專利名稱：胞內(nèi)發(fā)炎、細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活通道的調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及由TNF/NGF受體超家族受體及其相關(guān)細(xì)胞內(nèi)銜接蛋白質(zhì)、蛋白酶類(caspase)和激酶介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活通道的調(diào)節(jié)劑領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種新的蛋白(該蛋白原來稱為CBK，但現(xiàn)在命名為B1)，其同種型、類似物、片段和衍生物，它表現(xiàn)出能與屬于細(xì)胞死亡、細(xì)胞存活和發(fā)炎通道的各種細(xì)胞內(nèi)蛋白和酶直接或間接相互作用，從而是這些通道的調(diào)節(jié)劑。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長因子(TNF/NGF)受體超家族的特征是其成員胞外結(jié)構(gòu)域具有結(jié)構(gòu)同源性(Bazan，1993；Beulter和Van Huffel，1994；Smith等人.，1994)。除了p55 TNF受體和Fas/APO1這兩個受體外，該受體家族各成員的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)沒有呈現(xiàn)出明顯的相似性。然而這些受體之間在功能上是很相近的，這提示這些受體分享了共同的信號傳導(dǎo)通道。這種相似性的一個例子是幾種TNF/NGF家族的受體都有激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的能力。這種共同的能力應(yīng)歸功于一種細(xì)胞質(zhì)蛋白，它能激活NF-κB，TNF受體相關(guān)因子2(TRAF2)使其與TNF/NGF家族的幾個受體中結(jié)構(gòu)不相似的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域發(fā)生結(jié)合。目前還不清楚TRAF2的作用機制，也不清楚針對其所結(jié)合的不同受體的應(yīng)答是如何被協(xié)調(diào)的。
TRAF2是一個最近被描述的稱為TRAF的蛋白質(zhì)家族中的一員，這個家族包括幾個已被確認(rèn)的蛋白質(zhì)如TRAF1、TRAF2(Rothe，M，Wong，s.c.，Hezen，W.J.和Goeddel，D(1994)Cell 78681-692；PCT公開出版物WO95/33051)、TRAF3(Cheng G.等人，(1995))和TRAF6(見Cao等人，1996a)。
所有屬于TRAF家族的蛋白質(zhì)其C端結(jié)構(gòu)域氨基酸有高度的相同性，而N端結(jié)構(gòu)域可能沒有相互關(guān)系。從TRAF2的簡示圖(

圖1)顯示，此分子在其C端區(qū)域含有一個環(huán)指基序和兩個TFIIIA樣的鋅指基序。分子的C端一半部分含有被稱為“TRAF結(jié)構(gòu)域”的區(qū)域，其包含一個在264-358位氨基酸之間延伸的潛在亮氨酸拉鏈區(qū)(稱為N-TRAF)，朝向結(jié)構(gòu)域羧基端的另一部分位于359-501位氨基酸之間(稱為C-TRAF)，這個部分負(fù)責(zé)TRAF結(jié)合受體以及其他TRAF分子從而形成同源或異源二聚體。
轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化是某些TNF/NGF受體所引發(fā)并由TRAF2所介導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng)的表現(xiàn)形式。NF-κB包括與Rel癌基因同源的、能形成二聚體的蛋白家族成員，當(dāng)這些蛋白質(zhì)處于二聚體形式時，能起轉(zhuǎn)錄因子的作用。這些因子是普遍存在的，并且參與多種基因的表達(dá)調(diào)控。盡管NF-κB最初被鑒定為一種在處于Igκ輕鏈表達(dá)階段的B細(xì)胞中的組成型因子，但是已知NF-κB主要作為可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活物起作用。在大多數(shù)已知的情況下，NF-κB作為一級因子(primaryfactor)發(fā)揮作用，即其活性是通過激活細(xì)胞中早已存在的無活性形式的分子來誘導(dǎo)的，而不是通過從頭合成(而該合成又依賴于開啟NF-κB基因的可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子)。NF-κB的效果是非常多效的。這些眾多效果中的大多數(shù)具有共同的特征，即在對胞外刺激的應(yīng)答中被迅速誘導(dǎo)。大多數(shù)NF-κB激活劑是免疫防御的誘導(dǎo)劑，其中包括病毒和細(xì)菌成份、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子、紫外線和其它誘導(dǎo)物。因此，大多數(shù)受NF-κB調(diào)控的基因在免疫防御中都起作用(見Blank等人，1992，Grilli等人，1993.Baeuerle和Henkel，1994，參見綜述)。
NF-κB調(diào)控作用的一個主要特點是，這個因子能以非DNA結(jié)合形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，能被誘導(dǎo)而轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，與DNA結(jié)合并且激活轉(zhuǎn)錄。NF-κB蛋白的這兩種形式受到I-κB的調(diào)控—I-κB是一類含有結(jié)構(gòu)域重復(fù)序列(該結(jié)構(gòu)域最初是在紅細(xì)胞錨蛋白中被發(fā)現(xiàn))的蛋白質(zhì)(Gilmore和Morin，1993)。處于未激活形式時，NF-κB二聚體和I-κB分子結(jié)合在一起，后者使NF-κB二聚體留在細(xì)胞質(zhì)中并防止其與可結(jié)合NF-κB的DNA序列發(fā)生相互作用和激活轉(zhuǎn)錄。I-κB從NF-κB二聚體上解離下來是其受很多誘導(dǎo)因子活化過程中的關(guān)鍵步驟(Di Donato，等人，1995)。涉及該調(diào)節(jié)過程機理的知識仍很有限。細(xì)胞對不同NF-κB誘導(dǎo)劑應(yīng)答的特異性方式明確的了解也很少。
腫瘤壞死因子(TNF)是最強的NF-κB誘導(dǎo)劑之一。有兩種不同的TNF受體，p55和p75受體(p55-R和p75-R)。它們的表達(dá)水平隨不同的細(xì)胞而單獨變化(Vandenabeele等，1995)。p75受體優(yōu)先對細(xì)胞結(jié)合形式的TNF反應(yīng)(TNF表達(dá)成β-跨膜蛋白和可溶性蛋白)，而p55受體則只對可溶性TNF分子有效應(yīng)答(Grell，等人，1995)。這兩個受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)上無關(guān)，并且與不同的細(xì)胞質(zhì)蛋白結(jié)合在一起。然而，TNF的至少部分效應(yīng)，包括TNF的殺細(xì)胞作用和NF-κB的誘導(dǎo)作用，都可以受這兩個受體的誘導(dǎo)。這個特性是細(xì)胞特異性的。p55受體能夠在所有對TNF起反應(yīng)表現(xiàn)出這類效應(yīng)的細(xì)胞中誘導(dǎo)殺細(xì)胞作用或激活NF-κB。而p75受體只是在某些細(xì)胞中有這些作用。其它細(xì)胞盡管p75受體表達(dá)水平很高，卻只有在對p55受體刺激應(yīng)答中才能誘導(dǎo)這些作用(Vandenabeele等人，1995)。除了TNF受體之外，TNF/NGF受體家族中的其他多種受體，如CD30(McDonald等人，1995)、CD40(Berberich等人1994；Lalmanach-Girard等人，1993)，淋巴毒素β受體和在某些類型細(xì)胞中的FAS/APO1(Rensing-Ehl等人，1995)也能誘導(dǎo)NF-κB的激活作用。盡管事實上IL-1I型受體在結(jié)構(gòu)上與TNF受體沒有相似性，IL-1I型受體也能有效地引發(fā)NF-κB的激活作用，并且具有TNF受體的大多數(shù)功能。
在這些不同的受體被觸發(fā)時，NF-κB的激活是由于與其結(jié)合的I-κB分子發(fā)生誘導(dǎo)性磷酸化而引起的。這個磷酸化過程使I-κB被降解，這種降解極可能發(fā)生于蛋白酶體。對于引起I-κB磷酸化的激酶的性質(zhì)以及受體觸發(fā)時的激活機制仍然未知。然而，在最近兩年，人們獲得了一些鑒定3種似乎參與磷酸化的受體相關(guān)蛋白的知識(見圖2a及6的圖解說明)。一種最初由D.Goeddel及其同事(Rothe等人，1994)克隆的、被稱為TRAF2的蛋白質(zhì)，好象在由TNF/NGF家族各類受體激活NF-κB的過程中起到中心作用。這個蛋白在高水平表達(dá)時本身可以觸發(fā)NF-κB的激活，結(jié)合活化的p75 TNF-受體(Rothe等人1994)、淋巴毒素β受體(Mosialos等人1995)、CD40(Rothe等人，1995a)和CD30(未發(fā)表數(shù)據(jù))，并通過它們來介導(dǎo)對NF-κB的誘導(dǎo)作用。TRAF2不能和p55 TNF受體結(jié)合，也不能和Fas/APO1結(jié)合。但是，它能和被稱為TRADD的p55受體相關(guān)蛋白質(zhì)相結(jié)合，而TRADD能結(jié)合于被稱為MORT1的Fas/APO1相關(guān)蛋白(或FADD，見Boldin等人1995b和1996)。另一種與受體相互作用的蛋白稱為RIP(見Stanger，等人1995)，它也能與TRAF2、FAS/APO1、TRADD、p55 TNF受體和MORT1發(fā)生相互作用。這樣，盡管RIP與細(xì)胞毒性誘導(dǎo)(細(xì)胞死亡)相關(guān)，它與TRAF2相互作用的能力也暗示它與NF-κB激活作用有關(guān)，并且此外它也可以在導(dǎo)致NF-κB激活的通道中增加FAS/APO1、MOTR-1、p55 TNF受體和TRADD與TRAF2之間的相互作用。這些關(guān)系顯然允許p55 TNF受體和Fas/APO1來觸發(fā)NF-κB的激活(Hsu等人1995，Boldin等人，1995；Chinnaiyan.等人1995，Varfolomeev，等人，1996；Hsu等人1996)。IL-1受體對NF-κB活化的觸發(fā)與TRAF2無關(guān)，這一觸發(fā)過程可能涉及到一種最近克隆的被稱為IRAK的IL-1受體相關(guān)蛋白激酶(Croston等人1995)。
TRAF2的作用機制尚不清楚。幾種與TRAF2結(jié)合的胞質(zhì)分子已被鑒定(Rothe等人，1994，Rothe等人，1995b)。但是從這些分子所得到的信息并沒有提供任何線索來說明本身沒有酶活性的TRAF2是通過何種方式來觸發(fā)I-κB的磷酸化。另外，對于不同受體激活TRAF2的細(xì)胞特異性模式(例如兩種TNF受體誘導(dǎo)NF-κB時所觀察到的模式)機理也沒有信息。
除了上述提到的以外，在各種TRAF蛋白中，也應(yīng)注意到TRAF2可結(jié)合p55(CD120a)和p75(CD120b)TNF受體，也能直接或間接地通過其它上述的銜接蛋白(adaptor protein)來結(jié)合TNF/NGF受體家族中的其它幾種受體，例如對于FAS/APO1受體，銜接蛋白是MOTR-1、TRADD和RIP。因此，TRAF2對于NF-κB的激活過程是關(guān)鍵的(另見Wallach，1996)。然而，TRAF3實際上可抑制TNF/NGF家族中某些受體對NF-κB的活化作用(參見Rothe等人，1995a)，而TRAF6則是在IL-1誘導(dǎo)NF-κB時所必需的(Cao等人，1996a)。
因此，在NF-κB的活化過程及其在維持細(xì)胞存活上的重要性方面，參與這一活化過程的各種胞內(nèi)通道至今仍未弄清，例如，不同的TRAF蛋白是如何直接或間接地參予？此外，現(xiàn)在已知道TNF/NGF受體家族的不同成員及其相關(guān)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通道(包括不同的銜接子、中介體(mediator)/調(diào)節(jié)蛋白)(例如參見待批的、共同擁有的以色列專利申請No.114615，114986，115319，116588中的簡要綜述及參考文獻(xiàn))，比如TNF和FAS/APO1的配體對細(xì)胞是既有益又有害的。例如，TNF對機體防御腫瘤及感染因子有貢獻(xiàn)，同時也能通過誘導(dǎo)殺滅病毒感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，增加粒細(xì)胞的抗細(xì)菌活性而使機體從損傷中恢復(fù)過來，因此，在這些情況下TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用是所需的。但是，過量的TNF也是有害的，比如在膿毒休克、厭食癥、風(fēng)濕性疾病、炎癥和移植物抗宿主反應(yīng)等許多疾病中，已知TNF是一個主要的致病因子。在這些情況下，TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用是不利的。例如，F(xiàn)AS/APO1配體也具有有益和有害的作用。FAS/APO1配體通過其受體在T細(xì)胞成熟過程中誘導(dǎo)殺死自身反應(yīng)T細(xì)胞，也就是說，在T細(xì)胞發(fā)育過程中殺死識別自身抗原的T細(xì)胞，以避免自身免疫疾病。此外，很多惡性細(xì)胞和HIV感染的細(xì)胞在其細(xì)胞表面攜帶FAS/APO1受體，因此就可用其配體或針對受體的抗體來激活這些受體，進(jìn)而激活該受體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡(凋亡)胞內(nèi)通道，從而摧毀這些細(xì)胞。但是，F(xiàn)AS/APO1受體也可介導(dǎo)有害的作用，例如在某些疾病如急性肝炎中，發(fā)現(xiàn)有不加控制地殺滅組織的現(xiàn)象，從而伴隨有肝細(xì)胞的損壞。
綜上所述，TNF/NGF家族的受體一方面能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡通道，另一方面也可以誘導(dǎo)細(xì)胞存活通道(通過NF-κB誘導(dǎo))，因此顯然在胞內(nèi)這兩種相反的通道之間，存在著精妙的平衡。例如，當(dāng)需要最大限度地殺傷腫瘤細(xì)胞或其它受感染或病態(tài)的細(xì)胞時，就需要讓TNF和/或FAS/APO1配體只誘導(dǎo)細(xì)胞死亡通道而不誘導(dǎo)NF-κB。相反，當(dāng)需要保護(hù)細(xì)胞(比如在炎癥、移植物抗宿主反應(yīng)、急性肝炎中)時，就希望阻斷TNF和/或FAS/APO1配體的殺細(xì)胞誘導(dǎo)作用，并且相反增強它們對NF-κB的誘導(dǎo)。與此相同，在某些病理狀態(tài)下，希望阻斷p75 TNF受體和IL-1受體介導(dǎo)的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通道，而在另一些情況下，則希望增強這些胞內(nèi)通道。
最近，本發(fā)明者已經(jīng)分離出一種稱為NIK的激酶(以色列專利申請No.117800，119133和WO97/37016)，該激酶能結(jié)合TRAF2，并直接參與導(dǎo)致NF-κB活化的磷酸化反應(yīng)。
另外，許多研究者(包括本發(fā)明者(見待批的共同申請的以色列專利申請No.IL120759))已經(jīng)分離出與上述銜接蛋白(如MORT-1/FADD)或銜接蛋白與TNF/NGF受體家族各種受體之間的復(fù)合物相互作用、并影響導(dǎo)致凋亡性細(xì)胞死亡的蛋白水解反應(yīng)的許多蛋白酶類。因此，在需要抑制或增強細(xì)胞死亡的上述情況下，需要直接調(diào)節(jié)這些蛋白酶類的作用，例如，當(dāng)希望抑制細(xì)胞死亡時，就希望抑制這些蛋白酶類的活性。在這方面，已經(jīng)報道(參見Hotmann等人，1997年的綜述)這些蛋白酶類中有許多存在一個稱為前結(jié)構(gòu)域(prodomain)的區(qū)域，該區(qū)域也存在于許多銜接蛋白如RAIDD(它能與RIP、TRADD相互作用，從而和MORT-1/FADD、p55-TNF-R和FAS/APO1相互作用)(一種細(xì)胞死亡通道的銜接蛋白)中；c-IAP1，c-IAP2這兩種蛋白似乎是凋亡抑制劑，其本身與TRAF2相互作用，因而，它可能是蛋白酶類的抑制劑或刺激TRAF2參與細(xì)胞存活通道導(dǎo)致誘導(dǎo)NF-κB的活化。因此，該前結(jié)構(gòu)域也被稱為CARD(即“蛋白酶類募集結(jié)構(gòu)域(capaserecruitment domain”)(見Hofmann等人，1997)。因此，該前結(jié)構(gòu)域(CARD)代表了用來調(diào)節(jié)與細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通道的另一個靶。
另外，最近已經(jīng)描述(見Ynag和Korsmeyer，1996的綜述)了稱為BCL2蛋白家族的另一類蛋白家族，其中蛋白BCL2、其同系物BCL-X(包括兩種形式，BCL-XL和另一種方式剪接的BCL-XS)MCL1、A1、BAK、BAD、BAG1、BAX、腺病毒E1B-19k以及Caenorhabditis elegans(C.elegans)CED-9蛋白均是其成員。在這些蛋白中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BCL2、BCL-XL、E1B-19k和CED-9有抑制凋亡或保護(hù)免受各種胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通道所誘導(dǎo)的凋亡的功能(見Yang和Korsmeyer，1996)。BCL2和BCL-XL也顯然是胞內(nèi)膜結(jié)合蛋白，位于線粒體和光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及核周膜，這些蛋白的C末端有一個信號錨序列，該序列起靶向和插入線粒體外膜和上述其它胞內(nèi)膜的作用。一旦錨著于各種細(xì)胞內(nèi)膜，BCL2和BCL-XL蛋白就接觸胞質(zhì)液，在那里與其它各種細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用。
關(guān)于BCL2、BCL-XL、E1B-19k和CED9如何保護(hù)細(xì)胞還不完全清楚，但是好象它們的效應(yīng)顯然在細(xì)胞死亡效應(yīng)物(上述各種蛋白酶類，如ICE/CED-3家族的ICE和ICE樣蛋白酶，包括CPP32/Yama，ICE-LAP3(Mch3)，ICH-1和其它蛋白酶)的上游。實際上，發(fā)現(xiàn)CED-9是C.elegans死亡效應(yīng)蛋白酶CED-3和CED-4的特異性抑制劑，BCL2顯然是ICH-1(也稱為NEDD2)、尤其是促進(jìn)細(xì)胞死亡的ICH-1L形式的抑制劑。因此，盡管BCL2、BCL-XL、CED-9和E1B-19k抑制凋亡的確切機制還不清楚，但其顯然在死亡效應(yīng)物ICE-CED-3蛋白酶的上游(參見Yang和Korsmeyer，1996的綜述以及Chinnaiyan等人，1996)。
關(guān)于上述其它BCL2家族成員，BAX是細(xì)胞死亡促進(jìn)物。BAX與其自身結(jié)合，并以BAX均二聚體的形式促進(jìn)凋亡。BAX還與BCL2和BCL-XL結(jié)合，這些異二聚體與BCL2抵御凋亡的保護(hù)作用有關(guān)。因此，BAX/BAX均二聚體數(shù)量和BAX/BCL2異二聚體數(shù)量之間的平衡確定了細(xì)胞是容易凋亡還是會受保護(hù)而免于凋亡。BAX在表觀上液是一種胞內(nèi)膜結(jié)合蛋白，它很大程度上也位于線粒體外膜上(對于上述關(guān)于BAX，另見Yang和Korsmeyer，1996的綜述)。另外，上述BAK和BAD蛋白也作為BCL2和BCL-XL活性的負(fù)調(diào)節(jié)劑起作用，即，它們抑制BCL2和BCL-XL保護(hù)細(xì)胞免受凋亡的能力。似乎BAK和BAD均與BCL2和BCL-XL結(jié)合進(jìn)而防止BAX與BAL2和BCL-XL結(jié)合，從而導(dǎo)致BAX/BAX均二聚體數(shù)量增加，因而促進(jìn)細(xì)胞死亡(見Yang和Korsmeyer，1996的綜述)。在這方面，看來BAK的功能是直接阻斷BCL2和BCL-XL的死亡抑制活性，因為BAK/BCL2和BAK/BCL-XL異二聚體缺乏保護(hù)細(xì)胞免受凋亡的能力。BAD似乎更象是BAX與BCL2和BCL-XL結(jié)合的競爭性抑制劑，因為BAD可能會替換BAX/BCL2和BAX/BCL-XL異二聚體中的BAX，從而提供了增加量的促進(jìn)死亡的BAX/BAX均二聚體。盡管BAK也好象是位于線粒體外膜的胞內(nèi)膜結(jié)合蛋白，但是BAD顯然沒有膜錨著序列，因此它不是膜結(jié)合蛋白(見Yang和Korsmeyer，1996的綜述)。
上述BCL2家族的另一成員是BAG1(見Yang和Korsmeyer，1996)，它是BCL2活性的正調(diào)節(jié)劑，它能增強BCL2抵抗凋亡的保護(hù)活性，甚至在通常不受BCL2抑制的信號所誘導(dǎo)而經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞中，它也能提供抵御凋亡的BCL2保護(hù)活性。
還應(yīng)注意，上述另一種剪接形式的BCL-XL，即BCL-XS蛋白也是BCL-XL和BCL2活性的拮抗劑，它阻斷了它們抵御凋亡的保護(hù)活性(見Yang和Korsmeyer，1996的綜述)。
根據(jù)上述內(nèi)容，BCL2蛋白家族在調(diào)節(jié)胞內(nèi)細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道中有一定作用，且從活躍阻斷凋亡的該家族蛋白向促進(jìn)凋亡或抑制抗凋亡活性的蛋白的平衡移動可能會導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加，同樣，平衡向另一方向移動可能導(dǎo)致細(xì)胞存活增加。
因此，當(dāng)希望在上述情況下通過增加細(xì)胞內(nèi)凋亡來增加細(xì)胞死亡時，就需要阻斷該家族中阻遏或抑制凋亡的BCL2、BCL-XL和其它成員的活性，或增加該家族中促進(jìn)凋亡或抑制BCL2或BCL-XL抗凋亡活性的BAX、BAK、BAD、BCL-XS的活性。同樣，當(dāng)希望通過減少凋亡來增加細(xì)胞群中的細(xì)胞存活時，就需要增加該家族中阻遏或抑制凋亡的BCL2、BCL-XL以及其它成員的活性，或減少上述該家族中凋亡促進(jìn)物的活性。
本發(fā)明的一個目的是提供新的蛋白質(zhì)，包括能調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通道而導(dǎo)致發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活的其同種型、類似物、片段或衍生物，該調(diào)節(jié)作用可以通過各種蛋白酶類的前結(jié)構(gòu)域(CARD)或通過參與NF-κB活化的各種激酶的激酶結(jié)構(gòu)域來進(jìn)行。因此，本發(fā)明的這些新蛋白可以是蛋白酶類活性的直接調(diào)節(jié)劑(細(xì)胞死亡通道)和/或通過激酶活性活化NF-κB(細(xì)胞存活通道)。同樣，本發(fā)明的新蛋白可以是參與發(fā)炎、細(xì)胞死亡或存活通道的其它各種蛋白(例如FAS/APO1，p55 TNF-R，p75 TNF-R，IL-1-R，MORT-1，TRADD，RIP，TRAF2，NIK和其它)的胞內(nèi)生物活性的間接調(diào)節(jié)劑。同樣，該調(diào)節(jié)作用也可以是通過與BCL2蛋白家族成員直接或間接相互作用，本發(fā)明的新蛋白能夠調(diào)節(jié)BCL2或該家族其它蛋白的活性，在此意義上，本發(fā)明的新蛋白可以是受BCL2蛋白家族成員所調(diào)節(jié)的各種蛋白酶類的間接調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明的另一個目的是提供針對上述新蛋白的拮抗劑(如抗體、肽、有機化合物、或甚至是一些同種型)，包括其同種型、類似物、片段和衍生物，它們可用來在需要時抑制發(fā)炎、細(xì)胞死亡或存活信號傳導(dǎo)過程。
