專利名稱：抗微生物肽的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及新的人類防衛(wèi)素肽。具體地說，本發(fā)明提供了編碼人類抗微生物肽的分離的核酸分子。本發(fā)明也提供了抗微生物肽以及載體、宿主細(xì)胞和產(chǎn)生該肽、載體、宿主細(xì)胞的重組方法。本發(fā)明還提供了用于檢測與免疫系統(tǒng)有關(guān)的病癥的診斷方法和用于治療這些病癥的方法。
發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)呼吸上皮在哺乳動(dòng)物中的關(guān)鍵作用之一是形成防止可能有害的環(huán)境威脅的屏障。已經(jīng)確定其防衛(wèi)機(jī)制是保護(hù)呼吸道免受據(jù)認(rèn)為與空氣傳播途徑疾病有關(guān)的空中傳播物質(zhì)(如傳染性物質(zhì)、煤氣和微粒)的侵害。(Newhouse等，″呼吸道防衛(wèi)機(jī)理″，肺病教科書，Little Brown和Co.(1989))。最近對得自各種物種的抗微生物肽的鑒定和表征揭示了動(dòng)物宿主防衛(wèi)系統(tǒng)的一個(gè)新成員，并且據(jù)認(rèn)為它參與抗可能微生物病原體的防衛(wèi)。這些新近確定的抗微生物肽家族包括殺菌肽、爪蟾抗菌肽和防衛(wèi)素。殺菌肽是結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗微生物多肽的第一個(gè)完全鑒定出的家族，并且發(fā)現(xiàn)其存在于廣泛分布的昆蟲中。(Bowman等，微生物學(xué)年鑒41103(1987))。在脊椎動(dòng)物中，抗微生物肽的爪蟾抗菌肽家族已自有爪蟾蜍的皮膚和胃腸道腺體中分離得到，并且認(rèn)為它們形成了抗感染的兩棲動(dòng)物粘膜表面的防衛(wèi)系統(tǒng)的基礎(chǔ)。(Soravia等，F(xiàn)EBS Lett.228337(1988)；Zasloff等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，845449(1987))。防衛(wèi)素是在分離自幾種哺乳動(dòng)物物種(包括人)的噬菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的抗微生物肽，人們可以通過其序列中的八個(gè)不變殘基來表征它。(Gabay等，Curr.Opin.Immunol.136(1988)；Gabay等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，865610(1989)；Ganz等，傳染免疫，55568(1987)；Ganz等，免疫學(xué)雜志，1431358(1989)；Ganz等，臨床研究雜志，761427(1985))。
諸如防衛(wèi)素之類的肽的抗微生物活性的機(jī)理經(jīng)由導(dǎo)致特征性廣譜的抗生素活性的選擇性膜破裂來形成。(Bowman，免疫學(xué)年鑒1361(1995))。防衛(wèi)素的抗微生物譜包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌、分技桿菌、蒼白密螺旋體、許多真菌、一些有包膜病毒。(Bowman，免疫學(xué)年鑒1361(1995))。防衛(wèi)素具有抗多個(gè)正常和惡性靶的非特異性細(xì)胞毒性活性，包括抗TNF-α和NK-細(xì)胞溶解因子的細(xì)胞抗性。它們似乎經(jīng)由普通機(jī)理來殺害哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞和微生物，這些機(jī)理包括與帶負(fù)電的靶細(xì)胞表面分子之間的初始靜電作用，其后插入至它們可滲透的細(xì)胞膜中，形成電壓調(diào)節(jié)通道。(Lehrer等，免疫學(xué)年鑒11105(1993))。除它們的抗微生物與細(xì)胞毒性性質(zhì)之外，一些防衛(wèi)素充當(dāng)調(diào)理素，而另一些則抑制蛋白激酶C、特異性地結(jié)合ACTH受體以及封阻類固醇生成或充當(dāng)單核細(xì)胞的選擇性趨化素。防衛(wèi)素新近被描述為效應(yīng)分子家族，對人類來說，其對于宿主細(xì)胞防衛(wèi)、發(fā)炎和細(xì)胞毒性的貢獻(xiàn)可能是巨大的。(Lehrer等，免疫學(xué)年鑒11105(1993))。防衛(wèi)素是堿性肽，其具有30-34個(gè)氨基酸，有三個(gè)二硫鍵。已知的并且已鑒定出的骨髓和非骨髓組織的防衛(wèi)素都具有屬于該家族的高度保守的氨基酸殘基，其包括6個(gè)不變的半胱氨酸。最近的研究發(fā)現(xiàn)；類似的抗微生物肽也由某些上皮細(xì)胞制造，這表明它們在粘膜表面的防衛(wèi)中起著附加的作用。(Diamond等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，905496(1993)；Diamond等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，883952(1991)；Eisenhauer等，傳染免疫，603556(1992)；Jones等，生物化學(xué)雜志，26723216(1992)；Schonwetter等，科學(xué)2671645(1995)；Selsted等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，118929(1992))。
氣管抗微生物肽(TAP)是具有38個(gè)氨基酸的肽，其分離自牛呼吸道粘膜，并且是現(xiàn)在已被認(rèn)為屬于比較大的抗微生物肽家族(β-防衛(wèi)素)的第一個(gè)成員，該家族的所有成員在體外都具有廣譜的抗微生物活性。(Diamond等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，883952(1991))。前不久，自牛舌頭分離得到上皮細(xì)胞源的第二類β-防衛(wèi)素(即舌抗微生物肽(LAP))。(Schonwetter等，科學(xué)2671645(1995)；Selsted等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，118929(1992))。
因此，需要具有如抗微生物或免疫調(diào)節(jié)劑一樣的功能的多肽，因?yàn)樵谂c傳染病有關(guān)的病癥、發(fā)炎以及免疫紊亂中可能涉及這種調(diào)節(jié)的障礙。
發(fā)明概述本發(fā)明公開了分離的核酸分子，該核酸分子包含編碼抗微生物多肽的多核苷酸，該抗微生物多肽具有SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列或者為cDNA克隆所編碼的氨基酸序列，該cDNA克隆于1997年4月14日以保藏號97982保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心專利保藏處，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209。
本發(fā)明也涉及重組載體，該重組載體包含本發(fā)明的分離的核酸分子，以及涉及包含重組載體的宿主細(xì)胞，并且還涉及制造這樣的載體和宿主細(xì)胞的方法和利用它們由重組技術(shù)來產(chǎn)生抗微生物多肽或肽的方法。
本發(fā)明還公開了分離的人抗微生物多肽，該抗微生物多肽具有由本文描述的多核苷酸編碼的氨基酸序列。
本發(fā)明公開了一種在免疫系統(tǒng)紊亂的診斷期間有用的診斷方法。
本發(fā)明還涉及治療需要增加體內(nèi)抗微生物肽活性水平的個(gè)體的方法，該方法包括向這樣的個(gè)體施用包含治療上有效量的本發(fā)明分離的抗微生物肽或其興奮劑的組合物。
本發(fā)明還涉及治療需要減少體內(nèi)抗微生物肽活性水平的個(gè)體的方法，該方法包括向這樣的個(gè)體施用包含治療上有效量的抗微生物肽拮抗劑的組合物。
附圖概述

圖1顯示核苷酸(SEQ ID NO1)和人類抗微生物肽的推定的氨基酸(SEQ ID NO2)序列。蛋白質(zhì)含有具有大約23個(gè)氨基酸殘基(有下劃線)的前導(dǎo)序列和推定的大約7.3kDa分子量。圖1中的帶下劃線的氨基酸殘基(即前23個(gè)氨基酸)對應(yīng)于SEQ ID NO2中的氨基酸-23至-1。圖1中的其后41個(gè)氨基酸(無下劃線)對應(yīng)于SEQ ID NO2中的氨基酸1至41。
圖2顯示抗微生物肽蛋白質(zhì)與牛氣管抗微生物肽(SEQ ID NO3)的氨基酸序列之間的相似性區(qū)。
圖3顯示抗微生物肽氨基酸序列的分析結(jié)果。α、β、回轉(zhuǎn)和螺旋區(qū)，親水性、疏水性和兩親性區(qū)，柔性區(qū)，抗原指數(shù)以及表面可能性都得到了顯示。在“抗原指數(shù)-Jameson-Wolf”圖中，圖1中的大約42至大約50以及大約54至大約64的氨基酸殘基對應(yīng)于所顯示的抗微生物肽蛋白質(zhì)的高抗原區(qū)。圖1中的這些高抗原片段分別對應(yīng)于下列片段SEQ ID NO2中的大約19至大約27以及大約31至大約41的氨基酸殘基。
圖4顯示pHE4a表達(dá)載體(SEQ ID NO4)的示意性表達(dá)。其中指出了卡那霉素抗性標(biāo)記基因、多克隆位點(diǎn)連接區(qū)、oriC序列以及l(fā)acIq編碼序列的位置。
圖5顯示pHE4a啟動(dòng)子(SEQ ID NO5)的調(diào)節(jié)元件的核苷酸序列。兩種lac操縱基因序列、Shine-Delgarno序列(S/D)和末端HindIII與NdeI限制酶切位點(diǎn)(斜體)得到了說明。
發(fā)明詳述本發(fā)明公開了分離的核酸分子，該核酸分子包含編碼具有SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列的抗微生物肽的多核苷酸，該多核苷酸通過測序克隆的cDNA得到確定。本發(fā)明的抗微生物肽與牛氣管抗微生物肽(圖2)(SEQID NO3)具有序列同源性。SEQ ID NO1所示的核苷酸序列通過測序cDNA克隆(HLJB175)得到，該cDNA克隆于1997年4月14日以保藏號97982保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心專利保藏處，10801 UniversityBoulevard Manassas，VA 20110-2209。利用SalI/NotI限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)將所保藏的克隆插入pCMVSport1中。核酸分子除非額外說明，本文中所有通過測序DNA分子確定的核苷酸序列都是利用自動(dòng)DNA測序儀(如Applied Biosystem，Inc.的Model 373)確定的，并且本文所確定的由DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列都是通過翻譯如上所確定的DNA序列來確定的。因此，正如本領(lǐng)域所熟知的用這種自動(dòng)化方法確定的DNA序列一樣，本文所確定的任何核苷酸序列可能含有一些誤差。自動(dòng)測序所確定的核苷酸序列典型地是與所測序的DNA分子的實(shí)際核苷酸序列有至少大約90％同源性，更典型地為至少大約95％至至少大約99.9％同源性。實(shí)際序列可由其它方法更精確地確定，這些方法包括本領(lǐng)域所熟知的手工DNA測序方法。正如本領(lǐng)域所知的，與實(shí)際序列相比，在確定出的核苷酸序列中的單一插入或者缺失在核苷酸序列的翻譯中將造成讀框移位，以致自插入或缺失點(diǎn)開始，預(yù)測出來的由所確定的核苷酸序列編碼的氨基酸序列完全不同于由所測序的DNA分子實(shí)際編碼的氨基酸序列。
利用本文所公開的信息，如SEQ ID NO1中的核苷酸序列，可以利用標(biāo)準(zhǔn)克隆和篩選過程(如那些利用mRNA作為起始材料來克隆cDNA的方法)獲得編碼抗微生物肽多肽的本發(fā)明核酸分子。對于本發(fā)明來說，SEQ IDNO1中所描述的核酸分子發(fā)現(xiàn)于得自肺組織的cDNA文庫中。所確定的SEQ ID NO1的抗微生物肽cDNA的核苷酸序列包含編碼具有大約64個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的開放讀框、所預(yù)測的具有大約23個(gè)氨基酸殘基的前導(dǎo)序列和推定的大約7.3kDa的分子量。SEQ ID NO2中所顯示的抗微生物肽與牛氣管抗微生物肽之間具有44％同源性和大約63％相似性(圖2)。
本發(fā)明也公開了本發(fā)明的抗微生物肽蛋白質(zhì)的成熟形式。按照信號假說，由哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)具有信號或者分泌前導(dǎo)序列，其中一旦不斷增長的穿過糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)鏈的輸出開始，該前導(dǎo)序列就自成熟蛋白質(zhì)上切割下來。大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞甚至昆蟲細(xì)胞都以相同的特異性切割所分泌的蛋白質(zhì)。然而，在某些情況下，所分泌的蛋白質(zhì)的切割并不完全一致，這就產(chǎn)生了蛋白質(zhì)的兩個(gè)或多個(gè)成熟物種。進(jìn)一步地說，人們長期以來一直知道，所分泌的蛋白質(zhì)的切割特異性最終由完全蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定，即它是多肽的氨基酸序列所固有的。因此，本發(fā)明提供了編碼成熟抗微生物肽多肽的核苷酸序列，該多肽具有由cDNA克隆所編碼的氨基酸序列，該cDNA克隆包含在與ATCC保藏號97982相同的宿主中并且如SEQ ID NO2所示。具有由包含在與ATCC保藏號97982相同的宿主中的cDNA克隆編碼的氨基酸序列的成熟抗微生物肽意指成熟形式的抗微生物肽，該抗微生物肽由在具有完全開放讀框的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如COS細(xì)胞，如下所述)中的表達(dá)來產(chǎn)生，該完全開放讀框由包含在保藏宿主的載體中的克隆的人DNA序列編碼。如下所述，具有由包含在ATCC保藏號97982中的cDNA克隆編碼的氨基酸序列的成熟抗微生物肽可以也可以不必不同于所預(yù)測的SEQ ID NO2(大約1至大約23氨基酸)中所顯示的″成熟″抗微生物肽，這取決于基于計(jì)算機(jī)分析的預(yù)測切割位點(diǎn)的準(zhǔn)確度。
用于預(yù)測蛋白質(zhì)是否存在用于前導(dǎo)序列的分泌前導(dǎo)區(qū)和切割點(diǎn)的方法是可以利用的。例如，可以利用McGeoch(病毒研究，3271-286(1985))和von Heinje(核酸研究，144683-4690(1986))的方法。這些方法之每一個(gè)預(yù)測已知的哺乳動(dòng)物分泌蛋白質(zhì)的切割點(diǎn)的準(zhǔn)確度范圍為75-80％。von Heinje(同上)。然而，對于給定的蛋白質(zhì)，這兩種方法并非總是產(chǎn)生相同的預(yù)測切割點(diǎn)。
