專利名稱：Dna序列,這些dna序列的表達,這些dna序列所編碼的嗜熱漆酶,及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及編碼具有漆酶活性的蛋白的DNA序列，這些DNA序列的表達，這些DNA序列所編碼的嗜熱漆酶，及其應用。
在工業(yè)應用上具有很高價值的一類酶是漆酶(對羥基苯酚氧化酶，EC1.10.3.2.)。漆酶這類蛋白質屬于被稱作“綠銅蛋白”的家族，通常含有四個銅離子，位于標為1型至3型的三個銅中心。漆酶通常以分泌的蛋白和可能含有的糖基化含量(10％至45％的分子量)來加以區(qū)別。對于它所氧化的芳香化合物，漆酶具有很廣的底物特異性。在這種氧化中產(chǎn)生的電子用于還原氧，產(chǎn)生水。特別地存在于白腐真菌中的漆酶的功能是能夠降解木質素，這也就是在紙張制造中使用漆酶進行紙漿去木質化而具有應用價值的原由。
除了可以解聚象木質素這樣的大分子化合物，漆酶還可以催化特別是芳香化合物的聚合。例如與植物中的漆酶相關的植物木質素的生物合成。故漆酶可能的工業(yè)應用通常也包括用于各種類型的聚合反應，例如用于廢水處理。漆酶在有機化學合成中的應用也是已知的，例如芳香族化合物的偶聯(lián)反應和側鏈氧化。然而，對于這許多的潛在應用，一個不利的方面是大多數(shù)已知漆酶是常溫型的，就是說它們具有低溫最適性以及有限的熱穩(wěn)定性。
漆酶的工業(yè)應用的一個前提條件是它們能夠以可接受的成本來制備，通常只有通過使用以重組技術制備的酶才能使之成為可能。有許多原核和真核的表達系統(tǒng)可用于蛋白質的生產(chǎn)，原核表達系統(tǒng)的代表有大腸桿菌和枯草桿菌，而廣泛使用的真核表達系統(tǒng)是哺乳動物細胞和昆蟲細胞的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，以及真核微生物如酵母或絲狀真菌。
WO 96/00290公開了五種來自絲狀真菌Polyporu pinsitus的漆酶基因，該真菌屬于擔子菌綱的亞綱。這些漆酶基因之一(LCC1)通過重組技術制備。雖然該酶的嗜熱性沒有進一步研究，但其所述的LCC1用于染發(fā)目的顯示該酶具有常溫的特性。
在WO 95/33837中，描述了從Deuteromycetes的亞綱的絲狀真菌Scytalidium thermophilum中制備出帶有嗜熱特性的重組漆酶。不知道該酶是否能夠用于紙漿的漂白。
迄今，還未描述有從擔子菌綱的亞綱的絲狀真菌中以重組蛋白來制備嗜熱型漆酶的方法。
CAAN 96-203142公開了一個嗜熱型漆酶的多種特性。但沒有公開該蛋白質的DNA或者蛋白質序列。
本發(fā)明涉及一個編碼具有漆酶活性的蛋白質的DNA序列，此DNA含有DNA序列SEQ ID NO1的第76位直至且包括第1572位或者SEQ ID NO2的第76位直至且包括第1572位的序列，或者與所說序列具有80％以上的同源性的序列。
SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的第1位至第75位編碼該蛋白分泌所需的信號肽序列。此信號序列可以被任何其他的蛋白分泌的信號序列所替換。
該新的DNA序列可以通過例如克隆的方法從擔子菌綱菌株Trametes versicolor TV-1(保藏于DSMZ，德意志微生物保藏中心，D-38124 Braunschweig，保藏號DMS 11523)中獲得。為此，以已知的方法從Trametes versicolor TV-1建立一個基因文庫，它可以是cDNA文庫或是基因組文庫。
為了在基因文庫中分離該新的DNA序列，要使用含有漆酶特異DNA序列的DNA探針。此類探針可以例如利用DNA引物經(jīng)PCR從Trametes versicolor TV-1基因組DNA獲得。
所用的引物為簡并的DNA片段，長度優(yōu)選為14至27bp，其序列通過比較已知的漆酶基因序列而確定。
適于作為引物的DNA片段最好是通過熟知的DNA片段的寡核苷酸合成來獲得。
新的漆酶基因可按照例如實施例1至5的方法分離。
按照所示實施例的方法分離出的一個漆酶基因，可以通過熟練技術人員所知的技術，例如定點誘變，在其序列的任何所需位置進行修飾。因而，本發(fā)明也涵蓋了一個編碼具有漆酶活性的蛋白的DNA序列，其所含有的序列與DNA序列SEQ ID NO1從第76位直至且包括第1572位或者DNA序列SEQ ID NO2從第76位直至且包括第1572位的序列具有80％以上的同源性。
為了表達此新的DNA，利用熟知的方法將其克隆至一個表達載體上，再將含有漆酶基因的表達載體導入一微生物中并在微生物中表達。
表達載體可以是一個整合到宿主基因組中去并和宿主一起復制的DNA結構?；蛘撸磉_載體是一個自主復制的DNA結構而不需要整合至宿主基因組中，例如，質粒、人工染色體、或者類似的染色體外遺傳因子。
一個適當?shù)谋磉_載體應該優(yōu)選地含有下列遺傳元件一個啟動漆酶基因在宿主中表達的啟動子，這應該優(yōu)選地是一個強啟動子從而能確保較高的表達效率。啟動子應優(yōu)選地有功能地連接于漆酶基因的5′端。
適當?shù)暮蛢?yōu)選的啟動子選自以下一組tac啟動子、枯草桿菌蛋白酶啟動子、GAL啟動子、TAKA淀粉酶啟動子、多角蛋白啟動子、葡糖淀粉酶啟動子、gapDH啟動子和醇氧化酶啟動子。
適合的和優(yōu)選的啟動子，用于在大腸桿菌中表達的是tac啟動子、用于在枯草桿菌中表達的是枯草桿菌蛋白酶啟動子、用于在啤酒糖酵母中表達的是GAL啟動子、用于在黑曲霉中表達的是TAKA淀粉酶啟動子、用于在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中表達的是多角蛋白啟動子，或者，來自黑曲霉的葡糖淀粉酶啟動子或來自巴斯德畢赤氏酵母的醇氧化酶啟動子。
尤其合適的可用于該新嗜熱漆酶表達的啟動子是來自黑曲霉的葡糖淀粉酶啟動子或來自巴斯德畢赤氏酵母的醇氧化酶啟動子。
表達載體也應當優(yōu)選地含有適合于宿主的轉錄終止信號，而在真核中還應含有聚腺苷化的信號，該信號應功能性地連接于漆酶基因的3′端。
表達的蛋白質應優(yōu)選地被宿主分泌到培養(yǎng)基中。宿主的分泌通過N-端信號序列來介導。該信號序列是天然存在于漆酶基因中的，或者，是一個異源信號序列，其編碼DNA在表達載體上功能地連接于漆酶基因的5’端。
下列分泌蛋白的信號序列是優(yōu)選的來自Klebsiella oxytoca的α-環(huán)糊精葡糖轉移酶，來自啤酒糖酵母的α-因子，來自巴斯德畢赤氏酵母的酸性磷酸酶，來自黑曲霉的α-淀粉酶，來自黑曲霉或泡盛曲霉的葡糖淀粉酶，或者天然存在于漆酶基因中的信號序列。
尤其合適的是天然存在于漆酶基因中的信號序列，以及下列的異源信號序列來自黑曲霉或者泡盛曲霉的葡糖淀粉酶的信號序列，來自啤酒糖酵母的α-因子的信號序列，或者巴斯德畢赤氏酵母的酸性磷酸酶的信號序列。
漆酶的分泌也可以通過融合蛋白的表達而完成，其中一個分泌蛋白的基因或者該蛋白的一個分泌片段的基因在表達載體中有功能地與漆酶基因相連接。這方面尤為優(yōu)選的是，一種由來自黑曲霉的葡糖淀粉酶N-端片段和該嗜熱漆酶組成的融合蛋白的表達。
對葡糖淀粉酶片段和該嗜熱漆酶的連接點的選擇更優(yōu)選的是使得該連接點的氨基酸序列能夠作為宿主細胞的分泌器的加工肽酶的識別位點，從而表達的融合蛋白可被體內切割并釋放出該漆酶。
表達載體優(yōu)選地還含有一個選擇標記的基因。該基因編碼的選擇標記可以給宿主帶來一種抗生素抗性或者對宿主的一種缺陷有互補。
優(yōu)選的選擇標記是可帶來如下抗生素抗性的基因，如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、潮霉素、zeocin或bialaphos。優(yōu)選的可對生長缺陷互補的選擇標記基因如amdS，pyrG，trpC，His4，niaD，argB，或者hygB。
尤其合適的選擇標記是amdS和pyrG基因和His4基因和抗生素zeocin的抗性基因。
此外，選擇標記基因可以在一個DNA分子上與漆酶基因一同存在，或者兩個基因分別存在于不同的DNA分子上。后一種情況下，宿主應被兩種DNA分子一同共轉化。
因而本發(fā)明也涉及含有該新的DNA序列的表達載體。
合適的和優(yōu)選的用于表達此新表達載體的微生物是，細菌來源的如大腸桿菌或枯草桿菌，真核來源的如糖酵母或畢赤氏酵母屬的酵母，或者絲狀真菌如曲霉屬，木霉屬，鏈孢霉屬或裂褶菌屬，或者真核細胞培養(yǎng)物例如桿狀病毒感染的昆蟲細胞。
尤其合適的是曲霉屬絲狀真菌如黑曲霉或泡盛曲霉或者酵母類的啤酒糖酵母或巴斯德畢赤氏酵母。
由此新的DNA所編碼的蛋白具有以下的生化特性該蛋白具有漆酶的酶學活性，該酶活性的最適pH位于酸性范圍且最大為pH2.0，最高活性的一半酶活性位于pH4.0。該酶在45℃及pH4.5至6.0下的穩(wěn)定性在2小時內保持100％。
該酶在45℃及pH3.0下的穩(wěn)定性在1小時的時間中為50％。pH4.5的條件下最適溫度為70℃。該酶的活性在65-70℃時仍有其最高活性的80％。在50-80℃時酶的活性仍具有其最高活性的50％。在pH4.5且高達55℃溫度條件下，在長達兩個小時的時間內該酶的穩(wěn)定性仍為90％。而在pH4.5且溫度65℃條件下，在長達一個小時的時間內該酶的穩(wěn)定性為50％。
此新的蛋白含有SEQ ID NO3的蛋白質序列。
此新的蛋白的制備優(yōu)選地通過在上述的微生物中表達新的DNA序列的方法而進行。
該DNA的表達優(yōu)選地利用上述的一種表達載體在微生物中進行。
本發(fā)明因而也涉及含有新的DNA序列或者新的表達載體的微生物。
尤為優(yōu)選的是，結合應用微生物以及也能從微生物分泌蛋白的表達系統(tǒng)。這種優(yōu)選的結合應用的例子是利用葡糖淀粉酶啟動子在黑曲霉或泡盛曲霉中表達該新的DNA序列。在這個表達系統(tǒng)中使用的分泌信號優(yōu)選地是嗜熱漆酶本身的信號序列或者是葡糖淀粉酶-漆酶融合蛋白的葡糖淀粉酶部分的信號序列。