本發(fā)明的另一個目的是用上述新蛋白及其同種型、類似物、片段和衍生物來分離并鑒定參與調(diào)節(jié)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或存活通道并影響其活性的其它蛋白或因子，和/或分離并鑒定這些新蛋白、類似物、片段和衍生物結(jié)合的信號傳導(dǎo)過程中更上游或下游(因而其功能也參與其中)的其它受體或其它細(xì)胞蛋白。
本發(fā)明還有一個目的是提供能導(dǎo)入細(xì)胞與新蛋白及其可能的同種型結(jié)合或相互作用的抑制劑，這些抑制劑能在需要時抑制發(fā)炎、細(xì)胞死亡或存活過程。
另外，本發(fā)明的一個目的是用上述新蛋白及其同種型和類似物、片段和衍生物作為抗原來制備針對它的多克隆和/或單克隆抗體。該抗體進(jìn)而例如可用來純化不同來源(如細(xì)胞抽提物或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系)的新蛋白。
另外，這些抗體可用于診斷目的，例如，用來鑒定與細(xì)胞效應(yīng)功能異常有關(guān)的疾病，這些細(xì)胞效應(yīng)由蛋白酶類、激酶、屬于BCL2家族的蛋白或TRAF蛋白直接介導(dǎo)的，或由通過與TRAF蛋白、蛋白酶類、激酶或BCL蛋白家族成員相互作用而直接或間接調(diào)節(jié)/介導(dǎo)胞內(nèi)過程的p55 TNF受體、FAS/APO1受體或其它相關(guān)受體及其相關(guān)細(xì)胞蛋白(如RAIDD、MORT-1、TRADD、RIP)介導(dǎo)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種包含上述新蛋白及其同種型、類似物、片段或衍生物的藥物組合物，以及包含上述抗體或其它拮抗劑的藥物組合物。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)分離出一種命名為B1的新蛋白(以前稱為CBK(即′c-IAP-結(jié)合激酶′)，因為它與c-IAP有一些同源性，見下文實施例1，但是在本文稱為′B1′)，該蛋白具有前結(jié)構(gòu)域(CARD)區(qū)、激酶結(jié)構(gòu)域以及在所述CARD和激酶結(jié)構(gòu)域之間的中間區(qū)，因此它能參與調(diào)節(jié)發(fā)炎、細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活過程(詳見下文)。如下文所解釋的，B1調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡或存活通道的作用可以是正作用(促進(jìn)/增強作用)或負(fù)作用(抑制作用)，這取決于與它作用的胞內(nèi)蛋白的類型。
因此，本發(fā)明提供了編碼B1蛋白、其同種型、片段或類似物的DNA序列，所述B1、其同種型、片段或類似物能與發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道的胞內(nèi)中介體(mediator)或調(diào)節(jié)劑直接或間接地相互作用，所述B1、同種型、片段或類似物是所述胞內(nèi)發(fā)炎、細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞存活通道的胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明上述DNA序列的實例包括(i)一種DNA序列，它選自(a)衍生自天然B1蛋白編碼區(qū)的cDNA序列；(b)編碼能調(diào)節(jié)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道或兩者的生物活性蛋白的序列(a)的片段；(c)能在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列(a)或(b)雜交的DNA序列，該序列編碼能調(diào)節(jié)胞內(nèi)發(fā)炎、死亡或細(xì)胞存活通道或兩者的有生物活性的B1蛋白、類似物或片段；(d)遺傳密碼與(a)-(c)所確定的DNA序列簡并的DNA序列，該序列編碼能調(diào)節(jié)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道或兩者的具有生物活性的B1蛋白、類似物或片段。
(ii)上述一種DNA序列，它包含圖3所示序列的至少部分并編碼至少一種有活性的B1蛋白、同種型、類似物或片段。
(iii)上述一種DNA序列，它編碼的B1蛋白、同種型、類似物或片段具有圖3所示氨基酸序列的至少一部分。
另一方面，本發(fā)明提供了一種載體，該載體包含上述任何能在真核和原核宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的本發(fā)明的DNA序列；以及含有所述載體的轉(zhuǎn)化的原核和真核細(xì)胞。
利用本發(fā)明的另一方面，提供了一種由本發(fā)明上述DNA序列編碼的B1蛋白、其同種型、片段、功能性類似物和衍生物，它們能通過與細(xì)胞內(nèi)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道的其它胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑或中介體相結(jié)合來直接或間接地調(diào)節(jié)胞內(nèi)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道。
本發(fā)明的蛋白的一個實例是，B1蛋白、及其同種型、片段、類似物和衍生物，其中所述蛋白、同種型、類似物、片段和衍生物具有圖3所示氨基酸序列的至少一部分。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生上述B1蛋白及其同種型、片段、類似物或衍生物的方法，該方法包含使上述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在適合所述蛋白、其同種型、片段類似物或衍生物表達(dá)的條件下生長，在需要時進(jìn)行翻譯后修飾以獲得所述蛋白、其同種型、片段、類似物或衍生物，以及分離所述表達(dá)的蛋白、同種型、片段、類似物或衍生物。
另一方面，本發(fā)明提供了對本發(fā)明的B1蛋白、其同種型、類似物、片段或衍生物有特異性的抗體或其活性片段或衍生物。
另一方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通道的各種方法，例如有下列方法(i)一種方法，用來調(diào)節(jié)或介導(dǎo)細(xì)胞中發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道的活性或調(diào)節(jié)由B1或與本發(fā)明的B1蛋白、其同種型、類似物、片段或衍生物結(jié)合或直接或間接相互作用的其它分子直接或間接調(diào)節(jié)或介導(dǎo)的其它胞內(nèi)信號傳導(dǎo)活性，所述方法包括通過將一種或多種所述的B1蛋白、其同種型、類似物、片段或衍生物以適合胞內(nèi)導(dǎo)入的形式導(dǎo)入所述細(xì)胞，或?qū)⒕幋a所述一種或多種B1蛋白、其同種型、類似物、片段或衍生物的DNA序列以攜帶所述序列的合適載體形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)來處理所述細(xì)胞，所述載體能將所述序列插入所述細(xì)胞內(nèi)以使所述序列在所述細(xì)胞中表達(dá)。
(ii)如上所述的一種方法，其中所述細(xì)胞的處理方法包括將編碼所述B1蛋白、其同種型、片段、類似物或衍生物的DNA序列以攜帶所述序列的合適載體形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，所述載體能將所述序列插入所述細(xì)胞內(nèi)以使所述序列在所述細(xì)胞中表達(dá)。
(iii)如上所述的一種方法，其中所述細(xì)胞的所述處理方法是用重組動物病毒載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，該方法包括下列步驟(a)構(gòu)建一個重組動物病毒載體，該載體攜帶了編碼能結(jié)合所述待處理細(xì)胞表面上特異性細(xì)胞表面受體的病毒表面蛋白(配體)的序列以及編碼選自上述B1蛋白、同種型、類似物、片段和衍生物的蛋白的第二序列，該蛋白在所述細(xì)胞中表達(dá)時能直接或間接地調(diào)節(jié)/介導(dǎo)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道的活性，或與所述B1蛋白、其同種型、類似物、片段和衍生物直接或間接相互作用的其它胞內(nèi)分子所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的其它胞內(nèi)信號傳導(dǎo)活性；和(b)用(a)所述的載體感染所述細(xì)胞。
(iv)一種調(diào)節(jié)由B1直接或間接調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道的方法，該方法包括用上文所述的抗體或其活性片段或衍生物處理所述細(xì)胞，所述處理是將含有所述抗體、其活性片段或衍生物的合適組合物施加于所述細(xì)胞，其中當(dāng)所述細(xì)胞的B1蛋白或其部分暴露在胞外表面時，所述組合物就配制成用于胞外應(yīng)用，當(dāng)所述B1蛋白是胞內(nèi)蛋白時，所述組合物就配制成胞內(nèi)應(yīng)用。
(v)一種調(diào)節(jié)由B1直接或間接調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活或其它通道的方法，該方法包括用編碼本發(fā)明B1蛋白的DNA序列的至少一部分的反義序列的寡核苷酸序列處理所述細(xì)胞，所述寡核苷酸序列能阻斷B1蛋白的表達(dá)。
(vi)如上所述的一種方法，其中通過上文(ii)所述的病毒將所述寡核苷酸序列導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，其中所述病毒的所述第二序列編碼所述寡核苷酸序列。
(vii)一種調(diào)節(jié)由B1直接或間接調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)發(fā)炎、細(xì)胞死亡、細(xì)胞存活或其它通道的方法，該方法包括采用核酶程序，其中將載體以允許所述核酶序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，該載體編碼的核酶序列能與編碼本發(fā)明B1蛋白的細(xì)胞mRNA序列相互作用，并且當(dāng)所述核酶序列在所述細(xì)胞中表達(dá)時，它與所述細(xì)胞mRNA序列相互作用并切割所述mRNA序列，導(dǎo)致所述B1蛋白在所述細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)被抑制。
在不同的方面，本發(fā)明提供了一種通過本發(fā)明蛋白中存在的激酶結(jié)構(gòu)域或中間結(jié)構(gòu)域來分離和鑒定本發(fā)明蛋白的方法，該蛋白與具有前結(jié)構(gòu)域或蛋白酶類募集結(jié)構(gòu)域(CARD)的蛋白或參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的其它蛋白或酶同源或能與之直接或間接相互作用，該方法包括采用酵母雙雜交程序，其中一個雜交載體攜帶了具有所述CARD、激酶和中間結(jié)構(gòu)域或這些結(jié)構(gòu)域中至少一個的所述蛋白的編碼序列，第二個雜交載體攜帶了來自cDNA或基因組DNA文庫的序列，然后用載體轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞，分離陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后抽提所述第二雜交載體，獲得與含有CARD、激酶和/或中間結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合的蛋白編碼序列。
在本發(fā)明的還有一個方面，提供了一種用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)由B1直接或間接調(diào)節(jié)的發(fā)炎、細(xì)胞死亡、細(xì)胞存活或其它通道的藥物組合物，該組合物包含至少一種本發(fā)明的B1蛋白、其生物活性片段、類似物、衍生物或其混合物作為活性組分。
上述藥物組合物的一個實例是一種用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)由B1直接或間接調(diào)節(jié)的發(fā)炎、細(xì)胞死亡、細(xì)胞存活或其它通道的藥物組合物，它包含一種重組動物病毒載體作為活性組分，該載體編碼能與細(xì)胞表面受體結(jié)合的蛋白，并編碼至少一種B1蛋白、同種型、活性片段或類似物。
上述藥物組合物的另一個實例是一種用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)由B1直接或間接調(diào)節(jié)的發(fā)炎、細(xì)胞死亡、細(xì)胞存活或其它通道的藥物組合物，該組合物包含一種寡核苷酸序列作為活性組分，該寡核苷酸編碼B1蛋白mRNA序列的反義序列。
上述藥物組合物的另一個實例是一種用于預(yù)防或治療與B1蛋白直接或間接結(jié)合的一種或多種分子調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)的病理性疾病的藥物組合物，所述組合物包含有效量的B1蛋白或編碼該蛋白的DNA分子、或能破壞所述B1蛋白與能和B1蛋白結(jié)合或相互作用的一種或多種分子直接或間接相互作用的分子。
上述藥物組合物還有一個實例是一種用于預(yù)防或治療與B1蛋白直接或間接結(jié)合的一種或多種分子調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)的病理性疾病的藥物組合物，所述組合物包含有效量的B1蛋白、或其DNA編碼分子、或能破壞所述B1蛋白與能結(jié)合所述B1蛋白或與其相互作用的一種或多種分子直接或間接相互作用的分子。
上述藥物組合物的另一個實例是一種用于預(yù)防或治療與B1蛋白直接或間接結(jié)合的一種或多種分子所調(diào)節(jié)的凋亡相關(guān)的病理性狀態(tài)的藥物組合物，所述組合物包含一種能干擾B1的蛋白激酶活性的分子。
在本發(fā)明的另一個不同的方面，提供了下列治療方法(i)一種用于預(yù)防或治療與B1蛋白直接或間接結(jié)合的一種或多種分子所調(diào)節(jié)的凋亡相關(guān)的病理性狀態(tài)的方法，所述方法包括給予需要的患者有效量的B1蛋白或其同種型、片段、類似物和衍生物或它們的混合物、或其DNA編碼分子、或能破壞所述B1蛋白或其同種型、片段、類似物和衍生物或它們的混合物與能直接或間接結(jié)合B1蛋白或其同種型、片段、類似物和衍生物或它們的混合物的一種或多種分子直接或間接相互作用的分子。
(ii)一種調(diào)節(jié)B1蛋白直接或間接參與的發(fā)炎過程、凋亡過程或編程性細(xì)胞死亡過程(細(xì)胞死亡通道)的方法，該方法包括用一種或多種B1蛋白、同種型、類似物、片段或衍生物處理所述細(xì)胞，其中所述細(xì)胞的所述處理包括將一種或多種B1蛋白、同種型、類似物、片段或衍生物以適合胞內(nèi)導(dǎo)入的形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，或?qū)⒕幋a所述一種或多種B1蛋白、同種型、類似物、片段或衍生物的DNA序列以攜帶所述序列的合適載體形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，所述載體能將所述序列插入所述細(xì)胞內(nèi)從而使所述序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
(iii)一種調(diào)節(jié)B1蛋白直接或間接參與的細(xì)胞存活過程的方法，該方法包括用一種或多種B1蛋白、同種型、類似物、片段或衍生物處理所述細(xì)胞，其中所述細(xì)胞的處理包括將所述一種或多種B1蛋白、同種型、類似物、片段或衍生物以適合胞內(nèi)導(dǎo)入的形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，或?qū)⒕幋a所述一種或多種B1蛋白、同種型、類似物、片段或衍生物的DNA序列以攜帶所述序列的合適載體形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，所述載體能將所述序列插入所述細(xì)胞內(nèi)從而使所述序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
本發(fā)明還有一個方面提供下列篩選方法以及用于鑒定和生產(chǎn)各種配體的方法(i)一種篩選能結(jié)合B1蛋白的配體的方法，該方法包括使連接了所述蛋白的親和層析基質(zhì)與細(xì)胞抽提物接觸，從而使配體與所述介質(zhì)結(jié)合，然后洗脫、分離和分析所述配體。
(ii)一種篩選編碼能結(jié)合B1蛋白的配體的DNA序列的方法，該方法包括采用酵母雙雜交技術(shù)，其中一個雜交載體攜帶了編碼所述B1蛋白的序列，第二個雜交載體攜帶了來自cDNA或基因組DNA文庫的序列，用所述載體轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞，分離陽性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，抽提所述第二個雜交載體以獲得編碼所述配體的序列。
(iii)一種鑒定和產(chǎn)生能調(diào)節(jié)B1調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性的配體的方法，該方法包括a)篩選能結(jié)合某多肽的配體，該多肽包含B1的至少一部分，具有至少一些圖3所示的B1氨基酸殘基，該部分基本上包括B1的全部前結(jié)構(gòu)域(或CARD)；b)對于所述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的、能進(jìn)行所述結(jié)合但非BCL2、TRAF2、或TNF/NGF受體家族受體一部分、或具有前結(jié)構(gòu)域(CARD)的其它已知蛋白的配體，進(jìn)行鑒定和特性分析；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述配體。
(iv)一種鑒定和產(chǎn)生能調(diào)節(jié)B1蛋白調(diào)節(jié)或介導(dǎo)的細(xì)胞活性的配體的方法，該方法包括a)篩選能與某多肽結(jié)合的配體，該多肽至少包含圖3所示的B1序列的羧基端部分，該部分包括前結(jié)構(gòu)域(CARD)；b)對于所述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的、能進(jìn)行所述結(jié)合但非BCL2、TRAF2、或TNF/NGF受體家族受體一部分、或具有前結(jié)構(gòu)域(CARD)的其它已知蛋白的配體，進(jìn)行鑒定和特性分析；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述配體。
(v)一種鑒定和產(chǎn)生能調(diào)節(jié)B1調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性的配體的方法，該方法包括a)篩選能與基本上包括B1所有激酶結(jié)構(gòu)域的圖3所示B1序列的至少N端部分結(jié)合的配體；b)對于所述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的、能進(jìn)行所述結(jié)合但非BCL2、TRAF2、或TNF/NGF受體家族受體一部分、或其它已知蛋白的胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白的配體，進(jìn)行鑒定和特性分析；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述配體。
(vi)一種鑒定和產(chǎn)生能直接或間接調(diào)節(jié)B1調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性的分子的方法，該方法包括a)篩選能調(diào)節(jié)B1調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的活性的分子；b)對所述分子進(jìn)行鑒定和特性分析；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述分子。
(vii)一種鑒定和產(chǎn)生能直接或間接調(diào)節(jié)本發(fā)明蛋白所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性的分子的方法，該方法包括a)篩選能調(diào)節(jié)本發(fā)明的蛋白所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的活性的分子；b)對所述分子進(jìn)行鑒定和特性分析；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述分子。
本發(fā)明的其它方面顯然可從本發(fā)明下文詳細(xì)描述中獲得。
附圖簡述圖1示意性地描述了TRAF2分子的結(jié)構(gòu)；圖2描述了參與發(fā)炎、細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活(NF-κB活化)通道的一些蛋白；圖3(A，B)顯示了本發(fā)明的B1蛋白的推定氨基酸序列(A)及其測得的核苷酸編碼序列(B)，其中氨基酸序列顯示了B1的激酶結(jié)構(gòu)域(N末端用方框表示的區(qū)域)和B1的CARD結(jié)構(gòu)域(C末端用下劃線表示的區(qū)域)。
圖4顯示了在不同人組織中表達(dá)的B1的Northern分析，它顯示了B1在大多數(shù)類型的人組織中表達(dá)；和圖5顯示了所測試的不同的B1構(gòu)建物的NF-κB活性、細(xì)胞死亡增強作用和JNK活化作用。
圖6顯示了用圖6和實施例3的不同構(gòu)建物進(jìn)行的NF-κB活化作用測定結(jié)果。
圖7顯示了用上述構(gòu)建物中的一些進(jìn)行的JNK1活化的測定結(jié)果；和圖8顯示了B1在體內(nèi)自身締合并且與TRAF1結(jié)合。
發(fā)明詳述本發(fā)明一方面涉及一種新的B1蛋白，該蛋白具有前結(jié)構(gòu)域或CARD結(jié)構(gòu)域(蛋白酶類募集結(jié)構(gòu)域)和與RIP激酶結(jié)構(gòu)域相似的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。因此，本發(fā)明的B1蛋白能與參與發(fā)炎、細(xì)胞死亡(凋亡)和細(xì)胞存活(NF-κB激活)通道的許多胞內(nèi)蛋白相互作用。這種相互作用可以通過前結(jié)構(gòu)域(CARD)與各種蛋白結(jié)合或與它們相互作用，或可以利用激酶結(jié)構(gòu)域的活性，或者這兩種相互作用可同時存在。例如，B1能募集許多具有前結(jié)構(gòu)域(CARD)的蛋白，然后通過利用其激酶結(jié)構(gòu)域使它們磷酸化。同樣，在一些情況下，B1可通過其前結(jié)構(gòu)域(CARD)作為可能不是B1激酶結(jié)構(gòu)域底物的其它各種含有前結(jié)構(gòu)域蛋白的?？炕蚰技鞍祝蛘連1可以只通過其激酶結(jié)構(gòu)域而不通過其CARD結(jié)構(gòu)域與各種蛋白相互作用。