在本發(fā)明情況下，本發(fā)明的完全抗微生物肽多肽的預(yù)測的氨基酸序列是由計(jì)算機(jī)程序(″PSORT″)(K.Nakai和M.Kanehisa，基因組，14897-911(1992))分析的，該程序是一個(gè)用于基于氨基酸序列預(yù)測蛋白質(zhì)的細(xì)胞位置的專家系統(tǒng)。作為這個(gè)定位計(jì)算預(yù)測的一部分，McGeoch和vonHeinje的方法合并使用。在SEQ ID NO2中，PSORT程序的分析預(yù)測切割位點(diǎn)位于氨基酸-1和1之間。此后，采用簡單形式的von Heinje(同上)(-1，-3)規(guī)則，由目視檢測進(jìn)一步分析完全的氨基酸序列。這樣，預(yù)測出微生物肽蛋白質(zhì)的前導(dǎo)序列由SEQ ID NO2中的大約-23至大約-1氨基酸殘基組成，而預(yù)測出成熟抗微生物肽蛋白質(zhì)則由SEQ ID NO2中的大約1至大約41位氨基酸殘基組成。
正如普通技術(shù)人員將會注意到的，由于測序誤差的可能性以及在不同的已知蛋白質(zhì)中的前導(dǎo)序列的切割位點(diǎn)的可變性，所預(yù)測的、由保藏的cDNA編碼的抗微生物肽多肽包含大約64個(gè)氨基酸，但是其范圍不論在何地都可能變化于55-75個(gè)氨基酸；同時(shí)所預(yù)測的這一蛋白質(zhì)的前導(dǎo)序列包含大約23個(gè)氨基酸，但在長度上可能是20、21、22、24或25個(gè)氨基酸。
正如所表明的，本發(fā)明的核酸分子可以是RNA形式的(如mRNA)或者DNA形式的(包括，例如由克隆獲得或合成產(chǎn)生的cDNA和基因組DNA)。DNA可以是雙鏈或單鏈的。單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈(也稱為有義鏈)，或者它可能是非編碼鏈(也稱作反義鏈)。
″分離的″核酸分子意指從其天然環(huán)境中移出的核酸分子、DNA或RNA。例如就本發(fā)明來說，認(rèn)為包含在載體中的重組DNA分子就是“分離的”。分離的DNA分子的另外的例子包括以溶液狀態(tài)保持在異源宿主細(xì)胞或(部分或基本上)純化的DNA分子中的重組DNA分子。分離的RNA分子包括本發(fā)明的DNA分子的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄物。按照本發(fā)明的分離的核酸分子還包括這樣合成產(chǎn)生的分子。
本發(fā)明的分離的核酸分子包括包含SEQ ID NO1中所顯示的開放讀框(ORF)的DNA分子；包含成熟抗微生物肽蛋白質(zhì)的編碼序列的DNA分子；和包含與上述明顯不同的序列，但由于其遺傳密碼的簡并而仍然編碼抗微生物肽蛋白質(zhì)的DNA分子。當(dāng)然，遺傳密碼是本領(lǐng)域所熟知的。因此，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，進(jìn)行常規(guī)操作就可產(chǎn)生這樣的簡并變體。
另一方面，本發(fā)明提供了編碼抗微生物肽多肽的分離的核酸分子，其中該抗微生物肽多肽具有由cDNA克隆(包含在1997年4月4日以ATCC保藏號97982保藏的質(zhì)粒中)所編碼的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，提供了編碼成熟抗微生物肽多肽或缺乏N端甲硫氨酸的全長抗微生物肽多肽的核酸分子。本發(fā)明也提供了分離的核酸分子(具有SEQ ID NO1中所顯示的核苷酸序列)或包含在上述保藏的克隆中的抗微生物肽cDNA的核苷酸序列或者核酸分子(具有上述序列之一的互補(bǔ)序列)。這樣的分離分子，尤其是DNA分子，可通過與染色體的原位雜交來用作為基因作圖的探針，并且可用來檢測人體組織中的抗微生物肽基因的表達(dá)，例如利用Northern印跡分析。
本發(fā)明還涉及本文描述的分離的核酸分子的片段。分離的核酸分子(具有保藏的cDNA的核苷酸序列或圖1(SEQ ID NO1)所顯示的核苷酸序列)的片段意指長度為至少大約15nt(優(yōu)選為至少大約20nt，更優(yōu)選為至少大約30nt，更為優(yōu)選為至少40nt)的、可用作為如本文所述的診斷探針和引物的片段。當(dāng)然，按照本發(fā)明，如同與保藏的cDNA的或SEQID NO1中所顯示的大多數(shù)(如果不是所有)核苷酸序列相對應(yīng)的片段一樣，長度為50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300或323nt的更大片段也是有用的。例如，長度至少為20nt的片段意指包含20或更多個(gè)得自保藏cDNA的核苷酸序列或SEQ ID NO1中所顯示的核苷酸序列的鄰接堿基的片段。
本發(fā)明的優(yōu)選的核酸片段包括編碼抗微生物肽蛋白質(zhì)的攜帶表位部分的核酸分子。尤其是，本發(fā)明的這樣的核酸片段包括編碼下列物質(zhì)的核酸分子包含在SEQ ID NO2中的大約19至大約27位氨基酸殘基的多肽；和包含在SEQ ID NO2中的大約31至大約41位氨基酸殘基的多肽。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)測定出上述多肽片段是抗微生物肽蛋白質(zhì)的抗原區(qū)。下面將詳盡描述用于確定抗微生物肽蛋白質(zhì)的其它的這樣攜帶表位部分的方法。
另一方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，該核酸分子包含在嚴(yán)格雜交條件下與本發(fā)明的上述核酸分子中的部分多核苷酸雜交的多核苷酸，例如，包含在ATCC 97982保藏物中的cDNA克隆。″嚴(yán)格雜交條件″意指在包含下列物質(zhì)的溶液中在42℃下培養(yǎng)過夜50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH 7.6)，5×Denhardt的溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20g/ml變性的、剪切的鮭精DNA；其后在大約65℃下用0.1×SSC洗滌濾器。
與″部分″多核苷酸雜交的多核苷酸意指與至少大約15個(gè)核苷酸(nt)(優(yōu)選為至少大約20nt，更優(yōu)選為至少大約30nt，更優(yōu)選為大約30-70nt)的參照多核苷酸雜交的多核苷酸(DNA或RNA)。這些多核苷酸可用作為如上所述并且下面將更詳細(xì)地加以討論的診斷探針和引物。
例如，″長度至少20nt″的部分多核苷酸意指20或者更多個(gè)得自參照多核苷酸的核苷酸序列(例如保藏的cDNA或SEQ ID NO1所顯示的核苷酸序列)的鄰接核苷酸。當(dāng)然，只與聚A序列(如SEQ ID NO1所顯示的抗微生物肽cDNA的3′末端聚(A)段)雜交或者只與T(或U)殘基的互補(bǔ)序列段雜交的多核苷酸將不包括在用來雜交部分本發(fā)明的核酸的本發(fā)明多核苷酸中，因?yàn)檫@樣的多核苷酸將與任何包含聚(A)段或其互補(bǔ)段的核酸分子雜交(例如，實(shí)踐上為任何雙鏈cDNA克隆)。
正如所表明的，編碼抗微生物肽多肽的本發(fā)明核酸分子可以包括但不限于那些自身編碼成熟多肽的氨基酸序列的核酸分子；成熟多肽的編碼序列和附加序列，如那些編碼大約23個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列或分泌序列(如前蛋白質(zhì)或原蛋白質(zhì)或者前原蛋白質(zhì)序列)的核酸分子；成熟多肽的、有或無上述附加編碼序列的、與附加的非編碼序列(包括例如但不限于內(nèi)含子和非編碼5’和3’序列，如在轉(zhuǎn)錄(mRNA加工)中起作用的、包含剪接和聚腺苷酸化信號(如mRNA的核糖體結(jié)合和穩(wěn)定性)的、轉(zhuǎn)錄的非翻譯序列)結(jié)合在一起的編碼序列；編碼附加的氨基酸(如那些提供附加功能的氨基酸)的、附加的編碼序列。因此，編碼多肽的序列可以與標(biāo)記序列融合，如編碼有利于所融合的多肽的純化的肽的序列。在本發(fā)明的這一方面的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記氨基酸序列是六組氨酸肽，如在pQE載體(Qiagen公司)中提供的標(biāo)記，在其它方面，大多數(shù)標(biāo)記氨基酸序列是市售的。例如，如Gentz等(Gentz等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，86821-824(1989))所描述的，六組氨酸便于融合蛋白質(zhì)的純化。″HA″標(biāo)記是在純化中有用的另一種肽，其與得自流感血凝素蛋白質(zhì)的表位相對應(yīng)，這已由Wilson等(Wilson等，細(xì)胞37767(1984))描述過。正如以下所討論的，這樣的其它融合蛋白質(zhì)包括在N或者C端與Fc融合的抗微生物肽。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的核酸分子的變體，其編碼抗微生物肽蛋白質(zhì)的部分、類似物或衍生物。變體可以天然產(chǎn)生，如天然的等位基因變體?！宓任换蜃凅w″意指在有機(jī)體的染色體上占據(jù)給定基因座的基因的幾種可選形式之一。基因II，Lewin，B.編著，John Wiley和Sons，紐約(1985)?？梢岳帽绢I(lǐng)域所熟知的誘變技術(shù)來產(chǎn)生非天然存在的變體。
這樣的變體包括那些由核苷酸取代、缺失或添加產(chǎn)生的變體，所說的取代、缺失或添加可以涉及一個(gè)或多個(gè)核苷酸。變體可以在編碼區(qū)、非編碼區(qū)或兩區(qū)發(fā)生改變。在編碼區(qū)的改變可以產(chǎn)生保守或非保守的氨基酸取代，缺失或添加。其中特別優(yōu)選的是沉默取代、添加和缺失，這并不改變抗微生物肽蛋白質(zhì)或其部分的性質(zhì)和活性。同時(shí)，在這一點(diǎn)上尤其優(yōu)選的是保守取代。
本發(fā)明的實(shí)施方案還包括分離的核酸分子，該核酸分子包含具有核苷酸序列的多核苷酸，該核苷酸序列與下列物質(zhì)有至少95％、96％、97％、98％或99％的同源性(a)編碼具有SEQ ID NO2所顯示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO2所顯示的氨基酸序列但缺乏N端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO2所顯示的大約1至大約41位的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(d)編碼具有由cDNA克隆(包含在ATCC保藏號97982中)編碼的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(e)編碼具有由cDNA克隆(包含在ATCC保藏號97982中)編碼的氨基酸序列的成熟抗微生物肽多肽的核苷酸序列；或者(f)與(a)、(b)、(c)、(d)或(e)之任一核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
例如，具有與編碼抗微生物肽的參照核苷酸序列有至少95％″同源性″的核苷酸序列的多核苷酸意指除了多核苷酸序列的每100個(gè)編碼抗微生物肽多肽的參照核苷酸序列可以包含多達(dá)五點(diǎn)突變外，多核苷酸的核苷酸序列與參照序列相同。換句話說，為了獲得具有與參照核苷酸序列有至少95％同源性的核苷酸序列的多核苷酸，參照序列中的多達(dá)5％的核苷酸可以缺失或者由另一個(gè)核苷酸取代，或者參照序列中的全部核苷酸的多達(dá)5％核苷酸可以插入到參照序列中。參照序列的這些突變可以發(fā)生在參照核苷酸序列的5’或3’末端位置或者在這兩末端位置之間的任一點(diǎn)，或個(gè)別地散布在參照序列的核苷酸中間或者散布于參照序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)鄰接基團(tuán)中。
實(shí)際上，任何具體核酸分子與例如SEQ ID NO1所顯示的核苷酸序列或保藏cDNA克隆的核苷酸序列是否有至少95％、96％、97％、98％或99％同源性通?？梢岳弥T如Bestfit程序(Wisconsin序列分析包，基于Unix的版本8，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組，University Research Park，575 ScienceDrive，Madison，WI 53711)之類的已知計(jì)算機(jī)程序來確定。Bestfit利用Smith和Waterman的局部同源性算法(應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展，2482-489(1981))，找到兩種序列之間的同源性最好的節(jié)段。當(dāng)利用Bestfit或任何其它序列對比來確定具體序列與例如按照本發(fā)明的參照序列是否有95％同源性時(shí)，當(dāng)然要調(diào)整參數(shù)以便在參照核苷酸序列的全長上計(jì)算同源性的百分比，以及允許在參照序列的核苷酸總數(shù)的同源性方面存在高達(dá)5％的缺口。
本申請涉及與SEQ ID NO1中所顯示的核酸序列或保藏cDNA的核酸序列有至少95％、96％、97％、98％或者99％同源性，而與它們是否編碼具有抗微生物肽活性的多肽無關(guān)的核酸分子。這是因?yàn)榧词咕唧w核酸分子不編碼有抗微生物肽活性的多肽，本領(lǐng)域技術(shù)人員仍然會知道如何將該核酸分子用作為例如雜交探針或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物。本發(fā)明的不編碼具有抗微生物肽活性的多肽的核酸分子的用途尤其包括(1)分離出cDNA文庫中的抗微生物肽基因或者等位基因變體；(2)正如Verma等(Verma等，人染色體基本技術(shù)手冊，Pergamon出版社，紐約(1988))所描述的，與提供抗微生物肽基因的精確染色體位置的中期染色體涂布板原位雜交(例如“FISH”)；以及用于檢測抗微生物肽mRNA在特定組織中的表達(dá)的Northern印跡分析。
然而，優(yōu)選的是核酸分子具有與SEQ ID NO1所顯示的核酸序列或保藏cDNA的核酸序列(事實(shí)上其編碼具有抗微生物肽蛋白質(zhì)活性的多肽)有至少95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列?！寰哂锌刮⑸镫幕钚缘亩嚯摹逡庵冈诰唧w的生物測定中顯示出抗微生物肽活性的多肽。例如，可以利用例如由Diamond等(美國國家科學(xué)院院報(bào)，883952(1991))描述的抗微生物測定來測定抗微生物肽活性。簡言之，將候選抗微生物肽的濃縮試樣點(diǎn)滴在大腸桿菌菌苔上并在37℃下培養(yǎng)一夜。利用由Soravia等(FEBS Lett.228337-340(1988))描述的方法的改進(jìn)測定肽的最小抑制性濃度。簡言之，在37℃下在靜態(tài)96孔微量滴定平板中隨著肽濃度的不斷增加培養(yǎng)2.5×104細(xì)菌一夜。由在600nm的光密度測定來評估細(xì)菌生長。用缺少肽的對照培養(yǎng)和缺少細(xì)菌的對照培養(yǎng)設(shè)定基底值。
當(dāng)然，由于遺傳密碼的簡并性，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將立即認(rèn)識到具有與保藏cDNA的核酸序列或SEQ ID NO1顯示的核酸序列有至少95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列的大量核酸分子將編碼″具有抗微生物肽蛋白質(zhì)活性″的多肽。事實(shí)上，由于這些核苷酸序列的所有簡并變體都編碼相同的多肽，因此技術(shù)人員即使沒有進(jìn)行上述比較測定也很清楚這一情況。本領(lǐng)域技術(shù)人員將進(jìn)一步認(rèn)識到對于不是簡并變體的這樣的核酸分子，合理數(shù)量的它們也將編碼具有抗微生物肽蛋白質(zhì)活性的多肽。這是因?yàn)榧夹g(shù)人員完全了解氨基酸取代不太可能或不可能顯著地影響蛋白質(zhì)功能(例如以第二種脂肪族氨基酸取代第一種脂肪族氨基酸)。
