本發(fā)明涉及一種用于同時鑒定中藥人參、西洋參和三七的引物組合及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：人參屬(PanaxL.)植物是名貴的藥用植物，全屬植物均作藥用。《中國藥典》收載的有6種，包括人參、西洋參、三七、竹節(jié)參、珠子參、羽葉三七。其中人參、西洋參、三七是人參屬最主要的藥用及功能性食品品種，其根、根莖、葉、花、果實等均做藥用，價值很高。在中醫(yī)臨床用藥上，人參性溫，功效大補元氣、固脫生津、安神；三七性溫、味甘微苦，功效散瘀止血、消腫定痛；西洋參性涼，功效補氣養(yǎng)陰、清熱生津。三者藥效具有很大區(qū)別，不能混用。然而，由于人參、三七、西洋參為人參屬近緣物種，形態(tài)和化學成分相似，市場有摻雜混用現(xiàn)象發(fā)生，尤其是市場常見人參、西洋參飲片或人參花、西洋參花、三七花相互摻雜的情況，對用藥安全造成損害，需要建立準確、可靠、特別是能同時檢測是否存在相互摻雜的鑒定方法。目前雖然分別有人參、西洋參特異性分子標記及其檢測方法的報道，但這些技術(shù)只關(guān)注人參屬真?zhèn)纹返蔫b定，無法鑒定是否存在摻雜品，對市場實際存在的花、葉、飲片類摻雜樣品需要進行多次PCR反應(yīng)才能判定。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種用于同時鑒定中藥人參、西洋參和三七的引物組合及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種引物組合，由引物對I、引物對II和引物對III組成；所述引物對I由引物F1和引物F2組成；所述引物F1為如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；(a2)將序列1經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物F2為如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；(a4)將序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物對II由引物F3和引物F4組成；所述引物F3為如下(a5)或(a6)：(a5)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；(a6)將序列3經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物F4為如下(a7)或(a8)：(a7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；(a8)將序列4經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物對III由引物F5和引物F6組成；所述引物F5為如下(a9)或(a10)：(a9)序列表的序列5所示的單鏈DNA分子；(a10)將序列5經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物F6為如下(a11)或(a12)：(a11)序列表的序列6所示的單鏈DNA分子；(a12)將序列6經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的DNA分子。所述引物組合的用途為如下(b1)至(b6)中的任意一種：(b1)鑒別人參、三七和西洋參；(b2)制備用于鑒別人參、三七和西洋參的試劑盒；(b3)鑒定待測藥材是否為人參、三七或西洋參；(b4)制備用于鑒定待測藥材是否為人參、三七或西洋參的試劑盒；(b5)鑒定待測樣品中是否含有人參和/或三七和/或西洋參；(b6)制備用于鑒定待測樣品中是否含有人參和/或三七和/或西洋參的試劑盒。本發(fā)明還保護所述引物組合的應(yīng)用，如下(b1)至(b6)中的任意一種：(b1)鑒別人參、三七和西洋參；(b2)制備用于鑒別人參、三七和西洋參的試劑盒；(b3)鑒定待測藥材是否為人參、三七或西洋參；(b4)制備用于鑒定待測藥材是否為人參、三七或西洋參的試劑盒；(b5)鑒定待測樣品中是否含有人參和/或三七和/或西洋參；(b6)制備用于鑒定待測樣品中是否含有人參和/或三七和/或西洋參的試劑盒。