另外，如本文所詳細(xì)描述的，結(jié)合試驗結(jié)果表明，本發(fā)明的新的B1蛋白可能能與BCL2蛋白結(jié)合。這一發(fā)現(xiàn)提出了B1蛋白可能是BCL2活性(尤其是凋亡調(diào)節(jié)作用方面)的調(diào)節(jié)劑的可能性。在最初的生物活性分析中，也提出了B1蛋白抑制BCL2抗凋亡保護(hù)效應(yīng)的可能性。其根據(jù)是觀察到B1蛋白本身不會引起細(xì)胞死亡，但是當(dāng)細(xì)胞中加入細(xì)胞死亡的其它誘導(dǎo)物(例如FAS-R、p55 TNF-R和RIP)(所述加入細(xì)胞是通過用能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)B1、FAS-R、p55 TNF-R或RIP的載體共轉(zhuǎn)化細(xì)胞，見下文實施例2)時，它具有增強細(xì)胞死亡的作用。因此，B1很有可能并非以類似于BAX或BAK的方式(靠其自身以均二聚體的形式引起細(xì)胞死亡(見上文“背景技術(shù)”部分))起作用，而是以類似于BAD的方式起作用(通過結(jié)合BCL2來負(fù)調(diào)節(jié)BCL2，防止其與BAX或BAK結(jié)合，從而導(dǎo)致更多游離的BAX和/或BAK，進(jìn)而增加細(xì)胞死亡(見上文“背景技術(shù)”部分))。
另外，對于上述NF-κB的激活和細(xì)胞存活，B1可能是通過引起NF-κB激活的減少來實現(xiàn)它所觀察到的增強細(xì)胞死亡的活性，NF-κB激活的減少可能是靠B1的激酶活性，該激酶活性可能起著調(diào)節(jié)誘導(dǎo)NF-κB激活所需的各種蛋白(如NIK)的作用，結(jié)果減少了NF-κB的激活，從而減少了細(xì)胞存活。在這方面，感興趣的是注意到當(dāng)B1和細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑(如FAS-R、p55 TNF-R或RIP)一起加入時，B1增強了這些誘導(dǎo)物的殺細(xì)胞活性。已經(jīng)知道，p55 TNF-R和FAS-R，可能還有RIP，它們除了誘導(dǎo)細(xì)胞死亡通道從而最終增加蛋白酶類活性外，還誘導(dǎo)了NF-κB的活化，這一定程度地抵消了誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。在一些細(xì)胞中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TNF不殺死細(xì)胞，這歸因于TNF受體誘導(dǎo)NF-κB激活，而不是這些受體不能共同誘導(dǎo)細(xì)胞死亡通道，因此在這些細(xì)胞中，NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞存活通道顯然比細(xì)胞死亡通道更具活性。因此，通過阻斷NF-κB誘導(dǎo)就可能增強例如FAS-R、p55 TNF、RIP介導(dǎo)的殺細(xì)胞作用，本發(fā)明的B1蛋白可能就起這個作用，當(dāng)其與FAS-R、p55-TNF-R或RIP一起加入時產(chǎn)生了所見的細(xì)胞死亡增強現(xiàn)象。
鑒于上述內(nèi)容，表明B1可能以多種方式調(diào)節(jié)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活過程，并且甚至可以多種方式同時進(jìn)行。例如，B1可能抑制NF-κB激活，或B1甚至可能不依賴于其對NF-κB的作用或除其對NF-κB可能產(chǎn)生的作用外，作用于參與細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道的其它胞內(nèi)蛋白。
因此，B1好象可能具有調(diào)節(jié)廣泛范圍的胞內(nèi)蛋白、尤其是參與發(fā)炎、細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活通道的那些蛋白的能力。如下文所詳細(xì)的描述的那樣，許多已知的胞內(nèi)蛋白具有前結(jié)構(gòu)域(CARD)，這些蛋白例如有參與細(xì)胞蛋白水解破壞(細(xì)胞死亡通道)的各種蛋白酶類酶(包括ICE、ICH-1、Mch6和其它)，以及也參與細(xì)胞死亡通道的各種銜接蛋白(包括RAIDD、c-IAP1、c-IAP2和其它)。這樣，B1可能能通過它們共同的CARD與各種蛋白酶類直接或間接相互作用，從而可以調(diào)節(jié)它們的活性。這種調(diào)節(jié)作用可能是正作用，即，B1可能起集中各種蛋白酶類的作用，從而增強它們的蛋白水解活性導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加。另外，用c-IAP1的序列分離B1，B1與本身是凋亡抑制劑的c-IAP1有同源性。c-IAP1具有前結(jié)構(gòu)域(CARD)，并且可通過募集蛋白酶類從而抑制它們的活性來抑制凋亡。因此，B1可能能與c-IAP1直接或間接相互作用，并導(dǎo)致其凋亡抑制作用受阻遏，從而增加細(xì)胞死亡。另外，B1可能通過其CARD與各種蛋白酶類間接或直接相互作用，還可通過其激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化作用來調(diào)節(jié)蛋白酶類從而增強蛋白酶類的活性。
一個更間接的方式是，B1可能能與銜接蛋白(如RAIDD、c-IAP1、c-IAP2和具有CARD的其它蛋白)直接或間接相互作用，從而可能能與發(fā)炎、細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活通道更上游的其它蛋白相互作用。例如，RAIDD通過共有的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain)與其它胞內(nèi)蛋白(如RIP和TRADD)相互作用，而RIP和TRADD再與諸如MORT-1、p55-TNF-R和FAS-R等蛋白相互作用。這樣，通過與RAIDD相互作用，B1可能與這些死亡效應(yīng)受體和蛋白間接連接。類似地，c-IAP1和c-IAP2與TRAF2蛋白相互作用，而TRAF2再與p75-TNF-R相互作用、并通過TRAF2與RIP和TRADD之間的相互作用與MORT-1、p55-TNF-R和FAS-R相互作用。因此，B1可能是通過間接地連接上述銜接蛋白、效應(yīng)蛋白和受體成為作為細(xì)胞死亡過程的間接調(diào)節(jié)劑。這種間接調(diào)節(jié)作用可能是正作用，即它可能導(dǎo)致增強細(xì)胞死亡。
另外，鑒于B1可能至少是間接地(通過c-IAP1)與TRAF2相互作用，提出B1參與了NF-κB激活誘導(dǎo)相關(guān)的細(xì)胞存活通道的可能性。現(xiàn)在已經(jīng)知道，TRAF2直接結(jié)合NIK(Malinin等人，1997)，而NIK直接參與誘導(dǎo)NF-κB激活，從而參與細(xì)胞存活。因此，通過可能間接調(diào)節(jié)TRAF2，B1也能調(diào)節(jié)細(xì)胞存活通道。另外，鑒于具有激酶結(jié)構(gòu)域，B1可能能更直接地參與NIK所屬的MAP激酶通道而導(dǎo)致誘導(dǎo)NF-κB激活和細(xì)胞存活。然而，如上所述，鑒于B1導(dǎo)致增強細(xì)胞死亡的事實，B1可能在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活過程中起負(fù)面作用，即B1可能調(diào)節(jié)TRAF2，或是說，B1可能直接參與MAP激酶通道但卻導(dǎo)致NF-κB激活減少。
B1也有可能在調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通道、尤其是發(fā)炎、細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活通道上起關(guān)鍵作用，因此B1可起調(diào)節(jié)這些通道的作用，從而使平衡從細(xì)胞存活向細(xì)胞死亡移動誘導(dǎo)移動，這與所觀察到的B1對細(xì)胞死亡誘導(dǎo)有增強作用相一致(見實施例2)。因此，B1可認(rèn)作組成這些通道的不同組成蛋白的直接或間接的“胞內(nèi)信號傳導(dǎo)活性調(diào)節(jié)劑”。
因此，在考慮B1在治療上各種可能的用途時，重要的是要了解B1在所有情況下均可能具有多種作用，即，它可能增強細(xì)胞死亡過程，同時它也能激活性抑制NF-κB的誘導(dǎo)從而抑制細(xì)胞存活通道，或根據(jù)B1實際結(jié)合的蛋白/酶以及它們在細(xì)胞內(nèi)的相對數(shù)量，B1可能會在一些細(xì)胞中起抑制細(xì)胞存活通道的作用，而在其它細(xì)胞中可能通過抑制細(xì)胞死亡抑制劑起增強細(xì)胞死亡通道的作用。
因此，例如從下文可以看出，當(dāng)需要增加細(xì)胞死亡時(如在腫瘤、HIV-感染的細(xì)胞等中)，可以用B1來實現(xiàn)這個目的。例如，可將B1直接給予細(xì)胞，或?qū)⒕幋aB1的DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)來增加B1的表達(dá)。
同樣，在希望拯救細(xì)胞免受TNF或FAS-配體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡而促進(jìn)細(xì)胞存活的場合下(例如在各種炎癥、自身免疫疾病、移植物抗宿主反應(yīng)等中)，可用B1拮抗劑來實現(xiàn)這個目的。例如，可以給予的B1拮抗劑例如是抗B1抗體、具有反義B1序列的寡核苷酸、具有B1序列的核酶、或所設(shè)計的特異性地抑制B1活性的各種肽或有機分子。
因此，當(dāng)下文提到B1的用途時，將根據(jù)B1對各種胞內(nèi)過程或疾病的調(diào)節(jié)效應(yīng)來闡述B1用途，根據(jù)上述內(nèi)容會理解，該調(diào)節(jié)作用可能是正作用(增強作用，在考慮細(xì)胞死亡通道的場合下)，或是負(fù)作用(抑制作用，在考慮細(xì)胞存活通道的場合下)。
本發(fā)明還涉及編碼生物活性B1蛋白的DNA序列，以及編碼其生物活性類似物、片段和衍生物的DNA序列，以及這些DNA序列編碼的B1蛋白、蛋白的類似物、片段和衍生物。這些類似物、片段和衍生物的制備采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如參見，Sambrook等人，1989)，其中在DNA編碼序列中，一個或多個密碼子可以缺失、加入或被另一個密碼子替代，產(chǎn)生的編碼的類似物與天然蛋白質(zhì)相比至少有一個氨基酸殘基發(fā)生變化?？山邮艿念愃莆锸侵辽俦Ａ袅薆1的前結(jié)構(gòu)域(CARD)或激酶結(jié)構(gòu)域或至少這些結(jié)構(gòu)域任一個或兩個的活性部分、有或沒有介導(dǎo)其它任何結(jié)合或酶促活性(即不與更下游的蛋白或其它因子結(jié)合或直接或間接相互作用，或不催化信號依賴型反應(yīng)(如激酶反應(yīng)))的那些類似物。這樣，可產(chǎn)生具有所謂顯性負(fù)效應(yīng)的類似物，該類似物通過前結(jié)構(gòu)域與其它蛋白結(jié)合或相互作用中有能力缺陷，或在上述結(jié)合后的隨后信號傳導(dǎo)中有(也可能是激酶活性)缺陷。例如，這些類似物可用來與天然的B1蛋白競爭來調(diào)節(jié)上述的發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道。同樣，可產(chǎn)生所謂的顯性陽性類似物來增強B1效應(yīng)。這些類似物將具有相同或更佳的B1相關(guān)的與其它蛋白結(jié)合的性質(zhì)，以及相同或更佳的天然B1蛋白信號傳導(dǎo)性質(zhì)或激酶活性。以類似的方式，本發(fā)明的克隆的生物活性片段可如上所述制備類似物那樣來制得。本發(fā)明的DNA序列的合適片段是其編碼的蛋白或多肽保留了與其它蛋白的B1結(jié)合能力或能介導(dǎo)上述其它結(jié)合活性或酶促(激酶)活性的那些片段。因此，可以制得具有如上文類似物所述的顯性陰性或顯性陽性效應(yīng)的本發(fā)明編碼蛋白的片段。類似地，通過用標(biāo)準(zhǔn)方法修飾蛋白、其類似物或片段的一個或多個氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)，或者通過將蛋白、其類似物或片段與另一分子(例如本領(lǐng)域熟知的抗體、酶、受體等)偶聯(lián)，可制得衍生物。
在編碼B1蛋白、同種型、類似物、片段或衍生物的本發(fā)明上述DNA序列中，本發(fā)明一個實例還包括能與天然B1蛋白編碼區(qū)衍生的cDNA序列雜交的DNA序列，其中這種雜交在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行，可雜交的DNA序列編碼了具有生物活性的B1蛋白。因此，這些可雜交的DNA序列包括與天然B1的cDNA序列有相對高同源性的DNA序列，并因而代表了B1樣序列，該B1樣序列可以是例如編碼各種B1蛋白同種型的天然衍生序列，或?qū)儆谝唤MB1樣序列且編碼具有B1蛋白活性的蛋白的天然存在的蛋白編碼序列。此外，這些序列還包括(例如)非天然存在的、合成的序列，該序列與天然B1蛋白cDNA序列相似但摻入了許多所需的修飾。因此，這類合成的序列包括編碼B1蛋白的類似物、片段和衍生物(都具有B1蛋白活性)的所有可能的序列。
為獲取上述各種天然存在的B1蛋白樣序列，可用天然B1蛋白cDNA或其部分作為探針，對不同組織中獲取的天然衍生的DNA或RNA樣品，用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行篩選和分離(參見例如Sambrook等人所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，1989)。
同樣地，為制備編碼B1蛋白的類似物、片段或衍生物的上述各種合成的B1蛋白樣序列，可以使用許多標(biāo)準(zhǔn)方法，正如下文詳細(xì)描述的有關(guān)制備這些衍生物、片段和類似物的方法。
“基本對應(yīng)于”B1蛋白的多肽或蛋白質(zhì)不僅包括B1蛋白，也包括是B1蛋白類似物的多肽或蛋白。
基本對應(yīng)于B1蛋白的類似物，是在B1蛋白的氨基酸序列中一個或多個氨基酸被其它氨基酸取代、刪除和/或被插入而形成的多肽，只要所得的蛋白質(zhì)基本上呈現(xiàn)出與其所對應(yīng)的B1蛋白同樣或更好的生物活性。
為了基本對應(yīng)于B1蛋白，在B1蛋白序列中的變化(如同種型)通常較小。雖然變化的數(shù)目可能多于10個，但較佳的不多于10個，更佳地不多于5個，最佳地不多于3個這樣的變化。盡管任何技術(shù)都可用于發(fā)現(xiàn)有潛在生物學(xué)活性且基本對應(yīng)于B1蛋白的蛋白質(zhì)，但是一種這樣的方法是對編碼該蛋白質(zhì)的DNA運用常規(guī)的誘變方法，產(chǎn)生一些修飾。然后，根據(jù)它們與具有例如前結(jié)構(gòu)域(CARD)、激酶結(jié)合位點的其它各種蛋白或與B1本身結(jié)合的能力以及在調(diào)節(jié)/介導(dǎo)上述胞內(nèi)通道時調(diào)節(jié)這些其它蛋白或B1本身活性的能力，對這些克隆表達(dá)的蛋白加以篩選。
“保守的”變化是指預(yù)計不會改變蛋白質(zhì)活性的那些變化，這些變化通常是首先要篩選的，因為這些變化預(yù)計不會明顯改變蛋白大小、電荷或構(gòu)型，因而預(yù)計不改變其生物特性。
B1蛋白的保守取代包括一種類似物，其中多肽中至少一個氨基酸殘基被不同的氨基酸保守地取代。較佳地，這種取代根據(jù)表1A中下列清單進(jìn)行，這些取代可用常規(guī)實驗來確定，從而使合成的多肽分子在保持B1蛋白生物活性的同時又在結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)上有所變化。
表IA原來的殘基 代表性的取代殘基Ala Gly；SerArg LysAsn Gln；HisAsp GluCys SerGln AsnGlu AspGly Ala；ProHis Asn；GlnIle Leu；ValLeu Ile；ValLys Arg；Gln；GluMet Leu；Tyr；IlePhe Met；Leu；TyrSer ThrThr SerTrp TyrTyr Trp；PheVal Ile；Leu或者，另一類B1蛋白的取代形式是在多肽中刪去至少一個氨基酸殘基，然后再根據(jù)下表IB在其位置插入不同殘基。多肽中可進(jìn)行的取代類型可依據(jù)對不同種類中同源蛋白之間氨基酸變化頻率的分析結(jié)果，例如Schulz等，G.E.，“蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)原理”(Principles of Protein Structure)，Springer-Verlag，New York，NY，1978中的表1-2，以及Creighton，T.E.，“蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子性能”(ProteinsStructureand Molecular Properties)，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，CA 1983中的圖3-9中給出的分析結(jié)果。根據(jù)這一分析，本文另外定義了保守性取代，該取代能在下列5組任一組中進(jìn)行互換。
表IB1.小的脂族非極性或弱極性殘基Ala、Ser、Thr(Pro，Gly)；2.極性帶負(fù)電荷的殘基及其酰胺Asp、Asn、Glu、Gln；
3.極性帶正電荷的殘基His、Arg，Lys；4.大的脂族非極性殘基Met、Leu、Ile、Val(Cys)；和5.大的芳族殘基Phe、Tyr、Trp。
上述括號中的3個氨基酸殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中有特殊作用。Gly是唯一沒有側(cè)鏈的殘基，因而它賦予肽鏈柔韌性。然而，這會傾向有利于形成除α-螺旋外的二級結(jié)構(gòu)。Pro，因其不同尋常的幾何結(jié)構(gòu)，會緊密地約束肽鏈，并且通常會促進(jìn)類似于β-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)，而在一些例子中，Cys能夠參與二硫鍵的形成(二硫鍵的形成在蛋白質(zhì)折疊中很重要)。應(yīng)注意，Schulz等(同上)將上面的第1和第2組合二為一。還應(yīng)注意，Tyr，因其有形成氫鍵的趨勢，因此與Ser和Thr等有顯著的親近關(guān)系。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的保守性氨基酸取代，例如上面所陳述的，都是本領(lǐng)域中已知的，并且預(yù)期在氨基酸取代后可以維持多肽的生物學(xué)和結(jié)構(gòu)特性。本發(fā)明的大多數(shù)缺失和取代是那些不導(dǎo)致蛋白質(zhì)或多肽分子特性發(fā)生根本變化的類型?！疤匦浴币员榕e方式(non-inclusive)定義，其定義了二級結(jié)構(gòu)(如α-螺旋或β-折疊)的變化和生物活性(例如上文和下文所述的與具有前結(jié)構(gòu)域(CARD)或激酶活性的其它蛋白結(jié)合，和/或調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡或存活通道)的變化。
可用于本發(fā)明來獲得B1蛋白類似物的在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生氨基酸替換的例子包括任何已知的方法步驟，例如在授予Mark等的美國專利RE33,653、4,959,314、4,588,585和4,737,462；授予Koths等的美國專利5,116,943；授予Namen等的美國專利4,965,195；授予Chong等的美國專利4,879,111；授予Lee等的美國專利5,017,691中給出的方法；以及在美國專利No.4,904,584(Shaw等)中給出的用賴氨酸取代的蛋白質(zhì)。
除了上述的不會明顯改變B1蛋白活性的保守性取代外，那些會增加B1蛋白類似物生物活性的保守性取代或保守性稍低而隨機性較高的改變，也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
當(dāng)需要證實取代或缺失的確切效果時，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可以通過常規(guī)的結(jié)合和細(xì)胞死亡試驗來評價取代、缺失等的效果。用這類標(biāo)準(zhǔn)測試方法進(jìn)行篩選并不需要過多的實驗。
在遺傳水平上，這些類似物通?？梢赃@樣制得對編碼B1蛋白的DNA中的核苷酸進(jìn)行定點誘變，從而產(chǎn)生編碼類似物的DNA，隨后合成DNA并在重組細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)多肽。類似物通常表現(xiàn)出與天然存在的蛋白相同或更高質(zhì)量的生物活性，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publications andWiley Interscience，New York，NY，1987-1995；Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989。
制備本文所述的B1蛋白，或者制備能編碼相同多肽但與天然序列不同的其他核苷酸序列(因為遺傳密碼已知的簡并性允許這些變化)，都可以通過定點誘變編碼早先制得的B1蛋白類似物或天然B1蛋白的DNA而實現(xiàn)。定點誘變可以利用編碼具有所需突變的DNA序列以及足夠數(shù)目的毗鄰核苷酸的特異性寡核苷酸序列來產(chǎn)生類似物，以提供具有足夠大小和序列復(fù)雜度(complexity)的引物序列，從而在被橫跨的缺失接頭兩側(cè)形成穩(wěn)定的雙鏈體。通常，較佳的是長度約20-25個核苷酸的引物，在待改變序列的每一側(cè)有約5-10個互補核苷酸。一般，定點誘變技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的，代表性的例子例如是Adelman等，DNA，2183(1983)，該文獻(xiàn)的公開內(nèi)容納入本文作參考。
正如人們所知曉的那樣，定點誘變技術(shù)通常采用單鏈和雙鏈形式的噬菌體載體。用于定點誘變的典型載體包括載體如M13噬菌體，例如公開在Messing等，Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA，A.Walton，Elsevier，Amsterdam編輯(1981)中，該文獻(xiàn)納入本文作參考。這些噬菌體易在商業(yè)上購得，且它們的用法通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。或者，也可用含有單鏈?zhǔn)删w復(fù)制起點的質(zhì)粒載體來獲得單鏈DNA(Veira等，Meth.Enzymol.1533，1987)。
通常，本文所述的定點誘變這樣來進(jìn)行先獲得一單鏈載體，該載體序列中含有編碼有關(guān)多肽的DNA序列。用自動化DNA/寡核苷酸合成法制得攜帶所需突變序列的寡核苷酸引物。然后將該引物與含有蛋白質(zhì)編碼序列的單鏈載體退火，然后用有DNA聚合作用的酶(如大腸桿菌聚合酶I的Klenow片段)作用，完成攜帶突變的鏈的合成。這樣，突變序列和第二條鏈就帶有所需的突變。然后用該異源雙鏈載體轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞(如大腸桿菌JM101細(xì)胞)，并選出含有帶突變序列重排的重組載體的克隆。
