專利名稱：用于有效反轉錄丙型肝炎病毒(hcv)rna的寡核苷酸引物及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于檢測生物樣品中核酸序列、特別是來源于感染性微生物的序列的改進方法。
丙型肝炎病毒是一種世界范圍內(nèi)的經(jīng)非腸道傳染的病毒，它可導致大量輸血后肝炎情況的發(fā)生和大量的偶發(fā)性(或群體感染性)肝炎情況發(fā)生。據(jù)估計超過1％的世界人口感染有HCV。HCV的感染與急性肝炎(通常是輕度的)、慢性肝炎(各種重度的)、肝硬變和隨后發(fā)生的肝細胞癌有關。
通常將HCV分在黃病毒科中的一種單獨的屬中(Hepacivirus)。它的基因組由約9,500個核苷酸的正鏈RNA分子組成，其中所述的核苷酸帶有單一的較大可讀框(ORF)，該可讀框可編碼約3,000個氨基酸的多蛋白前體。所述的較大ORF位于約340個核苷酸的5’非編碼(NC)區(qū)域之前，它是基因組中最高度的保守區(qū)。ORF的5’區(qū)域(在5’-至-3’方向上)可編碼一種衣殼蛋白、兩種包膜糖蛋白(E1和E2)以及一種未知功能的小蛋白(P7)。ORF的3’部分可編碼非結構性蛋白，它們包括蛋白酶、蛋白酶解旋酶的雙功能蛋白、RNA聚合酶和調(diào)節(jié)肽類。
來自全世界的對HCV編碼序列的分析結果已經(jīng)揭示出在各個病毒分離物中的相當可觀的序列變化形式。此外，對來自各個患者的HCV序列分析結果已經(jīng)證實這些病毒以所謂的“準種”的形式傳播，它們含有相關但不相同的序列。人們認為存在于分離物中和各個患者體內(nèi)的變化形式是由于病毒編碼的RNA依賴性RNA聚合酶的低確限度所導致的結果。HCV遺傳變異性的程度對預防、診斷和控制感染具有重要的意義。
HCV感染的血清診斷一般通過市售可得的酶免疫測定物(EIA)來確定，所述的酶免疫測定物可檢測結合重組HCV蛋白或肽的抗體。陽性EIA結果可由一種重組免疫印跡檢測試驗(RIBA)來證實，但是無論是EIA還是RIBA檢測試驗都不可能從現(xiàn)在的感染情況中區(qū)分過去。由于循環(huán)病毒的效價一般較低，所以還沒有成功地開發(fā)出對病毒蛋白的直接檢測法。此外，以抗體為主的檢測法不能在通常接觸后2-3個月內(nèi)檢測出HCV的感染。
因此，本領域中存在一種對HCV的改進檢測方法的需求，這些方法的敏感性足以在患者接最初觸HCV后幾天內(nèi)檢測出HCV病毒血癥。
因此，一方面，本發(fā)明涉及一種用于反轉錄生物樣品中丙型肝炎病毒(HCV)RNA的方法。該方法包括下列步驟(a)在寡核苷酸引導與至少部分RNA互補的DNA的合成的條件下，使來源于所述樣品的RNA與寡核苷酸接觸；其中所述的寡核苷酸選自(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ IDNO.6>、和(vii)上述任意寡核苷酸的任意組合物。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測生物樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)RNA的方法。該方法包括下列步驟(a)用來源于所述樣品的RNA作模板并用與所述RNA中含有的一段序列互補的寡核苷酸作引物來進行反轉錄反應，從而產(chǎn)生HCV特異性反轉錄產(chǎn)物，其中所述的引物選自(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ ID NO.6>、和(vii)上述任意引物的任意組合物；(b)擴增所述反轉錄反應的產(chǎn)物以便產(chǎn)生擴增產(chǎn)物；并(c)檢測所述的擴增產(chǎn)物；
其中對所述擴增產(chǎn)物的檢測顯示在所述的樣品中HCV RNA的存在。
擴增過程可以通過任意的方法來進行，優(yōu)選聚合酶鏈反應(PCR)。根據(jù)本發(fā)明，HCV特異性反轉錄引物的應用可提供一種對檢測樣品、尤其是血漿中HCV的敏感性方法。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測生物樣品中HCV的試劑盒。該試劑盒包括一種反轉錄引物，所述的反轉錄引物選自(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ IDNO.6>、和(vii)上述任意引物的任意組合物。