利用醇氧化酶啟動子在巴斯德畢赤氏酵母中表達該新的DNA序列。在這個表達系統(tǒng)中使用的分泌信號優(yōu)選地是嗜熱漆酶本身的信號序列或者是來自啤酒糖酵母的α-因子的信號序列或者是來自巴斯德畢赤氏酵母的酸性磷酸酶的信號序列。
該新的蛋白適合于已知的所有的漆酶應用。尤其適合于紙漿的去木質化和高分子量聚集物的解聚。漆酶可進一步用于廢紙的去墨漬，用于廢水處理中的芳香化合物的聚合，特別是紙漿漂白后含木質素的廢水的處理，或者可廣泛應用于受污染土壤的解毒。更進一步的應用方面涉及與前體組分及反應使染料氧化以及使染料活化而形成顏料。在有機合成方面的應用包括芳香化合物的偶聯(lián)反應以及芳香取代基的氧化，例如苯甲醇氧化形成相應的醛類而防止進一步氧化成羧酸。在上述的應用當中，漆酶可以單獨應用于相關的反應，也可以結合一種促進反應的介體。這樣的介體例如是ABTS或N-羥基苯并三唑。
本發(fā)明因而也涉及將該新的蛋白質應用于紙漿的去木質化、高分子量聚集物的解聚、廢紙的去墨漬、廢水尤其是紙漿漂白后含木質素的廢水中的芳香化合物的聚合、染料的氧化或者染料的活化以形成顏料、在有機合成方面應用于芳香化合物的偶聯(lián)反應以及芳香側鏈的氧化。
上述的應用可以通過單獨使用漆酶，也可以結合一種促進反應的介體來進行。


圖1示出DNA載體pANlac1S的結構。
圖2示出DNA載體pANlac2S的結構。
圖3示出DNA載體pL512的結構。
圖4示出DNA載體pL532的結構。
圖5示出新漆酶的活性與pH的相關性。
圖6示出新漆酶的pH穩(wěn)定性。
圖7示出新漆酶的活性與溫度的相關性。
圖8示出新漆酶的溫度穩(wěn)定性。
以下的實施例用于進一步解釋本發(fā)明。在實施例中對DNA或RNA的處理所使用的標準方法，例如用限制內切酶，DNA聚合酶，反轉錄酶的處理等，以及標準的方法，例如細菌的轉化，Sounthern和northern雜交分析，DNA測序，放射性標記，掃描和PCR技術，除非另有說明，均按照所用試劑盒的制造商推薦的方法進行，如果沒有制造商的說明，則按照本領域所熟知的標準教科書進行。實施例1來自Trametes versicolor TV-1的cDNA文庫的構建使用Trametes versicolor TV-1菌株。Trametes versicolor的菌絲首先通過在麥芽瓊脂平板(3％麥芽抽提物，0.3％大豆粉的蛋白胨，1.5％的瓊脂，pH5.0)于28℃培養(yǎng)7天而獲得。從麥芽瓊脂平板中取三塊菌絲搗碎并用以接種500ml三角瓶中的100ml無菌麥芽抽提物培養(yǎng)基(3％麥芽抽提物，0.3％大豆粉的蛋白胨，pH5.0)。在28℃以100rpm搖動培養(yǎng)7天。菌絲懸浮液通過瓷器漏斗的抽濾而制備，用0.9％的鹽溶液洗滌，將菌絲在液氮中冷凍并用研缽磨碎。用RNeasy試劑盒(Qiagen)分離RNA。200mg的菌絲可產(chǎn)生100μg的RNA。
600μg的RNA用于提取mRNA，這通過在oligo-dT Sepharose(mRNA分離試劑盒，Pharmacia)上的層析完成。產(chǎn)生的mRNA有26μg。7.25μg的分離的mRNA用于合成cDNA，這里使用了Stratagene的一種cDNA合成試劑盒。分級分離后，cDNA通過瓊脂糖凝膠電泳分成0.8-2.1kb大小和2.5-5kb大小的兩種組分，這兩種組分cDNA都從瓊脂糖中分離出來(Qiagen凝膠抽提試劑盒)用于構建cDNA文庫。cDNA文庫建于λ噬菌體(Stratagene，ZAP快速克隆系統(tǒng))，從0.8-2.1kb的組分中獲得4×105噬菌體/μg載體DNA，從2.1-5kb的組分中獲得1×105噬菌體/μg載體DNA，得到的噬菌體通過感染大腸桿菌菌株XL-1 Blue MRF′(Statagene)進行擴增。實施例2來自Trametes versicolor的染色體基因文庫的構建Trametes versicolor TV-1菌絲的制備如實施例1中所述。菌絲經(jīng)瓷器漏斗抽濾并用0.9％的鹽溶液洗滌，然后在液氮中冷凍，用研缽磨碎并分成1g的小份。每個1g的小份磨碎菌絲裝入一個無菌樣品管中并立刻混入5ml抽提溶液(0.1M Tris-HCl，pH8.0，0.1M EDTA，0.25MNaCl，0.6mg/ml蛋白酶K)和0.5ml 10％(w/v)的月桂酰肌氨酸鈉溶液。于50℃保溫至少2小時之后，混入0.85ml 5M NaCl和0.7ml在0.7MNaCl中的10％(w/v)CTAB溶液并于65℃保溫30分鐘。加入7ml的氯仿/異戊醇(24∶1)混合物之后，振蕩并通過離心將兩相分離。移出水相并加入0.6倍體積的異丙醇沉淀染色體DNA。沉淀的DNA接下來在柱(Qiagen Genomic Tip)上純化。以此方法從16g菌絲中可分離0.5mg的染色體DNA。
為了構建染色體基因文庫，用EcoRI將90μg來自Trametesversicolor TV-1的DNA完全酶切，并通過瓊脂糖凝膠電泳分離。染色體DNA片段分離成2-4kb和4-10kb大小兩種組分，并將每種組分分別克隆到λ噬菌體(Stratagene，ZAP快速克隆系統(tǒng))中。從2-4kb的組分中獲得1×105噬菌體/μg載體DNA。從4-10kb的組分中獲得5.4×104噬菌體/μg載體DNA。得到的噬菌體通過感染大腸桿菌菌株XL-1 Blue MRF′(Statagene)進行擴增。實施例3從Trametes versicolor基因組DNA中制備漆酶特異性DNA探針用于分離漆酶基因的DNA探針通過以通用引物從T.versicolor的基因組中PCR擴增的方法制備。根據(jù)已知的漆酶基因序列的對比來構建簡并引物。對于登記在EMBL基因數(shù)據(jù)庫中的漆酶基因的氨基酸序列進行了比較，它們來自粗糙鏈孢霉，毛革蓋菌，輻射射脈菌，雙孢蘑菇和擔子菌綱的亞綱中的一種未詳細鑒定的絲狀真菌。通過序列的比較，可確定4個長度為5-7個氨基酸的肽段在所有的漆酶基因中完全保守?？紤]到簡并密碼子，將這些肽段翻譯回DNA從而制備出簡并引物。這些簡并引物的序列如下A5’-TGGCAYGGNTTYTTYCA-3’(SEQ ID NO4)B5’-TCDATRTGRCARTG-3’(SEQ ID NO5)C5’-ATTCAGGGATCCTGGTAYCAYWSNCAY-3’(SEQ IDNO6)D5’-ATACGAGGATCCRTGNCCRTGNARRTG-3’(SEQ IDNO7)引物C和D在5′端含有一個BamHI酶切位點(劃線部分)，并帶有合適的簡并漆酶序列。
來自T. versicolor的基因組DNA按照實施例2所述的方法從搖瓶培養(yǎng)的菌絲中提取。PCR擴增按照本領域熟練技術人員熟知的方法進行。第一輪PCR中，在100μl的PCR體系中使用200ng的T.versicolor染色體DNA，以及1.25U的Taq聚合酶，1.25mMMgCl2，0.2mM的各4種dNTP和各100pmol的引物A和B。所需PCR產(chǎn)物的特異擴增的其他條件是94℃5分鐘后，7個循環(huán)的94℃0.5分鐘，40℃1分鐘和60℃2.5分鐘，然后30個循環(huán)的94℃0.5分鐘，50℃1分鐘和72℃2.5分鐘。取第一輪PCR反應的1ul用于第二輪PCR，其中還含有1.25U的Taq聚合酶，1.25mM MgCl2，0.2mM的各4種dNTP和各100pmol的引物C和D。所需PCR產(chǎn)物的特異擴增的其他條件是94℃5分鐘后，7個循環(huán)的94℃0.5分鐘，40℃1分鐘和60℃2.5分鐘，然后30個循環(huán)的94℃0.5分鐘，50℃1分鐘和72℃2.5分鐘。得到約1.1kb的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，用限制酶BamHI酶切，克隆入BamHI酶切的pUC18載體并轉化進E.coli.。從轉化的E.coli培養(yǎng)物中分離質粒。用5′端和3′端的DNA序列分析確認該克隆的DNA片段為漆酶基因的片段。
為了制備DNA探針用于篩選漆酶基因，將漆酶特異的PCR片段以BamHI處理，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離并用α-[32P]-dATP標記(隨機引物試劑盒，Boehringer Mannheim)。游離的放射性通過SephadexG25(Pharmacia)上的層析除去。放射性標記的DNA探針的比活性為1×107cpm/μgDNA。實施例4來自Trametes versicolor TV-1的漆酶的cDNA基因的分離使用如實施例1中所述的Trametes versicolor TV-1的cDNA基因文庫。漆酶cDNA基因的篩選按照本領域的方法進行。在第一輪篩選中，首先將大腸桿菌XL-1 Blue MRF′細胞在10個培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，然后每個培養(yǎng)皿以50000個cDNA文庫噬菌體感染(0.8-2.1kb組分，見實施例1)。37℃培養(yǎng)過夜后，新形成的噬菌體轉移至尼龍膜(Stratagene)上。再按照制造商的說明書將濾膜與放射性標記的漆酶特異性探針(見實施例3)雜交，雜交溫度為45℃，雜交緩沖液含有50％的甲酰胺。挑出陽性克隆并經(jīng)重復篩選過程進行純化。經(jīng)三輪的分離后，在篩選中分離出20個強雜交噬菌體克隆并按照制造商的方法(Stratagene)通過體內剪切重新克隆入pBK CMV載體(Stratagene)中。通過限制性內切酶消化以及DNA測序分析，確定在DNA水平上基本相同的2個漆酶基因已得到分離。這2個克隆的完全測序表明它們是漆酶的等位基因，具有相同的氨基酸序列。這2個漆酶cDNA基因被稱為Lac5.5和Lac5.6。相應地，帶有這兩個漆酶cDNA基因的質粒被稱為pLac5.5和pLac5.6。實施例5來自Trametes versicolor TV-1的漆酶的染色體基因的分離在如實施例2所述的Trametes versicolor TV-1的染色體基因文庫(2-10kb部分，見實施例2)中篩選染色體漆酶基因，方法類似于實施例4中所述的篩選cDNA克隆。實施例3中所用的放射性標記的漆酶特異性探針被再次使用。雜交溫度為45℃，雜交緩沖液含有50％的甲酰胺。在篩選中，分離出3個強雜交噬菌體克隆并按照制造商的方法(Stratagene)通過體內剪切重新克隆入pBK CMV載體(Stratagene)中。限制性內切酶分析得出的結論是所有這3個克隆是相同的，長度約為7kb。DNA測序分析表明所有這3個克隆代表著Lac5.6漆酶染色體基因。對一個克隆的編碼區(qū)及兩側大約1kb的5′和3′區(qū)進行了測序(SEQ ID NO8)。實施例6用于在曲霉中表達漆酶Lac5.5的DNA構建體的制備
