT GACCAAACAG GAAAAAACCG3180CCCTTAACAT GGCCCGCTTT ATCAGAAGCC AGACATTAAC GCTTCTGGAG AAACTCAACG3240AGCTGGACGC GGATGAACAG GCAGACATCT GTGAATCGCT TCACGACCAC GCTGATGAGC3300TTTACCGCAG GATCCGGAAA TTGTAAACGT TAATATTTTG TTAAAATTCG CGTTAAATTT3360TTGTTAAATC AGCTCATTTT TTAACCAATA GGCCGAAATC GGCAAAATCC CTTATAAATC3420AAAAGAATAG ACCGAGATAG GGTTGAGTGT TGTTCCAGTT TGGAACAAGA GTCCACTATT3480AAAGAACGTG GACTCCAACG TCAAAGGGCG AAAAACCGTC TATCAGGGCT ATGGCCCACT3540ACGTGAACCA TCACCCTAAT CAAGTTTTTT GGGGTCGAGG TGCCGTAAAG CACTAAATCG3600GAACCCTAAA GGGAGCCCCC GATTTAGAGC TTGACGGGGA AAGCCGGCGA ACGTGGCGAG3660AAAGGAAGGG AAGAAAGCGA AAGGAGCGGG CGCTAGGGCG CTGGCAAGTG TAGCGGTCAC3720GCTGCGCGTA ACCACCACAC CCGCCGCGCT TAATGCGCCG CTACAGGGCG CGTCCGGATC3780CTGCCTCGCG CGTTTCGGTG ATGACGGTGA AAACCTCTGA CACATGCAGC TCCCGGAGAC3840GGTCACAGCT TGTCTGTAAG CGGATGCCGG GAGCAGACAA GCCCGTCAGG GCGCGTCAGC3900GGGTGTTGGC GGGTGTCGGG GCGCAGCCAT GACCCAGTCA CGTAGCGATA GCGGAGTGTA3960TACTGGCTTA ACTATGCGGC ATCAGAGCAG ATTGTACTGA GAGTGCACCA TATGCGGTGT4020GAAATACCGC ACAGATGCGT AAGGAGAAAA TACCGCATCA GGCGCTCTTC CGCTTCCTCG4080CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG CTGCGGCGAG CGGTATCAGC TCACTCAAAG4140GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG GATAACGCAG GAAAGAACAT GTGAGCAAAA4200GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA CCGTAAAAAG GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT CCATAGGCTC4260CGCCCCCCTG ACGAGCATCA CAAAAATCGA CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG AAACCCGACA4320GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC TCCTGTTCCG4380ACCCTGCCGC TTACCGGATA CCTGTCCGCC TTTCTCCCTT CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT4440CATAGCTCAC GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA GCTGGGCTGT4500GTGCACGAAC CCCCCGTTCA GCCCGACCGC TGCGCCTTAT CCGGTAACTA TCGTCTTGAG4560TCCAACCCGG TAAGACACGA CTTATCGCCA CTGGCAGCAG CCACTGGTAA CAGGATTAGC4620AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA CTACGGCTAC4680ACTAGAAGGA CAGTATTTGG TATCTGCGCT CTGCTGAAGC CAGTTACCTT CGGAAAAAGA4740GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT TTTTGTTTGC4800AAGCAGCAGA TTACGCGCAG AAAAAAAGGA TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT CTTTTCTACG4860GGGTCTGACG CTCAGTGGAA CGAAAACTCA CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT GAGATTATCA4920AAAAGGATCT TCACCTAGAT CCTTTTAAAT TAAAAATGAA GTTTTAAATC AATCTAAAGT4980ATATATGAGT AAACTTGGTC TGACAGTTAC CAATGCTTAA TCAGTGAGGC ACCTATCTCA5040GCGATCTGTC TATTTCGTTC ATCCATAGTT GCCTGACTCC CCGTCGTGTA GATAACTACG5100ATACGGGAGG GCTTACCATC TGGCCCCAGT GCTGCAATGA TACCGCGAGA CCCACGCTCA5160CCGGCTCCAG ATTTATCAGC AATAAACCAG CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT5220CCTGCAACTT TATCCGCCTC CATCCAGTCT ATTAATTGTT GCCGGGAAGC TAGAGTAAGT5280AGTTCGCCAG TTAATAGTTT GCGCAACGTT GTTGCCATTG CTGCAGGCAT CGTGGTGTCA5340CGCTCGTCGT TTGGTATGGC TTCATTCAGC TCCGGTTCCC AACGATCAAG GCGAGTTACA5400TGATCCCCCA TGTTGTGCAA AAAAGCGGTT AGCTCCTTCG GTCCTCCGAT CGTTGTCAGA5460AGTAAGTTGG CCGCAGTGTT ATCACTCATG GTTATGGCAG CACTGCATAA TTCTCTTACT5520GTCATGCCAT CCGTAAGATG CTTTTCTGTG ACTGGTGAGT ACTCAACCAA GTCATTCTGA5580GAATAGTGTA TGCGGCGACC GAGTTGCTCT TGCCCGGCGT CAACACGGGA TAATACCGCG5640CCACATAGCA GAACTTTAAA AGTGCTCATC ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGAAAACTC5700TCAAGGATCT TACCGCTGTT GAGATCCAGT TCGATGTAAC CCACTCGTGC ACCCAACTGA5760TCTTCAGCAT CTTTTACTTT CACCAGCGTT TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT5820GCCGCAAAAA AGGGAATAAG GGCGACACGG AAATGTTGAA TACTCATACT CTTCCTTTTT5880CAATATTATT GAAGCATTTA TCAGGGTTAT TGTCTCATGA GCGGATACAT ATTTGAATGT5940ATTTAGAAAA ATAAACAAAT AGGGGTTCCG CGCACATTTC CCCGAAAAGT GCCACCTGAC6000GTCTAAGAAA CCATTATTAT CATGACATTA ACCTATAAAA ATAGGCGTAT CACGAGGCCC6060TTTCGTCTTC AA607權(quán)利要求
1.一種人源化抗體，其特征在于，非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)CDR被接枝到含VLκ亞組I(V1κI)和VH亞組III(VHIII)的人構(gòu)架上，其中在VL區(qū)中代表性編號(hào)殘基4和71中至少一個(gè)殘基被與該位置上氨基酸不同的氨基酸所取代，而且在VH區(qū)中代表性編號(hào)殘基24、37、67、69、71、73、75、76、78、93和94中至少3個(gè)殘基被與該位置上氨基酸不同的氨基酸所取代。
2.如權(quán)利要求1所述的人源化抗體，其特征在于，該抗體針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。
3.如權(quán)利要求2所述的人源化抗體，其特征在于，VL區(qū)具有SEQ ID NO8所示的序列而VH區(qū)具有SEQ ID NO11所示的序列。
4.如權(quán)利要求3所述的人源化抗體，其特征在于，在SEQ ID NO8中，殘基46亮氨酸被纈氨酸所取代。
5.如權(quán)利要求3所述的人源化抗體，其特征在于，在SEQ ID NO8中，殘基4甲硫氨酸被亮氨酸所取代；殘基71酪氨酸被苯丙氨酸所取代；而且在SEQ ID NO11中，殘基67苯丙氨酸被蘇氨酸所取代。
6.如權(quán)利要求2所述的人源化抗體，其特征在于，VL區(qū)具有SEQ ID NO7所示的序列而VH區(qū)具有SEQ ID NO10所示的序列，其中在SEQ ID NO7中殘基71苯丙氨酸被酪氨酸所取代，而且在SEQ ID NO10中殘基37纈氨酸被異亮氨酸所取代，殘基78亮氨酸被纈氨酸所取代，而殘基94精氨酸被賴氨酸所取代。
7.如權(quán)利要求6所述的人源化抗體，其特征在于，在SEQ ID NO7中殘基4甲硫氨酸被亮氨酸所取代。
8.如權(quán)利要求7所述的人源化抗體，其特征在于，在SEQ ID NO7中殘基71酪氨酸被苯丙氨酸所取代，而且在SEQ ID NO10中殘基67苯丙氨酸被蘇氨酸所取代。
9.一種使非人抗體人源化的方法，其特征在于，它包括步驟將非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)CDR移植到含VLκ亞組I(V1κI)和VH亞組III(VHIII)的人構(gòu)架上；對(duì)VL區(qū)中殘基4和71中至少一個(gè)殘基用與該位置上氨基酸不同的氨基酸進(jìn)行取代；對(duì)在VH區(qū)中殘基24、37、67、69、71、73、75、76、78、93和94中至少3個(gè)殘基用與該位置上氨基酸不同的氨基酸進(jìn)行取代。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，該抗體針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，VL區(qū)具有SEQ ID NO8所示的序列而VH區(qū)具有SEQ ID NO11所示的序列。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，在SEQ ID NO8中，殘基46亮氨酸被纈氨酸所取代。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，在SEQ ID NO8中，殘基4甲硫氨酸被亮氨酸所取代；殘基71酪氨酸被苯丙氨酸所取代；而且在SEQ ID NO11中，殘基67苯丙氨酸被蘇氨酸所取代。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，VL區(qū)具有SEQ ID NO7所示的序列而VH區(qū)具有SEQ ID NO10所示的序列，其中在SEQ ID NO7中殘基71苯丙氨酸被酪氨酸所取代，而且在SEQ ID NO10中殘基37纈氨酸被異亮氨酸所取代，殘基78亮氨酸被纈氨酸所取代，而殘基94精氨酸被賴氨酸所取代。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，在SEQ ID NO7中殘基4甲硫氨酸被亮氨酸所取代。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，在SEQ ID NO7中殘基71酪氨酸被苯丙氨酸所取代。
17.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，還包括步驟在噬菌粒上展示取代的VL和VH區(qū)；測(cè)定VEGF是否結(jié)合于取代的VL和VH區(qū)；選擇結(jié)合于VEGF的人源化抗體。
18.一種通過抑制促有絲分裂信號(hào)傳導(dǎo)而抑制腫瘤生長(zhǎng)方法，其特征在于，通過將權(quán)利要求1所述的人源化抗體施用于腫瘤。
19.如權(quán)利要求1所述的人源化抗體，其特征在于，該抗體由在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與具有SEQ ID NO14所示序列的核酸分子雜交的核酸分子所編碼。
20.如權(quán)利要求1所述的人源化抗體，其特征在于，由具有SEQ ID NO14所示序列的核酸分子編碼。
全文摘要
本發(fā)明描述了針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的人源化抗體。還描述了快速產(chǎn)生和鑒定可提高人源化抗體與其相關(guān)抗原結(jié)合力的構(gòu)架突變的方法。在一優(yōu)選例中,非人CDR被移植于人V
文檔編號(hào)C12N5/10GK1259961SQ98805910
公開日2000年7月12日 申請(qǐng)日期1998年4月3日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月7日
發(fā)明者J·A·韋爾斯, M·巴卡, L·G·普雷塔 申請(qǐng)人:基因技術(shù)股份有限公司