本發(fā)明還保護含有所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下(c1)或(c2)或(c3)：(c1)鑒別人參、三七和西洋參；(c2)鑒定待測藥材是否為人參、三七或西洋參；(c3)鑒定待測樣品中是否含有人參和/或三七和/或西洋參。本發(fā)明還保護所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨包裝的步驟。本發(fā)明還保護鑒別由單一原料加工的待測藥材的原料為人參、三七還是西洋參的方法，為如下方法I或方法II。所述方法I包括如下步驟：提取待測藥材基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，采用所述引物組合進行PCR擴增，如果擴增產(chǎn)物中含有227-267bp的DNA片段、待測藥材的原料為人參，如果擴增產(chǎn)物中含有472-512bp的DNA片段、待測藥材的原料為三七，如果擴增產(chǎn)物中含有1068-1108bp的DNA片段、待測藥材的原料為西洋參。所述方法II包括如下步驟：檢測待測藥材基因組DNA中是否含有所述引物組合中的引物對I的靶序列、引物對II的靶序列或引物對III的靶序列；如果所述基因組DNA中含有引物對I的靶序列、待測藥材的原料為人參，如果所述基因組DNA中含有引物對II的靶序列、待測藥材的原料為三七，如果所述基因組DNA中含有引物對III的靶序列、待測藥材的原料為西洋參。所述待測藥物的原料為人參、三七或西洋參的根、葉、花、莖或種子。本發(fā)明還保護鑒定由單一原料加工的待測藥材的原料是否為人參、三七或西洋參的方法，為如下方法III或方法IV或方法V。所述方法III包括如下步驟：提取待測藥材的基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，采用所述引物組合進行PCR擴增，如果采用擴增產(chǎn)物中含有227-267bp的DNA片段、待測藥材的原料為人參，如果擴增產(chǎn)物中含有472-512bp的DNA片段、待測藥材為三七，如果擴增產(chǎn)中含有1068-1108bp的DNA片段、待測藥材的原料為西洋參，如果擴增產(chǎn)物中不含有227-267bp的DNA片段、472-512bp的DNA片段或1068-1108bp的DNA片段、待測藥材的原料為非人參且非三七且非西洋參。所述方法IV包括如下步驟：提取待測藥材的基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，采用所述引物組合進行PCR擴增；如果擴增產(chǎn)物加入SYBRGreenI熒光染料后可以檢測到綠色熒光、待測藥材的原料為人參或三七或西洋參，如果擴增產(chǎn)物加入SYBRGreenI熒光染料后不可以檢測到綠色熒光、待測藥材的原料為非人參且非三七且非西洋參。所述方法V包括如下步驟：檢測待測藥材的基因組DNA中是否含有所述引物組合中的引物對I的靶序列、引物對II的靶序列或引物對III的靶序列；如果所述基因組DNA中含有引物對I的靶序列、待測藥材的原料為人參，如果所述基因組DNA中含有引物對II的靶序列、待測藥材的原料為三七，如果所述基因組DNA中含有引物對III的靶序列、待測藥材的原料為西洋參，如果所述基因組DNA中不含有引物對I、引物對II或引物對III的靶序列、待測的原料為非人參且非三七且非西洋參。所述待測藥材的原料具體可為人參、三七、西洋參、竹節(jié)參、珠子參或羽葉三七的根、葉、花、莖或種子。本發(fā)明還保護鑒定待測樣品中是否含有人參和/或三七和/或西洋參的方法，為如下方法VI或方法VII或方法VIII。所述方法VI包括如下步驟：提取待測樣品的基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，采用所述引物組合進行PCR擴增，如果擴增產(chǎn)物中含有227-267bp的DNA片段、待測樣品中含有人參，如果擴增產(chǎn)物中含有472-512bp的DNA片段、待測樣品中含有三七，如果擴增產(chǎn)物中含有1068-1108bp的DNA片段、待測樣品中含有西洋參，如果擴增產(chǎn)物中不含有227-267bp的DNA片段、472-512bp的DNA片段或1068-1108bp的DNA片段、待測樣品中不含有人參且不含有三七且不含有西洋參。