所述的試劑盒可以另外包括用于反轉錄、擴增和產(chǎn)物檢測的試劑和說明書。
本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當具有與存在于HCV RNA中的某些序列互補的序列的寡核苷酸用作反轉錄反應的引物時，檢測生物樣品中的丙型肝炎病毒(HCV)RNA將會更為有效。特別是，所述引物的序列與HCV RNA接近的3’非編碼區(qū)的序列一致。
HCV的3’非編碼(NC)區(qū)僅有98個核苷酸長，它過短以致于無法用隨機引物引導該區(qū)域中的反轉錄過程。本發(fā)明提供了新型特異性寡核苷酸引物，這些引物可使來源于HCV基因組的3’非編碼區(qū)的序列的反轉錄(并由此擴增和檢測該序列)。
將分子生物學、微生物學、重組DNA和蛋白質(zhì)生物化學中的許多技術可用于實施本發(fā)明，諸如那些在例如《分子生物學的最新技術》(Current Protocols inMolecular Biology)1997第I、II和III卷(F.M.Ausubel編輯)；Sambrook等在《分子克隆實驗指南》(Molecular CloningALaboratory Manual)1989，第二版(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；《DNA克隆實用方法》(DNA CloningA Practical Approach)第I和II卷1985(D.N.Glover編輯)；
《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)1984(M.L.Gait編輯)；《轉錄和翻譯》(Transcription and Translation)1984(Hames和Higgins編輯)；《分子克隆實用指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning)；《酶學系列方法》系列(Methods in Enzymology)(Academic Press，Inc.)；以及《蛋白質(zhì)純化原理和實踐》(Protein PurificationPrinciples and Practice)第二版(Springer-Verlag，N.Y.)中所解釋的技術。
本文所用的“核酸”或“多核苷酸”指的是任意長度的含嘌呤和含嘧啶的聚合物，既可以是多核糖核苷酸也可以是多脫氧核苷酸或者是混合的多核糖-多脫氧核糖核苷酸。這包括單鏈和雙鏈分子，諸如例如DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-DNA雜化物，還包括通過將堿基與氨基酸主鏈連接而形成的“蛋白質(zhì)核酸”(PNA)。這還包括含有堿基修飾的核酸。
本文所用的核酸序列的“補體”指的是與原始序列共同參與的沃森-克里克堿基配對的反義序列。
本文所用的“引物”是一種約10至約50個核苷酸長度之間的寡核苷酸，優(yōu)選約12-約25個核苷酸長度且最優(yōu)選約12-約18個核苷酸長度，它可形成一種含有有意義的單鏈核酸序列的雙鏈體并使用例如逆錄酶或DNA聚合酶聚合互補鏈。
本文所用的“分離的”核酸或多肽指的是從其原始環(huán)境(例如如果是天然出現(xiàn)的則是其自然環(huán)境或者如果是合成的則是一種反應混合物)中分離出的一種成分。分離的核酸或多肽一般含有小于約50％、優(yōu)選小于約75％且最優(yōu)選小于約90％的最初與之相關的成分。
“來源于”給定序列的核酸序列指的是相應于給定序列中的一段區(qū)域的序列。它包括與所述序列同源或互補的序列。
內(nèi)部陽性對照(IPC)靶核酸指的是克隆入質(zhì)粒載體的一種合成的核酸序列，所述的質(zhì)粒載體隨后一般由限制性內(nèi)切核酸酶的作用而線性化。IPC一般具有多個環(huán)繞普通探針結合區(qū)的引物結合序列并在核酸擴增反應中起對假陰性結果的一般的對照作用。
優(yōu)選的內(nèi)部陽性對照的靶DNA的序列是5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3’<SEQ ID NO.7>。