Trametes versicolor漆酶Lac5.5的cDNA有功能地與特異于曲霉屬的絲狀真菌的表達信號連接。使用了下列來自曲霉的基因表達元件。
a)來自黑曲霉的葡糖淀粉酶基因(glaA)的啟動子(J.C.Verdoes，P.J.Punt，J.M.Schrickx，H.W.van Verseveld，A.H.Stouthamer和C.A.M.J.Jvan den Hondel，轉基因研究2(1993)，84-92)b)glaA啟動子后接一個編碼信號序列和成熟葡糖淀粉酶的片段的DNA片段。與之相連的是編碼KEX2蛋白酶的切割位點的DNA序列(M.P.Broekhuijsen，I.E.Mattern，R.Contreras，J.R.Kinghorn，C.A.M.J.J van den Hondel(1993)，生物技術雜志.31，135-145)。
c)來自構巢曲霉的trpC基因的轉錄終止子(E.J.Mullaney，J.E.Hamer，M.M.Yelton和W.E.Timberlake(1985)，Mol.Gen.Gene.199，37-45)。
但是，對于Lac5.5的cDNA與曲霉表達信號的功能性連接，首先需要的是對Lac5.5的cDNA基因的5′和3′區(qū)進行修飾。A漆酶Lac5.5cDNA與glaA啟動子的連接為了進一步的操作，Lac5.5的cDNA基因被重新克隆進pUC19載體中。為此，將Lac5.5 cDNA基因以1.9kb的EcoRI-XbaI片段從實施例1中獲得的pBK CMV載體上分離出，并亞克隆到預先以EcoRI-XbaI切開的pUC19載體上。得到的4.6kb的質粒稱為pLac5。
為了修飾Lac5.5 cDNA基因的起始密碼子ATG，使用了引物E和F。引物E5’-CCGGAATTCATGACTGGGCTGCGTCTCCTTCCTTCCTTC-3’(SEQ ID NO9)引物F5’-GAGAGGCCCGGGAGCCTGG-3’(SEQ ID NO10)引物E中劃線部分表示一個BspHI切點，引物F中的劃線部分表示一個SmaI或XmaI切點。
為了修飾Lac5.5 cDNA基因的3′區(qū)，使用了引物G和H。引物G5’-GCTGAATTCGAAGACATCCCCGACACCAAGG-3’(SEQ ID NO11)引物H5’-TGCTCTAGAAAGCTTAAGTTCACTGGTCGTCAGCGTCGAGGG-3’(SEQ ID NO12)引物G中劃線部分表示一個BbsI切點，引物H中的劃線部分表示一個AflII切點。
通過PCR利用引物E和F在Lac5.5cDNA基因的5′區(qū)擴增出一個188bp大小的片段。通過PCR利用引物G和H在Lac5.5cDNA基因的3′區(qū)擴增出一個110bp大小的片段。在100μl的PCR混合物中，含有10ng的Lac5.5cDNA(在pBK CMV載體上)，0.5U的Tth聚合酶，1.25mM MgCl2，0.2mM的各4種dNTP和各140pmol的引物對E和F或者引物對G和H。PCR以如下條件進行94℃5分鐘后，30個循環(huán)的94℃1分鐘，50℃2分鐘和72℃1分鐘，最后是72℃7分鐘。
引物E和F的PCR片段產(chǎn)物先用EcoRI和XmaI切割，然后經(jīng)凝膠電泳純化后克隆到預先被EcoRI和XmaI切割的pLac5上。結果得到載體pLac51，其ATG翻譯起始密碼子上引入了一個BspHI切點。
引物G和H的PCR片段產(chǎn)物先用EcoRI和XbaI切割，然后經(jīng)凝膠電泳純化后克隆到預先被EcoRI和XbaI切割的pUC19上。用BbsI和XbaI在得到的質粒pLT5上切下插入的約100bp大小的插入片段。該BbsI-XbaI片段最后克隆入預先經(jīng)BbsI和XbaI切割的載體pLac51。得到載體pLac513，其上的漆酶cDNA基因的3′末端含有一個新的AflII切點。
通過對質粒pLac513作BbsHI的部分消化，可分離出5′和3′區(qū)域被修飾的Trametes versicolor漆酶Lac5.5的cDNA基因。結果得到一個2.6kb的含有Lac5.5cDNA基因的編碼區(qū)，以及約1.1kb的pUC19載體片段的片段。該片段第二步用AflII酶切，分離得到1.5kb大小的Lac5.5cDNA片段。此片段與7.4kb大小的來自載體pAN52-12的AflII-NcoI片段連接，該7.4kb片段含有一個4.0kb來自黑曲霉glaA啟動子的片段，一個0.7kb來自構巢曲霉trpC轉錄終止子的片段以及2.7kb大小的pUC18載體片段。得到的8.8kb大小載體被稱為pANlac1。在pANlac1上，glaA啟動子區(qū)域通過NcoI-BspHI連接點功能性地與漆酶cDNA基因的翻譯起始密碼子ATG相連接。B通過以葡糖淀粉酶片段替換N-端信號序列將漆酶Lac5.5cDNA與glaA啟動子相連為了修飾cDNA基因編碼成熟漆酶Lac5.5N端的區(qū)域，使用了引物I和F。引物I5’CCGGAATTCGATATCCAAGCGCGGGATCGGGCCTGTGCTCGAC-3’(SEQ ID NO13)引物I中劃線部分表示一個EcoRV切點。
為了修飾Lac5.5cDNA基因的3′區(qū)域，使用了引物G和H(見本實施例的A部分)。
通過PCR利用引物I和F在Lac5.5cDNA基因的5′區(qū)域擴增出一個110bp大小的片段。通過PCR利用引物G和H在Lac5.5cDNA基因的3′區(qū)域擴增出一個110bp大小的片段。PCR的操作如本實施例中A部分所述。
引物I和F的PCR DNA片段產(chǎn)物用EcoRI和XmaI切割，然后經(jīng)凝膠電泳純化后克隆到預先被EcoRI和XmaI切割的pLac5上。結果得到載體pLac52，該質粒中在成熟漆酶蛋白的第一個氨基酸密碼子之前的5’區(qū)域插入了一個EcoRV位點及編碼氨基酸序列Ile Ser LysArg(SEQ ID NO14)的密碼子，此序列是KEX2蛋白酶的一個識別位點。載體pLac52上漆酶cDNA基因3′區(qū)域的修飾如同對載體pLac51所述的處理一樣。將來自引物G和H的PCR產(chǎn)物的約100bp大小的插入片段用BbsI和XbaI從質粒pLT5上切下并分離出。該BbsI-XbaI片段最后克隆入預先經(jīng)BbsI和XbaI切割的載體pLac52中。得到載體pLac523，其上的漆酶cDNA基因的3′末端含有一個新的AflII切點。
以EcoRV和AflII酶切質粒pLac523，可得到帶有經(jīng)修飾的5′和3′區(qū)域的來自Trametes versicolor的漆酶Lac5.5的cDNA基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離出所得的1.5kb大小的Lac5.5cDNA片段。該片段連接到經(jīng)AflII-EcoRV酶切的9.3kb大小的載體pAN56-9片段上。載體pAN56-9含有一個4.0kb大小的黑曲霉的glaA啟動子片段，后面跟有一個2.0kb大小的編碼黑曲霉glaA葡糖淀粉酶片段的片段，一段編碼KEX2切點4個氨基酸的DNA短序列，一個0.7kb大小的構巢曲霉trpC轉錄終止子片段，和一個2.7kb大小的pUC18載體片段。EcoRV和AflII切點位于KEX2切點的3′端。轉化E.coli后得到一個10.8kb的載體，被稱為pANlac2。在pANlac2中，成熟漆酶Lac5.5的cDNA基因的編碼區(qū)與葡糖淀粉酶基因的編碼區(qū)相連，這樣在表達時，首先產(chǎn)生出一個由帶信號序列的葡糖淀粉酶片段，KEX2蛋白酶的識別序列和完整的漆酶Lac5.5組成的融合蛋白。分泌時，該融合蛋白被KEX2蛋白酶切割，成熟的漆酶被分泌到培養(yǎng)物上清中。CamdS和pyrG選擇標記摻入到載體pANlac1和pANlac2中取pANlac1和pANlac2載體各5μg用NotI消化過夜使之線性化，接下來用牛腸堿性磷酸酶處理，苯酚/氯仿抽提并以乙醇沉淀。選擇標記amdS(乙酰胺酶)和pyrG(乳清酸核苷-5′-單磷酸脫羧酶)的基因由質粒pAN52-11提供，其可從該質粒上通過NotI消化作為6.4kb大小的片段被分離。取經(jīng)線性化和磷酸酶處理的載體pANlac1和pANlac2各0.2μg，與0.6μg分離得到的NotI片段連接，并以之轉化大腸桿菌JM109。從轉化的氨芐青霉素抗性的菌落中制備質粒DNA，并用NotI酶切通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。所分析的8個來自載體pANlac1的轉化克隆中有6個克隆以及7個來自載體pANlac2的轉化克隆中有5個克隆含有該6.4kb的基因的NotI片段。配有選擇標記基因的載體被稱為pANlac1S(大小為15.3kb，圖1)和pANlac2S(大小17.2kb，圖2)。得到的6個pANlac1S克隆中有3個克隆含有的NotI片段具有如圖1所示的所需方向。得到的5個pANlac2S克隆中有1個克隆含有的NotI片段具有如圖2所示的所需方向。實施例7曲霉的轉化轉化中使用了菌株黑曲霉AB1.13(pyrG-)(W.van Hartingsveldt，I.E.Mattern，C.M.J.van Zeijl，P.H.Pouwels和C.A.M.J.J.van den Hondel(1987)Mol.Gen.Genet.206，71-75)和泡盛曲霉(菌株ATCC11358)。曲霉的轉化按照本領域的技術進行(P.J.Punt和C.A.J.J.van denHondel(1992)，酶學方法，216，447-457)。