所述方法VII包括如下步驟：提取待測樣品的基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，采用所述引物組合進行PCR擴增；如果擴增產(chǎn)物加入SYBRGreenI熒光染料后可以檢測到綠色熒光、待測樣品中含有人參或三七或西洋參，如果擴增產(chǎn)物加入SYBRGreenI熒光染料后不可以檢測到綠色熒光、待測樣品中不含有人參且不含有三七且不含有西洋參。所述方法VIII包括如下步驟：檢測待測樣品的基因組DNA中是否含有所述引物組合中的引物對I的靶序列、引物對II的靶序列或引物對III的靶序列；如果所述基因組DNA中含有引物對I的靶序列、待測樣品中含有人參，如果所述基因組DNA中含有引物對II的靶序列、待測樣品中含有三七，如果所述基因組DNA中含有引物對III的靶序列、待測樣品中含有西洋參如果所述基因組DNA中不含有引物對I、引物對II或引物對III的靶序列、待測樣品中不含有人參且不含有三七且不含有西洋參。本發(fā)明還保護所述引物對II或引物對III。本發(fā)明還保護所述引物對II在制備試劑盒甲中的應(yīng)用。所述試劑盒甲的用途為如下(d1)或(d2)：(d1)鑒定待測藥材是否為三七；(d2)鑒定待測樣品中是否含有三七。本發(fā)明還保護所述引物對III在制備試劑盒乙中的應(yīng)用。所述試劑盒乙的用途為如下(d3)或(d4)：(d3)鑒定待測藥材是否為西洋參；(d4)鑒定待測樣品中是否含有西洋參。本發(fā)明還保護含有所述引物對II的試劑盒甲。所述試劑盒乙的用途為如下(d1)或(d2)：(d1)鑒定待測藥材是否為三七；(d2)鑒定待測樣品中是否含有三七。本發(fā)明還保護含有所述引物對III的試劑盒乙。所述試劑盒乙的用途為如下(d3)或(d4)：(d3)鑒定待測藥材是否為西洋參；(d4)鑒定待測樣品中是否含有西洋參。以上任一所述的PCR擴增退火溫度為60℃。以上任一所述PCR擴增的反應(yīng)體系具體可為：2.5μL10×buffer緩沖液，1.6μLdNTP(2.5mM)，0.4μL引物F1，0.4μL引物F2，0.4μL引物F3，0.4μL引物F4，0.4μL引物F5，0.4μL引物F6，0.2μLSpeedStarHSTaqDNA聚合酶，2μL模板(DNA含量為0.032g-20ng)，16.3μL無菌雙蒸水。所述DNA含量具體可為10ng。以上各條引物均以引物溶液形式加入至PCR反應(yīng)體系中，各條引物在引物溶液中的初始濃度均為5μM。以上任一所述PCR擴增的反應(yīng)程序具體可為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性10s，退火10s，72℃延伸20s，共35個循環(huán)；72℃延伸3min。以上任一所述227-267bp的DNA片段具體可為247bp的DNA片段，更具體可為序列表的序列7所示的DNA分子。以上任一所述472-512bp的DNA片段具體可為492bp的DNA片段，更具體可為序列表的序列8所示的DNA分子。以上任一所述1068-1108bp的DNA片段具體可為1088bp的DNA片段，更具體可為序列表的序列9所示的DNA分子。以上任一所述待測樣品具體可為人參、三七、西洋參、竹節(jié)參、珠子參或羽葉三七的根、葉、花、莖、種子、加工制品或其他類型的藥材。真?zhèn)螕诫s品的鑒別一直是中藥鑒別的難點問題，依賴于具有同時檢測真?zhèn)纹诽禺愋詷擞浀姆椒ǖ拈_發(fā)。多重PCR是一種在同一體系內(nèi)進行多個PCR擴增的技術(shù)，其突出優(yōu)勢是在一次檢測中同時表征多個位點或基因片段，從而具有摻雜檢測的潛力。此前的人參屬多重PCR鑒別方法往往只關(guān)注于能否同時檢測人參、西洋參、三七物種，對每種藥材均需要兩對引物的擴增結(jié)果才能判定，無法用于鑒定是否存在摻雜樣品。本發(fā)明對多批人參、西洋參、三七及其他近緣物種進行了實驗驗證，包含根、葉、花、種子和不同類型的藥材，結(jié)果所有人參、三七、西洋參均獲得正確的陽性鑒別結(jié)果，其他人參屬近緣物種均為陰性，與形態(tài)學鑒定結(jié)果完全吻合，進一步驗證了本發(fā)明的可靠性和穩(wěn)定性。