例如，有關(guān)如何進(jìn)行表型沉默氨基酸取代的指導(dǎo)公開在下列文獻(xiàn)中Bowie J.U.等，″譯解蛋白質(zhì)序列中的信息對氨基酸取代的耐受性″，科學(xué)2471306-1310(1990)，其中作者指出蛋白質(zhì)驚人地耐受氨基酸取代。載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明的分離DNA分子的載體、利用重組載體由基因工程構(gòu)建的宿主細(xì)胞以及利用重組技術(shù)生產(chǎn)抗微生物肽多肽或者其片段。
多核苷酸可以結(jié)合在宿主中包含用于增殖的選擇性標(biāo)記的載體。一般地，將質(zhì)粒載體引入沉淀(如磷酸鈣沉淀)中或充滿脂質(zhì)的復(fù)合物中。如果載體是病毒，它可以利用適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系來進(jìn)行體外包裝，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入宿主細(xì)胞。
DNA插入序列應(yīng)該可操作地連接到適當(dāng)?shù)膯?dòng)子(如噬菌體λPL啟動(dòng)子，大腸桿菌lac、trp和tac啟動(dòng)子，SV40早期和晚期啟動(dòng)子和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs的啟動(dòng)子)上，以給一些物質(zhì)命名。其它的合適啟動(dòng)子將是技術(shù)人員所知的。表達(dá)構(gòu)建體還包含轉(zhuǎn)錄起始的位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止的位點(diǎn)和在轉(zhuǎn)錄區(qū)中的翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。由構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄物的編碼部分優(yōu)選包括開始時(shí)的翻譯起點(diǎn)和適當(dāng)?shù)匚挥谒g的多肽的末端的終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。
正如所表明的，表達(dá)載體優(yōu)選包括至少一個(gè)選擇性標(biāo)記。這樣的標(biāo)記包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)物中的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，和用于在大腸桿菌和其它細(xì)菌中培養(yǎng)的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因。適當(dāng)宿主的代表性例子包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌屬和鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞，如果蠅屬S2和夜蛾屬Sf9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO、COS和Bowes黑素瘤細(xì)胞；以及植物細(xì)胞。上述宿主細(xì)胞的合適培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域所知的。
除在本發(fā)明實(shí)踐中利用表達(dá)載體外，本發(fā)明還包括包含操縱基因和可操作地與編碼感興趣蛋白質(zhì)的核苷酸序列連接的啟動(dòng)子元件的新表達(dá)載體。這樣載體的一個(gè)例子是如下詳盡描述的pHE4a。
正如圖4和5所總結(jié)的那樣，pHE4a載體(SEQ ID NO4)的組分包括1)作為選擇標(biāo)記的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，2)大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)，3)T5噬菌體啟動(dòng)子序列，4)兩種lac操縱基因序列，5)Shine-Delgarno序列，6)乳糖操縱子阻抑基因(lacIq)和7)多克隆位點(diǎn)接頭區(qū)。復(fù)制起點(diǎn)(oriC)得自pUC19(LT1，Gaithersburg，MD)。啟動(dòng)子序列與操縱基因序列是合成制得的。核酸序列的合成產(chǎn)生是本領(lǐng)域所熟知的。CLONTECH 95/96目錄，頁碼215-216，CLONTECH，1020 East Meadow Circle，Palo Alto，CA 94303。pHE4a載體于1998年2月25日以209645保藏號保藏在ATCC中。
通過用NdeI和XbaI、BamHI、XhoI或Asp718之任一限制載體，以及分離凝膠上的較大片段(多克隆位點(diǎn)區(qū)是大約310個(gè)核苷酸)，可以可操作地使編碼抗微生物多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO1)與pHE4a的啟動(dòng)子和操縱基因連接。例如，按照實(shí)施例1中描述的PCR方案，利用具有Ndel(作為5’引物)和XbaI、BamHI、XhoI或Asp718(作為3’引物)之任一的限制酶切位點(diǎn)的PCR引物，產(chǎn)生編碼抗微生物多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO1)(具有適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn))。凝膠純化PCR插入序列，并以相容性酶限制之。按照標(biāo)準(zhǔn)方案連接插入序列和載體。
如上所述，pHE4a載體含有l(wèi)acIq基因。lacIq是使lac操縱基因緊密調(diào)節(jié)的lacI基因的等位基因。Amann，E.等，基因，69301-315(1988)；Stark，M.，基因，51255-267(1987)。lacIq基因編碼連接lac操縱基因序列和封阻下游(即3’)序列的轉(zhuǎn)錄的阻抑蛋白。然而，當(dāng)存在乳糖或某些乳糖類似物(如異丙基B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG))時(shí)，lacIq基因產(chǎn)物與lac操縱基因解離。因此，在包含pHE4a載體的未誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞中并不產(chǎn)生可觀數(shù)量的抗微生物多肽。然而，通過加入如IPTG的藥劑對這些宿主細(xì)胞的誘導(dǎo)導(dǎo)致抗微生物多肽編碼序列的表達(dá)。
pHE4a載體的啟動(dòng)子/操縱基因序列(SEQ ID NO5)包含T5噬菌體啟動(dòng)子和兩種lac操縱基因序列。一種操縱基因定位于相對于轉(zhuǎn)錄開始位點(diǎn)的5’位置，而另一種則定位于相對于同一位點(diǎn)的3’位置。這些操縱基因，當(dāng)與lacIq基因產(chǎn)物結(jié)合起來時(shí)，在缺少lac操縱子誘導(dǎo)物(如IPTG)的情況下使下游序列受到緊密阻抑?？梢酝ㄟ^加入lac操縱子誘導(dǎo)物，如IPTG，來誘導(dǎo)位于lac操縱基因下游的、可操作地連接的序列的表達(dá)。lac誘導(dǎo)物與lacIq蛋白質(zhì)的連接導(dǎo)致它們從lac操縱基因序列中釋放出來和可操作地連接的序列的轉(zhuǎn)錄起始。基因表達(dá)的lac操縱子調(diào)節(jié)描述在下列文獻(xiàn)中Devlin T.，TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WITH CLINICALCORRELATIONS，第4版(1997)，頁碼802-807。
載體的pHE4系列包含除抗微生物多肽編碼序列之外的pHE4a載體的所有組分。pHE4a載體的特征包括優(yōu)化的合成T5噬菌體啟動(dòng)子、lac操縱基因和Shine-Delagarno序列。此外，這些序列也具有理想的間隙，以便插入基因的表達(dá)能夠得到緊密調(diào)節(jié)，并可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的表達(dá)。
在適合用于產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)的已知細(xì)菌啟動(dòng)子中，包括大腸桿菌lacI和lacZ啟動(dòng)子、T3和T7啟動(dòng)子、gpt啟動(dòng)子、λPR和PL啟動(dòng)子以及trp啟動(dòng)子。合適的真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs(如那些Rous肉瘤病毒(RSV))的啟動(dòng)子以及金屬硫蛋白啟動(dòng)子(如小鼠金屬硫蛋白-I啟動(dòng)子)。
pHE4a載體也包含AUG起始密碼子5’側(cè)的Shine-Delgarno序列。Shine-Delgarno序列是一般定位于距AUG起始密碼子上游(即5’)大約10個(gè)核苷酸的短序列。這些序列本質(zhì)上使原核核糖體定向AUG起始密碼子。因此，本發(fā)明也涉及有用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生的表達(dá)載體。本發(fā)明的這一方面以pHE4a載體(SEQ ID NO4)示例說明。
在優(yōu)選用于細(xì)菌的載體中，包括得自Qiagen的pQE70、pQE60和pQE-9；得自Stratagene的pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；和得自Pharmacia的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。在優(yōu)選的真核載體中，包括得自Stratagene的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；和得自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它合適載體是技術(shù)人員熟知的。
可以由磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔法、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它方法，實(shí)現(xiàn)構(gòu)建體向宿主細(xì)胞的引入。這樣的方法描述在許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊中，如Davis等，分子生物學(xué)基本方法(1986)。
可以以修飾形式(如融合蛋白質(zhì))表達(dá)多肽，并且多肽不僅可以包括分泌信號，而且也可以包括附加的異源功能區(qū)。例如，附加氨基酸的區(qū)，尤其是帶電荷的氨基酸，可以加入至多肽的N-端以改善宿主細(xì)胞在純化期間或爾后的處理和存儲期間的穩(wěn)定性和持續(xù)性。此外，肽組分可以加入至多肽中以有利于純化。在多肽的最后制備之前可以除去這樣的區(qū)。與其它方面一樣，在多肽中加入肽組分以引起分泌或排泄、改善穩(wěn)定性和有利于純化都是本領(lǐng)域熟知的和常用的技術(shù)。優(yōu)選的融合蛋白質(zhì)包含得自有用于溶解蛋白質(zhì)的免疫球蛋白的異源區(qū)。例如，EP-A-0 464 533(加拿大對應(yīng)號2045869)公開了包含與另一人體蛋白質(zhì)或其部分結(jié)合在一起的免疫球蛋白分子的恒定區(qū)的各部分的融合蛋白質(zhì)。在許多情況下，融合蛋白質(zhì)的Fc部分在治療和診斷應(yīng)用方面是十分有利的，并因此產(chǎn)生例如改善的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(EP-A 0232262)。另一方面，就某些用途來說，需要在融合蛋白質(zhì)以描述的有利方式表達(dá)、檢測和純化之后能夠缺失Fc部分。當(dāng)證明Fc部分成為治療和診斷應(yīng)用的障礙時(shí)，例如當(dāng)融合蛋白質(zhì)將要用作為免疫的抗原時(shí)情況就是這樣。在藥物開發(fā)中，例如人蛋白質(zhì)(如hIL5-受體)已與Fc部分融合，目的是進(jìn)行高流通量篩選測定以鑒定hIL-5的拮抗劑。參見，D.Bennett等，分子識別雜志，8卷52-58(1995)和K.Johanson等，生物化學(xué)雜志，270卷，16期9459-9471(1995)。
可以由熟知的方法(包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析)，從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化抗微生物肽。最優(yōu)選的是，利用高效液相層析(“HPLC”)進(jìn)行純化。本發(fā)明的多肽包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成過程的產(chǎn)品以及由重組技術(shù)從原核或真核宿主(包括，例如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生的產(chǎn)物。取決于重組生產(chǎn)方法中所使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或者可以是非糖基化的。此外，本發(fā)明的多肽也可以包括初始修飾的甲硫氨酸殘基，這在某些情況下是宿主介導(dǎo)過程的結(jié)果。人抗微生物多肽和片段本發(fā)明還提供了分離的抗微生物肽(具有由保藏cDNA編碼的氨基酸序列或SEQ ID NO2的氨基酸序列)或包含部分上述多肽的肽或多肽。
本領(lǐng)域有關(guān)人員將認(rèn)識到抗微生物肽的一些氨基酸序列可以變化而不嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能。如果考慮這樣的序列差異，就應(yīng)該記住在蛋白質(zhì)上具有決定活性的關(guān)鍵性區(qū)域。
因此，本發(fā)明還包括抗微生物肽的變體，這些變體顯示出明顯的抗微生物肽活性或包括抗微生物肽的區(qū)(如以下討論的蛋白質(zhì)部分)。這樣的突變體包括缺失、插入、倒位、重復(fù)和模式取代。正如以上所表明的，有關(guān)氨基酸變化很有可能是表型沉默的解釋出現(xiàn)在如下文獻(xiàn)中Bowie J.U.等，″譯解蛋白質(zhì)序列中的信息對氨基酸取代的耐受性″，科學(xué)，2471306-1310(1990)。
因此，SEQ ID NO2的或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選為保守氨基酸殘基)所取代并且這樣取代的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基的上述片段、衍生物或類似物，或者(ii)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包括取代基團(tuán)的上述片段、衍生物或類似物，或者(iii)其中成熟多肽與另一化合物融合，該另一化合物如增加多肽的半壽期的化合物(例如聚乙二醇)的上述片段、衍生物或類似物，或者(iv)其中附加的氨基酸與成熟多肽融合，該成熟多肽如IgG Fc融合區(qū)肽或前導(dǎo)或分泌序列或用來純化成熟多肽的序列或原蛋白序列的上述片段、衍生物或類似物。據(jù)認(rèn)為這樣的片段、衍生物和類似物屬于本文涉及的領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的范圍之內(nèi)。