本文所用的適于反轉錄的條件即寡核苷酸引導cDNA合成的條件，包括在可導致cDNA合成的溫度下和時間內(nèi)用逆錄酶和核苷酸溫育RNA和引物寡核苷酸(參見例如Sambrook等)。
包括本文公開的任意序列或其亞序列的核酸可以通過常規(guī)方法來制備。例如，使用例如由Matteucci等在1981，J.Am.Chem Soc.1033185中所述的亞磷酰胺固體支持法、Yoo等在1989，J.Biol.Chem.76417078中所述的方法或其它公知的方法可以以化學方式合成DNA。還可以通過許多本領域公知的方式來修飾所述的核酸。這類修飾的非限制性實例包括甲基化、“封端劑法”、使用一種類似物置換一種或多種天然出現(xiàn)的核苷酸以及核苷酸修飾諸如例如那些使用非電荷鍵(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸鹽、氨基甲酸酯等)或電荷鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的核苷酸修飾。核酸可以含有一種或多種另外的以共價鍵方式連接的部分，諸如、例如蛋白質(zhì)(例如核酸酶、毒素、信號肽、聚-L-賴氨酸等)；嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)；螯合劑(例如金屬、放射性金屬、鐵、氧化金屬等)和烷化劑。術語“核酸”的含義中也包括PNA。通過形成甲基或乙基磷酸三酯或氨基磷酸烷基酯鍵可以衍生所述的核酸。此外，本發(fā)明的核酸序列可以由能夠提供出可檢測信號的標記物以直接或間接方式來修飾。典型的標記物包括放射性同位素、熒光分子、生物素等。
本文所用的擴增指的是一種重復過程，通過該過程可以復制核酸。用于擴增的合適方法包括但不限于聚合酶鏈反應、連接酶鏈反應、鏈置換擴增、核酸單堿基擴增和轉錄介導的擴增。
本文所用的丙型肝炎病毒(HCV)指的是Hepacivirus屬中的病毒?？梢杂杀景l(fā)明檢測的HCV分離物包括但不限于HCV血清型1-6。
本發(fā)明提供了用于反轉錄生物樣品中HCV RNA的方法。有效反轉錄HCVRNA使得生物樣品中對HCV的檢測敏感。通過使來源于所述樣品的DNA與本發(fā)明的寡核苷酸接觸來進行HCV RNA的反轉錄，該過程在下列條件下進行其中所述的寡核苷酸可引導與至少部分RNA互補的DNA的合成。
生物樣品中HCV RNA的檢測通過下列步驟來進行使用所述樣品中含有的RNA或來源于所述樣品的RNA作為模板、使用本發(fā)明中與HCV RNA內(nèi)含有的序列互補的寡核苷酸作為反轉錄引物來進行反轉錄反應，從而產(chǎn)生HCV特異性反轉錄產(chǎn)物；隨后擴增所述的反轉錄產(chǎn)物以便產(chǎn)生HCV特異性擴增產(chǎn)物；接著對HCV特異性擴增產(chǎn)物進行檢測。對HCV特異性擴增產(chǎn)物的檢測表明所述樣品中存在HCVRNA。
根據(jù)本發(fā)明，生物樣品是通過任意常規(guī)的方式獲自患者的。合適的生物樣品包括但不限于血液、血清、血漿、尿、唾液、乳汁、和腦脊液。優(yōu)選將血漿用作HCV RNA的來源。
用提供反轉錄試劑接觸樣品內(nèi)含有的RNA、特別是HCV RNA的機會的任意方式處理所述的生物樣品?！皝碓从凇鄙飿悠返腞NA是原始存在于所述樣品中的任意RNA且通過處理該樣品已經(jīng)獲得了與之接觸的機會。優(yōu)選使用本領域眾所周知的任意方法諸如、例如使用硫氰酸胍的方法或使用市售可得的試劑和諸如、例如來自Gentra System，Inc.(Minneapolis MN)的PureScript這樣的方法從所述樣品中提取RNA?？梢圆捎脤е路蛛xRNases中的RNA、其它蛋白質(zhì)和/或任意其它可干擾反轉錄的成分的任何提取工藝。