為檢測該方法對混偽品的鑒別能力，本發(fā)明制作了一系列不同摻偽程度的人參、西洋參、三七混合樣品并進行多重PCR擴增，結(jié)果對人參、西洋參、三七中任意兩者相互摻偽的檢出限均達到1％，滿足中藥生產(chǎn)檢驗的需求。本發(fā)明可用于人參、西洋參、三七的根、根莖、葉、花、果實及其加工制品的鑒別。附圖說明圖1為退火溫度優(yōu)化實驗結(jié)果。其中，各溫度泳道1和泳道2為西洋參樣本(表1中的序號為16、17)；泳道3和4為三七樣本(表1中的序號為10、11)；泳道5和6為人參樣本(表1中的序號為1、2)；泳道M為DNA分子量標準：從上至下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。圖2為PCR鑒定方法驗證結(jié)果。其中，泳道1-7為人參(表1中的序號為1-7)；泳道8-13為三七(表1中的序號為10-15)；泳道14-20為西洋參(表1中的序號為16、17、18、19、20、20、20)；泳道21為人參、西洋參、三七混合樣本(序號為1、10和16的樣本混合，人參樣本質(zhì)量占混合樣本質(zhì)量的1/3，西洋參樣本質(zhì)量占混合樣本質(zhì)量的1/3，三七樣本質(zhì)量占混合樣本質(zhì)量的1/3)；泳道22為人參、西洋參、三七混合樣本(序號為1、10和16的樣本混合，人參樣本質(zhì)量占混合樣本質(zhì)量的49.75％，西洋參樣本質(zhì)量占混合樣本質(zhì)量的0.5％，三七樣本質(zhì)量占混合樣本質(zhì)量的49.75％)；泳道23為人參、西洋參、三七混合樣本(序號為1、10和16的樣本混合，人參樣本質(zhì)量占混合樣本質(zhì)量的0.5％，西洋參樣本質(zhì)量占混合樣本質(zhì)量的49.75％，三七樣本質(zhì)量占混合樣本質(zhì)量的49.75％)；泳道24為以水做模板的空白對照；泳道M為DNA分子量標準：從上至下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。圖3為人參、三七、西洋參相互摻偽樣品PCR鑒別檢出限。其中，泳道1為人參；泳道9為三七；泳道17為西洋參；泳道2-8、泳道10-16、泳道18-24為人參、三七、西洋參以不同質(zhì)量比混合的混合樣本，人參、三七、西洋參占混合樣本質(zhì)量的百分比為：泳道2(50％、12.5％、12.5％)，泳道3(80％、10％、10％)，泳道4(90％、5％、5％)，泳道5(95％、2.5％、2.5％)，泳道6(98％、1％、1％)，泳道7(99％、0.5％、0.5％)，泳道8(0％、50％、50％)，泳道10(12.5％、50％、12.5％)，泳道11(10％、80％、10％)，泳道12(5％、90％、5％)，泳道13(2.5％、95％、2.5％)，泳道14(1％、98％、1％)，泳道15(0.5％、99％、0.5％)，泳道16(50％、0％、50％)，泳道18(12.5％、12.5％、50％)，泳道19(10％、10％、80％)、泳道20(5％、5％、90％)，泳道21(2.5％、2.5％、95％)，泳道22(1％、1％、98％)，泳道23(0.5％、0.5％、99％)，泳道24(50％、50％、0％)；泳道M為DNA分子量標準：從上至下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。以下實施例中，各條引物均以引物溶液形式加入至PCR反應(yīng)體系中，各條引物在引物溶液中的初始濃度均為5μM。10×buffer緩沖液：Takara公司，產(chǎn)品目錄號：A1101E。SpeedStarHSTaqDNA聚合酶：Takara公司，5U/μL，產(chǎn)品目錄號：RR070A。100×SYBRGreenI：Invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號：1135054。人參：參考文獻：張均田.人參研究的最新進展[J].江蘇大學學報醫(yī)學版，2009，19(3)：185-191.；公眾可以從中國中醫(yī)科學院中藥研究所獲得。西洋參：參考文獻：王筠默.西洋參藥理作用研究的最新進展[J].中藥藥理與臨床，2001，13(4)：46-48.；公眾可以從中國中醫(yī)科學院中藥研究所獲得。三七：參考文獻：楊志剛，陳阿琴，俞頌東.三七藥理研究新進展[J].上海中醫(yī)藥雜志，2005，39(4)：59-62.