尤其感興趣的是由另一帶電荷氨基酸和中性或帶負(fù)電荷氨基酸取代帶電荷氨基酸。后者隨著陽性電荷減少而產(chǎn)生蛋白質(zhì)以改善抗微生物肽的特征。聚集作用的預(yù)防是十分需要的。蛋白質(zhì)的聚集作用不僅導(dǎo)致活性的喪失，而且也可能在制備藥物制劑時(shí)出現(xiàn)問題，因?yàn)樗鼈兛赡苁敲庖咴缘摹?Pinckard等，臨床免疫試驗(yàn)，2331-340(1967)；Robbins等，糖尿病，36838-845(1987)；Cleland等，治療性藥物載體系統(tǒng)的評論性綜述10307-377(1993))。
正如所表明的，變化優(yōu)選的是具有次要性質(zhì)，如并不嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的折疊或活性的保守氨基酸取代(參見表1)。表1.保守氨基酸取代
當(dāng)然，技術(shù)人員所做出的氨基酸取代的數(shù)目取決于許多因素，包括以上描述的那些因素。一般地說，對于任一給定的抗微生物多肽，氨基酸取代的數(shù)目將不超過50、40、30、20、10、5或3。
在本發(fā)明抗微生物肽中的、具有十分重要功能的氨基酸可以用本領(lǐng)域所知方法來鑒定，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變方法(Cunningham和Wells，科學(xué)，2441081-1085(1989))。后一種方法在分子的每個(gè)殘基上引入單一丙氨酸突變。然后檢驗(yàn)所產(chǎn)生的突變分子的生物活性，如受體結(jié)合或者體外或體內(nèi)增殖活性。對于配體-受體結(jié)合關(guān)鍵性的位點(diǎn)也可以通過結(jié)構(gòu)分析來確定，這些結(jié)構(gòu)分析如結(jié)晶作用、核磁共振或光親和標(biāo)記(Smith等，分子生物學(xué)雜志，224899-904(1992)和de Vos等，科學(xué)，255306-312(1992))。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選以分離的形式提供?！宸蛛x的多肽″意指從其天然環(huán)境中移出的多肽。因此，就本發(fā)明的目的來說，一般認(rèn)為產(chǎn)生和/或包含在重組宿主細(xì)胞之內(nèi)的多肽是分離的?！宸蛛x的多肽″也意指從重組宿主細(xì)胞中部分或基本上純化出來的多肽。例如，可以由Smith和Johnson(基因，6731-40(1988))描述的一步法基本上純化得到重組產(chǎn)生的抗微生物肽多肽模型。
本發(fā)明的多肽包括由包含前導(dǎo)序列的保藏的cDNA編碼的多肽，由沒有前導(dǎo)序列的保藏的cDNA編碼的成熟多肽(即成熟蛋白質(zhì))，包含SEQ IDNO2中的大約-23至大約41位氨基酸的多肽；包含SEQ ID NO2中的大約-22至大約41位氨基酸的多肽；包含SEQ ID NO2中的大約1至大約41位氨基酸的多肽；和與上述的那些多肽有至少95％(優(yōu)選為至少96％、97％、98％或99％)同源性的、并且也包括具有至少30個(gè)氨基酸(優(yōu)選為至少50個(gè)氨基酸)的這樣多肽的部分的多肽。
具有與抗微生物肽的參照氨基酸序列有例如至少95％″同源性″的氨基酸序列的多肽意指除多肽序列的每100個(gè)抗微生物肽的參照氨基酸可以包括多達(dá)5個(gè)氨基酸的改變之外多肽的氨基酸序列與參照序列相同。換句話說，為了獲得具有與參照氨基酸序列有至少95％同源性的氨基酸序列的多肽，參照序列中多達(dá)5％的氨基酸殘基可以缺失或由另一氨基酸取代，或者在參照序列的全部氨基酸殘基中，多達(dá)5％的氨基酸殘基可以插入到參照序列中。參照序列的這些改變可以發(fā)生在參照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或者這些末端位置之間的任一點(diǎn)，個(gè)別地散布在參照序列的殘基中間或者散布在參照序列內(nèi)部的一個(gè)或多個(gè)鄰接基團(tuán)中。
實(shí)際上，任一具體多肽是否與例如SEQ ID NO2中顯示的氨基酸序列或由保藏的cDNA克隆編碼的氨基酸序列有至少95％、96％、97％、98％或99％同源性通?？梢岳弥T如Bestfit程序(Wisconsin序列分析包，基于Unix的版本8，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組，University Research Park，575Science Drive，Madison，WI 53711)之類的已知計(jì)算機(jī)程序來確定。當(dāng)利用Bestfit或任何其它序列對比程序來確定具體序列與按照本發(fā)明的參照序列是否有例如95％同源性時(shí)，當(dāng)然要調(diào)整參數(shù)以便在參照氨基酸序列的全長上計(jì)算同源性的百分比，以及允許在參照序列的氨基酸殘基總數(shù)的同源性方面存在多達(dá)5％的缺口。
在利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知方法的SDS-PAGE凝膠或者分子篩凝膠過濾柱上，本發(fā)明的多肽可以用作為分子量標(biāo)記。
另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多肽的攜帶表位部分的肽或多肽。這一多肽部分的表位是本文描述的多肽的免疫原性或抗原表位。″免疫原性表位″定義為蛋白質(zhì)的一部分，當(dāng)整個(gè)蛋白質(zhì)是免疫原時(shí)，其引起抗體應(yīng)答。另一方面，抗體可以與之結(jié)合的蛋白質(zhì)分子的區(qū)定義為″抗原表位″。蛋白質(zhì)的免疫原性表位的數(shù)量一般比抗原表位的數(shù)量少。參見，例如，Geysen等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，813998-4002(1983)。
至于攜帶抗原表位(即包含抗體可以與之結(jié)合的蛋白質(zhì)分子的區(qū))的肽或多肽的選擇，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知模擬蛋白質(zhì)序列的一部分的比較短的合成肽通常能夠產(chǎn)生與部分模擬蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗血清。參見，例如，Sutcliffe，J.G.，Shinnick，T.M.，Green，N.和Learner，R.A.(1983)，與蛋白質(zhì)上的預(yù)定位點(diǎn)反應(yīng)的抗體。科學(xué)，219660-666。能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)反應(yīng)性血清的肽通常在蛋白質(zhì)的一級序列中闡述，其可以由一套簡單的化學(xué)規(guī)則表征，并且既不限于完整蛋白質(zhì)的優(yōu)勢免疫區(qū)(即免疫原性表位)也不限于氨基或羧基末端。
因此本發(fā)明的攜帶抗原表位的肽和多肽有用于產(chǎn)生特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體(包括單克隆抗體)。參見，例如，Wilson等，細(xì)胞，37767-778(1984)，777頁。
本發(fā)明的攜帶抗原表位的肽和多肽優(yōu)選包含具有至少七個(gè)(優(yōu)選為至少九個(gè)，最優(yōu)選為至少大約15至大約30個(gè))氨基酸(包含在本發(fā)明的多肽的氨基酸序列之內(nèi))的序列。
可以用來產(chǎn)生抗微生物肽特異性抗體的抗原多肽或肽的非限定性例子包括包含SEQ ID NO2中的大約19至大約27位氨基酸殘基的多肽；和包含SEQ ID NO2中的大約31至大約41位氨基酸殘基的多肽。正如以上所表明的，本發(fā)明的發(fā)明人已測定出上述多肽片段是抗微生物肽蛋白質(zhì)的抗原區(qū)。
本發(fā)明的攜帶表位的肽和多肽可以由任一常規(guī)方法產(chǎn)生。Houghten，R.A.(1985)，用于大量肽的迅速固相合成的一般方法個(gè)體氨基酸水平的抗原-抗體相互作用的特異性，美國國家科學(xué)院院報(bào)，825131-5135?！逋瑫r(shí)的多個(gè)肽合成(SMPS)″方法還描述在授予Houghten等的美國專利號4,631,211(1986)中。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所注意到的，本發(fā)明的上述抗微生物肽多肽和其攜帶表位的片段可以與免疫球蛋白(IgG)的部分恒定區(qū)結(jié)合，結(jié)果產(chǎn)生嵌合多肽。這些融合蛋白質(zhì)有利于純化，并且顯示出增加的體內(nèi)半壽期。例如，對于由人CD4-多肽的前兩個(gè)結(jié)構(gòu)域和哺乳動(dòng)物免疫球蛋白的重或輕鏈的恒定區(qū)的各個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白質(zhì)來說已經(jīng)表明了這一點(diǎn)(EPA 394,827；Traunecker等，自然，33184-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫化物連接的二聚體結(jié)構(gòu)的融合蛋白質(zhì)也可以比單獨(dú)的單體抗微生物肽蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段更有效地結(jié)合和中和其它分子(Fountoulakis等，生物化學(xué)雜志，270，3958-3964(1995))。診斷本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗微生物肽在肺淋巴結(jié)和角膜組織中得到表達(dá)。據(jù)認(rèn)為對于一些與免疫系統(tǒng)有關(guān)的疾病來說，相對于″標(biāo)準(zhǔn)的″抗微生物肽基因表達(dá)水平(即在得自不具有免疫系統(tǒng)紊亂的個(gè)體的免疫系統(tǒng)組織或體液中的抗微生物肽表達(dá)水平)，可以在免疫系統(tǒng)組織或其它細(xì)胞或體液(如血清、血漿、尿、滑液或脊髓液)(得自具有這樣的疾病的個(gè)體)中檢測到顯著改變(增加或減少)的水平的抗微生物肽基因表達(dá)。因此，本發(fā)明提供了在免疫系統(tǒng)紊亂的診斷期間有用的診斷方法，這包括在免疫系統(tǒng)組織或其它細(xì)胞或體液(得自個(gè)體)中測量編碼抗微生物肽蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)水平，并將測得的基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)的抗微生物肽基因表達(dá)水平相比較，其中基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)相比所呈現(xiàn)出的增加或者減少是免疫系統(tǒng)紊亂的指示。
尤其是，據(jù)認(rèn)為當(dāng)與對應(yīng)的″標(biāo)準(zhǔn)的″水平比較時(shí)，在患有肺淋巴結(jié)或角膜癌的哺乳動(dòng)物中的一些組織表達(dá)明顯提高或降低水平的抗微生物肽蛋白質(zhì)和編碼抗微生物肽蛋白質(zhì)的mRNA。此外，據(jù)認(rèn)為當(dāng)與得自未患有癌癥的相同物種的哺乳動(dòng)物的血清相比時(shí)，在得自患有這樣的癌癥的哺乳動(dòng)物的一些體液(如血清、血漿、尿和脊髓液)中可以檢測到提高水平的抗微生物肽蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明提供了在免疫系統(tǒng)紊亂(包括這一系統(tǒng)的癌癥)的診斷期間有用的診斷方法，該方法包括在得自個(gè)體的免疫系統(tǒng)組織或其它細(xì)胞或體液中測量編碼抗微生物肽蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)水平，并把測得的基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)的抗微生物肽基因表達(dá)水平相比較，其中基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)相比所呈現(xiàn)出的增加或減少是免疫系統(tǒng)紊亂的指示。
當(dāng)已經(jīng)按照常規(guī)方法診斷出免疫系統(tǒng)紊亂時(shí)，本發(fā)明可用作為預(yù)后指示物，其中顯示出降低的抗微生物肽基因表達(dá)的患者與在鄰近標(biāo)準(zhǔn)的水平上表達(dá)基因的患者相比將經(jīng)歷更壞的臨床結(jié)果。
″測定編碼抗微生物肽的基因的表達(dá)水平″意指在第一種生物樣品中直接(例如通過確定或估計(jì)絕對的蛋白質(zhì)水平或mRNA水平)或相對(例如通過與第二種生物樣品中的抗微生物肽水平或mRNA水平比較)定性或定量測定或估計(jì)抗微生物肽水平或編碼抗微生物肽的mRNA水平。優(yōu)選地，在第一種生物樣品中的抗微生物肽蛋白質(zhì)水平或者mRNA水平得到測量或估計(jì)以及與標(biāo)準(zhǔn)的抗微生物肽蛋白質(zhì)水平或者mRNA水平相比較，標(biāo)準(zhǔn)得自第二種生物樣品(得自未患有疾病的個(gè)體)或者通過平均得自未患有免疫系統(tǒng)紊亂的個(gè)體的人群的表達(dá)水平來確定。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所注意到的，一旦標(biāo)準(zhǔn)的抗微生物肽水平或者mRNA水平已知，那么就可以重復(fù)地使用它作為標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行比較。
″生物樣品″意指得自包含抗微生物肽蛋白質(zhì)或者mRNA的個(gè)體、體液、細(xì)胞系、組織培養(yǎng)物或其它源的任一生物樣品。正如所表明的，生物樣品包括體液(如血清、血漿、尿、滑液和脊髓液)(含有自由抗微生物肽)、免疫系統(tǒng)組織和發(fā)現(xiàn)表達(dá)完全或成熟抗微生物肽或抗微生物肽受體的其它組織源。用于從哺乳動(dòng)物中獲得組織活檢物和體液的方法是本領(lǐng)域所熟知的。當(dāng)生物樣品欲包括mRNA時(shí)，組織活檢物是優(yōu)選的源。
本發(fā)明有用于診斷或治療哺乳動(dòng)物(優(yōu)選為人類)的各種與免疫系統(tǒng)有關(guān)的疾病。這樣的疾病包含炎性和傳染性病癥以及任何免疫細(xì)胞功能失調(diào)。
可以利用任何合適的技術(shù)，如Chomczynski和Sacchi(生物化學(xué)分析，162156-159(1987))描述的單步硫氰酸胍-酚-三氯甲烷方法，從生物樣品中分離總的細(xì)胞RNA。然后利用任何合適的方法測定編碼抗微生物肽的mRNA的水平。這些方法包括Northern印跡分析、S1核酸酶作圖、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、與聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合的逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)以及與連接酶鏈反應(yīng)結(jié)合的逆轉(zhuǎn)錄(RT-LCR)。