以Novozym 234處理菌絲而獲得曲霉的原生質體。在一個無菌Erlenmeyer燒瓶中，將來自一個搖瓶的菌絲用15ml新鮮配制的經(jīng)過濾除菌的裂解酶混合物Novozym234(Novo Nordisk)在OM培養(yǎng)基(0.27MCaCl2，0.6MNaCl)中的溶液懸浮。重懸于酶溶液中的菌絲在30℃下以低速(80rpm)搖動培養(yǎng)1至3小時。培養(yǎng)過程中用顯微鏡觀察原生質體的形成，通常1個小時后即可看到能自由移動的原生質體。獲得了大量的自由移動的原生質體后，可在玻璃濾器中用Miracloth(Calbiochem)過濾將其與殘留的菌絲分離開，并用STC培養(yǎng)基(1.2M山梨醇，50mM CaCl2，35mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH7.5)小心洗滌。在一個無菌的樣品管中將懸浮液離心(2000rpm，4℃，10分鐘)分離原生質體并用STC培養(yǎng)基洗滌2次。在顯微鏡下以記數(shù)皿確定原生質體的濃度。將原生質體的濃度調節(jié)至1×108原生質體/ml以用于原生質體的再生或轉化。
以質粒pANLac1S和pANLac2S轉化黑曲霉和泡盛曲霉的原生質體。兩種質粒都含有作為選擇標記的pyrG基因(編碼乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶)和amdS基因(編碼乙酰胺酶)。在一個體積為12ml的保溫管中，將0.1ml的原生質體的液體與10μg的質粒DNA混合，冰育25分鐘。然后緩慢加入1.25ml的60％PEG4000溶液(60％PEG4000，50mM CaCl2，10mM Tris-HCl，pH7.5)，與轉化混合物相混勻。20℃溫育20分鐘之后，以STC培養(yǎng)基加滿反應管，混勻，4℃離心10分鐘。沉淀重新懸浮，涂布于以山梨醇滲透壓平衡的選擇培養(yǎng)基平板上。平板在30℃培養(yǎng)7天后查看菌落生長狀況。在幾個實驗中，對于黑曲霉的轉化效率為1-5個轉化子/μg的質粒DNA，對于泡盛曲霉的轉化效率為0.1-0.5個轉化子/μg質粒DNA。
將轉化子轉入含有乙酰胺的選擇培養(yǎng)基平板上純化。通過在含有丙烯酰胺的選擇培養(yǎng)基上涂板，鑒定出帶有高拷貝數(shù)的轉化子。與乙酰胺相比，丙烯酰胺對于由amdS基因編碼的乙酰胺酶是一個較弱的底物，只有帶有高拷貝數(shù)的轉化子才能幫助生長。為了鑒定出具有漆酶功能性表達的轉化子，先將轉化子涂布在含有glaA啟動子表達的誘導物麥芽糊精的平板上，28℃生長2天后覆蓋ABTS瓊脂(0.1％ABTS，1％瓊脂糖，在McIllvaine緩沖液中，pH4.5)，表達漆酶的轉化子呈現(xiàn)綠色的菌暈。從在丙烯酰胺培養(yǎng)基上生長良好同時又在ABTS活性試驗中呈陽性反應的轉化子中制備孢子懸液。實施例8Trametes versicolor漆酶Lac5.5在曲霉中的表達在搖瓶水平上對漆酶Lac5.5在曲霉中的表達進行了研究。使用了下列的培養(yǎng)基5％(w/v)的麥芽糊精溶液高壓滅菌20分鐘，然后向500ml的這種基本培養(yǎng)基中加入1ml 1M MgSO4，0.5ml 1000×微量元素溶液，10ml 50×Asp A溶液和5ml 10％(w/v)酪蛋白氨基酸。1000×微量元素溶液含有如下成分在80mlH2O中溶解有2.2g ZnSO4×7H2O，1.1g H3BO3，0.5g MnCl2×4H2O，0.5g FeSO4×7H2O，0.17g CoCl2×5H2O，0.16g CuSO4×5H2O，0.15gNa2MoO4×2H2O和5g EDTA。50×AspA溶液含有如下成分在500mlH2O中溶解有150g NaNO3，13gKCl，38g KH2PO4，以10M KOH調節(jié)至pH5.5。還在培養(yǎng)基中加入CuSO4×5H2O至終濃度為0.5mM。
在表達實驗中，以1×106孢子/ml接種一個300ml的Erlenmeyer搖瓶內的50ml培養(yǎng)基。30℃下300rpm搖動培養(yǎng)。一周中每天取樣品，確定培養(yǎng)上清中的漆酶活性。在60至100小時呈現(xiàn)出最大的漆酶活性，0.5-2.5U/ml。通過在pH4.5，37℃條件下，于McIllvaine緩沖液中與底物0.1mM ABTS的反應比色來確定漆酶活性。通過對0.2MNa2HP4溶液滴定0.1M檸檬酸溶液至pH4.5制備McIllvaine緩沖液。測量420nm處吸收的增長(ABTS在420nm的吸收系數(shù)是3.6×1041×mol-1×cm-1)。1U的漆酶活性定義為每分鐘轉化1μmol的ABTS底物。實施例9Trametes versicolor漆酶Lac5.5在巴斯德畢赤氏酵母中的表達使用了從Invitrogen商業(yè)購得的一個表達系統(tǒng)，及相關的表達載體(pPIC3和pPIC9)和巴斯德畢赤氏酵母菌株(GS115和KM71)。巴斯德畢赤氏酵母菌株GS115和KM71是組氨酸營養(yǎng)缺陷型。表達載體含有來自巴斯德畢赤氏酵母的醇氧化酶基因AOX1的啟動子和終止子。Trametes versicolor漆酶Lac5.5的cDNA克隆到這兩個遺傳調控元件之間。載體pPIC9含有位于AOX1啟動子下游的編碼啤酒糖酵母的α-因子蛋白的信號序列的DNA序列，后面跟有一段編碼識別序列Glu-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala(SEQ ID NO15)的DNA短序列。載體上含有用于在E.coli中選擇的氨芐青霉素抗性基因。載體上含有用于在巴斯德畢赤氏酵母中選擇的來自巴斯德畢赤氏酵母的HIS4基因。A帶有漆酶Lac5.5信號序列的漆酶Lac5.5表達載體的構建利用載體pLac5.5和引物K和L擴增漆酶基因。引物K和L的序列如下引物K5’-ACTCGAGAATTCACCATGACTGGGCTGCGTCTTCTTCC-3’(SEQ ID NO16)引物L5’-ACTAGAGCGGGCCGCCTATCACTGGTCGTCAGCGTCGAGGGC-3’(SEQ ID NO17)引物K含有一個EcoRI的切點序列(劃線部分)，其后為編碼漆酶Lac5.5信號序列的前7位氨基酸的DNA序列。引物L含有一個NotI的切點序列(劃線部分)，其后為反相互補方向的，翻譯終止密碼子及編碼漆酶Lac5.5信號序列的最后7位氨基酸的DNA序列。
PCR擴增按照本領域熟練技術人員所熟知的方法進行。在50μl的PCR體系中使用20ng的pLac5.5DNA，并含有0.5U的Vent聚合酶，1mM MgCl2，0.2mM的各4種dNTP和各100pmol的引物K和L。所需PCR產(chǎn)物的特異擴增的其他條件是94℃5分鐘后，25個循環(huán)的94℃1分鐘，55℃1分鐘和72℃2分鐘。得到所預計的1.5kb大小的PCR片段。該PCR片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，用限制酶EcoRI和NotI酶切，乙醇沉淀并溶解于H2O中。載體pPIC3用限制酶EcoRI和NotI酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，分離，用堿性磷酸酶處理。之后用苯酚/氯仿(3∶1)抽提，乙醇沉淀。PCR擴增制備的漆酶Lac5.5的DNA片段與這樣制備的pPIC3載體連接，轉化E.coli Top 10F′細胞(Invitrogen)。從氨芐青霉素抗性克隆中分離出質粒DNA，用限制酶EcoRI和NotI酶切鑒定克隆的1.5kb插入序列。在12個所分析的克隆中9個呈陽性。這樣制備的載體被稱為pL512(圖3)。B帶有啤酒糖酵母的α-因子的信號序列的漆酶Lac5.5表達載體的構建利用質粒pLac5.5和引物L和M擴增漆酶基因。引物M的序列如下引物M5’-ACTCGAGAATTCGGGATCGGGCCTGTGCTCGACCTCACG-3’(SEQ ID NO18)引物M含有一個EcoRI的切點序列(劃線部分)，其后為編碼加工過的漆酶Lac5.5的假定的N-端的前9個氨基酸的DNA序列。加工過的漆酶Lac5.5的假定的N-端是從與其他漆酶序列的比較中推導出來的。
編碼加工過的漆酶Lac5.5的DNA片段，按照如本實施例A部分中所述的方法，通過載體pLac5.5和引物L和M的PCR擴增而制備。載體pPIC9用EcoRI和NotI酶切，如本實施例A部分所述的制備載體pPIC3那樣制備，并與PCR擴增制備的漆酶Lac5.5的DNA片段連接，轉化E.coli Top 10F′細胞(Invitrogen)。從氨芐青霉素抗性克隆中分離出質粒DNA，用限制酶EcoRI和NotI酶切鑒定克隆的1.5kb的插入序列。在12個所分析的克隆中3個呈陽性。這樣制備的載體被稱為pL532(圖4)。C巴斯德畢赤氏酵母的轉化首先在5ml YPD培養(yǎng)基(1％酵母抽提物，2％蛋白胨，2％右旋糖)中于30℃培養(yǎng)巴斯德畢赤氏酵母菌株GS115和KM71過夜。取0.2ml該預培養(yǎng)物接種到兩個主培養(yǎng)基，每個為250ml的YPD培養(yǎng)基，再于30℃過夜培養(yǎng)至光密度(OD600nm)為1.3-1.5。然后將250ml的主培養(yǎng)物離心(1500×g5分鐘)沉淀酵母細胞，用200ml H2O洗滌兩次，10ml 1M山梨醇洗滌1次，最后加入0.5ml 1M山梨醇。