；公眾可以從中國中醫(yī)科學院中藥研究所獲得。竹節(jié)參：參考文獻：左銳，袁丁.竹節(jié)參化學成分和藥理活性研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥，2005，16(9)：838-839.；公眾可以從中國中醫(yī)科學院中藥研究所獲得。珠子參：參考文獻：趙仁，趙毅，李東明，等.珠子參研究進展[J].中國現(xiàn)代中藥，2008，10(7)：3-6..；公眾可以從中國中醫(yī)科學院中藥研究所獲得。羽葉三七：參考文獻：趙毅，趙仁，山學祥，等.羽葉三七植物性狀及生長動態(tài)分析[J].云南中醫(yī)學院學報，2012，35(2)：24-27.；公眾可以從中國中醫(yī)科學院中藥研究所獲得。以下實施例中的人參屬植物材料及其來源見表1。表1中的樣品均符合中國藥典(2015年版)一部正文各藥材項下的有關(guān)規(guī)定。通過鑒定，各味樣品實物與名稱相符，質(zhì)量符合標準。所有植物材料均經(jīng)過減壓干燥后使用球磨粉碎機粉碎至能過五號篩，得到植物材料粉末用于檢測。表1人參屬植物材料來源表實施例1、引物設(shè)計對各種人參屬物種的基因組進行大量序列分析，獲得了用于鑒定人參、三七和西洋參的若干引物。將各個引物進行預(yù)實驗，比較靈敏度、特異性等性能，最終得到用于鑒定人參、三七和西洋參的三套引物對。用于鑒定人參的引物對(引物對I)由引物F1和引物F2組成(5’→3’)：F1(序列表的序列1)：TAACAATACCGGGCTGATAC；F2(序列表的序列2)：CCAGTTAAGGACAGGAG；用于鑒定三七的引物對(引物對II)由引物F3和引物F4組成(5’→3’)：F3(序列表的序列3)：AGGGATGAGGGGTGCGTAG；F4(序列表的序列4)：CGACATGAGAAGAGGGCTTTTA；用于鑒定西洋參的引物對(引物對III)由引物F5和引物F6組成(5’→3’)：F5(序列表的序列5)：AAATGCGGGTTATGACAAA；F6(序列表的序列6)：TTCTGCATATACGCCCAAATT。引物對I、引物對II和引物對III組成引物組合。實施例2、鑒定方法優(yōu)化一、退火溫度優(yōu)化待測樣本為：人參(表1中的序號為1和2)、三七(表1中的序號為10和11)、西洋參(表1中的序號為16和17)。1、提取待測樣本的基因組DNA。2、取步驟1得到的基因組DNA為模板，采用實施例1制備的引物組合進行PCR擴增。PCR擴增體系(25μL)：2.5μL10×buffer緩沖液，1.6μLdNTP(2.5mM)，0.4μL引物F1，0.4μL引物F2，0.4μL引物F3，0.4μL引物F4，0.4μL引物F5，0.4μL引物F6，0.2μLSpeedStarHSTaqDNA聚合酶，2μL模板(DNA含量為10ng)，16.3μL無菌雙蒸水。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性10s，退火10s，72℃延伸20s，共35個循環(huán)；72℃延伸3min。分別設(shè)置如下退火溫度：退火溫度I：59℃；退火溫度II：60℃；退火溫度III：61℃；退火溫度IV：62℃。3、將步驟2得到的擴增產(chǎn)物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明退火溫度為60℃-62℃時人參、三七、西洋參分別出現(xiàn)約247bp、492bp以及1088bp大小的特異性條帶，無非特異性擴增及假陽性條帶出現(xiàn)，但61℃以上時人參、三七特異性條帶亮度明顯降低，因此確定PCR最佳退火溫度為60℃。二、引物用量優(yōu)化待測樣本為：人參(表1中的序號為1和2)、三七(表1中的序號為10和11)、西洋參(表1中的序號為16和17)。1、提取待測樣本的基因組DNA。2、取步驟1得到的基因組DNA為模板，采用實施例1制備的引物組合進行PCR擴增。PCR擴增體系(25μL)：2.5μL10×buffer緩沖液，1.6μLdNTP(2.5mM)，引物F1，引物F2，引物F3，引物F4，引物F5，引物F6，0.2μLSpeedStarHSTaqDNA聚合酶，2μL模板(DNA含量為10ng)，無菌雙蒸水加至25μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸20s，共35個循環(huán)；72℃延伸3min。