可以利用基于抗體的技術(shù)測定生物樣品中的抗微生物肽水平。例如，可以由經(jīng)典免疫組織學(xué)方法(Jalkanen，M.等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，101976-985(1985)；Jalkanen，M.等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，1053087-3096(1987))研究抗微生物肽在組織中的表達(dá)。用來檢測抗微生物肽基因表達(dá)的其它基于抗體的方法包括免疫測定，如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和放射免疫測定(RIA)。合適的抗體測定標(biāo)記是本領(lǐng)域所知的，并且包括酶標(biāo)記(如葡萄糖氧化酶)和放射性同位素(如碘(125I，121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(112In)和锝(99mTc))以及熒光標(biāo)記(如熒光素和羅丹明以及生物素)。
除測定得自個(gè)體的生物樣品中的抗微生物肽水平之外，也可以通過成像來體內(nèi)檢測抗微生物肽。抗微生物肽的體內(nèi)成像的抗體標(biāo)記物或標(biāo)記包括那些可由X射線照相、NMR或ESR檢測的抗體標(biāo)記物或標(biāo)記。對于X射線照相，合適的標(biāo)記包括放射可檢測的輻射但不對患者構(gòu)成明顯危害的放射性同位素，如鋇或銫。NMR和ESR的合適標(biāo)記包括那些可以通過標(biāo)記有關(guān)雜交瘤的營養(yǎng)物來摻入抗體的、具有可檢測的特征自旋的標(biāo)記，如氘。
將已經(jīng)用適當(dāng)?shù)目蓹z測成像組分(如放射性同位素(如131I、112In、99mTc)、放射性不透明物質(zhì)或核磁共振可檢測的材料)標(biāo)記的抗微生物肽特異性抗體或抗體片段(例如腸胃外、皮下或腹膜內(nèi))引入哺乳動(dòng)物以檢查其免疫系統(tǒng)紊亂。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白受檢對象的大小和所利用的成像系統(tǒng)將確定需要產(chǎn)生診斷圖象的成像組分的量。在放射性同位素組分的情況下，對于人作為受檢對象來說，注入的放射性的量通常變化于大約5至20毫居里99mTc之間。然后，標(biāo)記的抗體或抗體片段將優(yōu)先積聚在包含抗微生物肽的細(xì)胞位置上。體內(nèi)腫瘤成像描述在下列文獻(xiàn)中S.W.Burchiel等，″放射性標(biāo)記的抗體及其片段的免疫藥物動(dòng)力學(xué)″(腫瘤成像的第13章癌的放射性化學(xué)檢測，S.W.，Burchiel和B.A.Rhodes編著，Masson出版公司，(1982))。治療劑本發(fā)明的抗微生物肽可以用作為治療真菌或細(xì)菌感染的抗微生物劑。本發(fā)明的肽可以以痤瘡治療藥、燒傷治療藥、眼睛感染治療藥、漱口藥、除臭劑或局部殺真菌劑的局部或系統(tǒng)制劑來用于這樣的治療中。此外，利用基于β-防衛(wèi)素的治療藥物或與現(xiàn)有藥物結(jié)合的藥物，可以在有關(guān)個(gè)體中更有效地控制對幾種β-防衛(wèi)素極端敏感的白假絲酵母(艾滋病患者的粘膜皮膚真菌疾病的常見致因)。施用方式人們將注意到可以通過施用抗微生物肽來治療個(gè)體中的抗微生物肽活性的標(biāo)準(zhǔn)或者正常水平的下降所造成的病癥。因此，本發(fā)明還提供了治療需要增加抗微生物肽活性水平的個(gè)體的方法，該方法包括向這樣的個(gè)體施用包含有效量的本發(fā)明分離的抗微生物肽，尤其是成熟形式的抗微生物肽的藥物組合物，以有效地提高這樣的個(gè)體中的抗微生物肽活性水平。
一般建議，每劑量腸胃外施用的總的藥學(xué)上有效量的抗微生物肽變化于每kg患者體重大約1μg/天至10mg/天之間，雖然如此，但正如以上所述的，這將易受治療判斷力的影響。更優(yōu)選地，這一劑量是至少0.01mg/kg/天，對人來說，最優(yōu)選為大約0.01和1mg/kg/天之間的激素。如果持續(xù)施用，抗微生物肽的典型施用劑量比率為大約1μg/kg/小時(shí)至大約50μg/kg/小時(shí)，每天1-4次注射或連續(xù)的皮下注射(例如利用小型泵)。也可以使用靜脈內(nèi)袋溶液。
包含本發(fā)明抗微生物肽的藥物組合物可以經(jīng)口、直腸、腸胃外、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(以粉末、軟膏、滴液或透皮膜片)、頰施用或者作為口或鼻噴劑施用。″藥學(xué)上可接受的載體″意指無毒固體、半固體或液體填充物、稀釋劑、包膜材料或任何類型的成型輔劑。本文所使用的術(shù)語″腸胃外″意指包含靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注的施用方式。染色體測定本發(fā)明的核酸分子對于染色體鑒定來說也是有價(jià)值的。序列特異性定向于和能夠雜交個(gè)體人染色體上的具體位置。DNAs對按照本發(fā)明的染色體的作圖是使這些序列和與疾病有關(guān)的基因關(guān)聯(lián)的重要的第一步驟。
在一些基于這一考慮的優(yōu)選實(shí)施方案中，這里公開的cDNA用來克隆抗微生物肽基因的基因組DNA。利用各種熟知的技術(shù)和文庫(一般都有市售的)可以實(shí)現(xiàn)這一步。然后，利用這一方面的熟知技術(shù)將基因組DNA用于原位染色體作圖。
此外，在某些情況下，通過制備得自cDNA的PCR引物(優(yōu)選為15-25bp)，序列可以作圖到染色體上?；虻?’非翻譯區(qū)的計(jì)算機(jī)分析用來迅速選擇在基因組DNA中不跨越超過一個(gè)外顯子的引物，因此使擴(kuò)增過程變得復(fù)雜。然后這些引物用于包含個(gè)體人類染色體的體細(xì)胞雜交體的PCR篩選。
指向中期染色體涂布的cDNA克隆的熒光原位雜交(″FISH″)可以用來在一個(gè)步驟中提供精確的染色體位置。這一技術(shù)可以與由得自短達(dá)50或者60bp的cDNA的探針一起使用。對于這一技術(shù)的綜述，參見，Verma等，人染色體基本技術(shù)手冊，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦序列作圖到精確的染色體位置上，序列在染色體上的物理位置可以與遺傳學(xué)圖譜的數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)?？梢栽谟嘘P(guān)文獻(xiàn)中找到這樣的數(shù)據(jù)，例如V.McKusick，人的孟德爾遺傳，可通過約翰霍普金斯大學(xué)，Welch醫(yī)學(xué)圖書館聯(lián)機(jī)獲得。然后，已經(jīng)作圖在相同染色體區(qū)的基因和疾病之間的關(guān)系可以通過連鎖分析(物理上鄰近的基因的共遺傳)來確定。
其次，需要確定受影響和未受影響的個(gè)體之間的cDNA或基因組序列的差別。如果在一些或所有受影響的個(gè)體中觀察到突變而在任何正常個(gè)體中沒有觀測到突變，那么突變很有可能是疾病的病原體。
已經(jīng)一般地描述了本發(fā)明，但是通過參照下列實(shí)施例將更容易理解本發(fā)明，所提供的這些實(shí)施例目的是說明而不有意限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1抗微生物肽在大腸桿菌中的表達(dá)和純化在這一例子中細(xì)菌表達(dá)載體pQE60用于細(xì)菌表達(dá)。(QIAGEN公司，Eton大街9259號，Chatsworth，CA，91311)。pQE60編碼氨芐青霉素抗生素抗性(″Amp″)并包含細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)(″ori″)、IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(″RBS″)、六個(gè)編碼組氨酸殘基的密碼子(其可以用QIAGEN公司(同上)出售的鎳-次氮基-三乙酸(″Ni-NTA″)親和性樹脂進(jìn)行親和性純化)和合適的單限制酶切位點(diǎn)。這些元件安排為以便編碼多肽的插入的DNA片段可以表達(dá)具有六個(gè)與多肽的羧基末端共價(jià)連接的組氨酸殘基(即″6X組氨酸標(biāo)記″)的多肽。
編碼缺乏疏水前導(dǎo)序列的人類抗微生物肽的所需部分的DNA序列利用PCR寡核苷酸引物由保藏的cDNA克隆擴(kuò)增，其中寡核苷酸引物退火至人類抗微生物肽的所需部分的氨基末端序列和保藏的構(gòu)建體3’至cDNA編碼序列的序列。將包含有利于在pQE60載體中克隆的限制酶切位點(diǎn)的附加核苷酸分別加至5’和3’序列上。
對于克隆成熟蛋白質(zhì)來說，5’引物具有包含帶下劃線的后跟20個(gè)核苷酸(互補(bǔ)于圖1中的成熟人類抗微生物肽序列的氨基末端編碼序列)的NcoI限制酶切位點(diǎn)的序列5’GACTCCATGGGTGTTTTTGGTGGTATAGGC3’(SEQ IDNO6)。當(dāng)然，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將注意到在蛋白質(zhì)編碼序列中的5’引物開始的位點(diǎn)可以變化，從而擴(kuò)增編碼比成熟形式短或長的完全蛋白質(zhì)的任何所需部分的DNA節(jié)段。3’引物具有包含帶下劃線的后跟20個(gè)核苷酸(互補(bǔ)于在圖1的人類抗微生物肽DNA序列中的、恰好在終止密碼子之前的編碼序列的3’末端)的BglII限制酶切位點(diǎn)的序列5’GACTAGATCTTGGCTTTTTGCAGCATTTTG3’(SEQ ID NO7)，其中排列編碼序列與限制酶切位點(diǎn)以便保持其具有含有六個(gè)組氨酸密碼子(在pQE60載體中)的序列的讀框。
用NcoI和BglII消化所擴(kuò)增的人類抗微生物肽DNA片段和載體pQE60，然后將所消化的DNAs連接在一起。插入人類抗微生物肽DNA至受限制的pQE60載體中使人類抗微生物肽蛋白質(zhì)編碼區(qū)位于IPTG誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的下游并且符合具有起始AUG和六個(gè)組氨酸密碼子的讀框。
利用如那些由Sambrook等(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，NY(1989))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法，將連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。將包含多拷貝的質(zhì)粒pREP4，表達(dá)lac阻抑物并授予卡那霉素抗性(″Kanr″)的大腸桿菌菌株M15/rep4用于實(shí)施這里描述的說明性例子。這一菌株(其僅僅是許多適于表達(dá)人類抗微生物肽的菌株之一)是由QIAGEN公司(同上)市售的。按照它們在存在氨芐青霉素和卡那霉素時(shí)在LB平板上的生長能力來識別轉(zhuǎn)化體。將質(zhì)粒DNA從抗性菌落中分離，由限制酶切分析、PCR和DNA測序測定克隆的DNA的等同性。
使包含所需構(gòu)建體的克隆在液態(tài)培養(yǎng)物中在補(bǔ)加有氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的LB培養(yǎng)基上生長過夜(″O/N″)。O/N培養(yǎng)物用來接種大型培養(yǎng)物，其稀釋比例為大約1∶25至1∶250。使細(xì)胞在0.4和0.6的600nm光密度(″OD600″)下生長。然后加入異丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(“IPTG”)至1mM的終濃度，以便通過滅活lacI阻抑物來誘導(dǎo)lac阻抑敏感啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。其后進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)。然后由離心收獲細(xì)胞。
然后在4℃下在6M胍-HCl(pH8)中攪拌細(xì)胞3-4小時(shí)。由離心除去細(xì)胞碎片，并將包含人類抗微生物肽的上清液裝載到鎳-次氮基-三乙酸(″Ni-NTA″)親和性樹脂柱(得自QIAGEN公司，同上)上。具有6X組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)與具有高親和性的NI-NTA樹脂結(jié)合，并可以使用簡單的一步方法(詳見QIAexpressionist，1995，QIAGEN公司，同上)純化該蛋白質(zhì)。簡要地說，將上清液裝載到在6M胍-HCl(pH8)中的柱上，首先以10體積6M胍-HCl(pH8)洗滌該柱，然后用10體積6M胍-HCl(pH6)洗滌柱，最后用6M胍-HCl(pH5)洗脫人類抗微生物肽。
然后通過在磷酸鹽-緩沖鹽水(PBS)或50mM乙酸鈉緩沖液(pH 6)加上200mM NaCl中透析，使純化的蛋白質(zhì)復(fù)性。此外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)固定在Ni-NTA柱上時(shí)，可以成功地重折疊該蛋白質(zhì)。推薦的條件如下復(fù)性時(shí)利用線性6M-1M尿素梯度，該尿素溶于500mM NaCl、20％甘油、20mMTris/HCl pH7.4中，其中包含蛋白酶抑制劑。完成復(fù)性應(yīng)該歷時(shí)1.5小時(shí)或更長時(shí)間。在復(fù)性之后，可以通過加入250mM咪唑來洗脫蛋白質(zhì)。由在PBS或50mM乙酸鈉(pH6)緩沖液加上200mM NaCl中的最后透析步驟來除去咪唑。將純化的蛋白質(zhì)存儲在4℃下或凍結(jié)在-80℃下。實(shí)施例1(b)抗微生物肽在大腸桿菌中的表達(dá)和純化在這一實(shí)施例中細(xì)菌表達(dá)載體pQE60用于細(xì)菌表達(dá)。(QIAGEN公司，Eton大街9259號，Chatsworth，CA，91311)。pQE60編碼氨芐青霉素抗生素抗性(″Amp″)和包含細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)(″ori″)、IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(″RBS″)、利用QIAGEN公司(同上)出售的鎳-次氮基-三乙酸(″Ni-NTA″)親和性樹脂使之得以親和性純化的六個(gè)編碼組氨酸殘基的密碼子和合適的單限制酶切位點(diǎn)。這些元件安排為以便編碼多肽的DNA片段可以以一定方式插入，其中該方式能夠產(chǎn)生具有六個(gè)與多肽的羧基末端共價(jià)連接的組氨酸殘基(即“6X組氨酸標(biāo)記”)的多肽。然而，在這個(gè)實(shí)施例中，插入多肽編碼序列以便六個(gè)組氨酸密碼子的翻譯受到阻止，并因此而產(chǎn)生了不具有6X組氨酸標(biāo)記的多肽。
編碼缺乏疏水前導(dǎo)序列的成熟人類抗微生物肽的所需部分的DNA序列利用PCR寡核苷酸引物由保藏的cDNA克隆擴(kuò)增，其中PCR寡核苷酸引物退火至人類抗微生物肽的所需部分的氨基末端序列和保藏的構(gòu)建體3’至cDNA編碼序列的序列。將包含有利于在pQE60載體中克隆的限制酶切位點(diǎn)的附加核苷酸分別加至5’和3’序列上。