在選出了這樣的克隆后，可以取出有突變的B1蛋白序列，并置于合適的載體中，該載體通常是可用于轉(zhuǎn)染合適宿主的轉(zhuǎn)移載體或表達(dá)載體。
因此，利用已知的DNA或RNA擴增技術(shù)(如PCR和化學(xué)寡核苷酸合成技術(shù))，就可在體外、原位和/或體內(nèi)檢測、獲得和/或修飾編碼B1蛋白的基因或核酸。PCR可以通過重復(fù)的DNA聚合酶反應(yīng)來擴增特異的DNA序列(增加數(shù)目)。該反應(yīng)可用作克隆的替代手段；而所需的只是有關(guān)核酸序列的知識。為了進(jìn)行PCR，可設(shè)計與感興趣的序列互補的引物。然后通過自動化DNA合成法制得這些引物。因為引物被設(shè)計成能與基因任何部分雜交，因此可創(chuàng)造一些能夠容忍互補堿基對存在錯配的條件。擴增這些錯配區(qū)域會導(dǎo)致合成出誘變的產(chǎn)物，從而產(chǎn)生具有新特性的肽(即定點誘變)。另見例如Ausubel，(同上)，第16章。此外，通過偶聯(lián)互補DNA(cDNA)合成技術(shù)，并使用反轉(zhuǎn)錄酶和PCR反應(yīng)，可將RNA用作原料來合成催乳素受體的胞外結(jié)構(gòu)域，而不經(jīng)過克隆。
此外，PCR引物可被設(shè)計成含有新的限制性位點或具有其他特征，例如在待擴增的基因節(jié)段末端處有終止密碼子。在擴增的基因序列的5′和3′端安置限制性位點，可以使編碼B1蛋白或其片段的基因節(jié)段能按需進(jìn)行設(shè)計，以便在載體中連接其他序列和/或克隆位點。
PCR及擴增RNA和/或DNA的其它方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且根據(jù)此處所講述和給予的指導(dǎo)，無需過多試驗就可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行使用。已知的DNA或RNA擴增方法包括(但并不限于)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和有關(guān)的擴增方法(例如參見授予Mullis等的美國專利No.4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；授予Tabor等的美國專利4,795,699和4,921,794；授予Innis的美國專利5,142,033；授予Wilson等的美國專利5,122,464；授予Innis的美國專利5,091,310；授予Gyllensten等的美國專利5,066,584；授予Gelfand等的美國專利4,889,818；授予Silver等的美國專利4,994,370；授予Biswas的美國專利4,766,067；授予Ringold的美國專利4,656,135；和Innis等編輯的PCR ProtocolsA Guide to Methodand Applications)，以及RNA介導(dǎo)的擴增方法，其中使用對靶序列的反義RNA作為模板來合成雙鏈DNA(授予Malek等的美國專利No.5,130,238，其商品名為NASBA)；以及結(jié)合了DNA擴增和抗體標(biāo)記技術(shù)的免疫-PCR(Ruzicka等，Science260487(1993)；Sano等，Science 258120(1992)；Sano等，Biotechniques 91378(1991))。這些專利和對比文獻(xiàn)的全部內(nèi)容納入本文作參考。
按類似的方式，B1蛋白或其同種型的生物活性片段可參考上述B1蛋白類似物所述的方式進(jìn)行制備。合適的B1蛋白片段是那些至少保留前結(jié)構(gòu)域相關(guān)結(jié)合能力或激酶活性、并能介導(dǎo)B1蛋白直接或間接關(guān)聯(lián)的其它各種蛋白或胞內(nèi)通道生物活性的那些片段。因此，可以制得如上述類似物那樣具有顯性陰性或顯性陽性效應(yīng)的B1蛋白片段。應(yīng)注意，這些片段代表了本發(fā)明的一類特殊的類似物，即，它們是衍生自全長B1蛋白序列的B1蛋白的確定部分，每個這樣的片段或部分具有任一上述所需的活性。例如，這樣的片段可以是一個肽。
類似地，衍生物還可通過對B1蛋白及其類似物或片段的一個或多個氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)修飾，或者通過將B1蛋白及其類似物或片段偶聯(lián)于其他分子(例如抗體、酶、受體等)來制得，這些技術(shù)都是本領(lǐng)域中熟知的。因此，本文所用的術(shù)語“衍生物”覆蓋了用本領(lǐng)域已知手段對位于殘基側(cè)鏈的官能團(tuán)或N-端或C-端基團(tuán)進(jìn)行修飾而制得的衍生物，這些衍生物均包括在本發(fā)明內(nèi)。衍生物可以具有例如碳水化合物或磷酸殘基的化學(xué)分子部分，只要這樣的組份具有與B1蛋白相同或更高的生物活性。
例如，衍生物可包括羧基的脂族酯、羧基的酰胺(通過與氨或與伯胺或仲胺反應(yīng)獲得)、氨基酸殘基的游離氨基與?；糠?例如烷?；?alkanoyl)或碳環(huán)類的芳酰基)形成的N-?；苌铮蛴坞x的羥基(例如絲氨?；蛱K氨酰殘基)與酰基部分形成的O-?；苌?。
術(shù)語“衍生物”只包括那些沒有一個氨基酸變成20種常見的天然氨基酸中的某一種氨基酸的衍生物。
B1蛋白是蛋白質(zhì)或多肽，即它是氨基酸殘基序列。根據(jù)本文的定義，由包括了B1蛋白全部序列的更長序列所構(gòu)成的多肽也包括在該多肽范圍內(nèi)，只要所添加部分不影響本發(fā)明的基本特性和新的特性，即，它們保留或提高了B1蛋白的生物活性，或它們能夠斷裂產(chǎn)生具有B1蛋白生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。因此，例如，本發(fā)明包括B1蛋白與其他氨基酸或肽形成的融合蛋白。
新的B1蛋白、其類似物、片段和衍生物有許多可能的用途，例如(i)它們可通過直接或間接調(diào)節(jié)它們所結(jié)合的胞內(nèi)蛋白來調(diào)節(jié)細(xì)胞存活通道。在不希望增強這些通道活性的情況下，即希望抑制它們而有利于細(xì)胞死亡通道時，例如在抗腫瘤或免疫刺激應(yīng)用中，希望B1、其同種型、類似物、片段或衍生物的這種調(diào)節(jié)作用是抑制性的。在這種情況下，可用本來已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將本發(fā)明的B1蛋白、其類似物、片段或衍生物導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。例如當(dāng)本發(fā)明的DNA克隆編碼的蛋白在細(xì)胞內(nèi)，且它們只應(yīng)被導(dǎo)入所需細(xì)胞內(nèi)時，就需要一種將這些蛋白質(zhì)特異性導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的系統(tǒng)。實現(xiàn)該目的的一種方法是產(chǎn)生一個重組動物病毒(例如從牛痘獲得)，在DNA中導(dǎo)入下列兩個基因編碼配體的基因，該配體能與細(xì)胞特異性表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白(例如一種是與一些細(xì)胞(CD4淋巴細(xì)胞和相關(guān)的白血病細(xì)胞)特異性結(jié)合的AIDS(HIV)病毒gp120蛋白))結(jié)合；或者是編碼與攜帶已知受體的細(xì)胞特異性結(jié)合的任何其它配體的基團(tuán)，這樣重組病毒載體將能結(jié)合這些細(xì)胞；以及編碼本發(fā)明蛋白的基因。這樣，細(xì)胞表面結(jié)合蛋白在病毒表面上的表達(dá)會使病毒特異性地靶向腫瘤細(xì)胞或其它攜帶受體的細(xì)胞，然后編碼蛋白的序列會通過病毒導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，而且它一旦在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，就會抑制細(xì)胞存活通道，導(dǎo)致這些細(xì)胞中產(chǎn)生所需的細(xì)胞死亡或免疫刺激效應(yīng)。這些重組動物病毒可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來構(gòu)建(例如參見，Sambrook等，1989)。另一種可能是將編碼蛋白的序列以能被細(xì)胞吸收并在其中表達(dá)的寡核苷酸形式導(dǎo)入。
類似地，當(dāng)B1蛋白、同種型、類似物、片段或衍生物是刺激性的或增強細(xì)胞死亡過程時，它們也可如上所述那樣給予細(xì)胞以提高抗腫瘤、免疫刺激性或其它細(xì)胞死亡作用的活性。
(ii)或者，例如在AIDS、膿毒休克、移植物抗宿主排斥反應(yīng)等組織破壞的情況下，當(dāng)需要阻斷細(xì)胞死亡通道或刺激細(xì)胞存活通道時，它們可用來增強或提高細(xì)胞存活通道。在這種情況下這是可能的，例如，當(dāng)B1蛋白實際上抑制了細(xì)胞存活過程、或是刺激或增強細(xì)胞死亡通道時，可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將具有本發(fā)明B1蛋白反義編碼序列的寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，該寡核苷酸將有效地阻斷編碼該蛋白的mRNA的翻譯，從而阻斷其表達(dá)并導(dǎo)致抑制不希望的(細(xì)胞死亡)效應(yīng)。這些寡核苷酸可用上述重組病毒方法導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，該病毒攜帶的第二序列是該寡核苷酸序列。
另一種可能是用針對本發(fā)明蛋白的特異性抗體來抑制它們的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)活性。
抑制不希望的效應(yīng)還有一種方法是最近開發(fā)出來的核酶方法。核酶是具有催化性的RNA分子，它能特異性地切割RNA。核酶可經(jīng)基因工程改造來切割所選的靶RNA(例如編碼本發(fā)明B1蛋白的mRNA)。這種核酶具有的序列對蛋白mRNA有特異性，能在切割mRNA后與其相互作用(互補結(jié)合)，從而導(dǎo)致蛋白表達(dá)的減少或完全喪失，而表達(dá)減少的水平取決于靶細(xì)胞中核酶表達(dá)的水平。為了將核酶導(dǎo)入所選細(xì)胞(例如攜帶B1蛋白序列的那些細(xì)胞)內(nèi)，可以采用任何合適的載體，例如通常用于此目的的質(zhì)粒、動物病毒(逆轉(zhuǎn)錄病毒)載體(另見上文(i)，其中病毒具有的第二序列是編碼所選核酶序列的cDNA)。(關(guān)于有關(guān)核酶方法的回顧參見Chen等，1992；Zhao和Pick，1993)。
(iii)它們還可用來分離、鑒定和克隆能結(jié)合它們的其它蛋白，例如參與胞內(nèi)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道的其它蛋白。例如，可將編碼本發(fā)明蛋白的DNA序列用于酵母雙雜交系統(tǒng)中，在該系統(tǒng)中用編碼蛋白作為“誘餌”來分離、克隆和鑒定cDNA或基因組DNA文庫中編碼能結(jié)合克隆蛋白的其它蛋白序列(＂獵物＂)。同樣，還可以確定本發(fā)明的蛋白是否能結(jié)合其它細(xì)胞蛋白，如TNF/NGF受體超家族的其它受體、或BCL2家族的其它成員。
(iv)編碼的蛋白、其類似物、片段或衍生物還可用來分離、鑒別和克隆相同類別中的其它蛋白(即具有前結(jié)構(gòu)域(CARD)或激酶結(jié)構(gòu)域的那些蛋白、或功能上相關(guān)的并參與胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程的蛋白)。在該應(yīng)用中，可采用上述酵母雙雜交系統(tǒng)，或可采用最近開發(fā)出的采用非嚴(yán)謹(jǐn)性Southern雜交然后進(jìn)行PCR克隆的系統(tǒng)(Wilks等人，1989)。
(v)利用本發(fā)明的編碼蛋白、其類似物、片段或衍生物的還有一種方法是將它們用于親和層析方法來分離和鑒別它們能結(jié)合的其它蛋白或因子，例如與B1蛋白相關(guān)的蛋白或參與胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程的其它蛋白或因子。在這種應(yīng)用中，本發(fā)明的蛋白、其類似物、片段或衍生物可單獨與親和層析基質(zhì)連接，然后使其與細(xì)胞抽提物或懷疑參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程的分離的蛋白或因子接觸。在親和層析步驟后，就可洗脫、分離并鑒定和本發(fā)明的蛋白、其類似物、片段或衍生物結(jié)合的其它蛋白或因子。
(vi)如上所述，本發(fā)明的蛋白或其類似物、片段或衍生物還可用作免疫原(抗原)來生產(chǎn)其特異性的抗體。這些抗體也可用來從細(xì)胞抽提物或產(chǎn)生B1蛋白、其類似物或片段的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中純化本發(fā)明的蛋白。另外，這些抗體可用于診斷目的，用來鑒定與受體系統(tǒng)或它們在其中起作用的發(fā)炎、細(xì)胞死亡或存活通道的功能異常有關(guān)的疾病。因此，若這些疾病與涉及本發(fā)明蛋白的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)功能失常有關(guān)，那么這些抗體就可作為重要的診斷工具。術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、嵌合抗體、針對可溶或結(jié)合形式被標(biāo)記的抗體的抗獨特型(抗-Id)抗體、以及它們的片段(例如Fab和F(ab′)2—缺少完整抗體Fc片段、能結(jié)合抗原的片段)。
(vii)用于本發(fā)明的抗體，包括抗體片段，可用于定量或定性地檢測樣品中本發(fā)明的克隆，或者用于檢測是否存在表達(dá)本發(fā)明克隆的細(xì)胞。這可采用熒光標(biāo)記抗體的免疫熒光技術(shù)，并結(jié)合光學(xué)顯微計量檢測、流式細(xì)胞計量檢測或熒光計量檢測術(shù)而實現(xiàn)。
本發(fā)明所用的抗體(或其片段)可用于組織學(xué)，如在免疫熒光或免疫電子顯微術(shù)中，以便原位檢測本發(fā)明的克隆。原位檢測可這樣進(jìn)行取一份患者組織樣品，然后將標(biāo)記的本發(fā)明抗體提供給該樣品?？贵w(或其片段)的提供宜通過將標(biāo)記的抗體(及其片段)施加或覆蓋在生物樣品上。通過使用這一程序，不僅可以確定是否存在克隆，而且可以確定其在受檢組織中的分布。使用本發(fā)明，一般技術(shù)人員將會知道，可以改進(jìn)各種不同的組織學(xué)方法(例如染色程序)以實現(xiàn)這種原位檢測。
這些分析本發(fā)明克隆的方法通常包括將生物樣品如生物液體、組織提取物、新收獲的細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞或白細(xì)胞)、或在組織培養(yǎng)中培育過的細(xì)胞，在能鑒別該編碼蛋白質(zhì)的可檢測標(biāo)記抗體存在下培育，然后用本領(lǐng)域熟知的眾多方法中的任一種技術(shù)來檢測抗體。
(viii)本發(fā)明的編碼蛋白利用其結(jié)合其他胞內(nèi)蛋白質(zhì)的能力，還可被用作眾多其他蛋白質(zhì)的間接調(diào)節(jié)劑，而這些其他胞內(nèi)蛋白質(zhì)可直接結(jié)合另一些胞內(nèi)蛋白或跨膜蛋白的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。
為了調(diào)節(jié)這些其他的胞內(nèi)蛋白質(zhì)或跨膜蛋白的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，可用上文(i)和(ii)提到的許多方法將本發(fā)明蛋白質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞。
還應(yīng)注意，本發(fā)明蛋白的分離、鑒定和特性分析可用任何熟知的標(biāo)準(zhǔn)篩選步驟來進(jìn)行。例如，這些篩選步驟中的一種—酵母雙雜交程序可用來鑒定本發(fā)明的蛋白。同樣，也可采用其它步驟，例如本領(lǐng)域熟知的親和層析、DNA雜交程序，來分離、鑒定和特性分析本發(fā)明的B1蛋白，或用來分離、鑒定和特性分析能與本發(fā)明的蛋白結(jié)合的其它蛋白、因子、受體等。
此外，發(fā)現(xiàn)能結(jié)合本發(fā)明蛋白的蛋白質(zhì)，其本身也能按上文或下文使用本發(fā)明蛋白的類似方式被利用，以分離、鑒別和特性分析其他蛋白質(zhì)、因子等，這些蛋白質(zhì)和因子等能結(jié)合本發(fā)明蛋白結(jié)合的蛋白，并代表了參與相關(guān)信號傳導(dǎo)過程更下游的因子，或有它們的信號傳導(dǎo)活性并因此代表了參與不同的信號傳導(dǎo)過程的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的DNA序列和所編碼的蛋白質(zhì)可用任何標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法(參見例如Sambrook等人，1989)產(chǎn)生，方法是用合適的含有蛋白質(zhì)編碼序列的真核或原核載體轉(zhuǎn)化合適的真核或原核宿主細(xì)胞。因此，本發(fā)明還涉及這些用于生產(chǎn)本發(fā)明蛋白的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。如上所述，這些蛋白質(zhì)還包括它們的生物活性類似物、其片段和衍生物，因此編碼它們的載體也包括編碼這些蛋白質(zhì)的類似物和片段的載體，而轉(zhuǎn)化的宿主包括那些產(chǎn)生這些類似物和片段的宿主。這些蛋白質(zhì)的衍生物是由轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、其類似物或片段通過標(biāo)準(zhǔn)修飾而產(chǎn)生的衍生物。
本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)B1介導(dǎo)的效應(yīng)的藥物組合物。該藥物組合物含有一種或多種下列物質(zhì)作為活性成分(i)被亞克隆入合適的表達(dá)載體中的本發(fā)明的一種或多種DNA序列，或其部分；(ii)本發(fā)明的蛋白質(zhì)、其生物活性片段、類似物、衍生物或它們的混合物；(iii)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)、其生物活性片段、類似物或衍生物的重組動物病毒載體。
該藥物組合物可根據(jù)待治療的疾病并以對病人有益的劑量(取決于體重和其他考慮因素)進(jìn)行施用，這可以由醫(yī)師來確定。
如上所述，B1可能是TRAF2的間接調(diào)節(jié)劑，因此它可能通過TRAF2-NIK-相互作用而參與NF-κB的激活。因此B1可能在細(xì)胞存活通道中起作用，使得TRAF2獨立地或與其他蛋白質(zhì)(如p55 TNF和p75 TNF受體、FAS/APO1受體、MORT-1、RIP和TRADD)一起發(fā)揮作用。在這方面，已認(rèn)識到需要設(shè)計出能夠增強或抑制TRAF2-NIK相互作用的藥物是至關(guān)重要的。例如，當(dāng)需要增加TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性時，就希望通過抑制TRAF2-NIK相互作用或通過特異性地抑制TRAF2和/或NIK來抑制NF-κB的誘導(dǎo)。同樣，例如當(dāng)需要抑制TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性時，就希望通過增強TRAF2-NIK相互作用或通過增強TRAF2和/或NIK特異性的NF-κB誘導(dǎo)作用來增強NF-κB的誘導(dǎo)。這類藥物對許多疾病有很大幫助。這其中(請參見上面的論述)包括急性肝炎，其中對肝臟的急性損傷似乎反映了在受Fas配體誘導(dǎo)后FAS/APO1受體介導(dǎo)的肝臟細(xì)胞死亡情況；自身免疫所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，例如導(dǎo)致糖尿病的胰腺β郎格罕(Langerhans)細(xì)胞的死亡；在移植物排斥(如腎臟、心臟和肝臟)中的細(xì)胞死亡；在多發(fā)性硬化癥中的腦少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡；和造成AIDS病毒的增殖并導(dǎo)致AIDS病的AIDS抑制的T細(xì)胞自殺。
在這些情況下，需要抑制FAS/APO1受體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(凋亡)通道，并通過TRAF2和TRAF2-NIK相互作用來增強FAS/APO1受體介導(dǎo)的NF-κB誘導(dǎo)。一種做法是增加細(xì)胞中NIK的數(shù)量，或者增加TRAF2和NIK的數(shù)量，這樣將增加NIK或TRAF2-NIK-所介導(dǎo)的對NF-κB激活的誘導(dǎo)，從而提供了更高水平的NF-κB激活，因而使細(xì)胞存活更好；或者這樣將增加FAS/APO1受體和TRAF2(或TRAF2-NIK)之間的直接或間接相互作用，結(jié)果使FAS/APO1受體與細(xì)胞毒中介體(如MACH，參見圖2的示意圖)的相互作用減少，從而提高NF-κB激活的誘導(dǎo)和細(xì)胞存活。
相反，例如在腫瘤和受感染細(xì)胞(參見上文的論述)的情況下，則需要增加FAS/APO1受體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，以增加細(xì)胞死亡。在這種情況下，就需要抑制FAS/APO1受體與TRAF2(或TRAF2-NIK)的相互作用和/或直接抑制NIK，從而減少對NF-κB活性的誘導(dǎo)。
由于本發(fā)明的B1蛋白可能與TRAF2有相互作用，因此它可能增強或抑制該相互作用，從而增強或抑制TRAF2的活性，尤其是增強或抑制TRAF2與NIK的相互作用以及相關(guān)的對NF-κB激活的誘導(dǎo)。B1和TRAF2之間相互作用的增強或抑制可能是直接的，或通過結(jié)合TRAF2以及可能通過和B1直接或間接相互作用的其它蛋白(如c-IAP1，c-IAP2)來實現(xiàn)。因此，通過側(cè)重于B1蛋白并調(diào)節(jié)其與TRAF2之間可能的(直接或間接)相互作用，也可以調(diào)節(jié)TRAF2的活性，從而還能調(diào)節(jié)FAS/APO1(FAS-R)以及p55-TNF-R的效應(yīng)(如上所述)。
另如上所述，B1可能直接作用于細(xì)胞死亡的中介體(即其蛋白水解活性導(dǎo)致細(xì)胞死亡的各種蛋白酶類)。因此，上述FAS/APO1(FAS-R)或p55 TNF-R效應(yīng)可通過B1對蛋白酶類(如MACH和其它蛋白)的調(diào)節(jié)作用由B1來直接或間接調(diào)節(jié)，這些蛋白酶類與p55 TNF-R、FAS-R或其結(jié)合蛋白MORT-1相關(guān)并明顯影響其介導(dǎo)的凋亡反應(yīng)。因此，如果B1以增強這些蛋白酶類活性方式與它們相互作用，那么當(dāng)如上所述需要細(xì)胞死亡時，這種相互作用應(yīng)當(dāng)增強，而當(dāng)如上所述不需要細(xì)胞死亡時，這種相互作用應(yīng)當(dāng)抑制。
因此，鑒于上述內(nèi)容，當(dāng)不希望有這種相互作用時，可以篩選各種物質(zhì)(如肽、有機化合物、抗體等)來獲得能抑制B1與其它各種蛋白之間可能的相互作用的特異性藥物。這些藥物可能是特異性識別B1前結(jié)構(gòu)域的那些藥物，例如是與B1 CARD特異性結(jié)合并防止其與含有CARD的其它蛋白相互作用的肽、有機分子、抗體或抗體片段。相反，當(dāng)需要B1與其它蛋白之間的這種相互作用時，可通過上文(i)中所述的標(biāo)準(zhǔn)程序增加細(xì)胞內(nèi)B1的量來增強這種相互作用。在這里，還可以篩選能增強B1胞內(nèi)活性或能增強其與其它蛋白相互作用的各種特異性藥物。