分別設(shè)置不同的引物加入量。設(shè)置方法如表2所示，按照表2所示的3個因素(F1、F2加入量，F(xiàn)3、F4加入量，F(xiàn)5、F6加入量)設(shè)置64個處理組。表2引物加入量F1、F2加入量(μL)F3、F4加入量(μL)F5、F62加入量(μL)0.10.10.10.20.20.150.30.30.20.40.40.253、將步驟2得到的擴增產(chǎn)物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，最佳引物加入量為F1、F2各0.3μL，F(xiàn)3、F4各0.2μL，F(xiàn)5、F6各0.25μL。實施例3、鑒定方法建立一、瓊脂糖凝膠電泳法1、提取待測樣本的基因組DNA。2、以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用實施例1制備的引物組合進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物。PCR擴增體系(25μL)：2.5μL10×buffer緩沖液，1.6μLdNTP(2.5mM)，0.3μL引物F1，0.3μL引物F2，0.2μL引物F3，0.2μL引物F4，0.25μL引物F5，0.25μL引物F6，0.2μLSpeedStarHSTaqDNA聚合酶，2μL模板DNA，17.2μL無菌雙蒸水。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸20s，共35個循環(huán)；72℃延伸3min。3、將步驟2得到的擴增產(chǎn)物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)結(jié)果進行如下判斷：如果擴增產(chǎn)物中含有247bp的DNA片段，則待測樣本中含有人參，如果擴增產(chǎn)物中不含有247bp的DNA片段，則待測樣本中不含有人參；如果擴增產(chǎn)物中含有492bp的DNA片段，則待測樣本中含有三七，如果擴增產(chǎn)物中不含有492bp的DNA片段，則待測樣本中不含有三七；如果擴增產(chǎn)物中含有1088bp的DNA片段，則待測樣本中含有西洋參，如果擴增產(chǎn)物中不含有1088bp的DNA片段，則待測樣本中不含有西洋參。二、熒光染色法1、提取待測樣本的基因組DNA。2、以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用實施例1制備的引物組合進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物。PCR擴增體系(25μL)：2.5μL10×buffer緩沖液，1.6μLdNTP(2.5mM)，0.3μL引物F1，0.3μL引物F2，0.2μL引物F3，0.2μL引物F4，0.25μL引物F5，0.25μL引物F6，0.2μLSpeedStarHSTaqDNA聚合酶，2μL模板DNA，17.2μL無菌雙蒸水。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸20s，共35個循環(huán)；72℃延伸3min。3、向步驟2得到的PCR擴增產(chǎn)物中加入1μL100×SYBRGreenI，于362nm紫外波長下檢測熒光，根據(jù)結(jié)果進行如下判斷：如果擴增產(chǎn)物加入1μL100×SYBRGreenI后進行檢測可以產(chǎn)生綠色熒光，則待測樣本中含有人參或三七或西洋參，如果擴增產(chǎn)物加入1μL100×SYBRGreenI后進行檢測不能產(chǎn)生綠色熒光，則待測樣本中不含有人參且不含有三七且不含有西洋參。實施例4、鑒定方法驗證待測樣本：表1中的人參屬植株材料。分別采用實施例3建立的瓊脂糖凝膠電泳法和熒光染色法對待測樣本進行鑒定，PCR反應(yīng)體系中，模板的DNA含量均為10ng。部分采用瓊脂糖凝膠電泳法進行鑒定的結(jié)果見圖2。將圖1中泳道1-7的247bp的目的條帶測序，測序結(jié)果均如序列7所示。將圖1中泳道8-13的492bp的目的條帶測序，測序結(jié)果均如序列8所示。將圖1中泳道14-20的1088bp的目的條帶測序，測序結(jié)果均如序列9所示?