對于克隆成熟蛋白質(zhì)來說，5’引物具有包含帶下劃線的后跟20個(gè)核苷酸(互補(bǔ)于圖1中的成熟人類抗微生物肽序列的氨基末端編碼序列)的NcoI限制酶切位點(diǎn)的序列5’GACTCCATGGGTGTTTTTGGTGGTATAGGC3’(SEQ IDNO6)。當(dāng)然，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將注意到在蛋白質(zhì)編碼序列中的5’引物開始的位點(diǎn)可以變化，從而擴(kuò)增比成熟形式短或長的完全蛋白質(zhì)的所需部分。3’引物具有包含帶下劃線的后跟終止密碼子和20個(gè)核苷酸(互補(bǔ)于在圖1的人類抗微生物肽DNA序列中的編碼序列的3’末端)的BglII限制酶切位點(diǎn)的序列5’GACTAGATCTTCATGGCTTTTTGCAGCATTTTG3’(SEQ IDNO8)。
用NcoI和BglII消化所擴(kuò)增的人類抗微生物肽DNA片段和載體pQE60，然后將所消化的DNAs連接在一起。插入人類抗微生物肽DNA至受限制的pQE60載體中使人類抗微生物肽蛋白質(zhì)編碼區(qū)位于IPTG誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的下游并且符合具有起始AUG的讀框。相關(guān)終止密碼子阻止插入點(diǎn)下游的六個(gè)組氨酸密碼子的翻譯。
利用如那些由Sambrook等(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，NY(1989))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法，將連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。將包含多拷貝的質(zhì)粒pREP4，表達(dá)lac阻抑物并授予卡那霉素抗性(″Kanr″)的大腸桿菌菌株M15/rep4用于實(shí)施這里描述的說明性例子。這一菌株(其僅僅是許多適于表達(dá)人類抗微生物肽的菌株之一)是由QIAGEN公司(同上)市售的。按照它們在存在氨芐青霉素和卡那霉素時(shí)在LB平板上的生長能力來識別轉(zhuǎn)化體。將質(zhì)粒DNA從抗性菌落中分離，由限制酶切分析、PCR和DNA測序測定克隆的DNA的等同性。
使包含所需構(gòu)建體的克隆在液態(tài)培養(yǎng)物中在補(bǔ)加有氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的LB培養(yǎng)基上生長過夜(″O/N″)。O/N培養(yǎng)物用來接種大型培養(yǎng)物，其稀釋比例為大約1∶25至1∶250。使細(xì)胞在0.4和0.6的600nm光密度(″OD600″)下生長。然后加入異丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(“IPTG”)至1mM的終濃度，以便通過滅活lacI阻抑物來誘導(dǎo)lac阻抑敏感啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。其后進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)。然后由離心收獲細(xì)胞。
然后在4℃下在6M胍-HCl(pH8)中攪拌細(xì)胞3-4小時(shí)。由離心除去細(xì)胞碎片，并使包含人類抗微生物肽的上清液在補(bǔ)加有200mM NaCl的50mM乙酸鈉緩沖液(pH 6)中透析。此外，通過使之在500mM NaCl、20％甘油、20mM Tris/HCl pH7.4(包含蛋白酶抑制劑)中透析，可以成功地重折疊該蛋白質(zhì)。在復(fù)性之后，可以用離子交換、疏水相互作用和大小排阻層析純化蛋白質(zhì)。此外，如抗體柱的親和層析步驟可以用來獲得純的人類抗微生物肽。將純化的蛋白質(zhì)存儲在4℃下或凍結(jié)在-80℃下。實(shí)施例2抗微生物肽在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的克隆和表達(dá)在這一說明性實(shí)施例中，質(zhì)粒穿梭載體pA2用來將編碼完全蛋白質(zhì)的克隆的DNA(包含其天然相關(guān)的分泌信號(前導(dǎo))序列)插入至表達(dá)成熟人類抗微生物肽的桿狀病毒中，其中所利用的方法是Summers等(用于桿狀病毒載體和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)過程的方法的手冊，得克薩斯農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站通訊，1555期(1987))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法。這一表達(dá)載體包含苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)的強(qiáng)多角體蛋白啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子后跟諸如BamHI和Asp718之類的便利的限制酶切位點(diǎn)。猴病毒40(″SV40″)的聚腺苷酸化位點(diǎn)用于有效的聚腺苷酸化。為了易于選擇重組病毒，質(zhì)粒包含得自在弱果蠅屬啟動(dòng)子控制下的具有相同取向的大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因，其后跟多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號。使所插入的基因位于用于以細(xì)胞介導(dǎo)的與野生型病毒DNA的同源重組的病毒序列的兩側(cè)，以產(chǎn)生表達(dá)克隆的多核苷酸的活病毒。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所易于認(rèn)識到的，只要構(gòu)建體為轉(zhuǎn)錄、翻譯、分泌等等提供適當(dāng)定位的信號(包含所需的信號肽和符合讀框的AUG)，就可以利用許多其它桿狀病毒載體(如pAc373、pVL941和pAcIM1)來替代上述載體。這樣的載體描述在例如Luckow等，病毒學(xué)，17031-39中。
利用與基因的5’和3’序列相對應(yīng)的PCR寡核苷酸引物，擴(kuò)增編碼保藏克隆中的全長人類抗微生物肽蛋白質(zhì)的cDNA序列，包括AUG起始密碼子和圖1中所顯示的天然相關(guān)的前導(dǎo)序列(SEQ ID NO2))。5’引物具有包含帶下劃線的BamHI限制酶位點(diǎn)的序列5’GACTGGATCCGCCATCATGAGGGTCTTGTATCTCC3’(SEQ ID NO9)(一種使真核細(xì)胞中的翻譯起始的有效信號，其由Kozak，M.，分子生物學(xué)雜志，196947-950(1987)描述)，其后跟著圖1所示的完全人類抗微生物肽的序列(開始于AUG起始密碼子)的19個(gè)堿基。3’引物具有包含帶下劃線的Asp718限制酶切位點(diǎn)(其后為20個(gè)互補(bǔ)于圖1中的3’非編碼序列的核苷酸)的序列5’GACTGGTACCGATGTCGCACGTCTCTGATG3’(SEQ ID NO10)。
利用市售試劑盒(″Geneclean″BIO 101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠中分離所擴(kuò)增的片段。然后以Bam HI和Asp718消化片段，并再一次在1％瓊脂糖凝膠上純化之。這一片段在這里被指定為″F1″。
以限制酶Bam HI和Asp718消化質(zhì)粒，同時(shí)可以選擇性地由本領(lǐng)域所知的常規(guī)方法利用小牛小腸磷酸酶對質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化。然后利用市售試劑盒(″Geneclean″BIO 101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠中分離DNA。這一載體DNA在這里被指定為″V1″。
使片段F1和去磷酸化的質(zhì)粒V1與T4 DNA連接酶連接。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101或其它合適的大腸桿菌宿主(如XL-1Blue(Stratagene克隆系統(tǒng)，La Jolla，CA))細(xì)胞，并將其涂布在培養(yǎng)平板上。利用PCR方法鑒定包含具有人類抗微生物肽基因的質(zhì)粒的細(xì)菌，其中，引物之一用來擴(kuò)增基因，第二引物得自載體，使得只有那些包含人類抗微生物肽基因片段的細(xì)菌菌落才會顯示出DNA的擴(kuò)增。通過DNA測序確認(rèn)克隆的片段的序列。這一質(zhì)粒在這里被指定為pBac抗微生物肽。
利用由Felgner等(美國國家科學(xué)院院報(bào)，847413-7417(1987))描述的脂轉(zhuǎn)染方法，用1.0μg市售的線性化桿狀病毒DNA(“BacuioGoldTM桿狀病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)共轉(zhuǎn)染5μg質(zhì)粒pBac抗微生物肽。在包含50μl無血清的Grace培養(yǎng)基(生命技術(shù)公司，Gaithersburg，MD)的微量滴定板的無菌孔中，混合1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg質(zhì)粒pBac抗微生物肽。其后，加入10μl Lipofectin和90μl Grace培養(yǎng)基，混合之并在室溫下將其培養(yǎng)15分鐘。然后，將轉(zhuǎn)染混合物滴加至接種在35mm組織培養(yǎng)平板(具有1ml Grace培養(yǎng)基而無血清)中的Sf9昆蟲細(xì)胞(ATCC CRL 171)中。來回往復(fù)地?fù)u動(dòng)平板以混合新加入的溶液。然后在27℃下培養(yǎng)平板5小時(shí)。在5小時(shí)之后，從平板上除去轉(zhuǎn)染溶液，并加入1ml補(bǔ)加有10％胎牛血清的Grace昆蟲培養(yǎng)基。將平板放回培養(yǎng)箱，并在27℃下繼續(xù)培養(yǎng)四天。
在四天之后，收集上清液，并按照如Summers和Smith(同上)所描述的方法進(jìn)行噬斑測定。具有″Blue Gal″(生命技術(shù)公司，Gaithersburg)的瓊脂糖凝膠用來使得半乳糖表達(dá)克隆(其產(chǎn)生藍(lán)色染色噬斑)易于鑒定和分離。(這一類型的″噬斑測定″的詳細(xì)描述也可以在由生命技術(shù)公司發(fā)布的關(guān)于昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)的用戶指南中發(fā)現(xiàn)，Gaithersburg，9-10頁)。在適當(dāng)?shù)臏赜?，以微量移液?如Eppendorf)尖端挑取藍(lán)色染色噬斑。然后在包含200μl Grace培養(yǎng)基的微量離心管中再懸浮包含重組病毒的瓊脂，并將包含重組桿狀病毒的懸浮液用來感染接種在35mm平皿上的Sf9細(xì)胞。四天后，收獲這些培養(yǎng)皿中的上清液，然后將它們存儲在4℃下。重組病毒被稱為V-抗微生物肽。
為了檢驗(yàn)人類抗微生物肽基因的表達(dá)，使Sf9細(xì)胞生長在補(bǔ)加有10％熱滅活的FBS的Grace培養(yǎng)基中。用重組桿狀病毒V-抗微生物肽對細(xì)胞進(jìn)行感染，感染復(fù)數(shù)(″MOI″)為大約2。六小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，并以SF900II培養(yǎng)基減去甲硫氨酸和半胱氨酸(得自生命技術(shù)公司，Rockville，MD)代替之。如果需要放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)，那么在42小時(shí)后，加入5μCi35S-甲硫氨酸和5μCi35S-半胱氨酸(由Amersham提供)。進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞16小時(shí)，然后由離心收獲它們。上清液中的蛋白質(zhì)以及胞內(nèi)蛋白質(zhì)由SDS-PAGE和其后的放射自顯影術(shù)(如果是放射性標(biāo)記的)分析。純化的蛋白質(zhì)的氨基末端的氨基酸序列的微量測序可以用來確定成熟蛋白質(zhì)的氨基末端序列，并因此而確定分泌信號肽的切割點(diǎn)與長度。實(shí)施例3人類抗微生物肽在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆和表達(dá)典型的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包含啟動(dòng)子元件(介導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄的起始)、蛋白質(zhì)編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄物聚腺苷酸化所需的信號。附加的元件包括增強(qiáng)子、Kozak序列和間插序列(側(cè)接RNA剪接的供體和受體位點(diǎn))。利用得自SV40的早期和晚期啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒(如RSV、HTLVI、HIVI)的長末端重復(fù)序列(LTRS)和巨細(xì)胞病毒(CMV)的早期啟動(dòng)子，可以實(shí)現(xiàn)高效的轉(zhuǎn)錄。然而，也可以利用細(xì)胞元件(例如人肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。例如，用于實(shí)踐本發(fā)明的合適表達(dá)載體包括諸如PSVL和PMSG(Pharmacia，Uppsala，瑞典)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC 67109)之類的載體?？梢岳玫牟溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞包括人Hela 293、H9和Jurkat細(xì)胞，小鼠NIH3T3和C127細(xì)胞，Cos1，Cos 7和CV 1，鵪鶉QC1-3細(xì)胞，小鼠L細(xì)胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
此外，基因可以在穩(wěn)定的細(xì)胞系中表達(dá)，這些細(xì)胞系包含整合入染色體的基因。利用選擇性標(biāo)記(如dhfr、gpt、新霉素或潮霉素)的共轉(zhuǎn)染使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的鑒定與分離得以實(shí)現(xiàn)。
也可以擴(kuò)增轉(zhuǎn)染的基因，以表達(dá)大量的所編碼的蛋白質(zhì)。DHFR(二氫葉酸還原酶)標(biāo)記用來產(chǎn)生攜帶數(shù)百或甚至數(shù)千拷貝的感興趣基因的細(xì)胞系。另一有用的選擇標(biāo)記是酶谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy等，生物化學(xué)雜志，227277-279(1991)；Bebbington等，生物/技術(shù)，10169-175(1992))。利用這些標(biāo)記，使哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長在選擇性培養(yǎng)基中，并選擇具有最高抗性的細(xì)胞。這些細(xì)胞系包含整合入染色體的擴(kuò)增的基因。中國倉鼠卵巢(CHO)和NSO細(xì)胞經(jīng)常用于蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