然后使用來源于HCV序列的引物使所述樣品進行反轉錄過程。優(yōu)選，所述的引物與HCV RNA中屬于下游需檢測區(qū)域即3’的區(qū)域一致。這些區(qū)域包括例如編碼病毒衣殼蛋白、E1和E2蛋白、P7蛋白、蛋白酶、蛋白酶/解旋酶、RNA聚合酶、和調(diào)節(jié)蛋白的區(qū)域以及5’-和3’-非編碼區(qū)。優(yōu)選，所述的引物與3’非編碼區(qū)中的序列一致，所述的3’非編碼區(qū)在3’最末端上包括98 bp的非同聚序列(Tanaka等，J.Virol.703307，1996；Kolykhalov等，J.Virol.703363，1996)?？梢詫⑺龅囊镄蛄杏糜谔禺愋澡b定特殊HCV分離物或血清型(例如HCV 1-6)。通過與來源于所述分離物的RNA進行雜交引物可以鑒定特殊分離物或血清型，該過程在下列條件下進行其中引物不與來自不同分離物的RNA進行雜交，即所述引物自身可以含有一種可區(qū)分分離物間差異的序列。另一方面，可以將所述的引物序列用于引導區(qū)分分離物間差異的HCV RNA的片段的合成，即所述可區(qū)分分離物間差異的序列可以在所述引物序列的下游。
以序列保守性、分子內(nèi)和分子間相互作用以及擴增子和周圍序列的預計的二級結構的理論研究為基礎來選擇用于實施本發(fā)明的反轉錄引物。此外，將引物和檢測系統(tǒng)設計成用于促進HCV基因組的多重區(qū)、多病毒種類和內(nèi)部陽性對照(IPC)RNA(或DNA)的共擴增(和共檢測)。
根據(jù)本發(fā)明，HCV反轉錄引物的非限制性實例包括5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’<SEQ ID NO.1>(命名為57R27，相當于相應于HCV的3’-非編碼區(qū)的57-83位核苷酸)；5’-TCAGCACTCTCT-3’<SEQ ID NO.8>(命名為63RT12，相當于63-74位核苷酸)；5’-GTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.2>(命名為66RT12，相當于66-77位核苷酸)；和66RT12的延伸、即5’-AGTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.3>(66RT13)；5’-CAGTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.4>(66RT14)；5’-CCAGTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.5>(66RT15)；以及5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.6>(66RT16)。
使用一種或多種上述引物進行反轉錄。還可以添加隨機引物諸如、例如隨機六聚體反轉錄引物(N6，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。使用常規(guī)工藝進行反轉錄，諸如在《分子生物學的最新技術》(Current Protocols in Molecular Biology)1997第I、II和III卷(F.M.Ausubel編輯)、在美國專利5,322,770、Young等在J.Clin.Microbiol.31(4)882(1993)、Myers等在Biochemistry30(3)7661(1991)中所述的常規(guī)方法或如在同時待審專利申請順序號09/__(代理人代碼2094/0E287)所述的常規(guī)方法。
在反轉錄反應后，回收產(chǎn)物并可以將其擴增?？梢允褂糜糜跀U增的任意方法，包括但不限于聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應、鏈置換反應、核酸單堿基置換和轉錄介導的擴增。優(yōu)選使用PCR。一般來說，直接向反轉錄反應混合物中添加含所有用于PCR的必須成分的反應混合物(包括HCV特異性擴增引物)。然后使用由所用引物對確定的條件進行擴增。適用于擴增由使用本發(fā)明反轉錄引物進行的反轉錄而產(chǎn)生的HCV DNA的引物公開在美國專利申請順序號09/中、代理人代碼為2094/0E287。
擴增后，可以使用本領域公知的任意方法來檢測所述的擴增產(chǎn)物，這些方法包括但不限于瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳法；在固體支持物上捕捉擴增產(chǎn)物、隨后進行比色檢測的方法(參見例如下面的實施例1)；ECi檢測法；化學熒光檢測法；放射性同位素檢測法和熒光檢測法。用于這類檢測方法的試劑商購自例如Molecular Probe，Eugene，Oregon和Ortho Clinical Diagnostics，Rochester，NY。