；旌蠘颖揪玫?47bp、492bp和1088bp的三條目的條帶。其余樣本(竹節(jié)參、珠子參和羽葉三七)均未得到條帶。結(jié)果表明，采用瓊脂糖凝膠電泳法進行鑒定的結(jié)果均與實際情況相符，檢測準確率高達100％。采用熒光染色法進行鑒定的結(jié)果均與實際情況相符，檢測準確率高達100％。綜上所述，采用實施例3建立的瓊脂糖凝膠電泳法和熒光染色法均能夠成功鑒定人參、三七和西洋參三種人參屬植物材料。實施例5、靈敏度待測樣品為：表1中編號為1的人參樣本、編號為5的10的三七樣本、編號為16的西洋參樣本。1、提取待測樣品的基因組DNA，得到DNA溶液；2、用ddH2O稀釋步驟1得到的DNA溶液，得到各稀釋液；3、取步驟2到的各稀釋液作為模板，采用實施例1制備的引物組合分別按照實施例3中的瓊脂糖凝膠電泳法和熒光染色法進行鑒定；由于采用的稀釋液的稀釋度不同，形成如下不同的反應(yīng)體系：反應(yīng)體系1中，待測樣品基因組DNA初始含量為：20ng；反應(yīng)體系2中，待測樣品基因組DNA初始含量為：4ng；反應(yīng)體系3中，待測樣品基因組DNA初始含量為：0.8ng；反應(yīng)體系4中，待測樣品基因組DNA初始含量為：0.16ng；反應(yīng)體系5中，待測樣品基因組DNA初始含量為：0.032ng。結(jié)果顯示，模板DNA含量最低為0.032ng時，采用實施例3建立的瓊脂糖凝膠電泳法和熒光染色法均能夠成功鑒定人參、三七、西洋參三種人參屬植物材料。實施例6、摻偽檢測限待測樣本為：人參(表1中的序號為1)、三七(表1中的序號為10)、西洋參(表1中的序號為16)。1、取待測樣本粉末，以不同質(zhì)量比混合，得到混合樣本。2、取待測樣本和步驟1得到的混合樣本，提取基因組DNA，得到DNA溶液。3、分別采用實施例3建立的瓊脂糖凝膠電泳法對步驟2得到的DNA溶液進行鑒定，PCR反應(yīng)體系中，模板的DNA含量均為10ng。結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，利用本發(fā)明的方法鑒定摻偽混合樣本，人參的質(zhì)量占混合樣本質(zhì)量的0.5％以上即可檢出，三七的質(zhì)量占混合樣本質(zhì)量的1％以上即可檢出，西洋參的質(zhì)量占混合樣本質(zhì)量的0.5％以上即可檢出。綜合上述結(jié)果表明，利用本發(fā)明的方法對人參、西洋參、三七中任意兩者相互摻偽的檢出限均達到1％。<110>中國中醫(yī)科學院中藥研究所<120>一種用于同時鑒定中藥人參、西洋參和三七的引物組合及其應(yīng)用<160>9<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1taacaataccgggctgatac20<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2ccagttaaggacaggag17<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3agggatgaggggtgcgtag19<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4cgacatgagaagagggctttta22<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>5aaatgcgggttatgacaaa19<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>6ttctgcatatacgcccaaatt21<210>7<211>247<212>DNA<213>人參（PanaxginsengC.A.Mey.）