另外，如上所述，B1還有一個激酶結(jié)構(gòu)域可能涉及了其對發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道的調(diào)節(jié)效應(yīng)。因此，該激酶結(jié)構(gòu)域可能起的作用是結(jié)合并磷酸化各種蛋白從而增加或減少它們的活性，這樣就可能會增加或減少發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道的活性。因此，當(dāng)需要抑制或增強發(fā)炎、細(xì)胞死亡或存活通道時，可以篩選各種肽、有機化合物、抗體等來獲得能抑制B1激酶活性的特異性藥物。
如何來設(shè)計和篩選抑制B1通過其前結(jié)構(gòu)域或激酶結(jié)構(gòu)域與其它蛋白相互作用(如上所述)的肽抑制劑的非限制性實施例所根據(jù)的以前研究是ICE或ICE樣蛋白酶的肽抑制劑，ICE的底物特異性以及用肽合成法分析表位的策略。已發(fā)現(xiàn)，ICE有效切割肽的最低要求涉及切割位點左側(cè)的4個氨基酸，并且在P1位置強烈優(yōu)選天冬氨酸，在P1位的右側(cè)有足夠的甲胺(Sleath等，1990；Howard等，1991；Thornberry等，1992)。此外，一種縮寫為Ac-DEVD-AMC的熒光底物肽(四肽)乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-甲基-香豆酰(coumaryl)-7-酰胺)，它對應(yīng)于在FAS-R刺激后和其他凋亡過程(Kaufmann，1989；Kaufmann等，1993；Lazebnik等，1994)后不久在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的被切割的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的序列，而且該底物被CPP32(CED3/ICE蛋白酶家族的一個成員)和MACH蛋白酶有效地切割。
因為底物P1位的Asp顯得很重要，因此可快速篩選第四個氨基酸殘基為Asp而前3個殘基位置有各種氨基酸組合的四肽是否與蛋白酶活性位點結(jié)合，例如采用Geysen開發(fā)的方法(Geysen，1985；Geysen等，1987)，在該方法中對固相載體上的大量肽進(jìn)行篩選，確定它們是否與抗體有特異性的相互作用。MACH蛋白酶與特異性肽的結(jié)合可用本領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)范圍內(nèi)各種熟知的檢測方法(例如放射標(biāo)記等)來檢測。已表明，Geysen的這種方法每個工作日至少能測試4000種肽。
按類似的方式，確定B1與其它蛋白之間相互作用的確切結(jié)合區(qū)域或同源區(qū)域可以被闡明，然后可以篩選出能用于阻斷該相互作用的肽，例如合成序列類似于結(jié)合區(qū)域或互補于結(jié)合區(qū)域的、能與天然B1競爭結(jié)合的肽，或是通過CARD或激酶結(jié)構(gòu)域或者甚至是通過B1的CARD和激酶結(jié)構(gòu)域之間的中間結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道其它蛋白相互作用的肽。
因為設(shè)計出能選擇性抑制B1相互作用而不干擾胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通道其它成員參與的生理性細(xì)胞死亡或存活過程的肽抑制劑可能是有好處的，所以可以進(jìn)一步合成上述試驗中結(jié)合B1的肽庫作為熒光底物肽，以測試B1與其它這些蛋白的選擇性結(jié)合，只選出對B1有特異性的那些肽。然后可對經(jīng)測定對例如B1的CARD或激酶結(jié)構(gòu)域有特異性的肽進(jìn)行修飾，以提高細(xì)胞通透性并可逆或不可逆地調(diào)節(jié)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活過程。Thornberry等(1994)報道了一種四肽(酰氧基)甲基酮Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH2OC(O)-[2，6-(CF3)]Ph，它是ICE的強效滅活劑。類似地，Milligan等(1995)報道說，具有氯甲基酮的四肽抑制劑(不可逆地)或具有醛基團(tuán)的四肽抑制劑(可逆地)抑制ICE。此外，已表明芐氧基羧基-Asp-CH2OC(O)-2，6-二氯苯(DCB)可抑制ICE(Mashima等，1995)。因此，以類似的方式，可以用例如醛基、氯甲基酮、(酰氧基)甲基酮或CH2OC(O)-DCB基團(tuán)對選擇性結(jié)合(例如)B1的CARD或激酶結(jié)構(gòu)域的四肽進(jìn)行修飾，以產(chǎn)生B1活性的肽調(diào)節(jié)劑。另外，為了改進(jìn)通透性，例如可對肽進(jìn)行化學(xué)修飾或衍生，以增強它們通過細(xì)胞膜的通透性并使這些肽能傳遞通過膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。Muranishi等(1991)報道了用月桂酸衍生處理促甲狀腺釋放激素，形成一種親脂的、具有良好的通過細(xì)胞膜性能的月桂酰衍生物。Zacharia等(1991)還報道了將甲硫氨酸氧化成亞砜并用其酮亞甲基異酯(COCH2)(ketomethylene isoester)代替肽鍵，以幫助肽通過細(xì)胞膜。這些方法僅僅是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的修飾和衍生方法中的一些而已。
此外，能夠(例如)通過干擾B1與任何蛋白(B1靠其CARD、激酶或中間結(jié)構(gòu)域與該蛋白結(jié)合)之間的相互作用來抑制細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道活性的藥物或肽抑制劑可以與促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞的分子偶聯(lián)或復(fù)合。
美國專利No.5,149,782公開了將待運輸通過細(xì)胞膜的分子與膜共混劑(blending agent)偶連在一起，這些膜共混劑例如有融合性多肽、離子通道形成多肽、其他膜多肽、和長鏈脂肪酸如肉豆蔻酸和棕櫚酸。這些膜共混劑將分子偶聯(lián)物插入細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層中，并協(xié)助它們進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。
Low等的美國專利5,108,921回顧了通過受體介導(dǎo)的胞吞機制來跨膜運送分子(例如(但不局限于)蛋白質(zhì)、核酸)的現(xiàn)有方法。這些受體系統(tǒng)包括識別下列物質(zhì)的那些系統(tǒng)半乳糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、運鐵蛋白、脫唾液酸糖蛋白、鈷胺傳遞蛋白(維生素B12)、α-2巨球蛋白、胰島素和其他肽生長因子如表皮生長因子(EGF)。Low等講述了，營養(yǎng)物的受體(如生物素和葉酸的受體)可被有利地用于增強通過細(xì)胞膜的運輸，因為在大多數(shù)細(xì)胞的膜表面上存在多種生物素和葉酸受體并且有相應(yīng)受體介導(dǎo)的跨膜運輸過程。因此，待輸送入細(xì)胞質(zhì)的化合物與配體(如生物素或葉酸)形成的復(fù)合物與具有生物素或葉酸受體的細(xì)胞膜接觸之后，就啟動了受體所介導(dǎo)的跨膜運輸機制，從而允許所需化合物進(jìn)入細(xì)胞。
已知ICE能容忍P2位置上自由替換，而且對自由替換的這種容忍性可被加以利用，以開發(fā)出強效和高選擇性的、含有生物素標(biāo)記的親和標(biāo)記(Thornberry等，1994)。因此，可以對四肽抑制劑的P2位以及可能的N-端進(jìn)行修飾或衍生處理，例如添加生物素分子，從而提高這些肽抑制劑通過細(xì)胞膜的通透性。
此外，本領(lǐng)域中已經(jīng)知道，可以使所需的肽序列與前導(dǎo)肽/信號肽序列融合，以產(chǎn)生“嵌合肽”，這就能使該“嵌合肽”穿膜運輸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。
正如肽領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的那樣，本發(fā)明上述的抑制B1與其它蛋白相互作用的肽抑制劑包括肽模擬型藥物或抑制劑，它們也能被迅速篩選以確定是否和B1的CARD、激酶或中間結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而設(shè)計出可能更穩(wěn)定的抑制劑。
還應(yīng)理解，上述用于協(xié)助或增強肽抑制劑運輸通過細(xì)胞膜的相同手段，也可用于B1的類似物、片段或同種型，以及在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功效的其他B1特異性肽和蛋白質(zhì)(包括融合蛋白)。
關(guān)于全文中提及的抗體，術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、嵌合抗體、針對能夠以可溶或固定形式被標(biāo)記的抗體的抗獨特型(抗-Id)抗體、以及用各種已知技術(shù)(例如(但并不限于)酶切、肽合成或重組技術(shù))所提供的它們的片段。
多克隆抗體是異質(zhì)的抗體分子群體，它們來自用抗原免疫的動物血清。單克隆抗體含有基本上均質(zhì)的、對抗原特異的抗體群，該群體含有基本相似的表位結(jié)合位點。單克隆抗體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來獲得。例如參見Kohler和Milstein，自然，256495-497(1975)；美國專利No.4,376,110；Ausubel等編，Harlow和Lane，抗體實驗手冊(ANTIBODIESA LABORATORY MANUAL)，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；和Colligan等編，Current Protocols inImmunology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience N.Y.，(1992-1996)，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容都全部納入本文作參考。這些抗體可以是任何種類的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD及其任何亞類。產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤可以在體外、原位或體內(nèi)培養(yǎng)。在體內(nèi)或原位生產(chǎn)高滴度單克隆抗體的方法是目前較佳的生產(chǎn)方法。
嵌合抗體是這樣一種分子，它的不同部分來自不同的動物物種，例如具有鼠單克隆抗體可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子。嵌合抗體主要用于降低應(yīng)用中的免疫原性以及增加產(chǎn)量，例如當(dāng)鼠單克隆抗體在雜交瘤中有較高的產(chǎn)量但在人中具有較高免疫原性的情況下，可以使用這種人/鼠嵌合單克隆抗體。嵌合抗體及其生產(chǎn)方法是本領(lǐng)域中已知的(Cabilly等，美國科學(xué)院院報813273-3277(1984)；Morrison等，美國科學(xué)院院報816851-6855(1984)；Boulianne等，自然，312643-646(1984)；Cabilly等，歐洲專利申請125023(1984年11月14日公開)；Neuberger等，自然，314268-270(1985)；Taniguchi等，歐洲專利申請171496(1985年2月19日公開)；Morrison等，歐洲專利申請173494(1986年3月5日公開)；Neuberger等，PCT申請WO 8601533(1986年3月13日公開)；Kudo等，歐洲專利申請184187(1986年6月11日公開)；Sahagan等，J.Immunol.1371066-1074(1986)；Robinson等，國際專利申請No.WO8702671(1987年5月7日公開)；Liu等，美國科學(xué)院院報843439-3443(1987)；Sun等，美國科學(xué)院院報84214-218(1987)；Better等，科學(xué)2401041-1043(1988)；以及Harlow和Lane，抗體實驗手冊，同上)。這些文獻(xiàn)全部納入本文作參考。
抗獨特型(抗-Id)抗體是這樣一種抗體，它識別通常與抗體的抗原結(jié)合位點相關(guān)的獨特決定簇。Id抗體可這樣制得，免疫與單克隆抗體來源動物相同的物種和基因型的動物(例如小鼠品種)，其中該單克隆抗體就是制備的抗-Id所針對的。被免疫的動物會識別免疫用抗體的獨特型決定簇，并通過產(chǎn)生針對這些獨特型決定簇的抗體(抗-Id抗體)而進(jìn)行應(yīng)答。例如參見美國專利No.4,699,880，該專利全部納入本文作參考。
抗-Id抗體還可用作“免疫原”，在另一動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生所謂的抗-抗-Id抗體。該抗-抗-Id抗體可能與最初誘導(dǎo)抗-Id的單克隆抗體在表位上相同。因此，通過使用針對mAb獨特型決定簇的抗體，就可鑒別出表達(dá)具有相同特異性的抗體的其它克隆。
因此，可用針對本發(fā)明的B1蛋白、其類似物、片段或衍生物而產(chǎn)生的單克隆抗體在合適的動物(如BALB/c小鼠)中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗-Id抗體?？捎迷摫幻庖咝∈蟮钠⒓?xì)胞來產(chǎn)生分泌抗-Id mAb的抗-Id雜交瘤。此外，抗-Id單克隆抗體還可與載體(如匙孔 血藍(lán)蛋白(KLH))偶聯(lián)，并用于免疫其他的BALB/c小鼠。這些小鼠的血清含有抗-抗-Id抗體，該抗體具有最初單克隆抗體的結(jié)合特性，并對上述的B1蛋白、或其類似物、片段或衍生物的表位有特異性。
這樣，抗-Id單克隆抗體具有它們自己的獨特型表位，或有結(jié)構(gòu)上與被評價表位相似的“獨特位”(如GRB蛋白-a)。
術(shù)語“抗體”還包括完整的分子及其片段，例如能夠結(jié)合抗原的Fab和F(ab′)2。Fab和F(ab′)2片段缺少完整抗體的Fc片段，能夠更迅速地從循環(huán)系統(tǒng)中清除，并且與完整抗體相比具有更低的非特異性組織結(jié)合性(Wahl等，J.Nucl.Med.24316-325(1983))。
應(yīng)理解，根據(jù)本文公開的用于完整抗體分子的方法，本發(fā)明中有用的Fab和F(ab′)2以及其他抗體片段也可用于檢測和定量測定B1蛋白。這些片段通常可用木瓜酶(產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab′)2片段)進(jìn)行蛋白水解切割來產(chǎn)生。
如果抗體能特異性地與某分子反應(yīng)從而使該分子與抗體結(jié)合，那么就稱該抗體“能夠結(jié)合”該分子。術(shù)語“表位”指任何分子中能被抗體識別且還能被抗體結(jié)合的部分。表位或“抗原決定簇”通常由分子表面化學(xué)活性基團(tuán)(如氨基酸或糖的側(cè)鏈)構(gòu)成，而且具有特異的三維結(jié)構(gòu)特征和特異的電荷特征。
“抗原”是能被抗體結(jié)合、并且還能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生能與該抗原表位結(jié)合的抗體的分子或分子一部分?？乖删哂幸粋€或多個表位。上述特異反應(yīng)指抗原會以高度選擇性的方式與其相應(yīng)的抗體反應(yīng)，而不會與大量由其他抗原產(chǎn)生的其他抗體反應(yīng)。
本發(fā)明中有用的抗體(包括抗體片段)可用于定量或定性地檢測樣品中的B1蛋白，或檢測表達(dá)本發(fā)明B1蛋白的細(xì)胞的存在與否。這可以用免疫熒光技術(shù)，利用熒光標(biāo)記的抗體(見下文)并結(jié)合光學(xué)顯微術(shù)、流式細(xì)胞計量術(shù)或熒光計量術(shù)檢測而實現(xiàn)。
本發(fā)明中有用的抗體(或其片段)可在組織學(xué)上被采用，例如在免疫熒光或免疫電子顯微術(shù)中，用來原位檢測本發(fā)明的B1蛋白。原位檢測可這樣來實現(xiàn)從患者體內(nèi)取一份組織樣品，然后將經(jīng)標(biāo)記的本發(fā)明抗體供給該樣品?？贵w(或其片段)的提供最好是通過將經(jīng)標(biāo)記的抗體(及其片段)施加或覆蓋在生物樣品上。通過采用這種步驟，不僅可以確定是否存在B1蛋白，而且還能確定其在受檢組織中的分布。采用了本發(fā)明，一般技術(shù)人員容易知道，可對各種組織學(xué)方法(例如染色程序)加以改動來實現(xiàn)這種原位檢測。
對于本發(fā)明B1蛋白的這些試驗方法通常包括使生物樣品(如生物液體、組織抽提物、新收獲的細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞或白細(xì)胞)、或已經(jīng)在組織培養(yǎng)中培育過的細(xì)胞)在能夠鑒別B1蛋白的有可檢測標(biāo)記的抗體存在下進(jìn)行培育，然后用本領(lǐng)域熟知的眾多方法中的任一種方法檢測抗體。
生物樣品可以用固相支持物或載體(如硝酸纖維素、或能固定細(xì)胞、細(xì)胞顆?；蚩扇艿鞍椎钠渌滔嘀С治锘蜉d體)來處理。然后用合適的緩沖液洗滌支持物或載體，再根據(jù)本發(fā)明上述那樣用有可檢測標(biāo)記的抗體進(jìn)行處理。再用緩沖液第二次洗滌固相支持物或載體以除去未結(jié)合的抗體。然后可用常規(guī)方法檢測所述固相支持物或載體上所結(jié)合的標(biāo)記的量。
“固相支持物”、“固相載體”、“固體支持物”、“固體載體”、“支持物”或“載體”指能結(jié)合抗原或抗體的任何支持物或載體。熟知的支持物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍淀粉酶、天然的和改性的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長巖和磁鐵石。出于本發(fā)明的目的，載體的特性可以是不溶的，或在某種程度上可溶。載體材料可以有實際上所有可能的結(jié)構(gòu)構(gòu)型，只要偶聯(lián)的分子能夠結(jié)合抗原或抗體。因此，支持物或載體的構(gòu)型可以是球形(如在玻珠內(nèi))、圓柱形(如試管的內(nèi)表面或棒的外表面)。另外，表面可以是平坦的，例如板、測試條帶等。較佳的支持物或載體包括聚苯乙烯珠。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道用于結(jié)合抗體或抗原的其他許多合適的載體，或者能夠通過常規(guī)實驗來確定這些載體。
如上所述的本發(fā)明給定批次抗體的結(jié)合活性可以用眾所周知的方法來測定。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過常規(guī)實驗來確定每次測定的操作條件和最佳試驗條件。
其他的步驟，諸如洗滌、攪拌、振蕩、過濾等，可增加到試驗方法中，這些步驟都是常規(guī)的或是具體情況下所需的。
本發(fā)明的抗體能夠被可檢測地標(biāo)記的一種方法是將該抗體與酶相連，然后用于酶免疫分析(EIA)。然后，當(dāng)該酶與合適的底物接觸時，酶會與底物反應(yīng)，從而產(chǎn)生可被檢測(例如通過分光光度分析、熒光分析、或肉眼觀察)的化學(xué)物?？捎糜诳蓹z測地標(biāo)記抗體的酶包括(但不局限于)蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿脂酶。采用酶的生色團(tuán)底物，利用比色方法就可以完成檢測。檢測還可以通過將酶與底物反應(yīng)的程度與類似制備的標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行肉眼比較來實現(xiàn)。
檢測可用其他各種免疫試驗實現(xiàn)。例如，通過放射活性標(biāo)記抗體或抗體片段，就可以通過采用放射免疫分析(RIA)來檢測R-PTP酶。關(guān)于RIA的清楚描述可在《分子生物學(xué)試驗技術(shù)和生物化學(xué)》＂Laboratory Techniques and Biochemistryin Molecular Biology＂，Work，T.S.等，North Holland Publishing Company，NY(1978)中找到，尤其參見Chard，T.所寫的標(biāo)題為“An Introduction to Radioimmune Assayand Related Techniques(放射免疫分析和相關(guān)技術(shù)的介紹)”的章節(jié)，該文獻(xiàn)納入本文作參考。放射性同位素可用γ計數(shù)器或閃爍計數(shù)器等設(shè)備或通過放射性自顯影來進(jìn)行檢測。
還可以用熒光化合物來標(biāo)記本發(fā)明的抗體。當(dāng)熒光標(biāo)記的抗體暴露于適當(dāng)波長的光下時，就能因熒光而檢測出它的存在。最常用的熒光標(biāo)記化合物有異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白(pycocyanin)、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛和熒光胺。
抗體還可用發(fā)出熒光的金屬(如152E或其他鑭系金屬)進(jìn)行可檢測地標(biāo)記。這些金屬可通過這些金屬的螯合基團(tuán)(如二乙三胺五乙酸(ETPA))與抗體連接。
還可通過將抗體偶聯(lián)化學(xué)發(fā)光化合物，對抗體進(jìn)行可檢測標(biāo)記。然后，檢測在化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生的發(fā)光存在來檢測帶有化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的抗體的存在。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的例子是魯米諾、異魯米諾(isoluminol)、熱(theromatic)吖啶 酯、咪唑、吖啶 鹽和草酸酯。
同樣，還可以用生物發(fā)光化合物來標(biāo)記本發(fā)明的抗體。生物發(fā)光是在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一類化學(xué)發(fā)光物，其中催化性蛋白提高了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。生物發(fā)光蛋白的存在可通過檢測發(fā)光的存在來確定。用于標(biāo)記目的的重要的生物發(fā)光化合物是螢光素、螢光素酶和水母發(fā)光蛋白。
本發(fā)明的抗體分子可適應(yīng)用于免疫計量試驗，也稱為“雙位點”或“夾心”試驗。在典型的免疫計量試驗中，將一定量的未標(biāo)記抗體(或抗體片段)結(jié)合于固相支持物或載體上，加入一定量的帶可檢測標(biāo)記的可溶抗體，從而可以檢測和/或定量分析在固相抗體、抗原和標(biāo)記抗體之間形成的三元復(fù)合物。