對HCV特異性擴增產(chǎn)物的檢測表明樣品中存在HCV RNA。當使用凝膠電泳時，HCV特異性擴增產(chǎn)物通過其大小來證實，正如由與所述反應中所用擴增引物的所述序列一致的HCV RNA中的定位所預計的。
可以制備用于檢測生物樣品中HCV的試劑盒，該試劑盒包括一種反轉錄引物，該引物選自(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ ID NO.6>；和(vii)任意上述引物的任意組合物。
所述試劑盒可以另外包括用于反轉錄、擴增和產(chǎn)物檢測用的試劑和說明書。例如，試劑盒可以包括適用于DNA擴增反應的逆錄酶、脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定聚合酶以及用于標記和檢測核酸的試劑。
本發(fā)明的方法和組合物應用于患者HCV感染的診斷、檢測抗HCV療法的功效和篩選供HCV感染樣品的血液。
下列實施例用于解釋本發(fā)明而不用來限定本發(fā)明。
方法1.樣品制備使用PureScript RNA分離試劑(Gentra Systems，Minneapolis MN)從血漿樣品制備RNA。制造商的針對體液的技術方案的修改包括使用40g的糖原而不是20g作為載體以輔助病毒RNA的沉淀。另外，在大多數(shù)情況中，在用異丙醇沉淀RNA和用乙醇洗滌RNA沉淀后，將所述RNA沉淀重新懸浮于RT緩沖液混合物而不是由制造商提供的RNA水合溶液中。
2.反轉錄通過添加100 U重組莫洛尼鼠類白血病毒(M-MLV)遡錄酶(RT)(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)的50l溶液來催化從RNA合成cDNA，所述的50l溶液由下列成分組成50mMTris-HCl(pH8.3)、75mMKCl、3mM MgCl2、10mM DTT、0.4mM的每種dNTP(Pharmacia Biotech，Pscataway，NJ)、4 M引物和溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水的20個單位的RNasin(Promega，Madison，Wisconsin)。在42℃下培養(yǎng)30分鐘后，使RT反應保持在100℃5分鐘以破壞RT活性。將每一反應體系冷凍1分鐘，隨后以16000xg微量離心4秒。
3.PCR擴增在PE9600熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer)內(nèi)的100l溶液中進行PCR，所述的溶液由下列成分組成25mM Tris-HCl、3mM MgCl2、0.725mM EDTA、54mM KCl、3.72mM NaCl、40MDTT、108g/ml明膠(IV型)、9.5％甘油、0.02％Tween20、0.02％NP40、小牛胸腺DNA(2g)、1.2mM的每種dNTP、0.4M每種引物、10個拷貝的線性內(nèi)部陽性對照(IPC)質(zhì)粒DNA和16U的Taq聚合酶。分別以50∶1和5∶1的摩爾比向反應體系中添加單克隆抗體與Taq、TP1-12和TP4-9(它們的制備公開在美國專利5,338671中)，從而產(chǎn)生的抗體與Taq聚合酶的摩爾比為55∶1。在96℃下的最初變性3分鐘后，使40個循環(huán)的擴增在96℃下5秒并在68℃下進行40秒。循環(huán)結束時，在103℃下進行5分鐘的加熱后步驟以便使Taq聚合酶失活。所用引物如下列表3中所示。
4.PCR產(chǎn)物的檢測通過在擴增過程中使用5’-生物素標記的引物(有義鏈)使PCR產(chǎn)物生物素化。通過與以共價鍵方式結合乳汁顆粒的寡核苷酸探針雜交來捕捉產(chǎn)物，所示的乳汁顆粒沉積在通過膜的流體的表面上(SureCell試驗，Ortho Clinical Diagnostics，Rochester，NY)。所述的探針是5’-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3’<SEQ ID NO.9>和5’-ATGCGGCTCACACGGACCTTTCACAGC-3’<SEQ ID NO.10>。使探針/產(chǎn)物復合物與鏈霉抗生素(SA)-辣根過氧化物酶(HRP)連接物反應，這可催化染料前體向染料的氧化轉化(藍色)。通過比較顏色強度與標準色而以目測方式給藍色強度記分(0-10)。將所有觀察到的顏色的記分＞3看作是陽性結果。