用StuI或NsiI酶切，使載體pL512或pL532的質粒DNA線性化，乙醇沉淀并用水溶解至1μgDNA/μl的濃度。轉化混合物中含有80μl巴斯德畢赤氏酵母細胞和10μg線性載體DNA。轉化通過1500V，25μF和200Ohm的電穿孔(BioRad Gene Pulser)進行，放電時間約4.2ms。在轉化混合物中加入1ml 1M山梨醇，冰育30分鐘，然后取0.3ml液體涂板于不含組氨酸的MD培養(yǎng)板(1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％右旋糖，1.5％瓊脂)上。30℃培養(yǎng)3-5天后出現(xiàn)轉化子，在MD培養(yǎng)基平板劃線培養(yǎng)兩次純化轉化子。在MM指示培養(yǎng)基平板上鑒定漆酶產(chǎn)物，MM指示培養(yǎng)基含有1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇，1.5％瓊脂，1mM ABTS和0.1mM CuSO4。誘導物甲醇放于培養(yǎng)皿的蓋子中，并每天更新，以確保通過揮發(fā)向菌落提供甲醇。漆酶產(chǎn)物經(jīng)30℃培養(yǎng)2-3天后呈現(xiàn)出綠色暈輪。E搖瓶中的表達向50ml BMGY培養(yǎng)基(1％酵母抽提物，2％蛋白胨，0.1M磷酸鉀，pH6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油)中接種一個產(chǎn)漆酶的巴斯德畢赤氏酵母轉化子，在搖床上以300rpm于28℃培養(yǎng)48小時。預培養(yǎng)的細胞經(jīng)離心(1500g，10分鐘)分離，再懸于10ml主培養(yǎng)基中(MMY，1％酵母抽提物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％生物素，3％甲醇)。MMY培養(yǎng)基補充以0.5mM硫酸銅，主培養(yǎng)物在搖床上以300rpm在室溫下繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24小時用甲醇(0.3ml/10ml培養(yǎng)基)補充主培養(yǎng)物。24小時后開始產(chǎn)生重組漆酶Lac5.5。主培養(yǎng)開始后190小時時產(chǎn)率可高達4U/ml。實施例10重組漆酶Lac5.5的分離如實施例8中所述，通過培養(yǎng)轉化的曲霉菌株獲得重組漆酶Lac5.5。含有漆酶Lac5.5的培養(yǎng)物上清通過交叉流過濾濃縮。為此使用了具有30kD排阻限制的Sartocon微型過濾器(Sartorius)。然后將濃縮的漆酶Lac5.5凍干并溶解于20mM磷酸鈉，pH6.0。濃縮的重組漆酶Lac5.5的活性是18.6U/ml。
經(jīng)交叉流過濾濃縮的漆酶對20mM bistris-HCl，pH6.5透析，之后測量的電導為1.5mS/cm。透析后的漆酶在一個DEAE-Sepharose(Pharmacia)柱上進行層析，柱子用20mM bistris-HCl(上樣緩沖液)，pH6.5平衡。在此條件下，漆酶結合于DEAE-Sepharose。經(jīng)上樣緩沖液中0-0.5M NaCl線性梯度的洗脫，在0.15M NaCl濃度時回收獲得漆酶活性。將DEAE-Sepharose柱的漆酶收集組分與20％飽和度的硫酸銨和pH4.5的醋酸鈉(終濃度為20mM)混合，用醋酸調節(jié)pH至4.5。這樣制備的漆酶組分在phenyl-Sepharose(Pharmacia)柱上進行層析，柱子用上樣緩沖液(20mM醋酸鈉，20％飽和度的硫酸銨，pH4.5)平衡。在此條件下，漆酶結合于phenyl-Sepharose。經(jīng)pH4.5的20mM醋酸鈉緩沖液中20至0％飽和度的硫酸銨線性梯度的洗脫，在16％硫酸銨飽和度時回收獲得漆酶活性。漆酶組分對20mMbistris-HCl，pH6.5透析，通過結合于DEAE-Sepharose及0.3M NaCl的分步洗脫進行濃縮。0.3M NaCl的結合和洗脫均在20mM bistris-HCl，pH6.5中進行?；谄鹗嘉镔|的漆酶活性的產(chǎn)率為20％。對分離的漆酶作N-末端氨基酸測序分析。由此確定的序列為Gly Ile Gly Pro Val Leu Asp Leu Thr Ile Ser Arg Ala Val(SEQ IDNO19)，它與cDNA序列以及同源比較而導出的成熟漆酶Lac5.5的N-末端相符合。實施例11重組漆酶Lac5.5的生物化學特性對實施例8中所述的從曲霉中制備的重組漆酶Lac5.5的最適溫度和pH及pH和溫度穩(wěn)定性進行了分析。在這些實驗中，重組漆酶Lac5.5的緩沖液在Sephadex G25(Pharmacia，PD10柱)上先改變?yōu)镸cIllvaine緩沖液，pH4.5。A最適pH通過適當混合非緩沖的檸檬酸鈉和磷酸鈉溶液來制備圖5所示的各種pH值的緩沖液。在37℃下的各種pH中確定重組漆酶Lac5.5的漆酶活性。如圖5所表明的，漆酶Lac5.5具有的對于底物ABTS的最佳活性處在強酸范圍。BpH穩(wěn)定性漆酶Lac5.5預先溫育于pH3.0，4.5和6.0的McIllvaine緩沖液中(37℃)。經(jīng)0，30，60和120分鐘后分別取出等份樣品，用pH4.5的McIllvaine緩沖液稀釋，在37℃下確定漆酶活性。pH4.5和6.0的預處理對漆酶活性并無影響。在pH3.0下漆酶的半衰期為60至120分鐘(圖6)。C最適溫度在如圖7所示的溫度下對重組漆酶Lac5.5的漆酶活性進行了測定。通過在McIllvaine緩沖液，pH4.5中利用ABTS分析確定漆酶的活性。令人驚奇地，從中發(fā)現(xiàn)漆酶Lac5.5的最適溫度為70℃。在50℃和80℃時測定的漆酶活性仍為最大活性的一半。D溫度穩(wěn)定性漆酶Lac5.5預先溫育于45℃，55℃和65℃，pH4.5的McIllvaine緩沖液中。經(jīng)0，30，60和120分鐘后分別取出等份樣品，用pH4.5的McIllvaine緩沖液稀釋，在37℃下確定漆酶活性。45℃的預處理對漆酶活性并無影響。經(jīng)55℃預溫育120分鐘后的測定表明仍然具有80％的活性。在65℃下漆酶的半衰期為60分鐘(圖8)。序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱電化學工業(yè)有限公司(國際)(B)街道Zielstattstrasse20(C)城市慕尼黑(D)國家德國(F)郵政編碼D-81379(G)電話089 748440(H)電傳089 74844350(ii)發(fā)明名稱DNA序列，這些DNA序列的表達，這些DNA序列所編碼的嗜熱漆酶，及其應用(iii)序列數(shù)目19(iv)計算機閱讀格式(A)介質類型軟盤(B)計算機類型IBMPC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1572個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型cDNA至mRNA(iii)假設否(iii)[sic]反義否(vi)原始來源(A)生物Trametes versicolor(B)菌株TV-1(vii)直接來源(B)克隆pLac55
(xi)序列描述SEQIDNO1ATGACTGGGC TGCGTCTTCT TCCTTCCTTC GCGGCGTTGG CCGTGACCGT GTCTCTCGCG60CTCAACGCGT TGGCTGGGAT CGGGCCTGTG CTCGACCTCA CGATCTCCAA CGCGGTGGTG120TCGCCCGATG GCTTCTCTCG CGCGGCGGTC GTTGCGAACG ACCAGGCTCC CGGGCCTCTC180ATTACGGGCC AGATGGGCGA CCGTTTCCAG ATCAATGTGG TCAACAAGCT GTCGAACCAC240ACTATGCTCA AGTCGACCAG CATCCACTGG CACGGCTTCT TCCAGAAGGG TACGAACTGG300GCCGATGGCC CCGCGTTCGT GAACCAGTGC CCGATCGCGA CTGGTCACTC GTTCCTTTAC360GACTTCCAGG TCCCGGACCA GGCCGGGACG TTCTGGTACC ACAGCCATTT GTCTACCCAG420TACTGTGACG GGTTGAGAGG TCCTTTCGTC GTCTACGACC CGAACGACCC TCATGCCAGC480CTCTACGACG TGGACAACGA TGACACCGTC ATCACCCTCG CTGACTGGTA CCATACCGCT540GCCAAGCTTG GGCCGGCCTT CCCTCCTGGC TCTGATGCGA CGTTGATCAA TGGGCTCGGA600CGTACAGCGG CCACCCCCAA CGCGGATCTC GCTGTCATTA GTGTCACGCA CGGCAAGCGG660TACCGTTTCC GCCTGGTGTC GATGTCCTGC GACCCCGCGT ACACGTTCAG CATCGACGAC720CACTCGATGA CCATCATCGA GGCGGACTCA GTCAACACAA AGCCGCTCGA GGTCGACTCG780ATCCAGATCT TCGCCGGCCA GCGCTACTCG TTCGTGCTGG AGGCAAACCA GGACGTCGGC840AACTATTGGG TCCGCGCGGA CCCGCTGTTT GGCACGACGG GCTTCGATGG