典型的且較佳的免疫計量試驗包括“正向”試驗，在該試驗中與固相結(jié)合的抗體先與待測試樣品接觸，通過形成二元固相抗體-抗原復(fù)合物，將抗原從樣品中抽提出。在培育合適的時間后，洗滌固相支持物或載體以去除液體樣品殘余物(包括未反應(yīng)的抗原，如果有的話)，然后再與含有未知量的標(biāo)記抗體(其功能為“報道分子”)的溶液接觸。在第二次培育使標(biāo)記抗體通過未標(biāo)記抗體與結(jié)合于固相支持物或載體上的抗原復(fù)合后，第二次洗滌固相支持物或載體，除去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體。
在另一種“夾心”試驗(該試驗也可與本發(fā)明的抗原一起使用)中，使用所謂的“同時”和“反向”測定。“同時”測定涉及一次培育步驟，因為和固相支持物或載體結(jié)合的抗體和標(biāo)記抗體被同時加入到測試樣品中。在培育結(jié)束后，洗滌固體支持物或載體以除去液體樣品殘余物和未復(fù)合的標(biāo)記抗體。然后象常規(guī)的“正向”夾心測定那樣，測定與固相支持物或載體結(jié)合的標(biāo)記抗體的存在。
在“反向”測定中，分步先將標(biāo)記抗體溶液加至液體樣品中，然后在培育適當(dāng)時間后，再加入結(jié)合于固相支持物或載體上的未標(biāo)記抗體。在第二次培育后，以常規(guī)方式洗滌固相載體，使其不含被測試樣品的殘余物和未反應(yīng)的標(biāo)記抗體溶液。然后再象“同時”或“正向”測定那樣，測定與固相支持物或載體結(jié)合的標(biāo)記抗體的存在。
如上所述，本發(fā)明還涉及含有重組動物病毒載體的藥物組合物，該載體編碼B1蛋白，還編碼能結(jié)合特定靶細(xì)胞(如癌細(xì)胞)表面蛋白的病毒表面蛋白，從而能引導(dǎo)B1蛋白序列插入到該細(xì)胞中。本發(fā)明的其它藥物組合物含有下列物質(zhì)作為活性成分(a)編碼B1蛋白序列的反義序列的寡核苷酸序列；或(b)阻斷B1與其它蛋白相互作用的藥物。
本發(fā)明的藥物組合物含有足量的活性成分以達(dá)到其所需目的。此外，藥物組合物還含有合適的藥學(xué)上可接受的載體，包括賦形劑和輔助劑，它們可協(xié)助將活性化合物加工成可作為藥物使用的制劑，并且它們可使這些制劑更穩(wěn)定，以便給予需要的對象，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
懷疑B1蛋白及其同工型或同種型在不同組織中表達(dá)的水平明顯不同，其同種型的方式也明顯不同，這與上文列出的共同擁有的待批專利申請中所述的參與胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通道的其它各種蛋白的表達(dá)方式類似。這些差別可能導(dǎo)致了其對Fas/APO1-配體和TNF應(yīng)答反應(yīng)的組織特異性。至于其它CED3/ICE同系物(Wang等，1994；Alnermri等，1995)，本發(fā)明者早先就在上述專利申請中表明，發(fā)現(xiàn)含有不完全CED3/ICE區(qū)域的MACH同種型(例如MACHα3)對共同表達(dá)的MACHα1或MACHα2分子的活性有抑制作用；還發(fā)現(xiàn)它們阻斷了Fas/APO1和p55-R(p55-TNF-R)的死亡誘導(dǎo)作用。這些抑制性同種型在細(xì)胞中的表達(dá)可能構(gòu)成了細(xì)胞自我保護(hù)抵抗Fas/APO1和TNF介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的機制。MACH同種型具有廣泛的異質(zhì)性，該異質(zhì)性大大超出了CED3/ICE家族其它蛋白酶所見的異質(zhì)性，應(yīng)能特別精細(xì)地調(diào)節(jié)活性MACH同種型的功能。還知道BCL2、BCL-XL和BCL2家族的其它成員在不同細(xì)胞類型中表達(dá)和活潑的程度不同，從而使不同細(xì)胞對誘導(dǎo)的凋亡作用的易感性有差所不同，即一些細(xì)胞比其它細(xì)胞更可能存活(見Yang和Korsmeyer，1996年的綜述)。
如上所述，B1蛋白或其可能的同種型在不同組織中可能有不同的作用。例如，這些不同的作用可能表現(xiàn)在其與發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活過程中的其它蛋白的相互作用，以及它們對這些通道活性的影響，尤其是它們之間的平衡以及該平衡是否會向一個或另一方向移動。
一些可能的B1蛋白同種型還有可能起其它作用。例如，B1、其類似物、同種型可能也作為參與和上述細(xì)胞死亡或存活通道無關(guān)的其它胞內(nèi)通道的分子的?？课稽c。
由于Fas/APO1和TNF受體能獨特地引起細(xì)胞死亡，以及TNF受體能引發(fā)其它各種組織破壞性活性，因此這些受體的功能畸變對生物體特別有害。實際上，這些受體的功能過度和不足均已表明會導(dǎo)致各種疾病的病理表現(xiàn)(Vassalli，1992；Nagata和Golstein，1995)。鑒定參與受體信號傳導(dǎo)活性的分子，以及尋找方法來調(diào)節(jié)這些分子的活性，這些都能引出新的治療方法。由于懷疑TRAF蛋白有重要作用，因此懷疑可能直接或間接與TRAF蛋白相互作用的B1蛋白有重要作用，或懷疑B1和各種蛋白酶類之間有相互作用，所以，設(shè)計出能影響或調(diào)節(jié)B1和B1相互作用于的其它這些蛋白之間的相互作用、從而按需增強或抑制細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活的藥物似乎尤其重要。
本發(fā)明還涉及可能結(jié)合本發(fā)明B1蛋白從而調(diào)節(jié)/介導(dǎo)B1蛋白活性的蛋白或其它配體。這些蛋白或配體可用上述任何方法來篩選、分離和產(chǎn)生。例如，可以分離出許多新的配體，包括能與本發(fā)明B1蛋白結(jié)合蛋白。
如上所述，這些新的B1結(jié)合蛋白/配體可能作為(例如)B1介導(dǎo)活性的抑制劑或增強劑起作用，因此它們會在上述各種病理和其它場合中起重要作用。這些B1結(jié)合蛋白/配體的另一個功能是用作純化B1蛋白的特異性試劑，例如在親和層析中，這些新的結(jié)合蛋白/配體與合適的層析基質(zhì)連接形成固體或親和性支持物/基質(zhì)，含有B1蛋白的溶液、抽提物等通過該基質(zhì)，從而實現(xiàn)蛋白純化。這種親和層析方法現(xiàn)在是本領(lǐng)域中熟知的且通常是標(biāo)準(zhǔn)程序。
同樣，所有上述的本發(fā)明的B1蛋白、其類似物、片段、同種型和衍生物均可用來親和純化它們所結(jié)合的發(fā)炎、細(xì)胞死亡或存活通道的各種蛋白。例如，B1蛋白及其類似物、片段和突變蛋白可用來親和層析純化B1結(jié)合蛋白。鑒別和產(chǎn)生這些B1結(jié)合蛋白的這種方法將包括一個篩選步驟，其中將B1蛋白或至少其特異性部分用作底物或“誘餌”來獲得能與之結(jié)合的蛋白或其它任何配體；然后是鑒別和特性分析這些所獲得的這些蛋白/配體的步驟；隨后以基本上分離和純化的形式產(chǎn)生這些蛋白/配體。所有這些步驟均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并在上文和下文中有詳細(xì)描述。
現(xiàn)在本發(fā)明將在下列非限制性實施例及其附圖中作更詳細(xì)地描述。
還應(yīng)注意，下列步驟在本發(fā)明者以前關(guān)于其它胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白和通道的出版物中已有詳細(xì)描述i)雙雜交篩選和雙雜交半乳糖苷酶表達(dá)測試；ii)蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)、代謝性標(biāo)記和免疫沉淀；iii)體外結(jié)合；iv)細(xì)胞毒性的測定；v)Northern分析和序列分析，還有下列實施例中采用的其它程序。這些程序在共同擁有的待批以色列申請No.114615，114986，115319，116588，117932和120367以及相應(yīng)的PCT申請No.PCT/US96/10521中有詳細(xì)描述。因此，所有這些出版物和專利申請的全部公開內(nèi)容均全部被納入本文作參考，至少涉及其詳細(xì)的試驗步驟。關(guān)于NIK蛋白及其在激活NF-κB中的作用，以及細(xì)胞存活和TRAF2在該細(xì)胞存活通道中所起的作用，例如TRAF2和p55-R、FAS-R、RIP和其它蛋白之間的相互作用，本發(fā)明者在上述共同擁有的待批IL和PCT申請以及Malinin等人，1997年中均已詳細(xì)描述。
實施例1新的B1蛋白的分離、測序和部分特性分析利用上述共同擁有的專利申請中描述的各種方法，已經(jīng)分離出一種新的克隆的DNA，并進(jìn)行了測序和部分特性分析。該DNA序列編碼了一種新的蛋白，該蛋白原先由于與c-IAP蛋白同源且具有激酶結(jié)構(gòu)域而被稱為c-IAP結(jié)合激酶(CBK)，但是現(xiàn)在命名為B1。
簡言之，為了進(jìn)一步闡述最近發(fā)現(xiàn)的凋亡同系物c-IAP1和c-IAP2的細(xì)胞抑制劑(見Rothe等人，1995；Uren等人，1996；Hofmann等人，1997)的胞內(nèi)活性以及它們和哪些胞內(nèi)蛋白相互作用，用c-IAP序列來篩選各種數(shù)據(jù)庫(包括具有未鑒定(且未完全測序)的表達(dá)序列標(biāo)記(est)的數(shù)據(jù)庫)中其它可能的同源的或相關(guān)的序列。這樣，就發(fā)現(xiàn)一種新的克隆的部分序列與c-IAP1高度同源。采用這種以前沒有作過任何特性分析的部分序列，制備PCR引物，用商業(yè)上獲得的cDNA文庫作為模板DNA來PCR克隆該新克隆的全長DNA序列。
結(jié)果，獲得一個新的全長DNA克隆，該克隆編碼了以前未知的蛋白，即命名為B1的新蛋白。首先確定了B1的序列(DNA和氨基酸)。對最初的B1序列作進(jìn)一步分析和測定，結(jié)果揭示氨基酸序列N端部分(核苷酸序列的5′末端)有一些差異，其涉及前19個推定的氨基酸殘基。進(jìn)一步測序確定和分析產(chǎn)生了分別如圖3A和B所示的推定的B1氨基酸序列及其核苷酸編碼序列。
在分析了圖3的氨基酸序列后，發(fā)現(xiàn)蛋白的N末端有一個激酶基序，該基序由圖3的核苷酸序列開放讀框(ORF)前面約1000個核苷酸編碼。另外，在朝向氨基酸序列C端有一個前結(jié)構(gòu)域(CARD)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是參與凋亡信號傳導(dǎo)通道的許多胞內(nèi)蛋白(如c-IAP1，RAIDD(見Duan和Dixit，1997)、以及其它蛋白酶類如ICE和ICH-1)都具有的。在圖3A所示的B1的氨基酸序列中，顯示出了N端激酶結(jié)構(gòu)域(有方框的區(qū)域)以及C端CARD(下劃線表示的區(qū)域)。在這兩個結(jié)構(gòu)域之間是B1蛋白的中間結(jié)構(gòu)域。
B1的上述激酶結(jié)構(gòu)域與已知的RAF類激酶和RIP激酶結(jié)構(gòu)域有高度同源性(或相似性)。
B1的上述前結(jié)構(gòu)域最近也被命名為CARD(蛋白酶類募集結(jié)構(gòu)域＂caspaserecruitment domain＂)(見Hofmann等人，1997)，它看來是細(xì)胞內(nèi)凋亡信號傳導(dǎo)過程中各種蛋白所相互作用的區(qū)域。例如，沒有前結(jié)構(gòu)域(或CARD)的p55 TNF-R通過它與TRADD兩種蛋白都具有的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain)與另一個胞內(nèi)蛋白TRADD(一種銜接蛋白)相互作用。進(jìn)而，TRADD能與RIP和RAIDD(另一些此類銜接蛋白，另見Hofmann等人，1997；Duan和Dixit，1997；Wallach，1997)相互作用，所有這些蛋白均具有死亡結(jié)構(gòu)域，因此，p55-TNF-R能通過死亡結(jié)構(gòu)域與RAIDD直接或間接復(fù)合。RAIDD具有能與一種或多種蛋白酶類(如ICH-1(蛋白酶類-2))相互作用或結(jié)合的前結(jié)構(gòu)域(或CARD)(可能還有其它蛋白)，因而能將p55-TNF-R與這些蛋白酶類連接，并通過蛋白酶類的作用引起凋亡。同樣，p75-TNF-R能通過共有基序與TRAF2和TRAF1蛋白相互作用，而TRAF蛋白能與c-IAP1和c-IAP2相互作用。按類似的方式(另見Malinin等人，1997，WO97/37016)，利用FAS-R(Fas/APO1)能與MORT1(FADD)相互作用、進(jìn)而與TRADD相互作用(均通過它們共有的死亡結(jié)構(gòu)域)的能力，因此，TRADD與TRAF2、MORT1相互作用的能力能與c-IAP1、c-IAP2(通過TRAF2)相聯(lián)，從而與ICE、Mch6和其它蛋白酶類關(guān)聯(lián)，或與ICH-1、FLICE、MACH或其它蛋白酶類(通過上述TRADD-RIP-RAIDD相互作用)連接。還應(yīng)注意，p55 TNF-R還能通過上述TRADD-TRAF2-cIAP1、c-IAP2-ICE、Mch6的相互作用與ICE、Mch6和其它這類蛋白酶類連接，這利用的是p55 TNF-R與TRADD相互作用的能力。
另外，已經(jīng)知道，TRAF2還通過誘導(dǎo)NF-κB激活參與促進(jìn)細(xì)胞存活的一個或多個胞內(nèi)通道。在這些通道中，NIK似乎直接參與I-κB的磷酸化，導(dǎo)致I-κB與NF-κB解離，從而激活NF-κB，然后NF-κB能進(jìn)入細(xì)胞核并啟動各種基因的轉(zhuǎn)錄(這些基因的表達(dá)與細(xì)胞存活相聯(lián))(另見上文“背景技術(shù)”部分)。
因此，TRAF2參與了細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活通道，并且取決于在應(yīng)答各種外部刺激(例如結(jié)合各種受體的配體)期間與TRAF2起主要相互作用的是何種蛋白，細(xì)胞可能經(jīng)歷細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活誘導(dǎo)。顯然，在各種胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白之間有精妙的平衡，該平衡能向相反的細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道移動，而TRAF2似乎是維持這一平衡并負(fù)責(zé)該平衡向一個方向或另一個方向移動的一種關(guān)鍵蛋白。
在圖1中示出了TRAF2蛋白及其各個結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，在圖2中示出了一些各種細(xì)胞受體和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白之間可能的相互作用以及它們參與的細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活(NF-κB激活)通道。
因此，本發(fā)明的新的B1蛋白很有可能在發(fā)炎、細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活通道中起重要的調(diào)節(jié)作用。B1具有的前結(jié)構(gòu)域(或CARD結(jié)構(gòu)域)可能甚至能與c-IAP1、c-IAP2、RAIDD以及各種蛋白酶類(ICE、ICH-1等)的前結(jié)構(gòu)域間接地相互作用，因此它甚至可能與TRAF2以及與TRAF2直接或間接相互作用的各種蛋白(包括RIP、TRADD、p75 TNF-R、p55 TNF-R、MORT-1和FAS-R)間接地相互作用。B1還具有激酶結(jié)構(gòu)域，因此它可能直接或間接參與了MAP激酶通道(NIK似乎是該通道的一員)，從而還可能參與NF-κB激活通道。
另外，B1憑借其與c-IAP1的同源性還可能通過調(diào)節(jié)c-IAP1的生物活性或調(diào)節(jié)c-IAP1與其它蛋白的結(jié)合可能是c-IAP1(和c-IAP2)活性的調(diào)節(jié)劑。在這方面(另見下文實施例2)，B1通過間接地與c-IAP蛋白(c-IAP1，c-IAP2)相互作用、破壞或減少c-IAP1蛋白募集蛋白酶類的能力和限制其蛋白水解活性，結(jié)果是更多蛋白酶類能自由地進(jìn)行蛋白水解作用，B1也可能起增強凋亡作用。
另一個可能性是，B1通過其上述能力與細(xì)胞死亡的各種中介體(包括TRAF-1和TRAF2、RAIDD、RIP、TRADD、p55-TNF-R、p75-TNF-R、MORT-1和FAS-R)直接或間接相互作用；并和各種蛋白酶類相互作用，可能起關(guān)聯(lián)這些蛋白和蛋白酶類的作用，從而可能起這些蛋白所屬細(xì)胞死亡通道的中間因子作用。因此，B1可能是凋亡的重要中介體。
還有一個可能是，通過如上所述的B1可能與c-IAP蛋白的相互作用(即使是間接的)，B1可能阻止c-IAP與TRAF2結(jié)合或相互作用，從而可能阻斷TRAF2對于MAP激酶通道的活性，例如，TRAF2-c-IAP相互作用可能對TRAF2與NIK的相互作用很重要，如果該作用被B1與c-IAP的相互作用所抑制，那么TRAF2介導(dǎo)的NF-κB激活作用就可能被阻斷，從而導(dǎo)致細(xì)胞存活作用增強減小，而細(xì)胞死亡作用則可能增加。
還有一個可能是，B1可能以更直接的方式調(diào)節(jié)各種蛋白酶類的活性。因此，通過B1和各種蛋白酶類的前結(jié)構(gòu)域之間的直接或間接相互作用，B1可能會導(dǎo)致這些酶活性增加，從而增加了這些酶的細(xì)胞毒性。這樣，B1就可能通過募集或激活蛋白酶類來直接增強凋亡作用(另見下文實施例2)。
另一個可能是，B1的作用可能是通過與其它未知的蛋白結(jié)合或相互作用來調(diào)節(jié)介導(dǎo)細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通道。
感興趣的是，注意到(見上文)B1具有類似于RIP激酶的激酶結(jié)構(gòu)域。RIP也是涉及細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活通道之間平衡的一個關(guān)鍵蛋白，其利用的是其連接細(xì)胞死亡中介體(如p55 TNF-R、FAS-R、MORT-1、TRADD)和TRAF2，從而激活NF-κB和細(xì)胞存活的能力(見圖2)。RIP激酶活性可能也是該精確平衡中的一個因素，這取決于該激酶結(jié)合何種底物，例如，何種蛋白被RIP磷酸化，并且這種磷酸化是否影響它們對增加凋亡活性、減少凋亡活性、增加NF-κB激活或減少NF-κB激活的活性。類似地，B1還可能在其激酶活性可能是很重要(這取決于該激酶活性的底物是何種蛋白)的過程中起關(guān)鍵作用。
實施例2B1蛋白的生物活性分析(i)初步的結(jié)合試驗以確定哪些已知的蛋白能結(jié)合B1用WO 97/37016中制備并表達(dá)DNA構(gòu)建物的方法以及酵母雙雜交結(jié)合試驗，用B1的構(gòu)建物來測試它結(jié)合參與胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通道(細(xì)胞死亡和存活通道)的各種已知蛋白的能力，該B1的激酶結(jié)構(gòu)域已被除去，即是僅具有中間區(qū)域和C-端CARD區(qū)域的截短的B1。最初的初步結(jié)果(未顯示)看來表明，該截短的B1與BCL2結(jié)合。
(ii)細(xì)胞毒性分析來確定B1對細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活的效應(yīng)采用WO97/37016中制備DNA構(gòu)建物的方法、用構(gòu)建物轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法、和測定這些構(gòu)建物的表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活的影響的方法，用編碼全長B1蛋白的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物中的細(xì)胞。另外，在另一組試驗中，用編碼B1的構(gòu)建物和編碼FAS-R、p55 TNF-R和RIP的其它構(gòu)建物共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
這些轉(zhuǎn)染的結(jié)果(未示出)表明，表達(dá)的B1蛋白本身不會引起細(xì)胞死亡。然而，當(dāng)B1和FAS-R、p55 TNF-R或RIP一起表達(dá)時，它增強了這些已知的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡水平。
將這些結(jié)果與上文(i)的結(jié)果(B1可能結(jié)合BCL2)結(jié)合在一起，提出了這樣的可能性，即B1可能作為BCL2活性的抑制劑起作用，即B1可能抑制BCL2保護(hù)細(xì)胞抵抗凋亡的活性(見上文“背景”部分)，因此，B1顯然能增強FAS-R、p55TNF-R和RIP、以及細(xì)胞死亡的其它可能的誘導(dǎo)物(如上文“背景”部分所描述的)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡通道。在這一方面，B1可能按類似于BAD蛋白的方式作用，BDA蛋白是BCL2家族的一個成員，它與BCL2和BCL-XL結(jié)合，從而導(dǎo)致已知直接參與導(dǎo)致細(xì)胞死亡的BAX和BAK的水平增加。另一種可能是，B1可能利用其激酶結(jié)構(gòu)域在BCL2的磷酸化位點上使BCL2磷酸化，這樣它就可能影響B(tài)CL2保護(hù)細(xì)胞抵抗凋亡的活性，最終導(dǎo)致所見的B1效應(yīng)是增強了誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
另外，除了與BCL2可能有相互作用、影響NF-κB激活的誘導(dǎo)(這通過B1的激酶活性作用于導(dǎo)致NF-κB激活的通道)外，B1還有可能與(例如)NIK或NIK為成員的通道中的其它激酶相互作用，或它可能作用于與其相關(guān)的其它銜接蛋白(例如TRAF2)，從而導(dǎo)致NF-κB激活減少，并最終減少細(xì)胞存活，增加細(xì)胞死亡。
因此，總之，看來B1在胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通道(無論它們是否導(dǎo)致發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活)的調(diào)節(jié)中起作用。因此，B1可被認(rèn)為是“胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑”，因為它顯然具有通過多種方式來影響發(fā)炎、細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活通道的能力，這些方式是直接的(募集各種蛋白并激活或抑制它們或通過激酶活性)或間接的(通過與其它各種中間物相互作用，例如BCL2可能還有c-IAP，從而與TRAF2等相互作用；或與RAIDD相互作用，從而與RIP、TRADD等相互作用)。
實施例3B1生物活性的其它分析NF-κB活性、細(xì)胞死亡試驗、Northern分析和JNK活性試驗用下列B1和B1突變型構(gòu)建物(見圖6)進(jìn)行。
B1(見實施例1)B1 mutB1的突變體，47位的賴氨酸被丙氨酸代替ΔCARD缺少CARD結(jié)構(gòu)域的B1，它通過PCR產(chǎn)生并克隆到表達(dá)載體中ΔXba缺少CARD結(jié)構(gòu)域但其3′端比ΔCARD短的B1，用限制性位點產(chǎn)生并克隆到表達(dá)載體中ΔBam以ΔXba類似，并以類似方式用Bam限制性酶產(chǎn)生，
ΔNde含有激酶結(jié)構(gòu)域的一部分以及CARD結(jié)構(gòu)域，用PCR產(chǎn)生并克隆到表達(dá)載體中，和ΔK，用下列引物通過PCR產(chǎn)生1.5′-CAGA ATTCCA GAGTG TTTCA AGTG CCATTC；2.5′-AACTC GAGA CTTAC ATGCT TTTA TTTT GAA。