5.Roche Amplicor檢測根據(jù)制造商的說明(Roche Diagnostics，Kaiseraugst，Switzerland)來進行Roche Amplicor檢測。實施例1來源于3’非編碼區(qū)的HCV特異性反轉錄引物的設計進行下列實驗以檢測使用HCV特異性3’非編碼區(qū)引物反轉錄來源于人血漿樣品的HCVRNA的有效性。
使用HCV RNA作為模板將具有序列5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’<SEQ ID NO1>(命名為57R27)的寡核苷酸引物用于引導反轉錄。使用5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’<SEQ ID NO.11>(命名為1F27)作為正向引物并使用57R27作為反向引物進行擴增。
反應產(chǎn)生所預計大小的83nt的產(chǎn)物。然而，在多重反轉錄/擴增反應中使用57R27、即反應還包括內(nèi)部陽性對照(IPC)會產(chǎn)生100和70nt的兩種非特異性(即非HCV)產(chǎn)物。實施例2用于多重反應的3’非編碼區(qū)HCV反轉錄引物的最佳化進行下列實驗以檢測來源于57R27的引物在多重反轉錄/擴增試驗中的使用情況。
正如上述實施例1中所述，當使用IC倍增時，57R27反向引物形成兩種“副產(chǎn)物”帶，這些帶包括用溴化乙錠染色時產(chǎn)生的70bp高密度凝膠帶和100bp低密度凝膠帶。以優(yōu)先方式產(chǎn)生這些副產(chǎn)物帶且結果是HCV產(chǎn)物帶通常不存在。較為精確的分析結果表明在57R27與IPC反向引物之間存在強烈的相互作用。
為了克服這一難題，將較小的反轉錄(RT)引物設計成用于消除PCR過程中RT引物與PCR引物之間的直接競爭。這些新型RT引物的長度在8-16個堿基的范圍內(nèi)且將它們的3’末端設計成為來自57R27的3’末端的下游。
如下方式檢測它們在RNA提取和純化后，使用所述的引物進行反轉錄并使用相同引物作為正向引物和27聚體的反向引物進行PCR。
這種新型設計具有4個顯著的優(yōu)點。
1)這些引物的Tm低于27聚體的Tm，由此它們幾乎不可能在PCR條件下退火并伸展。
2)RT引物的3’末端是來自27聚體3’末端的下游，由此可消除與確實與27聚體相同的靶向DNA交叉反應的可能性并由此除去引物-二聚物。
3)基因組內(nèi)的定位對于擴增所有基因型是關鍵的且將反向引物設計成符合HCV基因組內(nèi)的保守序列。
4)在用短RT引物進行反轉錄后進行多重PCR是可能的。A.12聚體引物的特征最初設計4種短RT引物(12聚體)并以合理配對組合的方式進行試驗。目的是確定(i)在用于反轉錄過程的合并或單一RT引物間得到的PCR帶的強度中是否存在任何差異；和(ii)這些短RT引物是否能夠相互組合使用。如果以組合方式使用短RT引物，那么對避免3’末端的失配是有利的。
結果表明以組合方式使用短RT引物沒有不利影響。盡管可以看出以兩倍濃度使用引物(使用引物自身)，但是實際使用的是標準濃度的所述引物而沒有合并任何其它引物。
如表1中所示在反轉錄過程中使用合理配對組合的12聚體RT引物。分別使用3’NC區(qū)引物3×1F27和3×57R27正向和反向引物來進行PCR(參見上述實施例1)。以50個拷貝/反應使用HCV靶物。使用標準的RT-PCR條件