<400>7taacaataccgggctgatacagtctggtaattggaatgagtacaatctaaatcccttaac60gaggatccattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagc120gtatatttaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttggactttgggttgggtcggccgg180tccgcctctcggtgtgcaccgatcgtctcgtcccttctgccggcgatgcgctcctgtcct240taactgg247<210>8<211>492<212>DNA<213>三七（Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen）<400>8agggatgaggggtgcgtaggctccccaagttgcaaacccatggtcggggaccgcccttgg60gtggccctcgtccgaacaacgaccccccggcgcggaatgcgccaaggaaatcaaattgaa120cygcacgcgtcccccccgtttgcgggcggcggaagcgtctttctaaaacacaaacgactc180tcggcaacggatatctcggctctcgcatcgatgaagaacgtagcgaaatgcgatacttgg240tgtgaattgcagaatcccgtgaatcatcgagtctttgaacgcaagttgcgcccgaagcca300ttaggccgagggcacgtctgcctgggcgtcacgcatcgcgtcgccccccaacccatcatt360ccctcgcgggagtcgatgcggaggggcggataatggcctcccgtgtctcaccgcgcggtt420ggcccaaatgcgagtccttggcgatggacgtcacgacaagtggtggttgttaaaagccct480cttctcatgtcg492<210>9<211>1088<212>DNA<213>西洋參（PanaxquinquefoliusL.）<400>9aaatgcgggttatgacaaaaaattcagtttactaattgtgaaacgtttaattgctcgaat60gtatcaacagaatcatttgattctttctactaatgattctaaccaaaatagatttttgag120gcgcaacaagaatttgtattctcaaatgatatcagaggggtttgcagtcattgtggaaat180tccattttatctacaattaaaatcttccctagaaagcaaagggatagtcaaatctcataa240tttacgatcaattcattcaatatttccttttttagaggacaaaatttcacatttaattta300tggtttagagatactaataccctacccagtccatctggaaatcttggttcaaactcttcg360ctactgggtaaaagatgcttcttctttgcatttattacgattctttctccacgagtattg420taattggaatactccaaataaagccggttcttctttttcaaaaagaaatcaaagactatt480cttcttactatataattctcatctatgtgaatacgaatccatcttcatctttctccgtaa540ccaatcttctcatttacgctcaacatcttctggaacccttcttgaacgaatctatttcta600tggaaaaataaaatatcttgtaaaagtctttgttaaggcttttcaagtcaatctattgtt660gttgaaggatcctttcatgcattatgttaggtatcaaggaaaatcaattctcgcttcaaa720agggacgccctttttgatgaaaaaatggacatattactttgttaatttatggcaatgtca780tttttacctgtggtctcaaccgggaaggatctgtataaaccaattatacaatcattccct840cgacattctgggctatctatcaagtgcgcggctaaacccttcaatggtacgcggtcaaat900gctagaaaattcatttctaattgataatgctattaataagttcgatgctattgttccaat960tattcctctgattggatcattggctaaagcgaaattttgtaacgtattggggcatcctat1020tagtaaggcggtttggaccgatttatcagattctgatattattgaccaatttgggcgtat1080atgcagaa1088當前第1頁1 2 3