將PCR片段克隆到表達(dá)載體中并測序確認(rèn)。
NF-κB激活測定用WO97/37016中描述的報道基因試驗進(jìn)行。簡言之，用HIV LTR-螢光素酶基因質(zhì)粒(1微克)和B1及B1突變體表達(dá)載體(3微克)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。加入“空”的載體使轉(zhuǎn)染的DNA的量保持恒定。轉(zhuǎn)染24小時后，用PBS洗滌細(xì)胞并裂解。如Ausubel等人的Current Protocols in Molecular Biology中描述的那樣進(jìn)行螢光素酶試驗。結(jié)果可以從圖6中看出。
用生長于Dulbecco改進(jìn)的Eagle最小基本培養(yǎng)基(其中添加了10％胎牛血清、非必需氨基酸、100U/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素)中的293-T細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞死亡試驗。用磷酸鈣沉淀方法，用不同構(gòu)建物的cDNA和β-半乳糖苷酶一起瞬時轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞(6厘米平皿中5×105細(xì)胞)。在試驗中，每一平皿用1微克p55 TNF-R、RIP或TRADD構(gòu)建物、1微克各種B1或B1突變體構(gòu)建物(或空載體作為對照)、以及1微克pSV-β-gal(Promega)轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示在下圖6中。在培育期最后，通過測定β-半乳糖苷酶表達(dá)(如Boldin等人，1996所述)來評價細(xì)胞死亡的程度。
Northern分析用常規(guī)方法進(jìn)行，例如參見Boldin等人，1995，結(jié)果表明B1存在于許多人組織中(圖4)。
JNK激活通過用磷酸鈣沉淀方法用1.5微克pSV-HA-JNK1構(gòu)建物(一種HA表位標(biāo)記的JNK-1表達(dá)載體)和4微克各種B1和B1突變體構(gòu)建物表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞(6厘米平皿中5×105細(xì)胞)來進(jìn)行。24小時后，在裂解緩沖液(20mMHepes pH7.6，10mM EGTA，40mM β-甘油磷酸酯，.5mM MgCl2，1mM DTT和1％NP-40)中裂解細(xì)胞，用抗HA抗體免疫沉淀Ha-JNK1蛋白(例如參見Rothe等人，1995b)。(克隆12 CA5)。激酶試驗在30微升激酶緩沖液(20mM Hepes pH7.6，40mMβ-甘油磷酸酯，2.0mM MgCl2，2mM DTT，3nmole ATP和3μCiγ-p32-ATP)中30℃進(jìn)行20分鐘。用細(xì)菌產(chǎn)生的GST-Jun蛋白(約10微克)作為底物。加入2x SDS加樣緩沖液終止反應(yīng)，沸騰3分鐘，用SDS-PAGE凝膠分析。結(jié)果顯示在圖7中。
圖6結(jié)果表明，B1能直接誘導(dǎo)NF-κB激活。然而，發(fā)現(xiàn)B1必然還誘導(dǎo)NF-κB，該激活作用看來不依賴其激酶結(jié)構(gòu)域，據(jù)推測它可能與CARD結(jié)構(gòu)域有關(guān)，有或沒有部分或全部B1中間結(jié)構(gòu)域的貢獻(xiàn)。
另外，細(xì)胞毒性分析還表明，不僅是B1(見實施例2(ii))、而且B1 mut，當(dāng)其和p55-TNF-R、RIP或TRADD一起表達(dá)時，增強了細(xì)胞死亡的水平。ΔCARD、ΔNde和ΔK此作用的程度較低，而其它構(gòu)建物則沒有。這似乎表明，至少是CARD結(jié)構(gòu)域(可能還有中間結(jié)構(gòu)域)參與了細(xì)胞死亡的增強作用。
JNK激活的結(jié)果還似乎表明，至少CARD結(jié)構(gòu)域參與該激活作用，中間結(jié)構(gòu)域也可能一起參與。
除了上述內(nèi)容外，進(jìn)行的試驗已經(jīng)表明B1會自身磷酸化。這是B1確實是激酶的一個證據(jù)。
另外，已經(jīng)確認(rèn)B1與RIP有同源性。計算機分析表明，這兩種蛋白在氨基酸水平上有37％的相同性和47％的同源性?，F(xiàn)已廣泛認(rèn)為RIP主要是NF-κB調(diào)節(jié)劑，上述結(jié)果表明B1的作用類似。
實施例4結(jié)合特性B1及其突變體的結(jié)合特性顯示在下列表VI中表VI
從上表顯示結(jié)果看出，當(dāng)B1的作用是誘導(dǎo)NF-κB激活時，它進(jìn)行這種作用可能不依賴于和已知參與NF-κB激活的其它蛋白(如IRAK、TRAF2、NIK、TRAF6和RIP)的結(jié)合。因此，B1可能通過與形成該激活通道的其它一些蛋白相互作用來直接或間接地誘導(dǎo)NF-κB激活。
就B1所見的增強細(xì)胞死亡的活性而言，從上表還看出，B1進(jìn)行這種作用并非是直接與各種細(xì)胞死亡中介體(例如p55 TNF-R、Fas-R、MORT1、TRADD、RIP、ICE、ICH-1等)相互作用。
因此，B1還可能通過與這些不同的細(xì)胞死亡中介體/調(diào)節(jié)劑間接地相互作用或通過其它蛋白發(fā)揮其增強細(xì)胞死亡的功能。
鑒于B1參與了NF-κB的激活以及增強細(xì)胞死亡，因此，B1可能是參與導(dǎo)致細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活的胞內(nèi)通道之間精確平衡的一種關(guān)鍵蛋白。在這方面，B1可能能使細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活間的平衡移動(這取決于它與何種蛋白相互作用)。
用磷酸鈣程序，用10微克編碼HA-標(biāo)記的B1蛋白(HA-B1)的質(zhì)粒以及10微克編碼Flag標(biāo)記的B1蛋白(FL-B1)的質(zhì)粒、或編碼Flag-標(biāo)記的c-IAP1-蛋白(FL-IAP1)的質(zhì)粒、或編碼Flag標(biāo)記的TRAF1(FL-TRAF1)的質(zhì)粒、或編碼Flag-標(biāo)記的TRAF2(FL-TRAF2)的質(zhì)粒、或和10微克Flag標(biāo)記的TRAF1和未標(biāo)記的TRAF2(FL-TR1+TR2)的組合(1∶1)、或和10微克Flag-標(biāo)記的TRAF1、未標(biāo)記的TRAF2和c-IAP-1(FL-TR1+TR2+IAP1)的組合(1∶1∶1)瞬時轉(zhuǎn)染293人胚胎腎細(xì)胞(5×106；2.5×106/每10厘米平皿)。7小時后，洗滌轉(zhuǎn)染細(xì)胞，18小時后在含50mMHEPES pH7.5，250mM NaCl，0.2％NP-40，5mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氟、2.0微克/毫升抑酶肽和20微克/毫升亮抑酶肽的緩沖液(裂解緩沖液)中裂解細(xì)胞。使1毫升裂解液等份與抗FLAG表位抗體(5微克/等份)與蛋白G-瓊脂糖珠(30微升/等份)一起4℃培育2小時，進(jìn)行免疫沉淀。用裂解緩沖液洗滌免疫沉淀物三次，用PBS洗滌一次，用10％ SDS-PAGE分級，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Schleicher &Schuell，Dassel，Germany)上。用抗HA表位單克隆抗體進(jìn)行Western印跡分析，采用1∶1000的稀釋度和ECL試劑盒(Amersham，Buckinghamshire，England)。
從圖8明顯可以看出，B1能自身締合，并能和TRAF1相互作用。相互作用的水平似乎與自身締合的水平相同。沒有發(fā)現(xiàn)有和TRAF-2或IAP1直接相互作用。
實施例5 B1結(jié)合V-ATP酶的E亞單位用B1的CARD結(jié)構(gòu)域作為誘餌進(jìn)行雙雜交篩選導(dǎo)致克隆出V-ATP酶的E亞單位(Nelson等人，Experientia 52(1996)1101-1110頁)。
將V-ATP酶的E亞單位用熒光標(biāo)記并在有機分子或肽文庫的各種樣品存在下和B1的CARD結(jié)構(gòu)域樣品一起培育。培育后，B1-CARD基序與特異性抗體發(fā)生免疫沉淀，測定與該沉淀相關(guān)的熒光量。進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)了干擾熒光標(biāo)記的E蛋白沉淀的分子，作為潛在的先導(dǎo)化合物和通過ATP酶E亞單位的作用影響細(xì)胞存活或生長和/或發(fā)炎的藥物。
在全部描述了本發(fā)明后，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明的思路和范圍下，無需過多的實驗就可在等同的參數(shù)、濃度和條件的廣泛范圍內(nèi)進(jìn)行同樣的工作。
盡管本發(fā)明已經(jīng)聯(lián)系其具體實例作了描述，但是應(yīng)當(dāng)知道它還能作進(jìn)一步的改進(jìn)。本申請應(yīng)當(dāng)覆蓋大致上根據(jù)本發(fā)明原理、本文公開的內(nèi)容、利用本發(fā)明所屬領(lǐng)域已知或常規(guī)技術(shù)以及如下文所附權(quán)利要求范圍內(nèi)提出的必要特征所作的任何變化、用途或改進(jìn)。
本文中引用的所有文獻(xiàn)，包括期刊雜志或摘要、出版的或?qū)?yīng)的美國或外國專利申請、授權(quán)的美國或外國專利、或任何其它文獻(xiàn)，包括引用文獻(xiàn)中列舉的所有數(shù)據(jù)、圖表和文本，均全部納入本文作參考。另外，本文引用的文獻(xiàn)中所引用的文獻(xiàn)的全部內(nèi)容也全部納入本文作參考。
參考已知的步驟、常規(guī)的步驟、已知的方法或常規(guī)方法并不以任何方式表示承認(rèn)本發(fā)明的各個方面、描述或?qū)嵗言谙嚓P(guān)技術(shù)領(lǐng)域予以公開、指導(dǎo)或提示。
前述具體實例的描述將完全揭示本發(fā)明的總特征，在不脫離本發(fā)明的總思路下，其它人可運用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的知識(包括本文引用的內(nèi)容和參考文獻(xiàn))無需過多實驗就很容易對這些具體的實例作變化和/或改進(jìn)用于各種用途。因此，基于本文的理論和指導(dǎo)，這些變化和改進(jìn)均應(yīng)在本文所公開的實例的等價意義和范圍內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解，本文的措詞或術(shù)語均只是為了便于描述，而非限制性，因此本說明書的措詞或術(shù)語可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文的理論和指導(dǎo)結(jié)合本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識來作解釋。
參考文獻(xiàn)1.Adelman等人，(1983)DNA 2，183.2.Alnemri，E.S.等人(1995)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)270，4312-4317.3.Ausubel，F(xiàn).M.等人編輯，分子生物學(xué)的目前方案(Current Protocols inMolecular Biology.)4.Baeuerle，P.A.，和Henkel，T.(1994)免疫學(xué)年度回顧(Annu Rev Immunol.)5.Bazan，J.F.(1993).現(xiàn)期生物學(xué)(Current Biology)3，603-606.6.Berberich，I.，Shu，G.L.，和Clark，E.A.(1994).，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)153，4357-66.7.Beutler，B.，和van Huffel，C.(1994).科學(xué)(Science) 264，667-8.8.Blank，V.，Kourilsky，P.，和Israel，A.(1992).生物化學(xué)科學(xué)趨勢(TrendsBiochem.Sci)17，135-40.9.Boldin，M.P.等人(1995a)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)270，337-341.10.Boldin，M.P.，Varfolomeev，E.E.，Pancer，Z.，Mett，I.L.，Camonis，J.H.，和Wallach，D.(1995b).生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)270，7795-7798.11.Boldin.M.P.等人(1996)細(xì)胞(Cell)85，803-815.12.Cao，Z.等人(1996a)自然(Nature)383，443-446.13.Cao，Z.等人(1996b)科學(xué)(Science)71.1128-1131.14.Chen，C.J.等人(1992)紐約科學(xué)院年報(Ann.N.Y.Acad.Sci.)660271-273.15.Cheng，G.，Cleary，A.M.，Ye，Z-s.，Hong，D.I.，Lederman，S.和Baltimore，D.(1995)科學(xué)(Science)2671494-1498).16.Cheng，G.和Baltimore，D.(1996)基因發(fā)育(Genes Dev.)10，963-973.17.Chinnaiyan，A.M.，O′Rourke，K.，Tewari，M.，和Dixit，V.M.(1995)細(xì)胞(Cell)81，505-512.18.Chinnaiyan，A.M.等人(1996)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)271，4573-457619.Creighton，T.E.，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子特性(ProteinsStructre and MolecularProperties)，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，Ca.1983.20.Croston，G.E.，Cao，Z.，和Goeddel，D.V.(1995).生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)270.16514-7.21.DiDonato，J.A.，Mercurio，F(xiàn).，和Karin，M.(1995).分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)15，1302-11.22.DuanH.和Dixit，V.M.(1997)自然(Nature)385，86-8923.Durfee，T.等人(1993)基因發(fā)育(Genes Dev.)7555-569.24.Field，J.等人(1988)分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.).82159-2165.25.Geysen，H.M.(1985)今日免疫學(xué)(Immunol.Today)6，364-369.26.Geysen，H.M.等人(1987)免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Meth.)102，259-274.27.Gilmore，T.D.，和Morin.P.J.(1993).遺傳學(xué)趨勢(Trends Genet)9，427-33.28.Gossen，M.和Bujard，M.(1992)美國科學(xué)院院報(PNAS)895547-5551.29.Grell，M.，Duni，E.，Wajant，H.，Lohden，M.，Clauss，M.，Baxeiner，B.，Georgopoulos，S.，Lesslauer，W.，Kollias，G.，Pfizenmaier，K.，和Scheurich，P.(1995).細(xì)胞(Cell)83，793-802.30.Grilli，M.，Chiu，J.J.，和Lenardo，M.J.(1993).Int RevCytol.31.Hanks，S.K.，Quinn，A.M.，和Hunter，T.(1988).科學(xué)(Science)41，42-52.32.Hofmann K.等人，(1997)TIBS 1997年5月22日155-156頁33.Howard，A.D.等人(1991)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)147，2964-2969.34.Hsu，H.，Shu，H.-B.，Pan，M.-G.，和Goeddel，D.V.(1996).細(xì)胞(Cell)84，299-308.35.Hsu，H.，Xiong，J.，和Goeddol，D.V.(1995).細(xì)胞(Cell)81，495-504.36.Kaufmann，S.H.(1989)癌癥研究(Cancer Res.)49，5870-5878.37.Kaufmann，S.H.(1993)癌癥研究(Cancer Res.)53，3976-3985.38.Lalmanach-Girard，A.C.，Chiles，T.C.，Parker，D.C.，和Rothstein，T.L.(1993).實驗醫(yī)學(xué)雜志(J Exp Med)177，1215-1219.39.Lazednik Y.A.等人(1994)自然(Nature)371，346-347.40.Malinin，N.L.等人，(1997)自然(Nature)385，540-54441.Mashima，T.等人(1995)生物化學(xué)生物生理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)209，907-915.42.McDonald，P.P.，Cassatella，M.A.，Bald，A.，Maggi，E.，Romagnani，S.，Gruss，H.J.，和Pizzolo，G.(1995).歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)25，2870-6.43.Messing等人，第三次關(guān)于大分子和重組DNA的Cleveland會議論文集(ThirdCleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA)，Ed A.Walton，Elsevier，Amsterdam(1981).44.Milligan，C.E.等人(1995)神經(jīng)元(Neuron)15，385-393.45.Mosialos，G.，Birkenbach，M.，Yalamanchili，R.，VanArsdale，T.，Ware，C.，和Kieff，E.(1995).細(xì)胞(Cell)80，389-399.46.Muranishi，S.等人，(1991)藥物研究(Pharm.Research)8，649.47.Nagata，S.和Golstein，P.(1995)科學(xué)(Science)267，1449-1456.48.Rensing-Ehl，A.，Hess，S.，Ziegler-Heitbrock，H.W.L.，Riethmuller，G.，和Engelmann，H.(1995).J.Inlamm.45，161-174.49.Rothe，M.，Pan，M.-G.，Henzel，W.J.，Ayres，T.M.，和Goeddel，D.V.(1995b).細(xì)胞(Cell)83，1243-1252.50.Rothe，M.，Sarma，V.，Dixit，V.M.，和Goeddel，D.V.(1995a).科學(xué)(Science)269，1424-1427.51.Rothe，M.，Wong，S.C.，Henzel，W.J.，和Goeddel，D.V.(1994).細(xì)胞(Cell)78，681-692.52.Rothe，M.等人(1996)美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)93，8241-8246.53.Ruzicka等人，(1993)科學(xué)(Science)260，487.54.Sambrook等人(1989)分子克隆實驗室手冊(Molecular cloninga laboratorymanual)，Cold Spring.Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.55.Sano等人，(1992)科學(xué)(Science)258，120.56.Sano等人，(1991)生物技術(shù)(Biotechniques)9，1378.57.Schreiber，E.，Matthias，P.，Muller，M.M.和Schaffner，W.(1989)，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)176419.58.Schulz等人，G.E.，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)原理(Principles of Protein Structure)，Springer-Verlag，New York，N.Y.1798.59.Sleath，P.R.等人(1990)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.).265，14526-14528.60.Smith，C.A.，F(xiàn)arrah，T.，和Goodwin，R.G.(1994).細(xì)胞(Cell)76，959-962.61.Stanger，B.Z.等人(1995)細(xì)胞(Cell)81，513-523.62.Thornberry，N.A.等人(1992)自然(Nature)356，768-774.63.Thornberry，N.A.等人(1994)生物化學(xué)(Biochemistry)33，3934-3940.64.Uren，A.G.等人(1996)美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)93，4974-497865.Vandenabeele，P.，Declercq，W.，Beyaert，R.，和Fiers，W.(1995).細(xì)胞生物學(xué)趨勢(Trends Cell Biol.)5，392-400.66.Varfolomeev，E.E.，Boldin，M.P.，Goncharov，T.M.，和Wallach，D.(1996).，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)出版中67.Vassalli，P.(1992)免疫學(xué)年度回顧(Ann.Rev.Immunol.)10，411-452.68.Veira等人，(1987)酶學(xué)方法(Meth.Enzymol.)153，3.69.Wallach，D.(1996)歐洲細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)(Eur.Cytokine Net.)7，713-724.70.Wallach，D.(1997)生物化學(xué)科學(xué)趨勢(Trends Biochem.Sci.)22，107-10971.Wang，L.等人(1994)細(xì)胞(Cell)78，739-750.72.Wilks，A.F.等人(1989)美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，)861603-1607.73.Yang，E.和Korsmeyer，J.(1996)血液(Blood)88(2)，386-40174.Zaccharic，S.等人(1991)歐洲藥理學(xué)雜志(Eur.J.Pharmacol.)203，353-357.75.Zhao，J.J.和Pick，L.(1993)自然(Nature)365448-451.