>(+＝陽性，-＝陰性，且w＝由溴化乙錠染色確定的弱凝膠帶)當單獨或與3x76RT一起使用時3x84RT不能進行反轉錄。看起來它還對3x63RT有不利影響。無論是否使用引物組合物，3x66RT和3x63RT反轉錄情況均良好且所得(溴化乙錠染色的)PCR凝膠帶較濃厚。B.引物濃度范圍為進一步試驗而選擇3x66RT和3x63RT。將1M的27聚體(3x57R27)的標準濃度用于反轉錄過程。因12鏈節(jié)的長度較短，所以幾乎不可能象27聚體那樣有效地退火并伸展且認為反轉錄需要較高濃度。當分別以1、2、3或4(M濃度)時，無論濃度如何，RT-PCR產(chǎn)生3x63RT，3x66RT與27聚體相同。標準的實施方法是在RT反應中使用12聚體并向PCR中分別加入27聚體(和3x1F27)作為反向和正向引物。C.樣品處理的影響比較12聚體(3x66RT)和27聚體(3x57R27)的反轉錄。此外，當將12聚體用作反轉錄引物時，在相應的PCR過程中使用27聚體和正向引物(3x1F27)。在不同條件下放置樣品并將所得的溴化乙錠染色的PCR凝膠帶進行比較以便確定是否任意條件均對凝膠帶的質(zhì)量和強度有影響。
在RNA制備步驟過程中，向每一樣品試管內(nèi)加入冰凍的異丙醇(IPA)并將所述的試管在室溫下振搖2分鐘。使RNA進一步在-80℃(在IPA中)下沉淀或立即在室溫下制備RNA。在進行反轉錄前，將RNA重新懸浮于完全RT混合物中并置于冰上或在室溫下保留10分鐘。
在37℃或42℃下進行反轉錄。在擴增前，將cDNA在室溫下置于完全PCR混合物中4.5小時或在進行擴增反應前立即加入cDNA。
結果在上述任何條件中12聚體的RT引物(3×6RT)進行得同樣良好。盡管當所得PCR帶是單一清潔的帶而不含副產(chǎn)物時12聚體在總體上較好，但是根據(jù)帶的強度看起來12聚體和27聚體的RT引物是相同的。實施例312聚體反轉錄引物用于以50個拷貝/反應檢測HCV RNA的用途進行下列實驗以試驗上述12聚體引物檢測含不同血清型HCV患者樣品中的HCV的能力。
通過Roche Monitor檢測對基因型患者血漿進行定量并將其連續(xù)稀釋成50個拷貝/反應。使用改進的Purescript法提取RNA并使用3×63RT或3×66RT(12聚體)引物進行反轉錄。通過使用以內(nèi)部陽性對照引物(IPCF1和IPC R1)倍增的3×57R27/3×1F27(分別為HCV反向和正向引物)來進行PCR。用12聚體的RT引物對所有RNA基因型進行反轉錄。結果如下面的表2中所示，+表示陽性結果。
使用12聚體的RT引物、隨后進行多重(3’NC和IPC)PCR可產(chǎn)生對HCV基因型的敏感性檢測。Roche Monitor(tm)定量檢測(Roche Diagnostics，Kaiseraugst，Switzerland)檢測了基因型1-6的50個拷貝/反應。(僅以100個拷貝/反應檢測了基因型5。由終點稀釋法來測定用于這種基因型的拷貝數(shù)。)實施例4使用13-16核苷酸引物改進的敏感性進行下列實驗以進一使得用短反轉錄引物進行的HCV檢測最佳化。
使用改進的Purescript法制備來自常規(guī)HCV陽性血漿來源的RNA。使用下列檢測用引物之一進行RT5’-GTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.2>(命名為66RT12，相當于66-77位核苷酸)；和66RT12的延伸、即5’-AGTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.3>(66RT13)；5’-CAGTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.4>(66RT14)；5’-CCAGTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.5>(66RT15)；以及5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.6>(66RT16)。
使用1F27和57R27進行PCR。使PCR產(chǎn)物通過含有3x32R25或3x30R25探針的顆粒。結果如下面的表3中所示、為產(chǎn)生陽性結果的樣品的百分比。
*12聚體的結果以6份復制品/條件為基礎。