表達(dá)載體pC1和pC4包含Rous肉瘤病毒的強(qiáng)啟動(dòng)子(LTR)(Cullen等，分子和細(xì)胞生物學(xué)，438-447(1985年3月))和CMV-增強(qiáng)子的片段(Boshart等，細(xì)胞，41521-530(1985))。多克隆位點(diǎn)，例如具有限制酶切位點(diǎn)BamHI、XbaI和Asp718的多克隆位點(diǎn)，有利于感興趣的基因的克隆。此外，載體還包含大鼠前胰島素原基因的3’內(nèi)含子、聚腺苷酸化和終止信號。實(shí)施例3(a)在COS細(xì)胞中的克隆和表達(dá)通過將編碼全長人類抗微生物肽的cDNA克隆至表達(dá)載體pcDNAI/Amp或者pcDNAIII(可以得自Invitrogen公司)來制得表達(dá)質(zhì)粒(p抗微生物HA)。
表達(dá)載體pcDNAI/amp包含(1)對在大腸桿菌和其它原核細(xì)胞中的增殖有效的大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；(2)用于選擇包含質(zhì)粒的原核細(xì)胞的氨芐青霉素抗性基因；(3)用于在真核細(xì)胞中增殖的SV40復(fù)制起點(diǎn)；(4)CMV啟動(dòng)子、多接頭、SV40內(nèi)含子；(5)數(shù)個(gè)編碼血凝素片段的密碼子(即有利于純化的″HA″標(biāo)記)，其后跟終止密碼子和聚腺苷酸化信號，如此安排是以便cDNA可以方便地處于CMV啟動(dòng)子的表達(dá)控制下，并便于可操作地經(jīng)由多接頭中的限制酶切位點(diǎn)與SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸化信號連接。HA標(biāo)記對應(yīng)于得自由Wilson等(細(xì)胞，37767(1984))描述的流感血凝素蛋白質(zhì)的表位。HA標(biāo)記與靶蛋白質(zhì)的融合使得用能識別HA表位的抗體容易地檢測和回收重組蛋白得以實(shí)現(xiàn)。此外，pcDNAIII包含可選擇的新霉素標(biāo)記。
將編碼全長抗微生物肽的DNA片段克隆至載體的多接頭區(qū)，以便重組蛋白的表達(dá)受到CMV啟動(dòng)子的指導(dǎo)。質(zhì)粒構(gòu)建方法如下。利用包含便利的限制酶切位點(diǎn)的引物(正如上面對于構(gòu)建用于在大腸桿菌中表達(dá)抗微生物肽的載體所述的一樣)，擴(kuò)增保藏克隆的抗微生物肽cDNA。合適的引物包括下列的、用于這一實(shí)施例的引物。包含帶下劃線的BamHI位點(diǎn)、Kozak序列、AUG起始密碼子和完全抗微生物肽的5’編碼區(qū)的19個(gè)核苷酸的5’引物具有下列序列5’GACTGGATCCGCCATCATGAGGGTCTTGTATCTCC3’(SEQ IDNO9)。包含帶下劃線的BglII位點(diǎn)和20 bp的3’編碼序列的3’引物具有下列序列(在3’末端)5’GACTAGATCTTGGCTTTTTGCAGCATTTTG3’(SEQ IDNO7)。
以BamHI和BgllI消化PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體，即pcDNAI/Amp，然后連接之。將連接混合物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株SURE(得自Stratagene克隆系統(tǒng)，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037)中，并將所轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物接種在氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上，然后培養(yǎng)該平板以使氨芐青霉素抗性菌落得以生長。將質(zhì)粒DNA從抗性菌落中分離，并用限制酶切分析或者其它手段檢測質(zhì)粒DNA中是否存在抗微生物肽編碼片段。
對于重組抗微生物肽的表達(dá)，用如上所述的表達(dá)載體使用例如由Sambrook等(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1989))描述的DEAE-DEXTRAN來轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。在用于由載體表達(dá)抗微生物肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
利用例如Harlow等(抗體實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1988))描述的方法，由放射性標(biāo)記和免疫沉淀法檢測抗微生物肽-HA融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。為此，在轉(zhuǎn)染兩天之后，在包含35S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)8小時(shí)來標(biāo)記細(xì)胞。收集細(xì)胞和培養(yǎng)基，并用包含洗滌劑的RIPA緩沖液(150mM NaCl、1％NP-40、0.1％SDS、0.5％DOC、50mM TRIS，pH 7.5，正如以上引用的Wilson等所描述的)洗滌和溶解細(xì)胞。利用HA特異性單克隆抗體使蛋白質(zhì)從細(xì)胞溶胞產(chǎn)物和培養(yǎng)基中沉淀出來。然后由SDS-PAGE和放射自顯影術(shù)分析所沉淀的蛋白質(zhì)。在細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中看見預(yù)期大小的表達(dá)產(chǎn)物，而在陰性對照中則看不見。實(shí)施例3(b)在CHO細(xì)胞中的克隆和表達(dá)載體pC4用來表達(dá)抗微生物肽。質(zhì)粒pC4是質(zhì)粒pSV2-dhfr(ATCC保藏號37146)的衍生物。質(zhì)粒包含處于SV40早期啟動(dòng)子的控制之下的小鼠DHFR基因?？梢酝ㄟ^使細(xì)胞生長在補(bǔ)加有化療劑氨甲蝶呤的選擇性培養(yǎng)基(α-MEM，生命技術(shù))中來選擇缺乏二氫葉酸活性的、用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢細(xì)胞或其它細(xì)胞。在具有氨甲蝶呤(MTX)抗性的細(xì)胞中的DHFR基因的擴(kuò)增已得到充分的記載(參見，例如，Alt，F(xiàn).W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.和Schimke，R.T.，1978，生物化學(xué)雜志，253；1357-1370，Hamlin，J.L.和Ma，C.1990，生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)，1097107-143，Page，M.J.和Sydenham，M.A.1991，生物技術(shù)，964-68)。作為DHFR基因擴(kuò)增的結(jié)果，生長在MTX濃度不斷增加的環(huán)境中的細(xì)胞通過超量生產(chǎn)靶酶(DHFR)來產(chǎn)生抗藥性。如果第二個(gè)基因與DHFR基因連接，那么它通常得到共擴(kuò)增和超表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白這一方法可以用來產(chǎn)生攜帶超過1,000個(gè)拷貝的擴(kuò)增的基因的細(xì)胞系。其后，當(dāng)除去氨甲蝶呤時(shí)，獲得包含整合入宿主細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)染色體中的擴(kuò)增的基因的細(xì)胞系。
用于表達(dá)感興趣基因的質(zhì)粒pC4包含Rous肉瘤病毒(Cullen等，分子和細(xì)胞生物學(xué)，1985年3月438-447)的長末端重復(fù)序列(LTR)的強(qiáng)大的啟動(dòng)子和分離自人巨細(xì)胞病毒(CMV)(Boshart等，細(xì)胞，41521-530(1985))的立即早期基因的增強(qiáng)子的片段。啟動(dòng)子的下游是使基因得以整合的BamHI、XbaI和Asp718限制酶切割位點(diǎn)。在這些克隆位點(diǎn)后面，質(zhì)粒包含大鼠前胰島素原基因的3’內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點(diǎn)。其它的高效啟動(dòng)子也可以用于表達(dá)，例如人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，SV40早期或晚期啟動(dòng)子或者得自其它逆轉(zhuǎn)錄病毒(如HIV和HTLVI)的長末端重復(fù)序列。Clontech的Tet-Off和Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)和類似系統(tǒng)可以用來在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以可調(diào)方式表達(dá)抗微生物肽(Gossen，M.和Bujard，H.1992，美國國家科學(xué)院院報(bào)，895547-5551)。對于mRNA的聚腺苷酸化其它信號，例如得自人生長激素或珠蛋白基因的信號也可以利用。也可以基于利用選擇性標(biāo)記(如gpt、G418或潮霉素)的共轉(zhuǎn)染來選擇攜帶整合入染色體中的感興趣基因的穩(wěn)定細(xì)胞系。優(yōu)選在開始時(shí)利用一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記，例如G418和氨甲蝶呤。
用限制酶BamHI和Asp718消化質(zhì)粒pC4，然后利用小牛小腸磷酸酶由本領(lǐng)域已知的方法使之去磷酸化。然后從1％瓊脂糖凝膠中分離載體。
利用與基因的5’和3’序列對應(yīng)的PCR寡核苷酸引物，擴(kuò)增編碼完全抗微生物肽的DNA序列，包含其前導(dǎo)序列。5’引物具有包含帶下劃線的BamHI限制酶位點(diǎn)(其后為用于起始在真核生物中的翻譯的有效信號，正如Kozak，M.，分子生物學(xué)雜志，196947-950(1987)所描述的)和圖1(SEQID NO1)所示的抗微生物肽的20個(gè)堿基的編碼序列的序列5’GACTGGATCCGCCATCATGAGGGTCTTGTATCTCC3’(SEQ ID NO9)。引物3’具有包含帶下劃線的Asp718限制酶切位點(diǎn)(其后為互補(bǔ)于圖1(SEQ ID NO1)所示的抗微生物肽基因的非翻譯區(qū)的20個(gè)核苷酸)的序列5’GACTGGTACCGATGTCGCACGTCTCTGATG3’(SEQ ID NO10)。
以內(nèi)切核酸酶BamHI和Asp718消化所擴(kuò)增的片段，然后在1％瓊脂糖凝膠上再一次純化之。然后以T4 DNA連接酶連接分離的片段和去磷酸化的載體。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101或XL-1 Blue細(xì)胞，并利用例如限制酶分析鑒定包含插入到質(zhì)粒pC4中的片段的細(xì)菌。
將缺乏活性DHFR基因的中國倉鼠卵巢細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。利用Lipofectin(Felgner等，同上)用0.5μg質(zhì)粒pSV2-neo共轉(zhuǎn)染5μg表達(dá)質(zhì)粒pC4。質(zhì)粒pSV2-neo包含顯性選擇標(biāo)記、得自編碼酶(授予抗包括G418的抗生素的抗性)的Tn5的neo基因。將細(xì)胞接種在補(bǔ)加有1mg/mlG418的α-MEM中。在2天之后，對細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化，并將其接種在雜交瘤克隆平板(Greiner，德國)(在補(bǔ)加有10、25或50ng/ml氨甲蝶呤和1mg/ml G418的α-MEM中的)中。在大約10-14天之后，對單一克隆進(jìn)行胰蛋白酶消化，然后利用不同濃度(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)的氨甲蝶呤將其接種在6孔培養(yǎng)皿或10ml燒瓶中。然后將在最高濃度的氨甲蝶呤下生長的克隆轉(zhuǎn)移至包含更高濃度(1μM、2μM、5μM、10mM、20mM)氨甲蝶呤的新的6孔平板上。重復(fù)相同的過程，直到獲得生長在100-200μM濃度下的克隆。由例如SDS-PAGE和Western印跡或反相HPLC分析所需基因產(chǎn)物的表達(dá)。實(shí)施例4抗微生物肽mRNA表達(dá)的組織分布利用由Sambrook等(同上)描述的方法，進(jìn)行Northern印跡分析以檢測在人組織中抗微生物肽基因的表達(dá)。利用rediprimeTMDNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham生命科學(xué))，按照制造廠商的指導(dǎo)，用32P標(biāo)記包含抗微生物肽(SEQ ID NO1)的整個(gè)核苷酸序列的cDNA探針。在標(biāo)記之后，利用CHROMASPIN-100TM柱(Clontech實(shí)驗(yàn)室公司)，按照制造廠商的PT1200-1號方案純化探針。然后用純化的標(biāo)記的探針來檢測各人體組織中的抗微生物肽mRNA。
包含各種人體組織(H)或人免疫系統(tǒng)組織(IM)的多組織Northern(MTN)印跡得自Clontech，并利用ExpressHybTM雜交溶液(Clontech)按照制造廠商的PT1190-1號方案用標(biāo)記的探針檢測之。在雜交和洗滌之后，封固印跡同時(shí)使之在-70℃下在膠片上曝光一夜，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法顯影膠片。
明顯的是與在前面說明書和實(shí)施例中具體描述的方法相比，本發(fā)明可以用更多的其它方法實(shí)踐。
按照以上教導(dǎo)，本發(fā)明的許多改進(jìn)和變化是可能實(shí)現(xiàn)的，因此這些改進(jìn)和變化處于后附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
本文引用的所有出版物(包含專利、專利申請、期刊文章、實(shí)驗(yàn)室手冊、書或其它文獻(xiàn))的全部公開部分與本文一并參考。
序列表(1)一般信息(i)申請人人類基因組科學(xué)公司9410 KEY WEST AVENUEROCKVILLE，MD 20850美國申請人/發(fā)明人OLSEN，HENRIK S.
RUBEN，STEVEN M.
(ii)發(fā)明名稱抗微生物肽(iii)序列數(shù)10個(gè)(iv)通訊地址(A)收信人STERNE，KESSLER，GOLDSTEIN & FOX P.L.L.C.
(B)街道1100 NEW YORK AVENUE，SUITE 600(C)城市華盛頓(D)州DC(E)國家美國(F)ZIP20005(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，版本#1.30(vi)當(dāng)前的申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)柎?B)申請日本申請的提交日(C)分類(vii)在先的申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 60/046,415(B)申請日14-5-1997
(viii)律師/代理人信息(A)名稱STEFFE，ERIC K.