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名依達(dá)研究發(fā)展有限公司(B)街道WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE，P.O.B.95(C)城市REHOVOT(E)國家ISRAEL(F)郵政編碼(郵編)76100(G)電話972-8-9344093(H)電傳972-8-9470739(A)姓名WALLACH，DAVID(B)街道24 BOROCHOV STREET(C)城市REHOVOT(E)國家ISRAEL(F)郵政編碼(郵編)76406(A)姓名BOLDIN，MARK(B)街道BEIT CLORE，WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE(C)城市REHOVOT(E)國家ISRAEL(F)郵政編碼(郵編)76100(A)姓名MALININ，NIKOLAI(B)街道BEIT CLORE，WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE(C)城市REHOVOT(E)國家ISRAEL(F)郵政編碼(郵編)76100(ii)發(fā)明名稱胞內(nèi)發(fā)炎、細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活通道的調(diào)節(jié)劑(iii)序列數(shù)目2(iv)計算機可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朓L121011(B)申請日1997年6月5日(vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朓L121199(B)申請日1997年6月30日(vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朓L121746
(B)申請日1997年9月11日(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度540氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO1Met Asn Gly Glu Ala Ile Cys Ser Ala Leu Pro Thr Ile Pro Tyr His1 510 15Lys Leu Ala Asp Leu Arg Tyr Leu Ser Arg Gly Ala Ser Gly Thr Val20 25 30Ser Ser Ala Arg His Ala Asp Trp Arg Val Gln Val Ala Val Lys His35 40 45Leu His Ile His Thr Pro Leu Leu Asp Ser Glu Arg Lys Asp Val Leu50 55 60Arg Glu Ala Glu Ile Leu His Lys Ala Arg Phe Ser Tyr Ile Phe Pro65 70 75 80Ile Leu Gly Ile Cys Asn Glu Pro Glu Phe Leu Gly Ile Val Thr Glu85 90 95Tyr Met Pro Asn Gly Ser Leu Asn Glu Leu Leu His Arg Lys Thr Glu100 105 110Tyr Pro Asp Val Ala Trp Pro Leu Arg Phe Arg Ile Leu His Glu Ile115 120 125Ala Leu Gly Val Asn Tyr Leu His Asn Met Thr Pro Pro Leu Leu His130 135 140His Asp Leu Lys Thr Gln Asn Ile Leu Leu Asp Asn Glu Phe His Val145 150 155 160Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Trp Arg Met Met Ser Leu Ser165 170 175Gln Ser Arg Ser Ser Lys Ser Ala Pro Glu Gly Gly Thr Ile Ile Tyr180 185 190Met Pro Pro Glu Asn Tyr Glu Pro Gly Gln Lys Ser Arg Ala Ser Ile
195 200 205Lys His Asp Ile Tyr Ser Tyr Ala Val Ile Thr Trp Glu Val Leu Ser210 215 220Arg Lys Gln Pro Phe Glu Asp Val Thr Asn Pro Leu Gln Ile Met Tyr225 230 235 240Ser Val Ser Gln Gly His Arg Pro Val Ile Asn Glu Glu Ser Leu Pro245 250 255Tyr Asp Ile Pro His Arg Ala Arg Met Ile Ser Leu Ile Glu Ser Gly260 265 270Trp Ala Gln Asn Pro Asp Glu Arg Pro Ser Phe Leu Lys Cys Leu Ile275 280 285Glu Leu Glu Pro Val Leu Arg Thr Phe Glu Glu Ile Thr Phe Leu Glu290 295 300Ala Val Ile Gln Leu Lys Lys Thr Lys Leu Gln Ser Val Ser Ser Ala305 310 315 320Ile His Leu Cys Asp Lys Lys Lys Met Glu Leu Ser Leu Asn Ile Pro325 330 335Val Asn His Gly Pro Gln Glu Glu Ser Cys Gly Ser Ser Gln Leu His340 345 350Glu Asn Ser Gly Ser Pro Glu Thr Ser Arg Ser Leu Pro Ala Pro Gln355 360 365Asp Asn Asp Phe Leu Ser Arg Lys Ala Gln Asp Cys Tyr Phe Met Lys370 375 380Leu His His Cys Pro Gly Asn His Ser Trp Asp Ser Thr Ile Ser Gly385 390 395 400Ser Gln Arg Ala Ala Phe Cys Asp His Lys Thr Thr Pro Cys Ser Ser405 410 415Ala Ile Ile Asn Pro Leu Ser Thr Ala Gly Asn Ser Glu Arg Leu Gln420 425 430Pro Gly Ile Ala Gln Gln Trp Ile Gln Ser Lys Arg Glu Asp Ile Val435 440 445Asn Gln Met Thr Glu Ala Cys Leu Asn Gln Ser Leu Asp Ala Leu Leu450 455 460Ser Arg Asp Leu Ile Met Lys Glu Asp Tyr Glu Leu Val Ser Thr Lys465 470 475 480Pro Thr Arg Thr Ser Lys Val Arg Gln Leu Leu Asp Thr Thr Asp Ile485 490 495Gln Gly Glu Glu Phe Ala Lys Val Ile Val Gln Lys Leu Lys Asp Asn500 505 510Lys Gln Met Gly Leu Gln Pro Tyr Pro Glu Ile Leu Val Val Ser Arg515 520 525Ser Pro Ser Leu Asn Leu Leu Gln Asn Lys Ser Met530 535 540(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度2098堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO2GGCCATTATG GATGGATGGG CGGCGCTACG GCGTTGGCAC CAGTCTCTAG AAAAGAAGTC 60AGCTCTGGTT CGGAGAAGCA GCGGCTGGCG TGGGCCATCC GGGGAATGGG CGCCCTCGTG 120ACCTAGTGTT GCGGGGCAAA AAGGGTCTTG CCGGCCTCGC TCGTGCAGGG GCGTATCTGG 180GCGCCTGAGC GCGGCGTGGG AGCCTTGGGA GCCGCCGCAG CAGGGGGCAC ACCCGGAACC 240GGCCTGAGCG CCCGGGACCA TGAACGGGGA GGCCATCTGC AGCGCCCTGC CCACCATTCC 300CTACCACAAA CTCGCCGACC TGCGCTACCT GAGCCGCGGC GCCTCTGGCA CTGTGTCGTC 360CGCCCGCCAC GCAGACTGGC GCGTCCAGGT GGCCGTGAAG CACCTGCACA TCCACACTCC 420GCTGCTCGAC AGTGAAAGAA AGGATGTTTT AAGAGAAGCT GAAATTTTAC ACAAAGCTAG 480ATTTAGTTAC ATTTTTCCAA TTTTGGGAAT TTGCAATGAG CCTGAATTTT TGGGAATAGT 540TACTGAATAC ATGCCAAATG GATCATTAAA TGAACTCCTA CATAGGAAAA CTGAATATCC 600TGATGTTGCT TGGCCATTGA GATTTCGCAT CCTGCATGAA ATTGCCCTTG GTGTAAATTA 660CCTGCACAAT ATGACTCCTC CTTTACTTCA TCATGACTTG AAGACTCAGA ATATCTTATT 720GGACAATGAA TTTCATGTTA AGATTGCAGA TTTTGGTTTA TCAAAGTGGC GCATGATGTC 780CCTCTCACAG TCACGAAGTA GCAAATCTGC ACCAGAAGGA GGGACAATTA TTTATATGCC 840ACCTGAAAAC TATGAACCTG GACAAAAATC AAGGGCCAGT ATCAAGCACG ATATATATAG 900CTATGCAGTT ATCACATGGG AAGTGTTATC CAGAAAACAG CCTTTTGAAG ATGTCACCAA 960TCCTTTGCAG ATAATGTATA GTGTGTCACA AGGACATCGA CCTGTTATTA ATGAAGAAAG1020TTTGCCATAT GATATACCTC ACCGAGCACG TATGATCTCT CTAATAGAAA GTGGATGGGC1080ACAAAATCCA GATGAAAGAC CATCTTTCTT AAAATGTTTA ATAGAACTTG AACCAGTTTT1140GAGAACATTT GAAGAGATAA CTTTTCTTGA AGCTGTTATT CAGCTAAAGA AAACAAAGTT1200ACAGAGTGTT TCAAGTGCCA TTCACCTATG TGACAAGAAG AAAATGGAAT TATCTCTGAA1260CATACCTGTA AATCATGGTC CACAAGAGGA ATCATGTGGA TCCTCTCAGC TCCATGAAAA1320TAGTGGTTCT CCTGAAACTT CAAGGTCCCT GCCAGCTCCT CAAGACAATG ATTTTTTATC1380TAGAAAAGCT CAAGACTGTT ATTTTATGAA GCTGCATCAC TGTCCTGGAA ATCACAGTTG1440GGATAGCACC ATTTCTGGAT CTCAAAGGGC TGCATTCTGT GATCACAAGA CCACTCCATG1500CTCTTCAGCA ATAATAAATC CACTCTCAAC TGCAGGAAAC TCAGAACGTC TGCAGCCTGG1560TATAGCCCAG CAGTGGATCC AGAGCAAAAG GGAAGACATT GTGAACCAAA TGACAGAAGC1620CTGCCTTAAC CAGTCGCTAG ATGCCCTTCT GTCCAGGGAC TTGATCATGA AAGAGGACTA1680TGAACTTGTT AGTACCAAGC CTACAAGGAC CTCAAAAGTC AGACAATTAC TAGACACTAC1740TGACATCCAA GGAGAAGAAT TTGCCAAAGT TATAGTACAA AAATTGAAAG ATAACAAACA1800AATGGGTCTT CAGCCTTACC CGGAAATACT TGTGGTTTCT AGATCACCAT CTTTAAATTT1860ACTTCAAAAT AAAAGCATGT AAGTGACTGT TTTTCAAGAA GAAATGTGTT TCATAAAAGG1920ATATTTATAT CTCTGTTGCT TTGACTTTTT TTATATAAAA TCCGTGAGTA TTAAAGCTTW1980AWWRAARGKT CTTTSRKTAA ATATTAGTCT CCCTCCATGA CACTGCAGTA TTTTTTTTAA2040TTAATACAAG TAAAAAGTTG AATTTGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA 2098
權(quán)利要求
1.一種DNA序列，它編碼B1蛋白、其同種型、片段或類似物，所述B1蛋白、其同種型、片段或類似物能與發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道的胞內(nèi)中介體或調(diào)節(jié)劑直接或間接地相互作用，所述B1蛋白、其同種型、片段或類似物是所述細(xì)胞內(nèi)發(fā)炎、細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞存活通道的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，它選自(a)衍生自天然B1蛋白編碼區(qū)的cDNA序列；(b)序列(a)的片段，它編碼能調(diào)節(jié)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道的生物活性蛋白；(c)能在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列(a)或(b)雜交的DNA序列，該序列編碼能調(diào)節(jié)胞內(nèi)發(fā)炎、死亡或細(xì)胞存活通道的有生物活性的B1蛋白、類似物或片段；(d)遺傳密碼與(a)-(c)所確定的DNA序列簡并的DNA序列，該序列編碼能調(diào)節(jié)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道的具有生物活性的B1蛋白、類似物或片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DNA序列，它包含圖3所示序列的至少一部分并編碼至少一種有活性的B1蛋白、同種型、類似物或片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA序列，它編碼的B1蛋白、同種型、類似物或片段具有圖3所示氨基酸序列的至少一部分。
5.一種載體，它包含權(quán)利要求1-4任一所述的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體，它能在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體，它能在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)。
8.轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞，它含有權(quán)利要求5-7任一所述的載體。
9.一種B1蛋白、其同種型、片段、功能性類似物和衍生物，其由權(quán)利要求1-4任一所述的DNA序列編碼，所述蛋白、同種型、片段、類似物和衍生物能通過和細(xì)胞內(nèi)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道的其它細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑或中介體關(guān)聯(lián)來直接或間接地調(diào)節(jié)這些通道。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的B1蛋白、其同種型、片段、類似物和衍生物，其中所述蛋白、同種型、類似物、片段和衍生物具有圖3所示氨基酸序列的至少一部分。
11.一種生產(chǎn)權(quán)利要求9或10所述的B1蛋白、其同種型、片段、類似物或衍生物的方法，該方法包括在適合所述蛋白、其同種型、片段、類似物或衍生物表達(dá)、以及按需進(jìn)行翻譯后修飾的條件下使權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞生長，以獲得所述蛋白、其同種型、片段、類似物或衍生物，然后分離所述表達(dá)的蛋白、同種型、片段、類似物或衍生物。
12.抗體或其活性片段或衍生物，它對權(quán)利要求9或10所述的B1蛋白、其同種型、類似物、片段或衍生物有特異性。
13.一種調(diào)節(jié)或介導(dǎo)細(xì)胞中發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道活性、或由B1或權(quán)利要求9或10所述的B1蛋白、其同種型、類似物、片段或衍生物結(jié)合或直接或間接相互作用的其它分子直接或間接調(diào)節(jié)或介導(dǎo)的其它細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)活性的方法，所述方法包括通過將一種或多種所述的B1蛋白、其同種型、類似物、片段或衍生物以適合胞內(nèi)導(dǎo)入的形式導(dǎo)入所述細(xì)胞，或?qū)⒕幋a所述一種或多種B1蛋白、其同種型、類似物、片段或衍生物的DNA序列以攜帶所述序列的合適載體形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)來處理所述細(xì)胞，所述載體能將所述序列插入所述細(xì)胞內(nèi)以使所述序列在所述細(xì)胞中表達(dá)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的細(xì)胞處理包括將編碼所述B1蛋白、其同種型、片段、類似物或衍生物的DNA序列以攜帶所述序列的合適載體形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，所述載體能將所述序列插入所述細(xì)胞內(nèi)以使所述序列在所述細(xì)胞中表達(dá)。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述細(xì)胞的所述處理是用重組動物病毒載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，該方法包括下列步驟(a)構(gòu)建一個重組動物病毒載體，該載體攜帶了編碼能結(jié)合所述待處理細(xì)胞表面上特異性細(xì)胞表面受體的病毒表面蛋白配體的序列，以及編碼選自權(quán)利要求9或10所述的B1蛋白、同種型、類似物、片段和衍生物的蛋白的第二序列，該蛋白在所述細(xì)胞中表達(dá)時能直接或間接地調(diào)節(jié)/介導(dǎo)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道的活性或與所述B1蛋白、其同種型、類似物、片段和衍生物直接或間接相互作用的其它胞內(nèi)分子所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的其它胞內(nèi)信號傳導(dǎo)活性；和(b)用(a)所述的載體感染所述細(xì)胞。
16.一種調(diào)節(jié)由B1直接或間接調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活通道的方法，該方法包括用權(quán)利要求12所述的抗體或其活性片段或衍生物處理所述細(xì)胞，所述處理是將含有所述抗體、其活性片段或衍生物的合適組合物施加于所述細(xì)胞，其中當(dāng)所述細(xì)胞的B1蛋白或其部分暴露在胞外表面時，所述組合物就配制成用于胞外應(yīng)用，當(dāng)所述B1蛋白是胞內(nèi)蛋白時，所述組合物就配制成胞內(nèi)應(yīng)用。
17.一種調(diào)節(jié)由B1直接或間接調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)發(fā)炎、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活或其它通道的方法，該方法包括用寡核苷酸序列處理所述細(xì)胞，所述寡核苷酸編碼權(quán)利要求1-4任一所述B1蛋白的DNA編碼序列的至少一部分的反義序列，所述寡核苷酸序列能阻斷B1蛋白的表達(dá)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中通過權(quán)利要求15所述的病毒將所述寡核苷酸序列導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，其中所述病毒的所述第二序列編碼所述寡核苷酸序列。
19.一種調(diào)節(jié)由B1直接或間接調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)發(fā)炎、細(xì)胞死亡、細(xì)胞存活或其它通道的方法，該方法包括采用核酶程序，其中將一個載體以允許所述核酶序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，該載體編碼的核酶序列能與編碼權(quán)利要求9或10所述的B1蛋白的細(xì)胞mRNA序列相互作用，其中當(dāng)所述核酶序列在所述細(xì)胞中表達(dá)時，它與所述細(xì)胞mRNA序列相互作用并切割所述mRNA序列，導(dǎo)致抑制所述B1蛋白在所述細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
20.一種通過權(quán)利要求9或10所述的蛋白中存在的激酶結(jié)構(gòu)域或中間結(jié)構(gòu)域來分離和鑒定權(quán)利要求9或10所述的蛋白的方法，該蛋白與具有前結(jié)構(gòu)域或蛋白酶類募集結(jié)構(gòu)域CARD的蛋白或參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的其它蛋白或酶同源或能與之直接或間接相互作用，該方法包括采用酵母雙雜交程序，其中一個雜交載體攜帶了具有所述CARD、激酶和中間結(jié)構(gòu)域或這些結(jié)構(gòu)域中至少一個的所述蛋白的編碼序列，第二個雜交載體攜帶了來自cDNA或基因組DNA文庫的序列，然后用載體轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞，分離陽性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，然后抽提所述第二雜交載體，以獲得能與所述含有CARD、激酶和/或中間結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合的蛋白編碼序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求13-20任一所述的方法，其中所述蛋白是B1同種型、類似物、片段及其衍生物的至少一種。
22.一種用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)由B1直接或間接調(diào)節(jié)的發(fā)炎、細(xì)胞死亡、細(xì)胞存活或其它通道的藥物組合物，該組合物包含權(quán)利要求9或10所述的至少一種B1蛋白、其生物活性片段、類似物、衍生物或其混合物作為活性組分。
23.一種用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)由B1直接或間接調(diào)節(jié)的發(fā)炎、細(xì)胞死亡、細(xì)胞存活或其它通道的藥物組合物，它包含一種重組動物病毒載體作為活性組分，該載體編碼能與細(xì)胞表面受體結(jié)合的蛋白，并編碼權(quán)利要求9或10所述的至少一種B1蛋白、同種型、活性片段或類似物。
24.一種用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)由B1直接或間接調(diào)節(jié)的發(fā)炎、細(xì)胞死亡、細(xì)胞存活或其它通道的藥物組合物，該組合物包含一種寡核苷酸序列作為活性組分，該寡核苷酸序列編碼權(quán)利要求1-4任一所述的B1蛋白mRNA序列的反義序列。
25.一種用于預(yù)防或治療病理性狀態(tài)的藥物組合物，所述疾病與權(quán)利要求9或10所述的B1蛋白直接或間接結(jié)合的一種或多種分子所調(diào)節(jié)的凋亡作用相關(guān)，所述組合物包含有效量的B1蛋白或編碼該蛋白的DNA分子、或能破壞所述B1蛋白與能結(jié)合B1蛋白或與B1蛋白相互作用的一種或多種分子直接或間接相互作用的分子。
26.一種用于預(yù)防或治療與權(quán)利要求9或10所述的B1蛋白直接或間接結(jié)合的一種或多種分子所調(diào)節(jié)的凋亡相關(guān)的病理狀態(tài)的藥物組合物，所述組合物包含有效量的B1蛋白、其同種型、片段、類似物或衍生物、或其DNA編碼分子、或能破壞所述B1蛋白、其同種型、片段、類似物或衍生物與能結(jié)合所述B1蛋白、其同種型、片段、類似物或衍生物的一種或多種分子直接或間接相互作用的分子。
27.一種用于預(yù)防或治療與權(quán)利要求9或10所述的B1蛋白直接或間接結(jié)合的一種或多種分子所調(diào)節(jié)的凋亡相關(guān)的病理性狀態(tài)的藥物組合物，所述組合物包含一種能干擾B1蛋白激酶活性的分子。
28.一種用于預(yù)防或治療與一種或多種分子所調(diào)節(jié)的凋亡相關(guān)的病理性狀態(tài)的方法，所述一種或多種分子與權(quán)利要求9或10所述的蛋白直接或間接結(jié)合，所述方法包括給予需要的患者有效量的權(quán)利要求9或10所述的蛋白或其同種型、片段、類似物和衍生物、或它們的混合物、或其DNA編碼分子、或能破壞權(quán)利要求9或10所述的B1蛋白或其同種型、片段、類似物和衍生物或它們的混合物與能直接或間接結(jié)合權(quán)利要求9或10所述的B1蛋白或其同種型、片段、類似物和衍生物或它們的混合物的一種或多種分子直接或間接相互作用的分子。
29.一種調(diào)節(jié)B1蛋白直接或間接參與的凋亡過程或編程性細(xì)胞死亡過程—即細(xì)胞死亡通道—的方法，該方法包括用權(quán)利要求9或10所述的一種或多種B1蛋白、同種型、類似物、片段或衍生物處理所述細(xì)胞，其中所述細(xì)胞的所述處理包括將所述一種或多種B1蛋白、同種型、類似物、片段或衍生物以適合胞內(nèi)導(dǎo)入的形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，或?qū)⒕幋a所述一種或多種B1蛋白、同種型、類似物、片段或衍生物的DNA序列以攜帶所述序列的合適載體形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，所述載體能將所述序列插入所述細(xì)胞內(nèi)以使所述序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
30.一種調(diào)節(jié)B1蛋白直接或間接參與的并包括調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的細(xì)胞存活過程的方法，該方法包括用權(quán)利要求9或10所述的一種或多種B1蛋白、同種型、類似物、片段或衍生物處理所述細(xì)胞，其中所述細(xì)胞的處理包括將所述一種或多種B1蛋白、同種型、類似物、片段或衍生物以適合胞內(nèi)導(dǎo)入的形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，或?qū)⒕幋a所述一種或多種B1蛋白、同種型、類似物、片段或衍生物的DNA序列以攜帶所述序列的合適載體形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，所述載體能將所述序列插入所述細(xì)胞內(nèi)以使所述序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
31.一種篩選能結(jié)合權(quán)利要求9或10所述的B1蛋白的配體的方法，該方法包括使連接了所述蛋白的親和層析基質(zhì)與細(xì)胞抽提物接觸，從而使配體與所述基質(zhì)結(jié)合，然后洗脫、分離和分析所述配體。
32.一種篩選能結(jié)合權(quán)利要求9或10所述B1蛋白的配體的DNA編碼序列的方法，該方法包括采用酵母雙雜交程序，其中一個雜交載體攜帶了編碼所述B1蛋白的序列，第二個雜交載體攜帶了來自cDNA或基因組DNA文庫的序列，用所述載體轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞，分離陽性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，抽提所述第二個雜交載體以獲得編碼所述配體的序列。
33.一種鑒定和產(chǎn)生能調(diào)節(jié)B1調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性的配體的方法，該方法包括a)篩選能結(jié)合某多肽的配體，該多肽包含B1的至少一部分，具有至少某些圖3所示的B1氨基酸殘基，該部分基本上包括B1的全部前結(jié)構(gòu)域CARDb)對于經(jīng)所述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的、能進(jìn)行所述結(jié)合但非BCL2、TRAF2、或TNF/NGF受體家族受體一部分、或具有前結(jié)構(gòu)域CARD的其它已知蛋白的配體，進(jìn)行鑒定和特性分析；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述配體。
34.一種鑒定和產(chǎn)生能調(diào)節(jié)受權(quán)利要求9或10所述的B1蛋白調(diào)節(jié)或介導(dǎo)的細(xì)胞活性的配體的方法，該方法包括a)篩選能與某多肽結(jié)合的配體，該多肽至少包含圖3所示的B1序列的羧基端部分，該部分至少包括前結(jié)構(gòu)域CARD；b)對于經(jīng)所述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的、能進(jìn)行所述結(jié)合但非BCL2、TRAF2、或TNF/NGF受體家族受體一部分、或具有前結(jié)構(gòu)域CARD的其它已知蛋白的配體，進(jìn)行鑒定和特性分析；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述配體。
35.一種鑒定和產(chǎn)生能調(diào)節(jié)受B1調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性的配體的方法，該方法包括a)篩選能與圖3所示B1序列的至少N端部分結(jié)合的配體，該N端部分基本上包括了B1所有的激酶結(jié)構(gòu)域；b)對于所述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的、能進(jìn)行所述結(jié)合但非BCL2、TRAF2、或TNF/NGF受體家族受體一部分、或其它已知的胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白的配體，進(jìn)行鑒定和特性分析；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述配體。
36.一種鑒定和產(chǎn)生能直接或間接調(diào)節(jié)受B1調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性的分子的方法，該方法包括a)篩選能調(diào)節(jié)受B1調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的活性的分子；b)對所述分子進(jìn)行鑒定和特性分析；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述分子。
37.一種鑒定和產(chǎn)生能直接或間接調(diào)節(jié)受權(quán)利要求9或10所述的蛋白調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性的分子的方法，該方法包括a)篩選能調(diào)節(jié)權(quán)利要求9或10所述的蛋白所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的活性的分子；b)對所述分子進(jìn)行鑒定和特性分析；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述分子。
38.根據(jù)權(quán)利要求9所述的片段，該片段是肽。
39.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、細(xì)胞存活和/或發(fā)炎的方法，該方法包括用能與V-ATP酶的E亞單位相互作用的分子處理細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種B1蛋白、其同種型、類似物、片段和衍生物以及編碼這些蛋白的DNA和重組產(chǎn)物。該蛋白可用來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)發(fā)炎、細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞存活通道。
文檔編號C12N1/21GK1259165SQ98805736
公開日2000年7月5日 申請日期1998年6月1日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月5日
發(fā)明者D·沃勒克, M·博爾金, N·馬利寧 申請人:依達(dá)研究發(fā)展有限公司