該表說明了當使用增加RT引物長度時探針陽性結果的％。當用于反轉錄的RT引物達16個核苷酸長度時可以觀察到對拷貝數(shù)敏感性的進一步改進。當以3個拷貝/反應使用HCV靶物時可以觀察到敏感性差異。作為一般的觀察結果，當使用14-16聚體作為RT引物時獲得更高的敏感性。此外，無論拷貝水平或RT引物的長度如何，在副產(chǎn)物形成方面沒有顯著性差異。就敏感性而言，當用稍長的RT引物(例如14-16聚體)引導反轉錄時，3’NC的擴增可以更為敏感。在該項實驗中，由于使用了看起來可提供較高拷貝數(shù)敏感性的長RT引物，所以50個拷貝的HCV/rxn.在敏感性上沒有差異，但在3個拷貝水平上觀察到有差異。
將上述所有的專利、申請、文章、公開出版物和試驗方法的全部內(nèi)容引入本文作為參考。
本發(fā)明提示對于本領域普通技術人員來說，根據(jù)上述具體描述可以對本發(fā)明作許多修改。這類顯而易見的改變完全屬于所附權利要求的范圍。
權利要求
1.一種用于反轉錄生物樣品中丙型肝炎病毒(HCV)RNA的方法，該方法包括下列步驟(a)在寡核苷酸引導與至少部分所述RNA互補的DNA的合成的條件下，使來源于所述樣品的RNA與一種或多種寡核苷酸接觸；其中所述的寡核苷酸選自(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID NO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ ID NO.6>、和(vii)上述任意寡核苷酸的任意組合物。
2.一種如權利要求1中所述的方法，其中所述的樣品選自血液、血清、血漿、唾液和腦脊液。
3.一種如權利要求1中所述的方法，還包括(b)回收所述的cDNA的步驟。
4.一種用于檢測生物樣品中丙型肝炎病毒RNA存在的方法，所述的方法包括下列步驟(a)用來源于所述樣品的RNA作模板并用與所述RNA中含有的一段序列互補的寡核苷酸作引物來進行反轉錄反應，從而產(chǎn)生HCV特異性反轉錄產(chǎn)物，其中所述的引物選自(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID NO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ ID NO.6>、和(vii)上述任意引物的任意組合物；(b)擴增所述反轉錄反應的產(chǎn)物以便產(chǎn)生擴增產(chǎn)物；并(c)檢測所述的擴增產(chǎn)物；其中對所述擴增產(chǎn)物的檢測顯示HCV RNA在所述的樣品中的存在。
5.一種如權利要求4中所述的方法，其中所述的樣品選自血液、血清、血漿、尿、唾液和腦脊液。
6.一種如權利要求4中所述的方法，其中所述的擴增通過選自下列的方法來進行聚合酶鏈反應、連接酶鏈反應、鏈置換反應、核酸單堿基置換和轉錄介導的擴增。
7.一種如權利要求4中所述的方法，其中所述的檢測通過選自下列的方法來進行瓊脂糖凝膠電泳法、丙烯酰胺凝膠電泳法、比色檢測法、ECi檢測法、熒光檢測法、放射性同位素檢測法和化學發(fā)光法。
8.一種寡核苷酸，它選自5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID NO.1>、5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ ID NO.6>。
9.一種HCV特異性反轉錄引物，它選自5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID NO.1>、5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ ID NO.6>。
10.一種用于檢測生物樣品中HCV的試劑盒，所述的試劑盒包括一種或多種反轉錄引物，該反轉錄引物選自(i)5’A-GGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ ID NO.6>、和(vii)上述任意引物的任意組合物。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于有效反轉錄丙型肝炎病毒(HCV)RNA的新型寡核苷酸引物。本文還提供了用于檢測生物樣品中HCV核酸序列的方法和試劑盒。
文檔編號G01N33/569GK1270228SQ00104179
公開日2000年10月18日 申請日期2000年2月3日 優(yōu)先權日1999年2月3日
發(fā)明者J·M·林南, K·M·戈曼 申請人:奧索臨床診斷有限公司