GGGTATCAAC900TCTGCGATCC TCCGGTACGA CACCGCGTCG CCGACCGAGC CGACCACGAC GCAGGCCACC960TCTACGAAGC CGTTGAAGGA GACGGACCTT GAGCCTCTCG CGTCGATGCC GGTGCCTGGC1020TCTGCTGTCT CGGGTGGTGT GGACAAGGCG ATTAACTTCG CTTTCAGCTT CAACGGGTCC1080AACTTCTTCA TCAACGGCGC GACCTTCCAG CCGCCCACCA CTCCCGTTCT GCTGCAGATC1140ATGAGCGGTG CCCAGGCTGC TAGCGACCTC CTCCCGTCCG GTGACGTCTA CGCCCTGCCG1200TCGGACTCGA CCATCGAGCT CTCGTTCCCC GCGACTACTG GTGCTCCCGG TGCCCCCCAC1260CCCTTCCACT TGCACGGTCA CACCTTCGCC GTTGTGCGCA GCGCGGGCAG CGCTGAGTAC1320AACTACGACA ACCCCATCTG GCGCGACGTC GTCAGCACTG GTACCCCTGC AGCGGGCGAT1380AACGTCACCA TTCGCTTCAG GACTGACAAC CCTGGCCCGT GGTTCCTCCA CTGCCACATC1440GACTTCCACT TGGAGGCCGG CTTCGCCGTG GTCATGGCTG AAGACATCCC CGACACCAAG1500GCCGACAACC CTGTTCCTCA GGCGTGGTCA GACCTTTGCC CCATCTACGA CGCCCTCGAC1560GCTGACGACC AG1572(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度1572個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型cDNA至mRNA(iii)假設否(iii)[sic]反義否(vi)原始來源(A)生物Trametes versicolor(B)菌株TV-1(vii)直接來源(B)克隆pLac56(xi)序列描述SEQ ID NO2ATGACTGGGC TGCGTCTTCT TCCTTCCTTC GCGGCGTTGG CCGTGACCGT GTCGCTCGCG60CTCAACGCGT TGGCCGGGAT CGGGCCCGTG CTCGACCTTA CGATCTCCAA TGCGGTTGTT120TCGCCCGATG GCTTCTCTCG CGCGGCGGTC GTCGCGAACG ACCAGGCTCC CGGGCCTCTC180ATCACGGGCC AGATGGGCGA CCGCTTCCAG ATCAATGTGG TCAACAAGCT GTCGAACCAC240ACCATGCTTA AATCGACCAG CATCCACTGG CACGGCTTCT TCCAGAAGGG CACGAACTGG300GCGGACGGCC CTGCGTTCGT GAACCAATGC CCGATTGCGA CGGGCCACTC GTTCCTTTAC360GACTTCCAGG TCCCGGACCA GGCCGGGACG TTCTGGTACC ACAGCCATCT GTCTACTCAG420TACTGCGATG GCTTGAGGGG TCCGTTCGTC GTCTACGACC CGAATGACCC TCATGCCAGT480CTCTACGATG TGGACAACGA TGACACCGTC ATCACCCTCG CCGATTGGTA CCATACTGCT540GCCAAGCTTG GGCCGGCCTT CCCTCCTGGC TCTGATGCGA CGTTGATCAA TGGGCTCGGA600CGTACAGCGG CCACCCCCAA CGCGGACCTC GCTGTCATCA GCGTCACGCA CGGCAAGCGG660TACCGTTTCC GCCTGGTGTC GATGTCCTGC GACCCCGCGT ACACCTTCAG CATCGACGAC720CACTCGATGA CCATCATCGA GGCGGACTCG GTCAACACGA AGCCGCTCGA GGTCGACTCG780ATCCAGATCT TCGCCGGCCA GCGCTACTCG TTCGTGCTGG AGGCAAACCA GGACGTCGGC840AACTATTGGG TCCGCGCGGA CCCGCTGTTT GGCACGACGG GCTTCGATGG GGGTATCAAC900TCTGCGATCC TCCGGTACGA CACCGCGTCG CCGACCGAGC CGACCACGAC GCAGGCCACC960TCTACGAAGC CGTTGAAGGA GACGGACCTT GAGCCTCTCG CGTCGATGCC GGTGCCTGGC1020TCTGCTGTGT CGGGTGGTGT GGACAAGGCG ATTAACTTCG CTTTCAGCTT CAACGGGTCC1080AACTTCTTCA TCAACGGCGC GACCTTCCAG CCGCCCACCA CTCCCGTTCT GCTGCAGATC1140ATGAGCGGTG CCCAGGCTGC TAGCGACCTC CTCCCGTCCG GTGACGTCTA CGCCCTGCCG1200TCGGACTCGA CCATCGAGCT CTCGTTCCCC GCGACTACTG GTGCTCCCGG TGCCCCCCAC1260CCCTTCCACT TGCACGGTCA CACCTTCGCC GTTGTGCGCA GCGCGGGCAG CGCTGAGTAC1320AACTACGACA ACCCCATCTG GCGCGACGTC GTCAGCACTG GTACCCCTGC AGCGGGCGAT1380AACGTCACCA TTCGCTTCAG GACTGACAAC CCTGGCCCGT GGTTCCTCCA CTGCCACATC1440GACTTCCACT TGGAGGCCGG CTTCGCCGTG GTCATGGCTG AAGACATCCC CGACACCAAG1500GCCGACAACC CTGTTCCTCA GGCGTGGTCA GACCTTTGCC CCATCTACGA CGCCCTCGAC1560GCTGACGACC AG1572(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度524個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假設是(vi)原始來源(A)生物Trametes versicolor(B)菌株TV-1(ix)特征(A)名稱/關鍵蛋白質(B)位置1..524(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Thr Gly Leu Arg Leu Leu Pro Ser Phe Ala Ala Leu Ala Val Thr1 510 15Val Ser Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ala Gly Ile Gly Pro Val Leu Asp202530Leu Thr Ile Ser Asn Ala Val Val Ser Pro Asp Gly Phe Ser Arg Ala354045Ala Val Val Ala Asn Asp Gln Ala Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Gln50 55 60Met Gly Asp Arg Phe Gln Ile Asn Val Val Asn Lys Leu Ser Asn His65 70 75 80Thr Met Leu Lys Ser Thr Ser Ile His Trp His Gly Phe Phe Gln Lys85 90 95Gly Thr Asn Trp Ala Asp Gly Pro Ala Phe Val Asn Gln Cys Pro Ile100 105 110Ala Thr Gly His Ser Phe Leu Tyr Asp Phe Gln Val Pro Asp Gln Ala115 120 125Gly Thr Phe Trp Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly130135140Leu Arg Gly Pro Phe Val Val Tyr Asp Pro Asn Asp Pro His Ala Ser145 150 155 160Leu Tyr Asp Val Asp Asn Asp Asp Thr Val Ile Thr Leu Ala Asp Trp165 170 175Tyr His Thr Ala Ala Lys Leu Gly Pro Ala Phe Pro Pro Gly Ser Asp180185 190Ala Thr Leu Ile Asn Gly Leu Gly Arg Thr Ala Ala Thr Pro Asn Ala195 200205Asp Leu Ala Val Ile Ser Val Thr His Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg210 215 220Leu Val Ser Met Ser Cys Asp Pro Ala Tyr Thr Phe Ser Ile Asp Asp225 230 235240His Ser Met Thr Ile Ile Glu Ala Asp Ser Val Asn Thr Lys Pro Leu245 250 255Glu Val Asp Ser Ile Gln Ile