(B)登記號36,688(C)參考/證書號1488.093PC01(ix)電訊信息(A)電話(202)371-2600(B)傳真(202)371-2540(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度323個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置36..227(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞信號肽(B)位置36..104(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟肽(B)位置105..227(xi)序列描述SEQ ID NO1GACTCAGCTC CTGGTGAAGC TCCCAGCCAT CAGCC ATG AGG GTC TTG TAT CTC 53Met Arg Val Leu Tyr Leu-23 -20CTC TTC TCG TTC CTC TTC ATA TTC CTG ATG CCT CTT CCA GGT GTT TTT 101Leu Phe Ser Phe Leu Phe Ile Phe Leu Met Pro Leu Pro Gly Val Phe-15 -10 -5GGT GGT ATA GGC GAT CCT GTT ACC TGC CTT AAG AGT GGA GCC ATA TGT 149Gly Gly Ile Gly Asp Pro Val Thr Cys Leu Lys Ser Gly Ala Ile Cys1 5 10 15CAT CCA GTC TTT TGC CCT AGA AGG TAT AAA CAA ATT GGC ACC TGT GGT 197His Pro Val Phe Cys Pro Arg Arg Tyr Lys Gln Ile Gly Thr Cys Gly20 25 30CTC CCT GGA ACA AAA TGC TGC AAA AAG CCA TGAGGAGGCC AAGAAGCTGC 247Leu Pro Gly Thr Lys Cys Cys Lys Lys Pro35 40TGTGGCTGAT GCGGATTCAG AAAGGGCTCC CTCATCAGAG ACGTGCGACA TGTAAACCAA 307ATTAAACTAT GGTGTC 323(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度64個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Arg Val Leu Tyr Leu Leu Phe Ser Phe Leu Phe Ile Phe Leu Met-23 -20 -15 -10Pro Leu Pro Gly Val Phe Gly Gly Ile Gly Asp Pro Val Thr Cys Leu-5 1 5Lys Ser Gly Ala Ile Cys His Pro Val Phe Cys Pro Arg Arg Tyr Lys10 15 20 25Gln Ile Gly Thr Cys Gly Leu Pro Gly Thr Lys Cys Cys Lys Lys Pro30 35 40(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度63個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)無關(guān)(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Arg Leu His His Leu Leu Leu Ala Leu Leu Phe Leu Val Leu Ser1 5 10 15Ala Trp Ser Gly Phe Thr Gln Gly Val Gly Asn Pro Val Ser Cys Val20 25 30Arg Asn Lys Gly Ile Cys Val Pro Ile Arg Cys Pro Gly Ser Met Lys35 40 45Gln Ile Gly Thr Cys Val Gly Arg Ala Val Lys Cys Cys Arg Lys50 55 60(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度3974個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4GGTACCTAAG TGAGTAGGGC GTCCGATCGA CGGACGCCTT TTTTTTGAAT TCGTAATCAT60GGTCATAGCT GTTTCCTGTG TGAAATTGTT ATCCGCTCAC AATTCCACAC AACATACGAG 120CCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT GAGCTAACTC ACATTAATTG 180CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG CATTAATGAA 240TCGGCCAACG CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CTCTTCCGCT TCCTCGCTCA 300CTGACTCGCT GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC TCAAAGGCGG 360TAATACGGTT ATCCACAGAA TCAGGGGATA ACGCAGGAAA GAACATGTGA GCAAAAGGCC 420AGCAAAAGGC CAGGAACCGT AAAAAGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC 480CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC CCGACAGGAC 540TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCGACCC 600TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCATA 660GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC 720ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA 780ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG 840CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA 900GAAGAACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG 960GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC 1020AGCAGATTAC GCGCAGAAAA AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT 1080CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTATCGTCGA 1140CAATTCGCGC GCGAAGGCGA AGCGGCATGC ATTTACGTTG ACACCATCGA ATGGTGCAAA 1200ACCTTTCGCG GTATGGCATG ATAGCGCCCG GAAGAGAGTC AATTCAGGGT GGTGAATGTG 1260AAACCAGTAA CGTTATACGA TGTCGCAGAG TATGCCGGTG TCTCTTATCA GACCGTTTCC 1320CGCGTGGTGA ACCAGGCCAG CCACGTTTCT GCGAAAACGC GGGAAAAAGT GGAAGCGGCG 1380ATGGCGGAGC TGAATTACAT TCCCAACCGC GTGGCACAAC AACTGGCGGG CAAACAGTCG 1440TTGCTGATTG GCGTTGCCAC CTCCAGTCTG GCCCTGCACG CGCCGTCGCA AATTGTCGCG 1500GCGATTAAAT CTCGCGCCGA TCAACTGGGT GCCAGCGTGG TGGTGTCGAT GGTAGAACGA 1560AGCGGCGTCG AAGCCTGTAA AGCGGCGGTG CACAATCTTC TCGCGCAACG CGTCAGTGGG 1620CTGATCATTA ACTATCCGCT GGATGACCAG GATGCCATTG CTGTGGAAGC TGCCTGCACT 1680AATGTTCCGG CGTTATTTCT TGATGTCTCT GACCAGACAC CCATCAACAG TATTATTTTC 1740TCCCATGAAG ACGGTACGCG ACTGGGCGTG GAGCATCTGG TCGCATTGGG TCACCAGCAA 1800ATCGCGCTGT TAGCGGGCCC ATTAAGTTCT GTCTCGGCGC GTCTGCGTCT GGCTGGCTGG 1860CATAAATATC TCACTCGCAA TCAAATTCAG CCGATAGCGG AACGGGAAGG CGACTGGAGT 1920GCCATGTCCG GTTTTCAACA AACCATGCAA ATGCTGAATG AGGGCATCGT TCCCACTGCG 1980ATGCTGGTTG CCAACGATCA GATGGCGCTG GGCGCAATGC GCGCCATTAC CGAGTCCGGG 2040CTGCGCGTTG GTGCGGATAT CTCGGTAGTG GGATACGACG ATACCGAAGA CAGCTCATGT 2100TATATCCCGC CGTTAACCAC CATCAAACAG GATTTTCGCC TGCTGGGGCA AACCAGCGTG 2160GACCGCTTGC TGCAACTCTC TCAGGGCCAG GCGGTGAAGG GCAATCAGCT GTTGCCCGTC 2220TCACTGGTGA AAAGAAAAAC CACCCTGGCG CCCAATACGC AAACCGCCTC TCCCCGCGCG 2280TTGGCCGATT CATTAATGCA GCTGGCACGA CAGGTTTCCC GACTGGAAAG CGGGCAGTGA 2340GCGCAACGCA ATTAATGTAA GTTAGCGCGA ATTGTCGACC AAAGCGGCCA TCGTGCCTCC 2400CCACTCCTGC AGTTCGGGGG CATGGATGCG CGGATAGCCG CTGCTGGTTT CCTGGATGCC 2460GACGGATTTG CACTGCCGGT AGAACTCCGC GAGGTCGTCC AGCCTCAGGC AGCAGCTGAA 2520CCAACTCGCG AGGGGATCGA GCCCGGGGTG GGCGAAGAAC TCCAGCATGA GATCCCCGCG 2580CTGGAGGATC ATCCAGCCGG CGTCCCGGAA AACGATTCCG AAGCCCAACC TTTCATAGAA 2640GGCGGCGGTG GAATCGAAAT CTCGTGATGG CAGGTTGGGC GTCGCTTGGT CGGTCATTTC 2700GAACCCCAGA GTCCCGCTCA GAAGAACTCG TCAAGAAGGC GATAGAAGGC GATGCGCTGC 2760GAATCGGGAG CGGCGATACC GTAAAGCACG AGGAAGCGGT CAGCCCATTC GCCGCCAAGC 2820TCTTCAGCAA TATCACGGGT AGCCAACGCT ATGTCCTGAT AGCGGTCCGC CACACCCAGC 2880CGGCCACAGT CGATGAATCC AGAAAAGCGG CCATTTTCCA CCATGATATT CGGCAAGCAG 2940GCATCGCCAT GGGTCACGAC GAGATCCTCG CCGTCGGGCA TGCGCGCCTT GAGCCTGGCG 3000AACAGTTCGG CTGGCGCGAG CCCCTGATGC TCTTCGTCCA GATCATCCTG ATCGACAAGA 3060CCGGCTTCCA TCCGAGTACG TGCTCGCTCG ATGCGATGTT TCGCTTGGTG GTCGAATGGG 3120CAGGTAGCCG GATCAAGCGT ATGCAGCCGC CGCATTGCAT CAGCCATGAT GGATACTTTC 3180TCGGCAGGAG CAAGGTGAGA TGACAGGAGA TCCTGCCCCG GCACTTCGCC CAATAGCAGC 3240CAGTCCCTTC CCGCTTCAGT GACAACGTCG AGCACAGCTG CGCAAGGAAC GCCCGTCGTG 3300GCCAGCCACG ATAGCCGCGC TGCCTCGTCC TGCAGTTCAT TCAGGGCACC GGACAGGTCG 3360GTCTTGACAA AAAGAACCGG GCGCCCCTGC GCTGACAGCC GGAACACGGC GGCATCAGAG 3420CAGCCGATTG TCTGTTGTGC CCAGTCATAG CCGAATAGCC TCTCCACCCA AGCGGCCGGA 3480GAACCTGCGT GCAATCCATC TTGTTCAATC ATGCGAAACG ATCCTCATCC TGTCTCTTGA 3540TCAGATCTTG ATCCCCTGCG CCATCAGATC CTTGGCGGCA AGAAAGCCAT CCAGTTTACT 3600TTGCAGGGCT TCCCAACCTT ACCAGAGGGC GCCCCAGCTG GCAATTCCGG TTCGCTTGCT 3660GTCCATAAAA CCGCCCAGTC TAGCTATCGC CATGTAAGCC CACTGCAAGC TACCTGCTTT 3720CTCTTTGCGC TTGCGTTTTC CCTTGTCCAG ATAGCCCAGT AGCTGACATT CATCCGGGGT 3780CAGCACCGTT TCTGCGGACT GGCTTTCTAC GTGTTCCGCT TCCTTTAGCA GCCCTTGCGC 3840CCTGAGTGCT TGCGGCAGCG TGAAGCTTAA AAAACTGCAA AAAATAGTTT GACTTGTGAG 3900CGGATAACAA TTAAGATGTA CCCAATTGTG AGCGGATAAC AATTTCACAC ATTAAAGAGG 3960AGAAATTACA TATG3974(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度112個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)雙鏈(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5AAGCTTAAAA AACTGCAAAA AATAGTTTGA CTTGTGAGCG GATAACAATT AAGATGTACC60CAATTGTGAG CGGATAACAA TTTCACACAT TAAAGAGGAG AAATTACATA TG 112(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型iii)分子類型cDNAixi)序列描述SEQ ID NO6GACTCCATGG GTGTTTTTGG TGGTATAGGC 30(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNAixi)序列描述SEQ ID NO7GACTAGATCT TGGCTTTTTG CAGCATTTTG 30(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度33個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNAixi)序列描述SEQ ID NO8GACTAGATCT TCATGGCTTT TTGCAGCATT TTG 33(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度35個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO9GACTGGATCC GCCATCATGA GGGTCTTGTA TCTCC 35(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10GACTGGTACC GATGTCGCAC GTCTCTGATG 30
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，該核酸分子包含具有與選自由下列序列組成的組中的序列有至少95％同源性的核苷酸序列的多核苷酸(a)一種編碼SEQ ID NO2中的大約-23至大約41位氨基酸的核苷酸序列；(b)一種編碼SEQ ID NO2中的大約-22至大約41位氨基酸的核苷酸序列；(c)一種編碼SEQ ID NO2中的大約1至大約41位氨基酸的核苷酸序列；(d)一種編碼具有由包含在ATCC保藏號97982中的cDNA克隆所編碼的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(e)一種編碼具有由包含在ATCC保藏號97982中的cDNA克隆所編碼的氨基酸序列的成熟抗微生物多肽的核苷酸序列；和(f)一種互補(bǔ)于(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的核苷酸序列之任一的核苷酸序列。
2.一種分離的核酸分子，該核酸分子包含編碼SEQ ID NO2的抗微生物多肽的攜帶表位部分的氨基酸序列的多核苷酸。
3.權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其中所說的攜帶表位部分選自由下列節(jié)段組成的組中SEQ ID NO2中的大約19至大約27位氨基酸和SEQ ID NO2中的大約31至大約41位氨基酸。
4.一種分離的核酸分子，該核酸分子包含具有選自由下列序列組成的組中的序列的多核苷酸(a)SEQ ID NO1所顯示的序列的片段的核苷酸序列，其中所說的片段包含至少20個(gè)SEQ ID NO1中的鄰接核苷酸；和(b)一種互補(bǔ)于(a)的核苷酸序列的核苷酸序列。
5.一種用于制備重組載體的方法，該方法包括將權(quán)利要求1的分離的核酸分子以對啟動(dòng)子可操作的鍵插入到載體中。
6.一種由權(quán)利要求5的方法產(chǎn)生的重組載體。
7.一種制備重組宿主細(xì)胞的方法，該方法包括將權(quán)利要求6的重組載體引入到宿主細(xì)胞中。
8.一種由權(quán)利要求7的方法產(chǎn)生的重組宿主細(xì)胞。
9.一種用于產(chǎn)生多肽的重組方法，該方法包括在使所說的多肽得到表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求8的重組宿主細(xì)胞并回收所說的多肽。
10.一種分離的抗微生物多肽，該抗微生物多肽包含與選自由下列氨基酸組成的組中的氨基酸有至少95％同源性的氨基酸(a)SEQ ID NO2中的大約-23至大約41位氨基酸；(b)SEQ ID NO2中的大約-22至大約41位氨基酸；(c)SEQ ID NO2中的大約1至大約41位氨基酸；和(d)包含(a)、(b)或(c)的多肽之任一的攜帶表位部分的氨基酸。
11.一種分離的多肽，該多肽包含SEQ ID NO2的抗微生物蛋白質(zhì)的攜帶表位部分，其中所說的部分選自由下列節(jié)段組成的組中SEQ ID NO2中的大約19至大約27位氨基酸和SEQ ID NO2中的大約31至大約41位氨基酸。
12.一種分離的抗體，該抗體特異性結(jié)合權(quán)利要求10的抗微生物肽。
13.一種分離的核酸分子，該核酸分子包含編碼抗微生物肽的多核苷酸，其中除至少一個(gè)保守氨基酸取代外，所說的多肽還具有選自由下列序列組成的組中的序列(a)SEQ ID NO2中的大約-23至大約41位氨基酸；(b)SEQ ID NO2中的大約-22至大約41位氨基酸；(c)SEQ ID NO2中的大約1至大約41位氨基酸；(d)由包含在ATCC保藏號97982中的cDNA克隆編碼的氨基酸序列；(e)由包含在ATCC保藏號97982中的cDNA克隆編碼的成熟抗微生物多肽的氨基酸序列；和(f)一種互補(bǔ)于(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的核苷酸序列之任一的核苷酸序列。
14.一種分離的抗微生物多肽，其中除至少一個(gè)保守氨基酸取代外，所說的多肽還包含選自由下列序列組成的組中的序列(a)SEQ ID NO2中的大約-23至大約41位氨基酸；(b)SEQ ID NO2中的大約-22至大約41位氨基酸；(c)SEQ ID NO2中的大約1至大約41位氨基酸；(d)由包含在ATCC保藏號97982中的cDNA克隆編碼的氨基酸序列；(e)由包含在ATCC保藏號97982中的cDNA克隆編碼的成熟抗微生物多肽的氨基酸序列；和(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的多肽之任一的攜帶表位部分的氨基酸序列。
15.一種分離的抗微生物多肽，該抗微生物多肽包含與由包含在ATCC保藏號97982中的cDNA克隆所編碼的氨基酸有至少95％同源性的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的人類抗微生物肽,該肽是防衛(wèi)素超家族的成員之一。具體地說,本發(fā)明提供了編碼人類抗微生物肽的分離的核酸分子。本發(fā)明也提供了抗微生物肽以及載體、宿主細(xì)胞和產(chǎn)生該肽、載體、宿主細(xì)胞的重組方法。本發(fā)明還提供了用于檢測與免疫系統(tǒng)有關(guān)的病癥的診斷方法和用于治療這些病癥的方法。
文檔編號C12N15/12GK1260834SQ98806203
公開日2000年7月19日 申請日期1998年5月14日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月14日
發(fā)明者H·S·歐爾森, S·M·魯本 申請人:人類基因組科學(xué)公司