Phe Ala Gly Gln Arg Tyr Ser Phe Val260265270Leu Glu Ala Asn Gln Asp Val Gly Asn Tyr Trp Val Arg Ala Asp Pro275280 285Leu Phe Gly Thr Thr Gly Phe Asp Gly Gly Ile Asn Ser Ala Ile Leu290 295 300Arg Tyr Asp Thr Ala Ser Pro Thr Glu Pro Thr Thr Thr Gln Ala Thr305 310315 320Ser Thr Lys Pro Leu Lys Glu Thr Asp Leu Glu Pro Leu Ala Ser Met325 330 335Pro Val Pro Gly Ser Ala Val Ser Gly Gly Val Asp Lys Ala Ile Asn340345 350Phe Ala Phe Ser Phe Asn Gly Ser Asn Phe Phe Ile Asn Gly Ala Thr355 360 365Phe Gln Pro Pro Thr Thr Pro Val Leu Leu Gln Ile Met Ser Gly Ala370 375380Gln Ala Ala Ser Asp Leu Leu Pro Ser Gly Asp Val Tyr Ala Leu Pro385 390 395 400Ser Asp Ser Thr Ile Glu Leu Ser Phe Pro Ala Thr Thr Gly Ala Pro405410 415Gly Ala Pro His Pro Phe His Leu His Gly His Thr Phe Ala Val Val420425 430Arg Ser Ala Gly Ser Ala Glu Tyr Asn Tyr Asp Asn Pro Ile Trp Arg435 440 445Asp Val Val Ser Thr Gly Thr Pro Ala Ala Gly Asp Asn Val Thr Ile450 455460Arg Phe Arg Thr Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu His Cys His Ile465 470 475480Asp Phe His Leu Glu Ala Gly Phe Ala Val Val Met Ala Glu Asp Ile485490 495Pro Asp Thr Lys Ala Asp Asn Pro Val Pro Gln Ala Trp Ser Asp Leu500 505 510Cys Pro Ile Tyr Asp Ala Leu Asp Ala Asp Asp Gln515 520(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設是(iii)[sic]反義否(xi)序列描述SEQ ID NO4TGGCAYGGNT TYTTYCA17(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度14個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設是(iii)[sic]反義無(xi)序列描述SEQ ID NO5TCDATRTGRC ARTG 14(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性
(ii)分子類型cDNA(iii)假設是(iii)[sic]反義否(xi)序列描述SEQ IDNO6ATTCAGGGAT CCTGGTAYCA YWSNCAY 27(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設是(iii)[sic]反義否(xi)序列描述SEQ ID NO7ATACGAGGAT CCRTGNCCRT GNARRTG 27(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度3284個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否
(iii)[sic]反義否(vi)原始來源(A)生物Trametes versicolor(B)菌株TV-1(vii)直接來源(B)克隆plac56chr(xi)序列描述SEQ ID NO8TTGGAATGGG CCCGCCGGTG TCGATCGCAA ACAGGTGAGT TCAGTACTAG CCCATCAGCG60CAGCAGCATT TGCGGCGAAG AAGTGTCCGC CCCACGCTCA TCACCCAGCG CCCTTCTCGA120CATCGGAACC GCCGCAACAC AGGGAAGAGG CCATTTCGCC CATCCAAGGC TCGGGGATCT180TCTCACGACG CGAGGGCATT TCGCGCGAGC GTCGCAGCCG GTGCGCCGAG GCTGCATGAT240CTGTGCGGCT CCTGCGCGTA TGCCGCTCGG GTCGCCGAGA CACAGCGAGA CATCTGCAGC300CGGGGCGGCG CGCAACCAGC TCGGCTGTTT GGAGTGCGTC GATGCAACGC GTCGACGTCC360ATCGGGGACG GCGCGTGGCT TGGCACGCGT AGCACCGACG CGCACTATAA AGGCGATGCG420GCAGAGAAGA GGCGGAGCAC CACGTTCAGT CCCTTCCTTG GATTCCGGGC AGCTTACTCC480TTCTCGCCTC TCTCTGCCTC CTTTCCTTCG GGCTTCTACT CTTCTTTTCT ATTTCGCTTC540TGTTCGAGGG TAGAACACAG AACACTATGA CTGGGCTGCG TCTTCTTCCT TCCTTCGCGG600CGTTGGCCGT GACCGTGTCG CTCGCGCTCA ACGCGTTGGC CGGGATCGGG CCCGTGCTCG660ACCTTACGAT CTCCAATGCG GTTGTTTCGC CCGATGGCTT CTCTCGCGCG GCGGTCGTCG720CGAACGACCA GGCTCCCGGG CCTCTCATCA CGGGCCAGAT GGGCGACCGC TTCCAGATCA780ATGTGGTCAA CAAGCTGTCG AACCACACCA TGCTTAAATC GACCAGCATC GTGAGTATTC840AATCTGGGCG TGGGGGTACG GGCTGCACTG ACGCAAGTAC ACGCTTCGCA GCACTGGCAC900GGCTTCTTCC AGAAGGGCAC GAACTGGGCG GACGGCCCTG CGTTCGTGAA CCAATGCCCG960ATTGCGACGG GCCACTCGTT CCTTTACGAC TTCCAGGTCC CGGACCAGGC CGGTATGTGA1020TCACGGAAGG TGTGCACGAA CCCAGCACTG ACGGTCATGT AGGGACGTTC TGGTACCACA1080GCCATCTGTC TACTCAGTAC TGCGATGGCT TGAGGGGTCC GTTCGTCGTC TACGACCCGA1140ATGACCCTCA TGCCAGTCTC TACGATGTGG ACAACGGTAA GCAGTTCAGA TTGCGAATCC1200TTGGCGGTCT ATTGACATCC CGGCCAGATG ACACCGTCAT CACCCTCGCC GATTGGTACC1260ATACTGCTGC CAAGCTTGGG CCGGCCTTCC CGTAAGTTGG ATTGTCAGTC TGTCTGTTCT1320CTACTTACTA ATCACGGGCT GCAGTCCTGG CTCTGATGCG ACGTTGATCA ATGGGCTCGG1380ACGTACAGCG GCCACCCCCA ACGCGGACCT CGCTGTCATC AGCGTCACGC ACGGCAAGCG1440GTAAGAGCGG CTGTACCTTC CTCTTGCTCG CAGCTGCTCA AACTTTATGG TTTATAGGTA1500CCGTTTCCGC CTGGTGTCGA TGTCCTGCGA CCCCGCGTAC ACCTTCAGCA TCGACGACCA1560CTCGATGACC ATCATCGAGG CGGACTCGGT CAACACGAAG CCGCTCGAGG TCGACTCGAT1620CCAGATCTTC GCCGGCCAGC GCTACTCGTT CGTGCTGGAG GCAAACCAGG ACGTCGGCAA1680CTATTGGGTC CGCGCGGACC CGCTGTTTGG CACGACGGGC TTCGATGGGG GTATCAACTC1740TGCGATCCTC CGGTACGACA CCGCGTCGCC GACCGAGCCG ACCACGACGC AGGCCACCTC1800TACGAAGCCG TTGAAGGAGA CGGACCTTGA GCCTCTCGCG TCGATGCCGG TGGTAAGTCT1860GACTAGCACT TCATCTTTGA TGGTATGCTC ATGCAACTCT CCAGCCTGGC TCTGCTGTGT1920CGGGTGGTGT GGACAAGGCG ATTAACTTCG CTTTCAGCTT CGTACGTCCA ACTCACGATT1980TCCCCCTTGA GATTTATATT GATGGCTCCA TTGACGGCTC CTCATAGAAC GGGTCCAACT2040TCTTCATCAA CGGCGCGACC TTCCAGCCGC CCACCACTCC CGTTCTGCTG CAGATCATGA2100GCGGTGCCCA GGCTGCTAGC GACCTCCTCC CGTCCGGTGA CGTCTACGCC CTGCCGTCGG2160ACTCGACCAT CGAGCTCTCG TTCCCCGCGA CTACTGGTGC TCCCGGTGCC CCCCACCCCT2220TCCACTTGCA CGGTGTAAGT TGTCATCTCA ATGTTCCGTT TGGGCCCCGA TACTAACGGC2280TAGATAGCAC ACCTTCGCCG TTGTGCGCAG CGCGGGCAGC GCTGAGTACA ACTACGACAA2340CCCCATCTGG CGCGACGTCG TCAGCACTGG TACCCCTGCA GCGGGCGATA ACGTCACCAT2400TCGCTTCAGG GTGAGTTGCT ATCATTATCC CCTCCTGTGT AATCGGTCGC TGACAGTCCT2460GCAGACTGAC AACCCTGGCC CGTGGTTCCT CCACTGCCAC ATCGACTTCC ACTTGGAGGC2520CGGCTTCGCC GTGGTCATGG CTGAAGACAT CCCCGACACC AAGGCCGACA ACCCTGTTCC2580TCGTGAGTAT TACCCCCCAA TCCCGTCAAG GCGCGCACTA ACAGGGTATT GCTGCAGAGG2640CGTGGTCAGA CCTTTGCCCC ATCTACGACG CCCTCGACGC TGACGACCAG TGAACACGCC2700TCACGAGATC GTCAACCATT TCCTCAATCA TTGACTTACC GACTTGCTAT TTCTAACACG2760CTATTTGCGA ACCCCCGCTC TCCCCTCTCT CACACTACGG TCCCTTCGTG AACATGGACT2820TGCATGGACT TTGGATTGTA GAAAGTTTAC ACAGCTGTAT AGTCGAATTA TCCCCGTAAT2880GCATGGTAGT GCCGCTGGCC TTTACCTCAA TCATTGTTAT CATGATATGG CCATCATAAA2940CATCACTGAC ATCTACTAAT CTGCTGTTAG TTTTGGGACC TCAAGAAGAT AAACGCCCGT3000CTACCACGAT GTGACGCGCG CGATACGTGA ATGTGACTGA TCGCGTTCCA TTATTCAAAA3060CGCGTCGGCT GGCGGCCAGG CCAAGTTGCT CCTCTCTCTC CGACGACGAC CACCCCTGGC3120TCTCTTACCC ACCTTCTCTG CACCATGACG GCAGACTACA GACTACAGTC TCTCGACGAT3180CCGACGGCGG TCATCCAAGA GCTCTACCGC GCCCATCCAG ACCCGAACGG TTTCCCCCGC3240CTCGTTGCTG AGCACTTCCA AAAGCTCTTC GAGAACCGAA CATG3284(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設是(iii)[sic]反義否(xi)序列描述SEQ ID NO9CCGGAATTCA TGACTGGGCT GCGTCTCCTT CCTTCCTTC39(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設是(iii)[sic]反義否(xi)序列描述SEQ ID NO10GAGAGGCCCG GGAGCCTGG 19(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設是(iii)[sic]反義否(xi)序列描述SEQ IDNO11GCTGAATTCG AAGACATCCC CGACACCAAGG 31(2)SEQIDNO12的信息(i)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設是(iii)[sic]反義否(xi)序列描述SEQ ID NO12TGCTCTAGAA AGCTTAAGTT CACTGGTCGT CAGCGTCGAG GG42(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度43個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設是(iii)[sic]反義否(xi)序列描述SEQ ID NO13CCGGAATTCG ATATCCAAGC GCGGGATCGG GCCTGTGCTC GAC 43(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ii)分子類型肽(iii)假設是(v)片段類型內部(vi)原始來源(A)生物黑曲霉(xi)序列描述SEQ ID NO14Ile Ser Lys Arg1(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性
(ii)分子類型肽(iii)假設是(v)片段類型內部(vi)原始來源(A)生物啤酒糖酵母(xi)序列描述SEQ ID NO15Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala1 5(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設是(iii)[sic]反義否(xi)序列描述SEQ ID NO16ACTCGAGAAT TCACCATGAC TGGGCTGCGT CTTCTTCC 38(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度41個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性
(ii)分子類型cDNA(iii)假設是(iii)[sic]反義否(xi)序列描述SEQ ID NO17ACTAGAGCGG CCGCCTATCA CTGGTCGTCA GCGTCGAGGG C 41(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設是(iii)[sic]反義否(xi)序列描述SEQ ID NO18ACTCGAGAAT TCGGGATCGG GCCTGTGCTC GACCTCACG39(2)SEQ IDNO19的信息(i)序列特征(A)長度14個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ii)分子類型肽(iii)假設否(v)片段類型N末端(xi)序列描述SEQ ID NO19Gly Ile Gly Pro Val Leu Asp Leu Thr Ile Ser Aro Ala Val1 510
權利要求
1.一種編碼具有漆酶活性的蛋白質的DNA序列，其含有DNA序列SEQ ID NO1的第76位直至且包括第1572位或者SEQ ID NO2的第76位直至且包括第1572位的序列，或者與所說的DNA序列具有80％以上的同源性的DNA序列。
2.含有如權利要求1所述的DNA序列的表達載體。
3.如權利要求2中所述的表達載體，其上另外還含有一個在宿主生物中調節(jié)漆酶基因表達的啟動子，和適合于該宿主生物且功能性地連接在如權利要求1所述的DNA序列3′末端的轉錄終止信號。
4.如權利要求3所述的表達載體，其中的啟動子選自tac啟動子、枯草桿菌蛋白酶啟動子、GAL啟動子、TAKA淀粉酶啟動子、多角蛋白啟動子、葡糖淀粉酶啟動子、GAPDH啟動子和醇氧化酶啟動子。
5.如權利要求3或4所述的表達載體，其中另外還含有一個N-末端信號序列。
6.如權利要求5所述的表達載體，其中的N-末端序列是存在于漆酶基因的天然信號序列，或者是選自下列一組分泌蛋白的信號序列Klebsiella oxytoca的α-環(huán)糊精葡糖轉移酶、枯草桿菌的枯草桿菌蛋白酶、啤酒糖酵母的α-因子、巴斯德畢赤氏酵母的酸性磷酸酶、黑曲霉的α-淀粉酶、或者黑曲霉或泡盛曲霉的葡糖淀粉酶。
7.如權利要求5所述的表達載體，其中一個分泌蛋白的基因或者一個蛋白的分泌片段的基因區(qū)段有功能地與該漆酶基因相連接。
8.含有如權利要求1所述的DNA序列或者如權利要求2至7任一項所述的表達載體的微生物菌株。
9.含有蛋白質序列SEQ ID NO3的蛋白質。
10.如權利要求9所述的蛋白質在紙漿的去木質化、高分子量聚集物的解聚、廢紙的去墨漬、廢水尤其是紙漿漂白后含木質素的廢水中的芳香化合物的聚合、染料的氧化、或者染料的活化以形成顏料中的應用及該蛋白質在有機合成中芳香化合物的偶聯(lián)反應或者芳香側鏈的氧化作用中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼具有漆酶活性的蛋白質且含有DNA序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2之一的DNA序列。本發(fā)明進而涉及這些DNA序列的表達,這些DNA序列編碼的嗜熱漆酶,及其在紙漿的去木質化、高分子量聚集物的解聚、廢紙的去墨漬、廢水尤其是紙漿漂白后含木質素的廢水中的芳香化合物的聚合、染料的氧化、或者染料的活化以形成顏料中的應用以及其在有機合成上用于芳香化合物的偶聯(lián)反應或者芳香側鏈的氧化作用中的應用。
文檔編號C12N1/15GK1259166SQ98805778
公開日2000年7月5日 申請日期1998年6月4日 優(yōu)先權日1997年6月6日
發(fā)明者魯珀特·普法勒, 京特·維希 申請人:電化學工業(yè)有限公司(國際)